專利名稱：一種抗病毒藥物的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗病毒藥物篩選技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種抗RNA病毒藥物的篩選方法。
背景技術(shù)：
藥物篩選在新藥的研究和開發(fā)過程中是一個(gè)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，簡(jiǎn)便有效的篩選方法可以大大縮短新藥開發(fā)的進(jìn)程。常規(guī)的藥物篩選是從細(xì)胞空斑實(shí)驗(yàn)開始，經(jīng)動(dòng)物模型的有效性及毒性測(cè)定評(píng)估后進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)代的藥物篩選增加了細(xì)胞致病性抑制實(shí)驗(yàn)，體外反應(yīng)抑制實(shí)驗(yàn)等方法[1-3]。每種方法都有針對(duì)特定病毒的特殊的設(shè)計(jì)依據(jù)，各有優(yōu)缺點(diǎn)。例如體外反應(yīng)抑制實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是快速，但是必需事先獲得病毒以及宿主的特定因子以及建立適合的測(cè)試體系[4-14]，并且目前已知的這類特定因子還很少。理想的篩選方法應(yīng)該具有明顯的檢測(cè)標(biāo)記，而且高效、簡(jiǎn)便。但是對(duì)大多數(shù)RNA病毒而言，理想的篩選方法還非常缺乏。尤其在抗植物病毒和真菌病毒病的藥物開發(fā)方面，目前還沒有簡(jiǎn)易、快速和高效的篩選方法。

發(fā)明內(nèi)容
無(wú)病毒的絲狀真菌真菌板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)EP-721(-)菌株具有桔黃色的表現(xiàn)型，而感染了雙鏈RNA低毒病毒CHV1-EP721的板栗疫病菌EP-721(-)菌株(命名為EP-721，ATCC編號(hào)66024)則具有菌絲體為白色的穩(wěn)定的表現(xiàn)型。EP-721除攜帶病毒外，與無(wú)病毒菌株EP-721(-)的遺傳背景完全相同。當(dāng)帶毒株EP-721失去可自主復(fù)制的低毒病毒時(shí)或者其滴度顯著降低時(shí)，菌絲體變?yōu)榻埸S色。這種顏色變化提供了判斷病毒是否存在或其滴度水平的一個(gè)方便的初步標(biāo)記。因此，有可能把低毒病毒/板栗疫病菌系統(tǒng)發(fā)展成為一個(gè)篩選抗RNA病毒復(fù)制和緩解RNA病毒感染所引起的病害癥狀的抗病毒化合物高通量篩選方法。
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便、快速的抗RNA病毒藥物的篩選方法。該方法是基于一種雙鏈RNA病毒和它的天然宿主—板栗疫病菌所組成的測(cè)試系統(tǒng)，在此系統(tǒng)中，無(wú)病毒的板栗疫病菌EP-721(-)菌株是桔黃色的，有很強(qiáng)的產(chǎn)生分生孢子的能力(圖1-A)；當(dāng)該菌株攜帶CHV1-EP721病毒后，則是白色的，不能產(chǎn)孢(圖1-B)。這種顏色變化可以作為判斷病毒存在與否或其濃度水平的一個(gè)方便的初步標(biāo)記。用藥物處理這種帶病毒菌株，然后根據(jù)用藥前后菌株顏色的變化，就可以初步判斷所用藥物對(duì)RNA病毒的復(fù)制是否有抑制作用，或?qū)κ躌NA病毒感染的真菌的癥狀是否有緩解作用。
該方法所需材料如下菌種攜帶低毒病毒CHV1-EP721的板栗疫病菌EP-721菌株來自美國(guó)菌種保藏中心(編號(hào)ATCC66024)，無(wú)病毒的板栗疫病菌EP721(-)是通過將EP-721菌株經(jīng)常規(guī)分生孢子單孢分離脫毒而獲得。
培養(yǎng)基PDA固體培養(yǎng)基(配方見附1.1)待測(cè)藥物各種已知成份或未知成份的藥物或化合物或天然成份。
方法步驟1.首先將待篩選藥物配制成一定濃度的溶液。
2.所配待篩選藥物溶液按照一定的濃度梯度加到已滅菌的PDA固體培養(yǎng)基，搖動(dòng)混勻。
