專利名稱：新型硫氧還蛋白可溶性表達(dá)載體及其融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及原核細(xì)胞中硫氧還蛋白融合蛋白的表達(dá)，特別涉及硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)類似物融合蛋白的表達(dá)。
最近McCoy等人(1993)將murine IL-2等多種細(xì)胞因子基因分別融合于大腸桿菌硫氧還蛋白(Thioredoxin)基因的C-端，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些融合蛋白在胞內(nèi)能以可溶狀態(tài)表達(dá)并能正確折疊獲得與天然細(xì)胞因子相同或相近的生物活性，這一表達(dá)系統(tǒng)成功地解決了多種細(xì)胞因子在原核細(xì)胞中表達(dá)形成包涵體的問題。包涵體雖然有利于分離純化，但需要進(jìn)行復(fù)雜的復(fù)性，才能獲得生物活性。Thioredoxin表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的外源蛋白不需要復(fù)性就具有生物活性，但由于可溶性表達(dá)，給分離純化帶來了困難，并且表達(dá)產(chǎn)物是以Thioredoxin融合蛋白的形式存在。
本發(fā)明的目的在于獲得一種適合于原核細(xì)胞表達(dá)的可溶性表達(dá)系統(tǒng)，由該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的融合蛋白既可以避免包涵體的形成，而具有生物活性，又有利于分離純化并能被特異水解，從而得到高純度的重組外源蛋白。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)。
通過在Thioredoxin活性位點(diǎn)(-Cys-Gly33-Pro34-Cys-)的Gly33-Pro34之間插入多聚組氨酸序列，獲得Thioredoxin的突變體。在Thioredoxin突變體與外源蛋白的接頭序列中設(shè)計(jì)水解蛋白酶特異切割序列，進(jìn)一步獲得既含有多聚組氨酸序列又含有水解蛋白酶特異切割序列接頭的融合蛋白表達(dá)載體，通過該載體在原核細(xì)胞中進(jìn)行外源蛋白的可溶性表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白經(jīng)柱層析分離純化，經(jīng)水解蛋白酶作用，得到具有生物活性的重組外源蛋白純品。
通過在Thioredoxin的活性位點(diǎn)插入了多聚組氨酸序列，并在Thioredoxin突變體與外源蛋白的接頭序列中設(shè)計(jì)了水解蛋白酶特異切割序列，使得通過該表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的外源基因融合蛋白既不形成包涵體而具有生物活性，又有利于分離純化和被特異水解，從而得到純的外源基因蛋白。


圖1為TrxAHis的基因序列。
圖2為TrxAHisL的基因序列。
圖3為融合基因表達(dá)載體PETTrxL和PETTrxHisL主要結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的實(shí)施例是通過以下步驟得以實(shí)現(xiàn)。
一、大腸桿菌Thioredoxin(TrxA)基因的擴(kuò)增大腸桿菌Thioredoxin全長含108氨基酸殘基，由位于基因組上的TrxA基因編碼。根據(jù)已發(fā)表的TrxA基因編碼序列，設(shè)計(jì)上、下游引物P1、P2上游引物P1長22個(gè)堿基(nt)，其3′-端12nt與模板互補(bǔ)，它包括ATG在內(nèi)的前四個(gè)氨基酸殘基編碼序列，其5′-端設(shè)計(jì)有EcoRI和NdeI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。下游引物P2長45nt，其3′-端15nt中有14nt與基因的324nt-339nt序列互補(bǔ)，為避免引物內(nèi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，第331nt-333nt位TTG由其簡并密碼TTA替換，另外考慮到構(gòu)建融合表達(dá)載體的需要，在設(shè)計(jì)的下游引物中取消了基因3′端原有的終止密碼，而代之以(GlySer)3多肽接頭及XbaI和BamHI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。
