專利名稱：Sars冠狀病毒核衣殼蛋白單克隆抗體、產生該抗體的雜交瘤和含此抗體的檢測試劑及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及以雜交瘤技術生產的單克隆抗體，特別是涉及產生SARS冠狀病毒核衣殼(N)蛋白的特異性單克隆抗體，產生該抗體的雜交瘤及此單抗在診斷SARS中的應用。
背景技術：
傳染性非典型肺炎，又稱嚴重急性呼吸道綜合癥(Severe AcuteRespiratory Syndrome，SARS)，是一種新出現(xiàn)的傳染病。SARS的致病原已于2003年4月10日，由世界衛(wèi)生組織確定為一種新的冠狀病毒，命名為SARS-CoV。自2002年11月首先在我國廣東地區(qū)發(fā)生后，已在30多個國家和地區(qū)傳播流行，該病的死亡率為6.4～16.5％。根據(jù)現(xiàn)有資料，該病主要通過呼吸道飛沫、體液及污物等方式近距離轉播，有家庭聚集性和醫(yī)院聚集性的特點。其主要的臨床特征為起病急，發(fā)燒、咳嗽、肺部陰影、外周血白細胞不升高或者降低。盡管在病原體的發(fā)現(xiàn)取得了很大進展，但在病原生物學特性，發(fā)病機制，早期有效的診斷試劑、特異性治療等方面的研究尚未獲得突破性的進展，尚有一系列的問題需要解決。尤其是SARS早期診斷是困擾臨床醫(yī)生對該病及早發(fā)現(xiàn)、隔離及防治等一系列困難，因為同一種病毒感染不同個體可表現(xiàn)出不同的臨床特征，而不同的病毒感染又會出現(xiàn)相同的臨床特征，所以，僅靠臨床癥狀和流行病學資料很難確定病毒感染真正病原，最終的確診往往需要實驗室的診斷，目前尚未有成熟的客觀實驗室診斷標準。由于大多數(shù)病毒性疾病尚沒有特效治療藥物，實驗室診斷已成為控制病毒性疾病流行和蔓延的重要手段。當務之急是盡快研究有效的診斷試劑，早診斷、早隔離、切斷傳播途徑，控制疫情蔓延。
對于SARS冠狀病毒感染的實驗室診斷，目前主要包括以下幾種方法以PCR和基因芯片技術為基礎的分子診斷；以抗體監(jiān)測為基礎的血清學診斷；以體外病毒培養(yǎng)為基礎的病原生物學診斷。
目前，對SARS冠狀病毒感染的實驗室早期診斷主要是以PCR為基礎的病毒核酸測定。現(xiàn)有的實驗數(shù)據(jù)顯示在發(fā)病14天左右病毒核酸的敏感性大約為70％，由于病毒RNA容易降解，檢測結果易受樣品收集和處理的影響，而且樣品污染可以造成假陽性，因此，需要嚴格的質量控制和經培訓的技術人員熟練操作。另外需要專門的檢測儀器并且價格昂貴，鑒于以上這些因素，有很多醫(yī)院尚不能開展。
以抗體監(jiān)測為基礎的免疫學診斷，根據(jù)已知抗原檢測抗體的存在是否，進一步推測病原體是否存在。不同類型的抗體產生的時間和水平變化的動態(tài)過程不同，在疾病的早期檢查不出抗體，IgM要在感染后的10天左右才檢測出，而I gG要在感染后的21天左右才可靠地檢測出來。目前所采用的方法有兩種酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbant assay，ELISA)和免疫熒光法(immunofluroescence assay，IFA)。ELISA所檢測的是受試者血清中的IgM和IgG抗體。IFA通常用于檢測IgM，但也可用于檢測IgG，此法需要把SARS-CoV固定在玻片上，然后經熒光分子標記的第二抗體處理后，再用熒光顯微鏡觀察。陽性結果表示先前有過SARS-CoV感染，血清抗體由陰性轉為陽性以及從急性期到恢復期抗體滴度增加4倍以上表示感染是在近期發(fā)生的。發(fā)病后21天都檢測不出抗體表示沒有SARS-CoV感染。由于特異性抗體在發(fā)病7～10開始出現(xiàn)，因此，抗體血清學檢測不能用于SARS的早期診斷。
