專利名稱：包括乳酸桿菌或雙歧桿菌組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的主題是一種具有免疫調(diào)節(jié)性能的細(xì)菌組合物，一種向介質(zhì)中提供免疫性能的免疫調(diào)節(jié)方法以及該組合物的用途。免疫調(diào)節(jié)是改善在健康或在病理狀況中整體免疫功能的能力。
背景技術(shù)：
在細(xì)菌中，一些細(xì)菌對腸介質(zhì)的免疫系統(tǒng)具有積極影響，特別是乳酸桿菌和雙歧桿菌，并且其被稱為“益生”菌或菌株。
該表達(dá)益生菌或菌株理解為一種菌株，當(dāng)在存活時攝入，該菌株通過腸菌類和/或腸免疫系統(tǒng)的平衡行為來給予宿主有益的影響。這些益生菌株具有在通過消化道上部以后仍然能夠存活的能力。它們?yōu)榉遣≡缘摹o毒的并且一方面通過它們與消化道聚居菌叢的生態(tài)相互作用以及另一方面通過它們對GALT(與腸有關(guān)的免疫組織)的作用而產(chǎn)生的對免疫系統(tǒng)的積極影響來對健康產(chǎn)生有益效果。根據(jù)益生的定義，當(dāng)以足夠數(shù)量給出的那些細(xì)菌具有活著通過所有腸道的能力。在給藥期間，在那兒它們成為聚居菌叢的一部分。所謂的集群現(xiàn)象(或瞬間集群現(xiàn)象)使得該益生菌例如潛在地抑制病原體微生物對菌叢和與腸有關(guān)的免疫系統(tǒng)的生態(tài)相互作用來產(chǎn)生有益的影響。
絕大多數(shù)廣泛使用的特別是用于乳制品的該益生菌株主要是細(xì)菌和酵母，其屬于下面的屬，乳酸桿菌亞種、鏈球菌亞種、腸球菌亞種和雙歧桿菌亞種和Sacharomyces亞種。在所報(bào)道的這些細(xì)菌的益生作用中，可以提出一個例如，乳糖耐受性的改善，預(yù)防和/或治療胃腸和泌尿生殖感染，減少某些癌癥，降低血液膽固醇。然而，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)，并非所有的來自上述屬的單個菌株都具有那些作用，而僅有一些經(jīng)過仔細(xì)選擇的菌株具有。
因此，為了滿足特性益生菌株的需求，需要選擇有效的并且能夠刺激免疫系統(tǒng)(免疫調(diào)節(jié))的菌株或其混合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題是提供一種具有益生性能的細(xì)菌組合物。
本發(fā)明的目的就在于滿足這些需求。
為實(shí)現(xiàn)這個目的，本發(fā)明提供一種具有免疫調(diào)節(jié)性能的細(xì)菌組合物，其包括至少一種選自由嗜酸乳酸桿菌PTA-4797，植物乳酸桿菌PTA-4799，唾液乳酸桿菌PTA-4800，副干酪乳酸桿菌PTA-4798，兩歧雙歧桿菌PTA-4801，乳酸雙歧桿菌PTA-4802和乳酸雙歧桿菌PTA-5658組成的組的菌株。
本發(fā)明的主題也是一種包括上述細(xì)菌組合物的食物或藥物組合物。
本發(fā)明的另一個主題是向一種介質(zhì)中提供免疫調(diào)節(jié)性能的方法。
本發(fā)明的另一個主題也是該組合物在胃腸系統(tǒng)中以治療或預(yù)防為目的制備向人類或向動物給藥的載體中的用途。
本發(fā)明組合物具有提供無可非議的合適菌株范圍性能的優(yōu)勢。
當(dāng)在胃腸系統(tǒng)中以治療或預(yù)防為目的向人類或向動物給藥時，特別是在減輕炎癥和/或過敏性反應(yīng)中，這種組合物尤其是有利的。
本發(fā)明的優(yōu)勢還在于當(dāng)其與藥學(xué)上可接受的載體組合或與食品組合時仍然能夠保留其所有的性能。
本發(fā)明的其它優(yōu)勢和特征將通過閱讀下面的說明書和僅以描述和并非限制的方式給出的實(shí)施例而變得更加清晰。
首先，本發(fā)明的主題是一種具有免疫調(diào)節(jié)性能的細(xì)菌組合物，其包括至少一種選自由嗜酸乳酸桿菌PTA-4797，植物乳酸桿菌PTA-4799，唾液乳酸桿菌PTA-4800，副干酪乳酸桿菌PTA-4798，兩歧雙歧桿菌PTA-4801，乳酸雙歧桿菌PTA-4802和乳酸雙歧桿菌PTA-5658組成的組的菌株。
根據(jù)本發(fā)明所使用的嗜酸乳酸桿菌是一種革蘭氏陽性菌株。有利地，它是一種過氧化氫酶陰性菌株，具有導(dǎo)致乳酸產(chǎn)生的同型發(fā)酵新陳代謝。
根據(jù)本發(fā)明所使用的嗜酸乳酸桿菌還可以產(chǎn)生一種細(xì)菌素，萵苣苦素，其對其它微生物有活性。
優(yōu)選地，其為在酸性pH條件下(在治療后40分鐘至少約73％的細(xì)菌仍舊存活)表現(xiàn)出良好的抗胃蛋白酶性的嗜酸乳酸桿菌。