3.將上述培養(yǎng)基分裝在透光的直徑為100毫米的培養(yǎng)皿(20ml/皿)。
4.將EP-721和EP-721(-)接種到上述培養(yǎng)基中。
5.在不加藥物的PDA固體培養(yǎng)基上接種EP-721和EP-721(-)，做為對(duì)照。
6.在室溫22-25℃、室內(nèi)光照(200-3000Lux)下，按每天有光14小時(shí)，黑暗10小時(shí)，培養(yǎng)5-10天。
7.表型觀察在不同的時(shí)間段進(jìn)行菌落和菌絲體顏色的觀察并記錄結(jié)果。給藥的處理與不給藥的對(duì)照相比，如果菌落變黃或產(chǎn)孢能力恢復(fù)，視為陽(yáng)性結(jié)果，即所用藥物對(duì)RNA病毒的復(fù)制有抑制作用或?qū)NA病毒感染所引起的癥狀有緩解作用；8.病毒相對(duì)量的分析以真菌EP-721的核糖體RNA作為內(nèi)參照，檢驗(yàn)用藥前后菌絲體中雙鏈RNA病毒的含量是否有所下降。雙鏈RNA病毒提取方法如下從平板上刮下大約200-500mg的菌絲放于研缽中，加液氮研磨至粉末狀后，快速加入2ml提取緩沖溶液(配方見附1.2)并攪拌均勻，然后轉(zhuǎn)移到合適的離心管中，加等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提兩次以上至看不到中間蛋白質(zhì)層為止；吸出上層水相加1/4體積10M的LiCl，-20℃沉淀2-3個(gè)小時(shí)，高速離心去沉淀；在溶液中加2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，-20℃沉淀1個(gè)小時(shí)，高速離心沉淀，用75％乙醇洗滌沉淀2-3次，自然涼干，加100ul無(wú)RNA酶的超純水溶解沉淀，取出小部分用適量DNA酶37℃消化1個(gè)小時(shí)。在0.7％瓊脂糖凝膠中電泳，照相記錄結(jié)果。
附1PDA培養(yǎng)基配方1.馬鈴薯200g洗凈、去皮、切成小塊，沸水煮1 5-20分鐘，過濾去渣，加20g葡萄糖，用蒸餾水定容至1L，加10-13g瓊脂粉，高壓滅菌分鐘。
2.雙鏈RNA病毒提取緩沖溶液(用超純水配制)Tris.Hcl(pH8.0)100mM，Nacl 200mM，EDTA(pH8.0)4mM，SDS 2％


圖1指示菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。
圖2經(jīng)阿昔洛韋處理的EP721的菌落形態(tài)。A.3.2mg/ml阿昔洛韋，B.對(duì)照?qǐng)D3經(jīng)快克處理的EP721菌落形態(tài)。A.20ug/ml快克，B.對(duì)照?qǐng)D4經(jīng)鹽酸嗎啉胍處理的EP721菌落形態(tài)。A.900ug/ml鹽酸嗎啉胍，B對(duì)照?qǐng)D5不同濃度鹽酸嗎啉胍處理后EP721病毒dsRNA相對(duì)量的變化MλHindIII；1EP-721；2EP-721(-)；390ug/ml鹽酸嗎啉胍；4900ug/ml鹽酸嗎啉胍；59000ug/ml鹽酸嗎啉胍圖6經(jīng)雙嘧達(dá)莫處理的EP721菌落形態(tài)。A.1mg/ml雙嘧達(dá)莫，B.對(duì)照?qǐng)D7經(jīng)貝爾芬處理的EP721菌落形態(tài)。A.500 U貝爾芬，B.對(duì)照具體實(shí)施方式
實(shí)施例一阿昔洛韋(100mg/片)，用滅菌水配成160mg/ml的溶液，離心除去不溶部分。藥物按照32mg/ml，3.2mg/ml，0.32mg/ml的梯度加入PDA固體培養(yǎng)基中。接種EP721，室溫培養(yǎng)7天。結(jié)果顯示，3.2mg/ml藥物濃度使得真菌的菌落明顯變?yōu)榻埸S色(圖2-A)，接近無(wú)病毒時(shí)的水平，表明癥狀已明顯緩解。而在32mg/ml的藥物濃度時(shí)，菌落除變?yōu)榻埸S色外，其生長(zhǎng)受到了明顯抑制。
實(shí)施例二快克(鹽酸金剛烷胺100mg/粒)，取4粒膠囊用無(wú)菌水配制成10ml的溶液，離心除去不溶物。藥物按照160，320，640ug/ml三個(gè)濃度梯度加入PDA固體培養(yǎng)基中。接種EP721，室溫培養(yǎng)7天。結(jié)果顯示320ug/ml藥物濃度使得真菌的菌落明顯變?yōu)榻埸S色(圖3-B)，而在640ug/ml的藥物濃度時(shí)，菌落除變?yōu)榻埸S色外，其生長(zhǎng)受到了明顯抑制。