以體外病毒培養(yǎng)為基礎的病原生物學診斷，從患者標本中分離到SARS-CoV是實驗室診斷的“金標準”，但由于試驗條件等的限制，一般不作為常規(guī)的方法。而且技術難度高，操作復雜，所需時間長，對設備要求高，不適于臨床醫(yī)院使用。
以特異性抗體為基礎的病原學診斷，是對SARS實驗室早期診斷的方法，是用已知的特異性抗體檢測樣品中病毒抗原。目前尚未有商品化SARS冠狀病毒抗原診斷試劑盒。用特異性抗體建立病毒抗原診斷試劑盒的技術難度是需要特異性很高單克隆抗體或多克隆抗體，成熟雜交瘤技術在多種疾病的免疫學診斷中已起到了巨大的作用，由于單克隆抗體具有高度特異的免疫學性質，可以構建高敏感特異的抗原檢測試劑，這已被以往多種病毒抗原檢測試劑所證實，具有特異性強、重復性好、易操作及成本低等優(yōu)點。
通過對SARS-CoV基因組結構的分析，SARS-CoV基因編碼結構蛋白由釘子糖蛋白(spike glycoprotein，S)、包膜小蛋白(small envelope，E)、膜蛋白(membrane，M)和核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)組成。盡管對這些結構蛋白的功能目前尚不清楚，但從動物冠狀病毒感染的細胞中發(fā)現(xiàn)，由于病毒包膜上的蛋白很容易發(fā)生變異，而核衣殼蛋白卻相對穩(wěn)定，其抗原性比其他結構蛋白強，而且是病毒主要的抗原部分。為此，本發(fā)明提供一組產生能與SARS-CoV N蛋白特異性結合的新的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。并發(fā)展相關的快速診斷試劑盒，用于早期診斷SARS感染提供一種快速、敏感性高、特異性強的方法，同時為SARS-CoV生物學性狀、蛋白組學及發(fā)病機制的研究奠定基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一個目的是提供一組可特異性結合SARS-CoV N蛋白的單克隆抗體；本發(fā)明的第二個目的是提供可產生該組單克隆抗體的雜交瘤；本發(fā)明的第三個目的是提供該組單克隆抗體所組成檢測SARS-CoV抗原的試劑及用該試劑建立的試劑盒。
本發(fā)明的第四個目的是提供該組單克隆抗體用于檢測SARS-CoV抗原試劑中的應用。
為了達到上述的目的，本發(fā)明是通過以下的技術方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明提供一組單克隆抗體，其可特異性結合SARS-CoV N蛋白，并涉及以下的技術特征
1、免疫印跡方法測定表明該組單克隆抗體特異性識別SARS-CoV N蛋白抗原分子量為46千道爾頓。
2、所述單克隆抗體，是由具有保存號包括雜交瘤1E8A11CCTCC-C200401，雜交瘤8E1A17CCTCC-C200402，雜交瘤10E4A4CCTCC-C200403，雜交瘤14A3A3A19CCTCC-C200404的細胞系分泌產生。
3、所述單克隆抗體屬于免疫球蛋白類型IgG1或IgG2b。
4、免疫印跡法表明可特異性與SARS冠狀病毒裂解產物中核衣殼蛋白分子量為46千道爾頓發(fā)生反應。
5、免疫印跡法表明可特異性與基因重組的核衣殼蛋白分子量為46千道爾頓發(fā)生反應。
6、用感染SARS-CoV的Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)作為抗原涂在特定的載體上，用間接免疫熒光方法檢測表明該組單克隆抗體可特異性與被SARS-CoV感染的細胞上的SARS-CoV抗原特異性結合。
7、在免疫熒光分析法中用于識別細胞或組織中SARS冠狀病毒核殼蛋白核心抗原。
8、在免疫組化分析法中用于識別細胞或組織中SARS冠狀病毒核殼蛋白核心抗原。