更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明所使用的嗜酸乳酸桿菌表現(xiàn)出極好的抗胰酶性(在治療后40分鐘至少100％的細(xì)菌仍舊存活)。
有利地，根據(jù)本發(fā)明所使用的嗜酸乳酸桿菌表現(xiàn)出對膽汁鹽的良好耐受性。
優(yōu)選地，將使用被描述為“疏水的”根據(jù)本發(fā)明所使用的嗜酸乳酸桿菌，也就是說其表現(xiàn)出對疏水有機(jī)溶劑，極性的或非極性的，例如癸烷、氯仿、十六烷或二甲苯的高親和力。
根據(jù)本發(fā)明所使用的嗜酸乳酸桿菌能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。細(xì)胞因子誘導(dǎo)檢測通過分離的外周血液單核細(xì)胞(PBMC)的體外刺激測試的方法來進(jìn)行。在測試期間所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子中，可以涉及白細(xì)胞間介素10(IL10)、γ-干擾素(γ-IFN)和腫瘤壞死因子α(TNFα)。另一方面，使用相同的測試方法，根據(jù)本發(fā)明所使用的嗜酸乳酸桿菌誘導(dǎo)很少或沒有白細(xì)胞間介素12(IL2)的分泌。
根據(jù)本發(fā)明所使用的嗜酸乳酸桿菌是嗜酸乳酸桿菌PTA-4797。該嗜酸乳酸桿菌菌株根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，紀(jì)錄其保藏號為PTA-4797。
根據(jù)本發(fā)明的組合物的一個具體方案是一種包括嗜酸乳酸桿菌PTA-4797的細(xì)菌組合物。
根據(jù)本發(fā)明的由益生菌組成的組合物還包括至少一種植物乳酸桿菌菌株。
根據(jù)本發(fā)明所使用的植物乳酸桿菌菌株優(yōu)選是一種革蘭氏陽性菌株。有利地，它是一種過氧化氫酶陰性菌株，具有導(dǎo)致乳酸產(chǎn)生的同型發(fā)酵新陳代謝。
優(yōu)選地，其為在酸性pH條件下(在治療后40分鐘約至少95％的細(xì)菌仍舊存活)具有抗胃蛋白酶性的植物乳酸桿菌。
更特別地，根據(jù)本發(fā)明所使用的植物乳酸桿菌表現(xiàn)出良好的抗胰酶性(在治療后40分鐘至少約79％的細(xì)菌仍舊存活)。
有利地，根據(jù)本發(fā)明所使用的植物乳酸桿菌表現(xiàn)出良好的抗膽汁鹽性。
根據(jù)本發(fā)明所使用的植物乳酸桿菌能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。細(xì)胞因子誘導(dǎo)檢測通過分離的外周血液單核細(xì)胞(PBMC)的體外刺激測試的方法來進(jìn)行。在測試期間所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子中，可以涉及白細(xì)胞間介素10(IL10)、γ-干擾素(γ-IFN)和腫瘤壞死因子α(TNFα)。另一方面，使用相同的測試方法，根據(jù)本發(fā)明所使用的植物乳酸桿菌誘導(dǎo)很少或沒有白細(xì)胞間介素12(IL2)的分泌。
根據(jù)本發(fā)明所使用的植物乳酸桿菌是植物乳酸桿菌PTA-4799。該植物乳酸桿菌菌株根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，紀(jì)錄其保藏號為PTA-4799。
根據(jù)本發(fā)明的組合物的一個具體方案是一種包括植物乳酸桿菌PTA-4799的細(xì)菌組合物。
根據(jù)本發(fā)明的由益生菌組成的組合物還包括至少一種唾液乳酸桿菌菌株。
根據(jù)本發(fā)明所使用的唾液乳酸桿菌菌株是一種革蘭氏陽性菌株。有利地，它是一種過氧化氫酶陰性菌株，具有導(dǎo)致乳酸產(chǎn)生的同型發(fā)酵新陳代謝。
更特別地，根據(jù)本發(fā)明所使用的唾液乳酸桿菌表現(xiàn)出良好的抗胰酶性(在治療后40分鐘至少100％的細(xì)菌仍舊存活)。
有利地，根據(jù)本發(fā)明所使用的唾液乳酸桿菌表現(xiàn)出對膽汁鹽的良好耐受性。
根據(jù)本發(fā)明所使用的唾液乳酸桿菌能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌。細(xì)胞因子誘導(dǎo)檢測通過分離的外周血液單核細(xì)胞(PBMC)的體外刺激測試的方法來進(jìn)行。在測試期間所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子中，可以涉及白細(xì)胞間介素10(IL10)和腫瘤壞死因子α(TNFα)。另一方面，使用相同的測試方法，根據(jù)本發(fā)明所使用的唾液乳酸桿菌誘導(dǎo)很少或沒有白細(xì)胞間介素12(I112)和γ-干擾素(γ-IFN)的分泌。