實(shí)施例三鹽酸嗎啉胍(100mg/片)，取100片用50ml無(wú)菌水溶解，離心除去不溶物。藥物按照90ug/ml，900ug/ml，9000ug/ml三個(gè)梯度加入PDA固體培養(yǎng)基中，接種EP721，室溫培養(yǎng)7天。結(jié)果顯示900ug/ml的藥物用量使得真菌的菌落明顯變?yōu)榻埸S色，接近無(wú)病毒時(shí)的水平，表明癥狀已明顯緩解。而在9000ug/ml的平板上，菌落除變?yōu)榻埸S色外，其生長(zhǎng)受到了明顯抑制(圖4)。進(jìn)一步提取dsRNA驗(yàn)證，隨著藥物濃度的增加，dsRAN的濃度略有下降(圖5)。
實(shí)施例四雙嘧達(dá)莫(潘生丁，25mg/片)，除去糖衣，用滅菌水配制成100mg/ml的溶液。藥物按照0.1，1，10mg/ml三個(gè)濃度梯度加入PDA固體培養(yǎng)基中。接種EP721，室溫培養(yǎng)7天。結(jié)果顯示三個(gè)藥物濃度的真菌菌落都有不同程度的變黃(圖6)。
實(shí)施例五(陰性結(jié)果示例)貝爾芬(重組a干擾素50萬(wàn)U/ml)，用500U的貝爾芬處理EP-721，固體培養(yǎng)7天后，顏色幾乎沒有任何變化(圖7)。將濃度增加至5000U，5萬(wàn)U時(shí)才出現(xiàn)顏色變黃的現(xiàn)象，說明該系統(tǒng)對(duì)這種類型的化合物不是很敏感。
參考文獻(xiàn)1.用微孔板培養(yǎng)表達(dá)病毒的細(xì)胞系，在培養(yǎng)液中待測(cè)化合物，通過定量檢測(cè)病毒基因表達(dá)水平來篩選抗病毒化合物的方法(WO99/51776)；2.Schimidtake M，Schnittler U，Jahn B，Dahse H，Stelzner A(2001).A rapidassay for evaluation of antiviral activity against coxsackie virus B3，ifluenza virus A，andherpes simplex virus type 1.J Virol Methods 95133-433.McMahon JB，Beutler JA，O’Keefe BR，Goodmm CB，Myers MA，BoydMR.(2000)Development of a cyanovirin-N-HIV-1 gp120 binding assay for highthroughput screening ofnatural product extracts by time-resovled fluorescence.JBiomo.Screen 5169-764.與流感病毒復(fù)制有關(guān)的宿主人NP-1蛋白及其編碼基因(US5750394、WO00111335)；5.由宿主人基因編碼的艾滋病毒HIV-1整合酶的作用子IN-1(US5872213、US6222024B1)；6.與艾滋病毒HIV-1復(fù)制有關(guān)的由宿主人編碼的一個(gè)類似MSS-1的蛋白質(zhì)(JP09028749)；7.從擬南芥克隆的與煙草花葉病毒的復(fù)制有關(guān)的tom-1基因(JP11232678)；8.篩選人呼吸道多核體病毒的調(diào)節(jié)子的方法(EP0926246A2、US6017694)；
9.利用人丙肝病毒編碼的NS4B蛋白(ATP酶)篩選NS4B的抑制子或激活子的方法(EP998585A1)；10.利用人丙肝病毒編碼的NS5B的截短了的蛋白篩選抗病毒化合物的方法(EP1037974、US6228576B1、WO99/29843)；11.以艾滋病毒HIV-1gp41核心結(jié)構(gòu)為靶標(biāo)的抗病毒化合物的篩選方法(WO55377A1)；12.以宿主人NP-1蛋白與流感病毒NP蛋白相互作用為基礎(chǔ)，篩選抗病毒化合物的方法(WO01/11335A2)；13.以流感病毒基質(zhì)蛋白M1的結(jié)晶態(tài)N-末端的三維結(jié)構(gòu)篩選抗RNA病毒化合物的方法(US6090690)；14.依據(jù)人呼吸道多核體病毒M2-1蛋白與病毒核衣殼蛋白相互作用及磷酸化原理，通過觀察M2-1功能的喪失來篩選抗病毒化合物的方法(WO00/50646)。