9、所述的單克隆抗體對人的冠狀病毒229E和OC43的核衣殼蛋白不具有反應性；且與其他動物冠狀病毒及呼吸道病毒沒有交叉反應。因此，本發(fā)明涉及的這組單克隆抗體能用于診斷由SARS-CoV感染的疾病，從中可以區(qū)分由其他與SARS-CoV相關的人和冠狀病毒所造成的疾病。
本發(fā)明還提供了產生上述單抗的雜交瘤，是具有保藏號為CCTCC-C200401、CCTCC-C200402、CCTCC-C200403和CCTCC-C200404的雜交瘤細胞株。
本發(fā)明提供這一組雜交瘤細胞株3個雜交瘤株為免疫球蛋白G1陽性(1E8A11、8E1A17、10E4A4)，1個雜交瘤株為免疫球蛋白G2b陽性(14A3A3A19)。
上述雜交瘤細胞株的制備方法，其中包括給動物交叉免疫接種基因重組的蛋白和天然的病毒蛋白，從而獲得高效的產生特異性針對SARS-CoV N蛋白抗體的免疫脾細胞，用常規(guī)細胞融合技術，將該免疫的脾細胞與小鼠的骨髓瘤細胞融合，成功獲得產生該組單克隆抗體特異性針對SARS-CoV N蛋白的雜交瘤。通過雜交瘤細胞株在小鼠體內獲得高效價的腹水，經用辛酸—硫酸銨沉淀法純化獲得高活性的特異性針對SARS-CoV N蛋白的單克隆抗體。
具體的說本發(fā)明利用細胞融合技術的方式，制備獲得一組針對SARS-CoV N蛋白具有特異性的雜交瘤細胞株包括10E4A4、8E1A17、1E8A11及14A3A3A19。其方法為利用公認的細胞融合劑，例如聚乙二醇(PEG)，將骨髓瘤細胞株與產生抗SARS-CoV N蛋白抗體的B淋巴細胞融合，以HAT篩選雜交瘤細胞株，再利用ELISA、間接免疫熒光法及免疫印跡法分析雜交瘤培養(yǎng)上清中抗體的特異性，再挑選對SARS-CoV N蛋白具有特異性的單株雜交瘤細胞株，將這一組單株雜交瘤細胞株注入小鼠的腹腔中以產生腹水。將這組單克隆抗體純化后標記酶或熒光素在免疫學技術中可用于檢測體液或組織中SARS-CoV抗原。本發(fā)明所使用的免疫原，是用基因工程方法制備的融合N蛋白抗原和已滅活天然的病毒抗原。
本發(fā)明還提供一種在免疫酶試驗中的抗體對，其特征在于分別組合上述單克隆抗體進行捕獲的抗體和標記的抗體的配對，用1E8A11、8E1A17和10E4A4組合作為捕獲的單克隆抗體，用14A3A3A19抗體作為標記的單克隆抗體，本發(fā)明通過將每一株單克隆抗體標記后，通過交叉組合試驗確定各單克隆抗體的抗原識別位點，以及通過SARS感染者血液中的抗N蛋白抗體陽性的血清對單克隆抗體的阻斷抑制分析，并從中篩選獲得捕獲及檢測抗體最佳抗體對用于試劑盒的構建。
此外本發(fā)明涉及通過上述一組對SARS-CoV N蛋白具有特異性反應的單克隆抗體可以被標記，即在單克隆抗體上結合一種標記試劑，如酶包括過氧化物酶、堿性磷酸酶等，膠體金及熒光素等，用這些標記試劑可單獨或相互結合，或與多克隆抗體結合在免疫學技術(各種酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫熒光、免疫化學發(fā)光等等)作為診斷SARS-CoV感染疾病的試劑。
因此本發(fā)明還提供一種SARS冠狀病毒核衣殼蛋白抗原檢測試劑，其特征在于包括上述的可被標記的單克隆抗體。
本發(fā)明也涉及一種SARS冠狀病毒核衣殼蛋白抗原檢測試劑盒，其特征在于包括上述的試劑。
本發(fā)明涉及通過上述描述可提供一種定性或定量檢測咽試子、漱口液、糞便、痰液及血清、血漿或其他體液、生物液中的SARS-CoV N蛋白的酶免疫方法，該測定方法是將一組針對SARS-CoV N蛋白不同抗原位點的單克隆抗體固相在微孔板上，配合一種酶標記的單克隆抗體或多克隆抗體，通過抗體夾心法原理，測定樣品中的SARS-CoV抗原，采用該測定方法測定SARS-CoV N蛋白含量靈敏性為10-50pg/ml，病毒的滴度測定靈敏性小于1.3×102PFU/ml。通過對靈敏性測定，該測定方法靈敏性能檢測到樣品中微量的病毒抗原。