引物P1Met Ser Asp Lys5′GGAATTCCATATGAGCGATAAA3′EcoRINdeI引物P25′AAGGATCCCTCTAGAACCAGAACCAGAGCCCGCCAGATTAGCGTC3′BamHI XbaI因?yàn)樯?、下游引物長度相差懸殊并且它們與模板也分別只有12nt和14nt互補(bǔ)，所以在作PCR反應(yīng)開始兩輪循環(huán)時(shí)，選擇了較低的退火溫度，經(jīng)循環(huán)擴(kuò)增得到了TrxA基因擴(kuò)增產(chǎn)物。
二、TrxA基因的克隆將TrxA基因擴(kuò)增產(chǎn)物直接用Promega公司生產(chǎn)的PCR純化Kit進(jìn)行純化，然后用BEcoRI和BamHI酶切，電泳回收酶切片段，與EcoRI/BamHI酶切并回收的載體(本實(shí)施例選用pUC19)片段連接，轉(zhuǎn)化E.coli，篩選重組克隆。經(jīng)進(jìn)一步鑒定獲得TrxA基因陽性克隆(本實(shí)施例為PUCTrx)。
三、大腸桿菌TrxA基因插入突變體的構(gòu)建硫氧還蛋白(Thioredoxin)的立體結(jié)構(gòu)顯示其活性中心(-Cys32-Gly-Pro-Cys35-)位于分子的表面。McCoy等發(fā)現(xiàn)，在此位點(diǎn)插入25個(gè)氨基酸殘基序列后Thioredoxin分子仍能在胞內(nèi)正確折疊，保持其表達(dá)的可溶性和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，且插入序列分布于分子表面?？紤]到如果這樣的插入不影響Thioredoxin融合蛋白表達(dá)的可溶性及其正確折疊，那么選擇多聚組氨酸作為Thioredoxin活性中心的插入序列，多聚組氨酸殘基分布在融合蛋白分子表面，從而使重組后可溶性表達(dá)的帶多聚組氨酸殘基的融合蛋白可用固相金屬螯合層析(IMAC)柱進(jìn)行純化。IMAC純化蛋白具有對(duì)目的蛋白結(jié)合的選擇性強(qiáng)，純化效率高，洗脫條件溫和，成本較低等優(yōu)點(diǎn)，基于以上考慮，在TrxA基因Gly33與Pro34序列之間插入(His)5Gly六肽序列獲得了活性位點(diǎn)含此插入序列的TrxA基因突變體(-Cys-Gly-His-His-His-His-His-Gly-Pro-Cys-)。利用活性位點(diǎn)序列中所特有的限制性內(nèi)切酶RsrII單酶切位點(diǎn)，因其切割序列CGGTCCG的特殊性，使我們?cè)O(shè)計(jì)的多肽接頭能夠定向插入此酶切位點(diǎn)，并且插入接頭以后又可形成一新的RsrII位點(diǎn)。
將質(zhì)粒(本實(shí)施例為PUCTrx)DNA用RsrII完全酶切，然后與人工合成(His)5Gly接頭連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5αMCR獲得轉(zhuǎn)化子。通過菌落原位雜交從中篩選并獲得陽性突變重組子。
四、重組TrxA基因序列測定經(jīng)測序，所得到的重組子的基因序列如圖1所示。
五、融合蛋白Linker的設(shè)計(jì)以融合蛋白形式表達(dá)目的蛋白，有時(shí)為了最終能夠獲得純的目的蛋白需要用化學(xué)的或蛋白酶水解的方法將融合蛋白特異斷裂或切割。本實(shí)施例選用IgA蛋白酶作為切割融合蛋白特異性的水解酶。這是因?yàn)?)與化學(xué)法相比，蛋白酶水解法作用條件溫和、特異性好、切割效率高、不對(duì)目的蛋白產(chǎn)生化學(xué)修飾；2)與目前常用的從動(dòng)物體中提取的蛋白酶相比，由于IgA蛋白酶來源于奈瑟氏淋球菌，其基因已經(jīng)克隆并且能在大腸桿菌中分泌性表達(dá)和生產(chǎn)，成本低廉，更適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)的需要。為構(gòu)建能被IgA蛋白酶識(shí)別切割的硫氧還蛋白融合蛋白表達(dá)載體，設(shè)計(jì)并合成含IgA蛋白酶特異切割位點(diǎn)的接頭(Linker)。該Linker的5′端含XbaI酶切位點(diǎn)及IgA蛋白酶識(shí)別和特異切割所需多肽序列，3′端含SmaI、BamHI和HindIII多克隆位點(diǎn)。此接頭可定向插入質(zhì)粒。
LinkerXbal Smal EcoRI BamHI HindIII—— —— ——L35′CTAGACCGGCTCCGCGTCCGCCCGGGAATTCGGATCCA3′L43′TGGCCGAGGCGCAGGCGGGCCCTTAAGCCTAGGTTCGA5′▲K P A P K P P↓Igase site六、表達(dá)載體pET-3b的改構(gòu)質(zhì)粒pET-3b(4.60kb)是目前常用的高效表達(dá)載體，它含有T7啟動(dòng)子，較強(qiáng)的翻譯起始區(qū)，起始密碼及T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。而且，其表達(dá)由IPTG而不是溫度誘導(dǎo)，因此更利于重組蛋白可溶性表達(dá)。本實(shí)施例依次將該質(zhì)粒上的兩個(gè)限制性片段，長190bp的EcoRV片段和1,593bp的AccI片段缺失，并將其XbaI位點(diǎn)消除獲得表達(dá)載體pET-3bΔ(2.82kb)。