根據(jù)本發(fā)明所使用的唾液乳酸桿菌是唾液乳酸桿菌PTA-4800。該唾液乳酸桿菌菌株根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，紀(jì)錄其保藏號為PTA-4800。
根據(jù)本發(fā)明的組合物的一個具體方案是一種包括唾液乳酸桿菌PTA-4800的細(xì)菌組合物。
根據(jù)本發(fā)明的由益生菌組成的組合物還包括至少一種副干酪乳酸桿菌菌株。
根據(jù)本發(fā)明所使用的副干酪乳酸桿菌優(yōu)選是一種革蘭氏陽性菌株。有利地，它是一種過氧化氫酶陰性菌株，具有導(dǎo)致乳酸產(chǎn)生的同型發(fā)酵新陳代謝。
優(yōu)選地，其為一種在酸性pH條件下(在治療后40分鐘至少約17.5％的細(xì)菌仍舊存活)具有弱抗胃蛋白酶性的副干酪乳酸桿菌。
更特別地，根據(jù)本發(fā)明所使用的副干酪乳酸桿菌表現(xiàn)出極好的抗胰酶性(在治療后40分鐘至少約100％的細(xì)菌仍舊存活)。
有利地，根據(jù)本發(fā)明所使用的副干酪乳酸桿菌表現(xiàn)出對膽汁鹽的良好耐受性。
根據(jù)本發(fā)明所使用的副干酪乳酸桿菌能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。細(xì)胞因子誘導(dǎo)檢測通過分離的外周血液單核細(xì)胞(PBMC)的體外刺激測試的方法來進(jìn)行。在測試期間所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子中，可以涉及白細(xì)胞間介素10(IL10)、γ-干擾素(γ-IFN)和腫瘤壞死因子α(TNFα)。另一方面，使用相同的測試方法，根據(jù)本發(fā)明所使用的副干酪乳酸桿菌誘導(dǎo)很少或沒有白細(xì)胞間介素12(IL2)的分泌。
根據(jù)本發(fā)明所使用的副干酪乳酸桿菌是副干酪乳酸桿菌PTA-4798。該副干酪乳酸桿菌菌株根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，紀(jì)錄其保藏號為PTA-4798。
根據(jù)本發(fā)明的組合物的一個具體方案是一種包括副干酪乳酸桿菌PTA-4798的細(xì)菌組合物。
根據(jù)本發(fā)明的由益生菌組成的組合物還包括至少一種兩歧雙歧桿菌菌株。
根據(jù)本發(fā)明所使用的兩歧雙歧桿菌菌株是一種革蘭氏陽性菌株。有利地，它是一種過氧化氫酶陰性菌株，具有導(dǎo)致乳酸和醋酸產(chǎn)生的異型發(fā)酵新陳代謝。
根據(jù)本發(fā)明所使用的兩歧雙歧桿菌能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌。細(xì)胞因子誘導(dǎo)檢測通過分離的外周血液單核細(xì)胞(PBMC)的體外刺激測試的方法來進(jìn)行。在測試期間所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子中，可以涉及白細(xì)胞間介素10(IL10)、γ-干擾素(γ-IFN)和腫瘤壞死因子α(TNFα)。另一方面，使用相同的測試方法，根據(jù)本發(fā)明所使用的兩歧雙歧桿菌誘導(dǎo)很少或沒有白細(xì)胞間介素12(IL2)的分泌。
根據(jù)本發(fā)明所使用的兩歧雙歧桿菌是兩歧雙歧桿菌PTA-4801。該兩歧雙歧桿菌菌株根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，紀(jì)錄其保藏號為ATCC PTA-4801。
根據(jù)本發(fā)明的組合物的一個具體方案是一種包括兩歧雙歧桿菌PTA-4801的細(xì)菌組合物。
根據(jù)本發(fā)明的由益生菌組成的組合物還包括至少一種乳酸雙歧桿菌菌株。
根據(jù)本發(fā)明所使用的乳酸雙歧桿菌菌株是一種革蘭氏陽性菌株。有利地，它是一種過氧化氫酶陰性菌株，具有導(dǎo)致乳酸和醋酸產(chǎn)生的異型發(fā)酵新陳代謝。
根據(jù)本發(fā)明所使用的乳酸雙歧桿菌能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌。細(xì)胞因子誘導(dǎo)檢測通過分離的外周血液單核細(xì)胞(PBMC)的體外刺激測試的方法來進(jìn)行。在測試期間所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子中，可以涉及白細(xì)胞間介素10(IL10)、γ-干擾素(γ-IFN)和腫瘤壞死因子α(TNFα)。另一方面，使用相同的測試方法，根據(jù)本發(fā)明所使用的乳酸雙歧桿菌可以誘導(dǎo)或沒有白細(xì)胞間介素12(IL2)的分泌。