本發(fā)明的單克隆抗體也可單獨或相互結合，或與多克隆抗體結合在免疫學技術(各種酶聯(lián)免疫吸附試驗、化學發(fā)光免疫分析等等)中用于檢測SARS-CoV抗原。
本發(fā)明的單克隆抗體在免疫學技術中可用于從天然或重組來源的材料中親和純化和分離出SARS-CoV N蛋白抗原，經純化的N蛋白可用于血清學診斷和蛋白質功能的研究。
本發(fā)明所提供的雜交瘤細胞株、抗SARS-CoV N蛋白抗原的單克隆抗體，除了可應用于上述的檢測試劑盒外，也可應用在其他相關的免疫學領域中，例如，快速免疫層析法(one-step strip)、免疫印跡法(Western blot)、免疫沉淀、免疫熒光染色、免疫組組織化學染色、原位標定(in situ labeling)等，都是在本發(fā)明的范疇之內。
所述本發(fā)明的有益效果在于所制備的特異性針對SARS-CoV N蛋白抗原的單克隆抗體，包括該抗體的試劑及以此試劑建立的檢測試劑盒，可簡易、方便、快速且準確檢測SARS-CoV抗原，與目前用于早期診斷病毒核酸檢測方法相比具有特異性強、重復性好、易操作、成本低、適合基層單位使用等優(yōu)點。
單克隆抗體的研制成功對研究SARS-CoV感染的早期診斷、疫源動物的篩查以及SARS-CoV蛋白組學的研究具有非常重要的科學價值，還可以用于SARS發(fā)病機制、SARS-CoV生物學活性。
由本發(fā)明涉及的雜交瘤已于2004年1月19日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國，武漢市)，保藏號分別為雜交瘤1E8A11CCTCC-C200401，雜交瘤8E1A17CCTCC-C200402，雜交瘤10E4A4CCTCC-C200403，雜交瘤14A3A3A19CCTCC-C200404。


圖1為免疫印跡結果，顯示本發(fā)明雜交瘤細胞培養(yǎng)上清特異性結合基因重組SARS-CoV N蛋白。
圖2為免疫印跡結果，顯示本發(fā)明雜交瘤細胞培養(yǎng)上清特異性結合全SARS-CoV病毒中的N蛋白。
圖3間接免疫熒光染色結果，顯示本發(fā)明雜交瘤細胞培養(yǎng)上清特異性結合被SARS-CoV感染Vero E6細胞上的病毒抗原。
圖4為顯示本發(fā)明的單克隆抗體建立的雙單克隆抗體夾心ELISA法檢測試劑盒檢測N蛋白的標準曲線。采用該測定方法測定SARS-CoV N蛋白含量靈敏性為10-50pg/ml。
圖5為顯示本發(fā)明的單克隆抗體建立的雙單克隆抗體夾心ELISA法檢測試劑盒檢測細胞培養(yǎng)中的SARS-CoV的N抗原。病毒的滴度測定靈敏性小于1.3×102PFU/ml。
圖6為顯示本發(fā)明的單克隆抗體檢測SARS病人肺組織中SARS-CoV抗原肺單核巨噬細胞病毒包涵體SARS-CoV染色陽性。
圖7為顯示本發(fā)明的單克隆抗體檢測SARS病人肺組織中SARS-CoV抗原支氣管-漿液腺上皮細胞SARS-CoV染色陽性。
圖8為顯示本發(fā)明的單克隆抗體建立的雙單克隆抗體夾心ELISA法檢測試劑盒檢測SARS病人血清中的SARS-CoV的N抗原。大于臨界線為測定陽性的樣品。
具體實施例方式
下面結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但這些實施例僅是作為舉例說明，并非用以限定本發(fā)明的范圍。
實施例1SARS-CoV核衣殼蛋白(以下簡稱N蛋白)單克隆抗體的制備方法。
1、免疫抗原的制備本發(fā)明用于制備單克隆抗體的免疫原為基因重組SARS-CoV N蛋白和已滅活天然的病毒抗原，基因重組SARS-CoV N蛋是用攜帶SARS-CoV N蛋白基因的工程菌株為一種大腸桿菌菌株進行制備的。經測序證實菌種攜帶的SARS冠狀病毒核殼基因序列與PUBMED公布SARS冠狀病毒HKU-39849株(或其他株)核殼基因序列一致。重組SARS-CoV N蛋白制備按常規(guī)方法進行，經用鎳-次氮基三醋酸金屬親和層析的方法進行純化獲得N融合蛋白抗原，詳細地制備方法可參照使用手冊。將N融合蛋白純化后，以考馬斯亮藍(Coomassie)蛋白分析試劑(PIERC，Cat，No.ED62976)定量。已滅活天然的病毒抗原，是從SARS-CoV感染的病毒宿主細胞(Vero，一種猴胚腎細胞)獲得。