權(quán)利要求
1.一種雙鏈RNA病毒和它的天然宿主一板栗疫病菌所組成的一種抗RNA病毒藥物的篩選方法，該方法涉及(1)菌種，無(wú)病毒的板栗疫病菌EP-721(-)菌株和攜帶CHV1-EP721病毒的EP-721菌株；(2)配制待篩選藥物溶液；(3)菌種EP-721和EP-721(-)接種到施藥和不施藥的培養(yǎng)基中；(4)菌種經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行菌落、菌絲體顏色的觀察和病毒相對(duì)量的分析，給藥的處理與不給藥的對(duì)照相比，根據(jù)菌落顏色變化或產(chǎn)孢能力的變化的一種抗RNA病毒藥物的篩選方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗RNA病毒藥物的篩選方法，其所述的菌種無(wú)病毒的板栗疫病菌EP-721(-)菌株是桔黃色的，有很強(qiáng)的產(chǎn)生分生孢子的能力，當(dāng)該菌株攜帶CHV1-EP721病毒后，則是白色的，不能產(chǎn)孢，當(dāng)帶毒株EP-721失去可自主復(fù)制的低毒病毒時(shí)，菌絲體變?yōu)榻埸S色，這種顏色變化作為判斷病毒存在與否或其濃度水平的一個(gè)標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗RNA病毒藥物的篩選方法，其具體方法步驟1)首先將待篩選藥物配制成一定濃度的溶液，2)所配待篩選藥物溶液按照一定的濃度梯度加到已滅菌的PDA固體培養(yǎng)基，搖動(dòng)混勻，3)將上述培養(yǎng)基分裝在透光的直徑為100毫米的培養(yǎng)皿(20ml/皿)，4)將EP-721和EP-721(-)接種到上述培養(yǎng)基中，5)在不加藥物的PDA固體培養(yǎng)基上接種EP-721和EP-721(-)，作為對(duì)照。6)在室溫22-25℃、室內(nèi)光照(200-3000Lux)下，按每天有光14小時(shí)，黑暗10小時(shí)，培養(yǎng)5-10天，7)表型觀察在不同的時(shí)間段進(jìn)行菌落和菌絲體顏色的觀察并記錄結(jié)果。給藥的處理與不給藥的對(duì)照相比，如果菌落變黃或產(chǎn)孢能力恢復(fù)，視為陽(yáng)性結(jié)果，即所用藥物對(duì)RNA病毒的復(fù)制有抑制作用或?qū)NA病毒感染所引起的癥狀有緩解作用；8)病毒相對(duì)量的分析以真菌EP-721的核糖體RNA作為內(nèi)參照，檢驗(yàn)用藥前后菌絲體中雙鏈RNA病毒的含量是否有所下降。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的一種抗RNA病毒藥物的篩選方法在篩選抗RNA病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便、快速的抗RNA病毒藥物的篩選方法。該方法是基于一種雙鏈RNA病毒和它的天然宿主—板栗疫病菌所組成的測(cè)試系統(tǒng)，在此系統(tǒng)中，無(wú)病毒的板栗疫病菌EP－721(－)菌株是桔黃色的，有很強(qiáng)的產(chǎn)生分生孢子的能力；當(dāng)該菌株攜帶CHV1－EP721病毒后，則是白色的，不能產(chǎn)孢。這種顏色變化可以作為判斷病毒存在與否或其濃度水平的一個(gè)方便的初步標(biāo)記。用藥物處理這種帶病毒菌株，然后根據(jù)用藥前后菌株顏色的變化，就可以初步判斷所用藥物對(duì)RNA病毒的復(fù)制是否有抑制作用，或?qū)κ躌NA病毒感染的真菌的癥狀是否有緩解作用。
文檔編號(hào)C12Q1/18GK1624150SQ200310116878
公開日2005年6月8日 申請(qǐng)日期2003年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月1日
發(fā)明者陳保善, 林海燕, 戴璐 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)