根據(jù)本發(fā)明所使用的乳酸雙歧桿菌PTA-4802菌株或乳酸雙歧桿菌PTA-5658菌株。乳酸雙歧桿菌PTA-4802菌株根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，紀(jì)錄其保藏號為ATCC PTA-4802。
乳酸雙歧桿菌菌株P(guān)TA-5658根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，紀(jì)錄其保藏號為ATCC PTA-5658。
根據(jù)本發(fā)明的組合物的一個具體方案是一種包括乳酸雙歧桿菌PTA-4802的細(xì)菌組合物。
根據(jù)本發(fā)明的組合物的一個具體方案是一種包括乳酸雙歧桿菌PTA-5658的細(xì)菌組合物。
根據(jù)本發(fā)明的組合物的另一個具體方案是一種包括至少一種選自由嗜酸乳酸桿菌PTA-4797，植物乳酸桿菌PTA-4799，乳酸雙歧桿菌PTA-4802組成的組的菌株的組合物。
更特別的，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包括至少2個選自由嗜酸乳酸桿菌PTA-4797，植物乳酸桿菌PTA-4799，唾液乳酸桿菌PTA-4800，副干酪乳酸桿菌PTA-4798，兩歧雙歧桿菌PTA-4801，乳酸雙歧桿菌PTA-4802和乳酸雙歧桿菌PTA-5658組成的組的菌株。
更特別的，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包括至少3個選自由嗜酸乳酸桿菌PTA-4797，植物乳酸桿菌PTA-4799，唾液乳酸桿菌PTA-4800，副干酪乳酸桿菌PTA-4798，兩歧雙歧桿菌PTA-4801，乳酸雙歧桿菌PTA-4802和乳酸雙歧桿菌PTA-5658組成的組的菌株。
更特別的，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包括一種唾液乳酸桿菌PTA-4800與選自兩歧雙歧桿菌PTA-4801，乳酸雙歧桿菌PTA-4802和乳酸雙歧桿菌PTA-5658的雙歧桿菌屬的菌株的混合物。
更特別的，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以優(yōu)選包括嗜酸乳酸桿菌PTA-4797與選自兩歧雙歧桿菌PTA-4801，乳酸雙歧桿菌PTA-4802和乳酸雙歧桿菌PTA-5658的雙歧桿菌屬的菌株的混合物。
更特別的，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以優(yōu)選包括植物乳酸桿菌PTA-4799與選自兩歧雙歧桿菌PTA-4801，乳酸雙歧桿菌PTA-4802和乳酸雙歧桿菌PTA-5658的雙歧桿菌屬的菌株的混合物。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包括嗜酸乳酸桿菌PTA-4797，植物乳酸桿菌PTA-4799，唾液乳酸桿菌PTA-4800，副干酪乳酸桿菌PTA-4798，兩歧雙歧桿菌PTA-4801，乳酸雙歧桿菌PTA-4802和乳酸雙歧桿菌PTA-5658的混合物。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以在凍結(jié)之前或之后以細(xì)菌懸浮液的形式使用，或者以凍干粉的形式使用。事實(shí)上，不管所使用的形式，該組合物均可以被凍結(jié)。
組合物中每個細(xì)菌的相對比例可以在很大的限制范圍變化例如從99/1至1/99，在這種情況下至少有2個菌株。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包括106至1011CFU細(xì)菌/g組合物，且更特別的是從108至1011CFU細(xì)菌/g組合物。術(shù)語“CFU”是指“集落形成單位”。表達(dá)克組合物理解為是指食品或藥學(xué)制劑，且如果在凍干形式中優(yōu)選109至1011CFU/g。
根據(jù)本發(fā)明的組合物用于治療，主要是預(yù)防或復(fù)發(fā)，而且還用于預(yù)防和/或減少炎性腸疾病。
根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌組合物還用于保持免疫系統(tǒng)的動態(tài)平衡。
根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌組合物還用于預(yù)防和/或減少變應(yīng)原性。
根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌組合物還用作免疫輔助劑。