七、Thioredoxin融合表達(dá)載體的構(gòu)建將含IgA蛋白酶切割位點(diǎn)的融合蛋白Linker(L)分別插入重組質(zhì)粒pUCTrx及pUCTrxHis中的XbaI/HindIII位點(diǎn)，構(gòu)建并獲得了重組質(zhì)粒pUCTrxL和pUCTrxHixL。鑒定正確后，將質(zhì)粒pUCTrxL和pUCTrxHisL所含TrxL及TrxHisL編碼序列即NdeI/BamHI DNA片段克隆至表達(dá)質(zhì)粒pET-3bΔ的NdeI/BamHI位點(diǎn)，構(gòu)建并獲得Thioredoxin融合表達(dá)載體pETTrxL和pETTrxHisL，經(jīng)酶切鑒定正確。這兩個(gè)質(zhì)粒上(圖3)含有噬菌體T7的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、翻譯起始區(qū)及起始密碼ATG，完整的Thioredoxin編碼序列，(GlySer)s序列、IgA蛋白酶Linker及多克隆位點(diǎn)和T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)等。兩者區(qū)別在于pETTrxL所含TrxA編碼序列為野生型，pETTrxHisL上的TrxA基因在其Gly33Pro34之間插入有(His)5Gly序列。
八、重組Thioredoxin及其突變體的高效、可溶性表達(dá)將表達(dá)質(zhì)粒pETTrxL和pETTrxHisL分別轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞BL21(DE3)，在37℃培養(yǎng)至O.D.600＝0.3～0.4時(shí)，加IPTG至1mmol/L，然后于25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，離心收集誘導(dǎo)后的表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎或Osmotic Shoch處理，然后于13000r/min離心30min，將離心上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。表達(dá)水平達(dá)細(xì)胞總可溶蛋白的40％以上；胞內(nèi)重組Thioredoxin或其突變體均以可溶性狀態(tài)存在；OsmoticShock處理可使重組Thioredoxin或其突變體特異地從胞漿滲透至胞外。
九、重組Thioredoxin突變體的純化通過Osmotic Shock即可使重組Thioredoxin及其突變體從胞漿特異滲透至胞外，從而在不破碎細(xì)胞的情況下將重組蛋白與絕大部分細(xì)胞蛋白分離，這一特性為表達(dá)產(chǎn)物的純化帶來很大方便。我們將pETTrxHis表達(dá)細(xì)胞的Osmotic Shock上清依次經(jīng)過DEAE-SepharoseFF陰離子交換層析和Cu2+IDASepharoeeFF金屬螯合層析。即可得到純的重組蛋白。電泳掃描顯示其純度可達(dá)95％以上。
十、反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)擴(kuò)增hG-CSF cDNA從LPS誘導(dǎo)后的單核細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA。以此總RNA作模板，digo(dT)15為引物，AMV-反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。直接取反轉(zhuǎn)錄混合物作模板，加上游引物P35′CCAGACCCAT GGCTGGACCTGC3′、下游引物、P45′TGGCTCAGGGCTGGGCAAGGT進(jìn)行PCR反應(yīng)。將擴(kuò)增DNA片段純化，用T4寡聚核苷酸激酶和Klenow處理使DNA片段形成磷酸化平末端，然后與EcoRV酶切并CIP脫磷的載體pBSM13DNA片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。經(jīng)菌落原位雜交篩選獲得雜交陽性克隆，從中取一克隆pBShG-CSF1進(jìn)行序列分析。