2、免疫小鼠取6周齡BALB/c小鼠，采用RIBI佐劑(MPL+TDM Adjuvant System，SigmaM6536)與等體積抗原混勻乳化，第一次于小鼠腹腔注射免疫，21天后于頸背部皮下及雙后足墊部免疫，12天后再次于腹腔及雙后足墊部注射加強免疫，每次抗原注射量均為每只小鼠50微克的抗原，共免疫10只小鼠。
3、免疫血清效價測定建立間接ELISA法測定免疫血清效價。配制1微克/毫升重組N蛋白的50mM pH9.6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，0.1毫升/孔，4℃過夜。次日，含1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)的封閉液0.3毫升/孔4℃過夜，次日再用10mM磷酸鹽緩沖液含10％蔗糖處理包被板條，真空干燥2～12小時，用鋁膜袋真空包裝4℃保存，用于鼠免疫血清效價測定。于第三次免疫后10天眼眶采血，鼠免疫血清用含1％BSA10mM PBS以103～106倍稀釋，加入96孔板，0.1毫升/孔37℃30分鐘，10mM PBS含0.1％ Tween-20洗滌液洗板五次后，加入1∶2000倍稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG(美國ZYMEDLABORATORIES，INC.)，0.1毫升/孔37℃30分鐘，同上洗板后，加入含有0.05％(W/V)TMB和0.06％(W/V)雙氧pH5.0檸檬酸緩沖液，0.1毫升/孔，室溫避光10分鐘，加0.1毫升/孔2M H2SO2終止反應，測450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作為陰性對照，以測定值與對照值得比≥2.1為陽性來判斷免疫血清的效價。
4、雜交瘤制備選擇血清抗體效價達1×106的小鼠，于融合前3天尾靜脈注射10微克抗原。無菌取小鼠脾臟，制成脾細胞懸液與對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞株NS-1按10∶1的比例混合，用50％聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma目錄號，批號)作用下進行融合。按下述步驟將聚乙二醇溶液加入細胞。在37℃下，在第1分半鐘內加入1.5毫升50％聚乙二醇溶液；在第2分鐘內，加入1.5毫升無血清RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO)，在第3分鐘，加入3毫升無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，在第4分鐘里再加入8毫升上述溶液。在第5和第6分鐘里再加入10毫升上相同的溶液。此混合液用離心機以每分鐘800轉的速度離心5分鐘，吸出離心管中的上清，再用50到60毫升含15％胎牛血清的培養(yǎng)基輕輕懸起細胞。將此細胞懸液加入6塊96孔培養(yǎng)板上，在二氧化碳培養(yǎng)箱中溫度為37℃、二氧化碳含量為5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中。一天以后，于每孔加入100微升含次黃嘌呤、氨基喋呤-胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT，Sigma)篩選培養(yǎng)基。。以后每3天用此篩選培養(yǎng)基給培養(yǎng)物換液一次，直到克隆細胞形成。