本發(fā)明其它一個主題也是一種免疫調(diào)節(jié)方法，其包括使用至少一種選自由嗜酸乳酸桿菌PTA-4797，植物乳酸桿菌PTA-4799，唾液乳酸桿菌PTA-4800，副干酪乳酸桿菌PTA-4798，兩歧雙歧桿菌PTA-4801，乳酸雙歧桿菌PTA-4802和乳酸雙歧桿菌PTA-5658組成的組的菌株的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以以食品或藥物制劑的形式。
表達(dá)藥物制劑理解為是指例如以膠囊或片劑形式的制劑。
本發(fā)明的主題也是一種包括上述細(xì)菌組合物的食物、飲食添加劑或藥物組合物。
優(yōu)選地，包括根據(jù)本發(fā)明組合物的食物組合物是一種食品添加劑、飲料產(chǎn)品或乳制基礎(chǔ)粉末。
更特別地，包括根據(jù)本發(fā)明組合物的食物組合物是一種乳制品。
更優(yōu)選地，包括根據(jù)本發(fā)明組合物的食物組合物是一種嬰兒乳粉。
根據(jù)本發(fā)明組合物的食品或藥物組合物能夠具有免疫調(diào)節(jié)性能。
本發(fā)明的另一個主題也是該組合物在胃腸系統(tǒng)中以治療或預(yù)防為目的制備向人類或向動物給藥的載體中的用途。
本發(fā)明還提供包括上述細(xì)菌組合物的藥物組合物用于預(yù)防炎性腸疾病。
本發(fā)明還提供包括上述細(xì)菌組合物的藥物組合物用于免疫調(diào)節(jié)。


附圖1、3和5為注射時間表。
附圖2、4、6、7和8為Wallace和Ameho記分，以及重量損失。
現(xiàn)在將描述具體的但并不能作為限制的本發(fā)明的實(shí)施例。
具體實(shí)施例方式
1/PBMC測試外周血液單核細(xì)胞(PBMC)通過得自公知給體的人類血液的離心分離而制備得到并且進(jìn)一步在Ficoll梯度上進(jìn)行純化。采集細(xì)胞、洗滌、(除去紅細(xì)胞)并計(jì)數(shù)。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)條件制備細(xì)菌并根據(jù)適當(dāng)?shù)南♂屢?10-7、10-8、10-9在林格氏溶液中)通過涂敷在瓊脂糖介質(zhì)上來計(jì)數(shù)。
將細(xì)胞洗滌3次并懸浮在PBS緩沖溶液中。
在CO2的合適條件下，將PBMC細(xì)胞用細(xì)菌(用磷酸鹽溶液(PBS)進(jìn)行負(fù)對照)刺激48小時。然后將含有細(xì)胞因子的上清液在-20℃下凍結(jié)。
細(xì)胞因子表達(dá)水平通過ELISA測試(《與酶有關(guān)的免疫吸附劑檢驗(yàn)(Enzyme linked immuno sorbent assay)》)來確定。ELISA平板涂覆有抗細(xì)胞因子抗體(過夜步驟)并且該抗體用表面活性劑例如吐溫80來阻滯。
制備了細(xì)胞因子公知濃度的合適標(biāo)準(zhǔn)，其將覆蓋15，62至2000pg/ml的檢測范圍(培養(yǎng)過夜)?？辜?xì)胞因子檢測和鑒定用鏈酶抗生素蛋白在培養(yǎng)基(10mg dABTS/10ml的檸檬酸緩沖溶液，0.1M，pH 4，35/20μl H2O2)上反應(yīng)來進(jìn)行。
細(xì)胞因子是炎癥前的(Th1、TNFα、IFNγ、IL12)或抗炎的(IL10)。

其中的值為pg/ml。
2/由嗜酸乳酸桿菌PTA-4797，植物乳酸桿菌PTA-4799，唾液乳酸桿菌PTA-4800，兩歧雙歧桿菌PTA-4801，乳酸雙歧桿菌PTA-5658或乳酸雙歧桿菌PTA-4802組成的不同組合物的制備
2-1/制備了含有嗜酸乳酸桿菌PTA-4797，植物乳酸桿菌PTA-4799，乳酸雙歧桿菌PTA-4802這3種菌株的混合物。該混合物命名為LAB。
為了顯示根據(jù)本發(fā)明的該混合物的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)能力，進(jìn)行了目的在于減少老鼠的化學(xué)誘導(dǎo)腸炎的動物測試。建立了幾個模型來模擬人類炎性腸疾病。
在第一個模型中，在0、7和14天注射1mg/老鼠的TNBS (三硝基苯磺酸，其為結(jié)腸炎誘導(dǎo)劑)，并且在20天注射2mg/老鼠的TNBS(兩倍劑量)來引起慢性結(jié)腸炎。注射時間表繪制在附圖1中。在-4至-1、6、9、13和19天細(xì)菌(LAB)的攝入將顯示出宏觀和組織效果，其記分在22天上，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)記分(分別為Wallace和Ameho)。