提取雙鏈pBShG-CSF1質(zhì)粒DNA，進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果表明所克隆DNA片段的序列與文獻(xiàn)報(bào)道hG-CSF cDNA序列完全一致，包括hG-CSF完整信號(hào)肽及全部174aa編碼序列和終止密碼。
十一、hG-CSF融合表達(dá)載體的構(gòu)建以質(zhì)粒pBSM13hG-CSF1為模板，擴(kuò)增含hG-CSF成熟蛋白編碼序列及翻譯終止密碼TGA的基因片段。擴(kuò)增所用上游引物P55′ACCCCCCTGGGCCCTG3′源于hG-CSF成熟蛋白N-端第1-6aa編碼序列，下游引物為載體本身的通用測序引物PU5′GTTTTCCCAGTCACGAC3′。為確保擴(kuò)增序列的準(zhǔn)確性，在擴(kuò)增時(shí)選用了Tli DNA聚合酶，并增加了模板量。將擴(kuò)增的DNA片段純化后用BamHI酶切，然后定向插入質(zhì)粒pETTrxL或pETTrxHisL上的SmaI/BamHI位點(diǎn)，使hG-CSF174aa編碼序列以正確閱讀框架融合于Thioredoxin編碼序列和蛋白接頭的C-端，構(gòu)建并經(jīng)篩選獲得hG-CSF與Thioredoxin及其突變體的融合蛋白表達(dá)載體pETTrxG-CSF和pETTrxHisG-CSF。
十二、hG-CSF融合蛋白以可溶性形式在胞內(nèi)高效表達(dá)將pETTrxG-CSF和pETTrxHisG-CSF分別轉(zhuǎn)化到宿主BL21(DE3)細(xì)胞，在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破碎細(xì)胞，離心，收集離心上清和沉淀，于SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示，所表達(dá)融合蛋白分子量大小與設(shè)計(jì)一致，重組表達(dá)產(chǎn)物均全部位于可溶性離心上清中，表明所構(gòu)建的Thioredoxin融合表達(dá)載體能使hG-CSF以融合蛋白形式在重組大腸桿菌胞內(nèi)可溶性表達(dá)；在Thioredoxin活性位點(diǎn)插入6個(gè)氨基酸殘基不影響其與hG-CSF融合蛋白高效、可溶性表達(dá)，蛋白電泳的激光掃描結(jié)果顯示pETTrxHisG-CSF所表達(dá)的融合蛋白TrxHisG-CSF可占細(xì)胞總可溶性蛋白的41％以上。
十三、金屬螯和層析(IMAC)純化融合蛋白分別將BL21(DE3)(pETTrxHisG-CSF)和BL21(DE3)(pETTrxG-CSF)表達(dá)細(xì)胞超聲破碎后的離心取上清，通過Cu2+(或Zn2+)-IDA SepharoseFF金屬螯合層析柱，用含EDTA或咪唑的樣品緩沖液洗脫結(jié)合蛋白。分部收集，然后于SDS-PAGE電泳分析所收集樣品。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pETTrxHisG-CSF所表達(dá)融合蛋白TrxHisG-CSF能與Cu2+-IDA柱結(jié)合，所結(jié)合融合蛋白用50mmol/LEDTA或35mmol/L咪唑可洗脫下來。面pETTrxG-CSF表達(dá)產(chǎn)物TrxG-CSF與Cu2+和Zn2+-IDA柱均不能結(jié)合。這表明插入到硫氧還蛋白活性中心的多聚組氨酸序列能暴露于分子表面，并且能與Cu2+-IDA特異結(jié)合，為蛋白純化提供新的手段。
在構(gòu)建的hG-CSF融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒中，hG-CSF N-端的Thr1Pro2與融合蛋白接頭上的ProAlaProArgProPro正好可形成一個(gè)完整的IgA蛋白酶切割位點(diǎn)ProAlaProArgProPro/ThrPro，因此所表達(dá)融合蛋白應(yīng)能夠被IgA蛋白酶在此位點(diǎn)特異切割，獲得與天然蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)完全一致的成熟hG-CSF。將BL21(DE3)(pETTrxHisG-CSF)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Cu2+-IDA SepharoseFF金屬螯合層析初步純化，在50mmol/LTris-HCl，pH7.5緩沖液中徹底透析后，加IgA蛋白酶于37℃作用30min，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物TrxHisG-CSF可被IgA蛋白酶特異切割成TrxHis和hG-CSF兩部分，后者經(jīng)蛋白質(zhì)序列分析，顯示與天然hG-CSF序列一致。這表明hG-CSF融合基因閱讀框架正確，并且所設(shè)計(jì)的IgA蛋白酶人工切點(diǎn)合適，該位點(diǎn)可暴露于融合蛋白分子表面。