得到的結(jié)果(見附圖2)清楚地顯示了結(jié)腸炎癥狀的改善，其證據(jù)為—減少粘膜的增加—減輕炎癥—重量損失2-2/還使用了慢性結(jié)腸炎的第二個模型(基于Camoglio等人，Eur.JImmunol 2000)，在0、7和14天通過直腸內(nèi)途徑注射2mg/老鼠的TNBS來誘導(dǎo)嚴(yán)重的慢性結(jié)腸炎。注射時間表繪制在附圖3中。在-5至-1天、在5和12天(附圖3)細(xì)菌(如上在2-1中所述(LAB))的攝入顯示出宏觀和組織效果，其記分在16天上，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)記分(分別為Wallace和Ameho)(附圖4)。
得到的結(jié)果清楚地顯示了結(jié)腸炎癥狀的改善，其證據(jù)(見附圖4)為—沒有壞死損傷—減少粘膜的增加—減輕炎癥2-3/還建立了老鼠結(jié)腸炎的第三個急性模型。在0天注射100mg/kg老鼠的TNBS。這將引起急性結(jié)腸炎，注射時間表繪制在附圖5中。在-5至0天單獨(dú)細(xì)菌或菌株混合物(108細(xì)菌/老鼠)的攝入顯示出宏觀和組織效果，其記分在2天上(附圖6、7和8)。
附圖6顯示了當(dāng)給老鼠注射乳酸雙歧桿菌PTA-4802或植物乳酸桿菌PTA-4799的單個明顯宏觀改善的菌株時所得到的Wallace記分。
附圖7顯示了當(dāng)給老鼠注射唾液乳酸桿菌PTA-4800(A)，兩歧雙歧桿菌PTA-4801(B)，乳酸雙歧桿菌PTA-4802(C)或乳酸雙歧桿菌PTA-5658(D)的單個菌株時所得到的Wallace記分。對照組(T)相應(yīng)于沒有細(xì)菌的TNBS注射。
附圖8顯示了當(dāng)給老鼠注射菌株的混合物時所得到的Wallace記分。該混合物包括如下不同的細(xì)菌菌株混合物150％嗜酸乳酸桿菌PTA-4797和50％乳酸雙歧桿菌PTA-4802；混合物250％乳酸雙歧桿菌PTA-4802和50％兩歧雙歧桿菌PTA-4801；混合物340％乳酸雙歧桿菌PTA-4802和40％兩歧雙歧桿菌PTA-4801和20％唾液乳酸桿菌PTA-4800；混合物425％乳酸雙歧桿菌PTA-4802和25％兩歧雙歧桿菌PTA-4801和16.66％唾液乳酸桿菌PTA-4800和16.66％嗜酸乳酸桿菌PTA-4797和16.66％植物乳酸桿菌PTA-4799；混合物540％乳酸雙歧桿菌PTA-4802和40％兩歧雙歧桿菌PTA-4801和6.66％唾液乳酸桿菌PTA-4800和6.66％嗜酸乳酸桿菌PTA-4797和6.66％植物乳酸桿菌PTA-4799。
其中的百分比為重量百分比。
用混合物2、3和5得到的結(jié)果與用對照組得到的結(jié)果明顯不同。
急性結(jié)腸炎癥狀的明顯宏觀改善在單獨(dú)細(xì)菌或菌株混合物(附圖6、7和8)中有所證明。
2-4/總的說來，所有在老鼠中的TNBS-誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型顯示，在誘導(dǎo)結(jié)腸炎之后，給這些老鼠服用根據(jù)本發(fā)明的菌株使得向腸系膜淋巴結(jié)和脾中的來自腸菌類的本身細(xì)菌的腸易位水平明顯減少。另外，觀察不到根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌菌株的易位。
3/抗胃蛋白酶性該測試的目的在于通過在胃蛋白酶存在下的酸性環(huán)境中測定培養(yǎng)之后細(xì)菌的存活數(shù)來評價細(xì)菌與通過胃屏障的對抗。將在-80℃凍結(jié)的100μl存貯培養(yǎng)接種在10ml的MRS(Man Rogosa Sharp)培養(yǎng)基中并且在30℃或37℃下培養(yǎng)過夜。然后將細(xì)胞在pH 7下在PBS中洗滌3次并且將球粒懸浮在1ml PBS緩沖溶液中并在4個試管中的200μl等分試樣中與添加了300μl NaCl(0.5％)的1ml過濾胃蛋白酶溶液在pH 2下培養(yǎng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)在取自在T＝0(接種時間)，T＝0+5分鐘；T＝0+20分鐘；T＝0+40分鐘；T＝0+60分鐘下培養(yǎng)的試管的100μl等分試樣上進(jìn)行并且將100μl的10-5、10-6和10-7的稀釋液涂敷在瓊脂糖上(連續(xù)的10倍稀釋液制成1ml林格氏溶液)。從稀釋系列的數(shù)據(jù)計(jì)算得到了每個培養(yǎng)時間的存活細(xì)菌百分?jǐn)?shù)。
顯示在表中的所有結(jié)果是3個重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果。

上述結(jié)果為相對于T＝0的存活％。
4/抗胰酶性該測試的目的在于通過在胰酶存在下的酸性環(huán)境中測定培養(yǎng)之后細(xì)菌的存活數(shù)來評價細(xì)菌與通過腸道的對抗。將在-80℃凍結(jié)的100μl存貯培養(yǎng)接種在10ml的MRS(Man Rogosa Sharp)培養(yǎng)基中并且在30℃或37℃下培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞在pH 7下在PBS中洗滌3次并且將球粒懸浮在1ml PBS緩沖溶液中并在4個試管中的200μl等分試樣中與添加了300μl NaCl(0.5％)的1ml過濾胰酶溶液在pH 8下培養(yǎng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)在取自在T＝0(接種時間)，T＝0+5分鐘；T＝0+20分鐘；T＝0+40分鐘；T＝0+60；T＝0+120分鐘下培養(yǎng)的試管的100μl等分試樣上進(jìn)行并且將100μl的10-5、10-5和10-7的稀釋液涂敷在MRS上(連續(xù)的10倍稀釋液制成1ml林格氏溶液)。從稀釋系列的數(shù)據(jù)計(jì)算得到了每個培養(yǎng)時間的存活細(xì)菌百分?jǐn)?shù)。顯示在表中的所有結(jié)果是3個重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果。

上述結(jié)果為相對于T＝0的存活％。
5/抗膽汁鹽性該試驗(yàn)過程如下。將在-80℃凍結(jié)的100μl存貯培養(yǎng)接種在10ml的MRS(Man Rogosa Sharp)培養(yǎng)基中并且在30℃或37℃下培養(yǎng)過夜。測量其光密度(OD)并在兩個瓶子中制備稀釋液(OD＝0.05至0.1)。其中一個培養(yǎng)瓶添加0.3％的膽汁鹽溶液(750μl過濾的12％溶液)并且在適當(dāng)?shù)臏囟认屡囵B(yǎng)。對OD進(jìn)行規(guī)則的測量直到?jīng)]有膽汁堿的對照瓶中的OD達(dá)到0.3。在那個點(diǎn)測試添加瓶的OD并且開始測量需要得到OD同為0.3的時間。因此該菌株的對抗以時間增長的延遲來進(jìn)行評價。
將結(jié)果編碼為敏感性的(0多于60分鐘)、耐受性的(115和60分鐘之間)或?qū)剐缘?2少于15分鐘)。
顯示在表中的所有結(jié)果是3個重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果。


6/有機(jī)溶劑的疏水性和親和力使用Rosdenberg等人1980(FEMS Microbiol.Letters 929-33)描述的MATS測試。簡而言之，該測試測量(在標(biāo)準(zhǔn)體外培養(yǎng)條件下培養(yǎng)過夜并在PBS中洗滌2次)細(xì)菌細(xì)胞壁的疏水性和極性，基于細(xì)菌向兩個非混合液體水相和分別5個溶劑的重新分配(通過光密度來測量)。培養(yǎng)基是MRS(Man Rogosa Sharp)且水相是為PBS的緩沖溶液。溶劑為癸烷、十六烷、乙酸乙酯、氯仿和二甲苯。
對于氯仿的親和力，酸溶劑，反映了細(xì)菌的電子給體特性(堿反應(yīng))。
對于乙酸乙酯的親和力，堿溶劑，反映了細(xì)菌的電子受體特性(酸反應(yīng))。
對于非極性溶劑(癸烷、十六烷、二甲苯)的親和力反映了細(xì)菌的疏水特征。
高疏水性可能與細(xì)胞壁表面上糖蛋白的存在有關(guān)，而低疏水性可能與細(xì)胞壁表面上多糖的存在有關(guān)。
％D’疏水性＝(1-A/AO)×100，其中-AO在540nm下的初始OD(在PBS中或多或少設(shè)置OD＝0.6)-A在渦流和穩(wěn)定化過程之后水相(1ml)的光密度

權(quán)利要求
1.一種具有免疫調(diào)節(jié)性能的細(xì)菌組合物，其包括至少一種選自由嗜酸乳酸桿菌PTA-4797，植物乳酸桿菌PTA-4799，唾液乳酸桿菌PTA-4800，副干酪乳酸桿菌PTA-4798，兩歧雙歧桿菌PTA-4801，乳酸雙歧桿菌PTA-4802和乳酸雙歧桿菌PTA-5658組成的組的菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌組合物，其中的菌株選自由嗜酸乳酸桿菌PTA-4797，植物乳酸桿菌PTA-4799和乳酸雙歧桿菌PTA-4802組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌組合物，其中的菌株是嗜酸乳酸桿菌PTA-4797。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌組合物，其中的菌株是植物乳酸桿菌PTA-4799。