十四、融合蛋白的生物活性將Cu2+-IDA SepharoseFF金屬螯合層析柱初步純化的TrxHisG-CSF融合蛋白進(jìn)行體外生物活性測定，表明所表達(dá)的G-CSF融合蛋白具有G-CSF特異的生物活性。初步純化的TrxHisG-CSF融合蛋白的生物比活性為0.5～1.33×107u/mg融合蛋白。
十五、多重插入突變對(duì)融合蛋白可溶性表達(dá)的影響在Thioredoxin分子活性中心插入(HisHisHisHisHisGly)等六個(gè)氨基酸殘基并不影響其與hG-CSF融合蛋白的可溶性表達(dá)。為進(jìn)一步了解Thioredoxin活性中心是否具有更大的柔韌性，在原突變體(pETTrxHisG-CSF)的基礎(chǔ)上，在其活性中心再次插入相同的多聚氨基酸接頭，構(gòu)建并獲得含(HisHisHisHisHisGly)2串聯(lián)序列的插入突變體(pETTrxHisIIG-CSF)。按照相同方法，又相繼獲得含3-6個(gè)串聯(lián)體的插入突變體(pETTrxHisIIIG-CSF至pETTrxHisVIG-CSF)，從而使插入序列最多達(dá)到36aa(pETTrxHisVIG-CSF)。將所構(gòu)建的含這些突變體的融合蛋白表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLys細(xì)胞中，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，離心，分別收集上清和離心沉淀，于SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管在Thioredoxn活性中心插入多至36aa序列，各融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物仍保持可溶。
十六、TrxAHis基因3′端缺失突變與hG-CSF融合基因的可溶性表達(dá)(一)TrxAHis基因缺失突變體的構(gòu)建載體pETTrxHisG-CSF DNA用限制性內(nèi)切酶RsrII和XbaI酶切，酶切末端用Klenow酶補(bǔ)平，然后電泳回收載體DNA片段，加T4DNA連接酶自身連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。經(jīng)快抽質(zhì)粒電泳及酶切分析證實(shí)，獲得缺失突變陽性克隆pETDTrxHisG-CSF。在pETDTrxHisG-CSF中，保留了Thioredoxin N-端33aa殘基編碼序列、多聚組氨酸接頭、IgA蛋白酶切割位點(diǎn)和hG-CSF編碼序列。其余Thioredoxin編碼序列及載體上Thioredoxin基因3′端的(GlySer)3接頭序列均被缺失。
(二)hG-CSF與Thioredoxin N-端33aa融合蛋白的可溶性表達(dá)將表達(dá)載體pETDTrxHisG-CSF轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心，分別收集可溶性離心上清于SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明Thioredoxin蛋白缺失了C-端序列僅保留其N-端33aa與hG-CSF的融合蛋白在大腸桿菌胞內(nèi)仍能獲得可溶性高效表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種編碼融合蛋白的DNA序列，其特征在于該DNA序列含有編碼融合到選擇外源蛋白上的硫氧還蛋白變構(gòu)體的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼融合蛋白的DNA序列，其特征在于該DNA序列編碼的硫氧還蛋白變構(gòu)體為大腸桿菌硫氧還蛋白變構(gòu)體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼融合蛋的DNA序列，其特征在于該DNA編碼的外源蛋白為細(xì)胞因子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼融合蛋的DNA序列，其特征在于所述細(xì)胞因子為G-CSF。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的編碼融合蛋的DNA序列，其特征在于所述的G-CSF為人的G-CSF。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的編碼融合蛋白的DNA序列，其特征在于所述的人G-CSF為包括其成熟分子全部174個(gè)氨基酸編碼序列和終止密碼子。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼融合蛋白的DNA序列，其特征在于所編碼的硫氧還蛋白變構(gòu)體為野生型的硫氧還蛋白的活性中心插入了多聚組氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的編碼融合蛋白的DNA序列，其特征在于所述的多聚組氨酸為(His)5Gly。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼融合蛋白的DNA序列，其特征在于還含有編碼連結(jié)所述硫氧還蛋白與選擇外源蛋白的接頭的DNA序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的編碼融合蛋白的DNA序列，所述的接頭的DNA序列含有水解蛋白酶的特異識(shí)別及切割位點(diǎn)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的編碼融合蛋白的DNA序列，所述的接頭的DNA序列含有IgA蛋白酶高效特異的切割位點(diǎn)編碼序列。
12.一種質(zhì)粒DNA分子，其特征在于其含有權(quán)利要求1～11所述的編碼融合蛋白的DNA序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的質(zhì)粒DNA分子，其特征在于其在合適的表達(dá)控制序列操縱下，在選擇的宿主細(xì)胞中進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的質(zhì)粒DNA分子，其特征在于該質(zhì)粒DNA還含有質(zhì)粒PET-3b的DNA序列。
15.一種大腸桿菌宿主細(xì)胞，其特征在于其被權(quán)利要求12～14所述的質(zhì)粒DNA分子所轉(zhuǎn)化。
16.一種生產(chǎn)目的蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟(1)構(gòu)建權(quán)利要求15所述的大腸桿菌宿主細(xì)胞的方法；(2)權(quán)利要求15所述大腸桿菌宿主細(xì)胞的表達(dá)培養(yǎng)條件及方法；(3)權(quán)利要求15所述大腸桿菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)物的分離純化；(4)分離純化的表達(dá)產(chǎn)物的酶裂解；(5)分離目的蛋白。(6)目的蛋白生物活性的測定。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的生產(chǎn)目的蛋白的方法，其特征在于，步驟(3)中采用固相金屬離子螯合層析柱純化方法；步驟(4)中采用IgA蛋白酶進(jìn)行高效特異切割。
18.由權(quán)利要求16或17所述方法獲得的目的蛋白。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的目的蛋白，其特征在于目的蛋白為細(xì)胞因子。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的目的蛋白，其特征在于目的蛋白為hG-CSF。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種融合蛋白的DNA分子,該DNA分子由編碼硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)類似物的DNA序列和編碼外源蛋白的DNA序列組成。本發(fā)明所涉及的融合蛋白不但保持了已有硫氧還蛋白融合蛋白可溶性高效表達(dá)的特性,而且由于在硫氧還蛋白基因序列的活性位點(diǎn)插入了若干個(gè)氨基酸序列,使得所表達(dá)的融合蛋白可通過固相螯合層析柱方便地進(jìn)行提取純化。并且由于融合蛋白中硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)類似物的DNA編碼序列與外源蛋白DNA編碼序列間含有可被特異性蛋白酶切割的接頭,融合蛋白可被特異性蛋白酶水解,從而獲得與天然蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)完全一致的重組外源蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1189539SQ9710036
公開日1998年8月5日 申請(qǐng)日期1997年1月31日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月31日
發(fā)明者崔立斌, 馬清鈞 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所