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌組合物，其中的菌株是乳酸雙歧桿菌PTA-4802或乳酸雙歧桿菌PTA-5658。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌組合物，其包括至少2個選自由嗜酸乳酸桿菌PTA-4797，植物乳酸桿菌PTA-4799，唾液乳酸桿菌PTA-4800，副干酪乳酸桿菌PTA-4798，兩歧雙歧桿菌PTA-4801，乳酸雙歧桿菌PTA-4802和乳酸雙歧桿菌PTA-5658組成的組的菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌組合物，其包括至少3個選自由嗜酸乳酸桿菌PTA-4797，植物乳酸桿菌PTA-4799，唾液乳酸桿菌PTA-4800，副干酪乳酸桿菌PTA-4798，兩歧雙歧桿菌PTA-4801，乳酸雙歧桿菌PTA-4802和乳酸雙歧桿菌PTA-5658組成的組的菌株。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌組合物，其包括一種嗜酸乳酸桿菌PTA-4797，植物乳酸桿菌PTA-4799，唾液乳酸桿菌PTA-4800，副干酪乳酸桿菌PTA-4798，兩歧雙歧桿菌PTA-4801，乳酸雙歧桿菌PTA-4802和乳酸雙歧桿菌PTA-5658的混合物。
9.根據(jù)前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)菌組合物，其特征在于其包括106至1011CFU細(xì)菌/g組合物。
10.根據(jù)前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)菌組合物，其特征在于其包括108至1011CFU細(xì)菌/g組合物。
11.根據(jù)前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)菌組合物，其特征在于該組合物用于預(yù)防和/或減輕炎性腸疾病。
12.根據(jù)前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)菌組合物，其特征在于該組合物用于保持免疫系統(tǒng)的動態(tài)平衡。
13.根據(jù)前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)菌組合物，其特征在于該組合物用于預(yù)防和/或減少變應(yīng)原性。
14.根據(jù)前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)菌組合物，其特征在于該組合物用作免疫輔助劑。
15.一種向一介質(zhì)中提供免疫調(diào)節(jié)性能的方法，其特征在于至少一種選自由嗜酸乳酸桿菌PTA-4797，植物乳酸桿菌PTA-4799，唾液乳酸桿菌PTA-4800，副干酪乳酸桿菌PTA-4798，兩歧雙歧桿菌PTA-4801，乳酸雙歧桿菌PTA-4802和乳酸雙歧桿菌PTA-5658組成的組的菌株。
16.包括根據(jù)權(quán)利要求1至14之一的組合物的食物、飲食添加劑或藥物組合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，其特征在于它是一種乳制品。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的組合物，其特征在于它是一種嬰兒乳粉。
19.根據(jù)權(quán)利要求16至18的組合物，其中該組合物具有免疫調(diào)節(jié)性能。
20.包括根據(jù)權(quán)利要求1至14組合物的藥物組合物用于預(yù)防炎性腸疾病。
21.包括根據(jù)權(quán)利要求1至14組合物的藥物組合物用于免疫調(diào)節(jié)。
全文摘要
本發(fā)明的主題是一種具有免疫調(diào)節(jié)性能的細(xì)菌組合物，其包括至少一種選自由嗜酸乳酸桿菌PTA－4797，植物乳酸桿菌PTA－4799，唾液乳酸桿菌PTA－4800，副干酪乳酸桿菌PTA－4798，兩歧雙歧桿菌PTA－4801，乳酸雙歧桿菌PTA－4802和乳酸雙歧桿菌PTA－5658組成的組的菌株。本發(fā)明另一主題是一種免疫調(diào)節(jié)方法，其包括使用至少一種選自上述組的菌株的步驟。
文檔編號A23L1/30GK1795027SQ200380105128
公開日2006年6月28日 申請日期2003年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月5日
發(fā)明者格雷戈里·萊耶, 韋羅尼克·丹寧, 索菲·尼特, 布律諾·波, 安尼科·梅森納爾 申請人:達(dá)尼斯科(法國)公司