實施例2篩選分泌SARS-CoV核殼蛋白單克隆抗體的雜交瘤為檢測產生抗體克隆的存在，用實施例1測免疫血清效價的方法即間接ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清，簡述如下將雜交瘤培養(yǎng)上清加入包被好的孔中，0.1毫升/孔37℃30分鐘，洗滌液洗板五次后，加入1∶2000倍稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG(美國ZYMED LABORATORIES，INC.)，0.1毫升/孔37℃30分鐘，同上洗板后，加入底物TMB，0.1毫升/孔，室溫避光10分鐘，加0.1毫升/孔2M H2SO2終止反應，測450nm吸收值。選擇強陽性克隆雜交瘤細胞進行了正式的克隆化，用有限稀釋法連續(xù)克隆化2～3次，共獲得4株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株。分別命名為8E1A17、1E8A11、10E4A4及14A3A3A19。將克隆化后陽性率達100％的細胞擴增培養(yǎng)后液氮凍存。
實施例3SARS-CoV核殼蛋白單克隆抗體亞類檢測用實施例1中描述的間接ELISA法檢測在本實施例中獲得的4個克隆以確定其產生的抗體亞類。將雜交瘤培養(yǎng)上清加入包被好的孔中，0.1毫升/孔37℃30分鐘，洗滌液洗板五次后，加入1∶1000倍稀釋辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠不同亞類特異性免疫球蛋白這些抗體包括兔抗小鼠IgG1(美國ZYMED LABORATORIES，INC，目錄號61-0120)，兔抗小鼠IgG2a(同上，目錄號61-0220)，兔抗小鼠IgG2b(同上，目錄號61-0320)，兔抗小鼠IgG3(同上，目錄號61-0420)，兔抗小鼠IgM(同上，目錄號61-6820)，0.1毫升/孔37℃30分鐘，同上洗板后，加入底物TMB，0.1毫升/孔，室溫避光10分鐘，加0.1毫升/孔2M H2SO2終止反應，測450nm吸收值。檢測結果1E8A11、8E1A17、10E4A4個雜交瘤細胞株為免疫球蛋白G1陽性，14A3A3A19 1個雜交瘤為IgG2b陽性。
實施例4抗SARS-CoV核殼蛋白單克隆抗體腹水的制備和純化及活性測定采用體內誘生法制備本發(fā)明中單克隆抗體，即在小鼠體內接種雜交瘤細胞，制備腹水，用25或27號標準針頭向每只小鼠腹腔內注射0.5毫升降植烷(2，6，10，10-四甲基十五烷，獲自Aldrich化學品公司)。降植烷的處理使瘤細胞能以腹水瘤形式在腹腔內生長。大約1～2周后，106個左右懸浮于無血清RPMI1460培養(yǎng)基的雜交瘤細胞注入用降植烷處理的小鼠腹腔。每個克隆都按上述程序注射入小鼠腹腔。注射雜交瘤細胞大約1～2周后，用16號針頭放腹水，可反復收集數(shù)次。腹水經離心澄清后凍存。腹水效價測定采用實施例1所描述間接ELISA法測定免疫血清效價的方法進行，腹水作倍比稀釋。結果本發(fā)明的4株單克隆抗體的腹水效價見表1。
表1抗SARS-CoV N蛋白單克隆抗體的免疫學特性

腹水抗體的純化采用辛酸-硫酸銨沉淀法，腹水用60mmol/毫升、pH5.0醋酸緩沖液稀釋2倍，用0.1N鹽酸調pH值至4.8，液體由清亮變混濁，室溫下邊攪拌邊逐滴緩慢30分鐘內加入辛酸，為每毫升稀釋前腹水加33微升辛酸，出現(xiàn)大量沉淀，4℃靜置2小時，10000g，4℃離心30分鐘，取上清，加入1/10體積的pH7.4 10mmol/毫升磷酸鹽緩沖液，并用0.1N氫氧化鈉調pH值至7.4，冰浴攪拌下緩慢加入0.277克/毫升硫酸銨，即為45％飽和度，或者直接加入PH值7.4飽和硫酸銨達終濃度45％，4℃靜置過夜，10000g，4℃離心30分鐘，棄上清，沉淀溶于適量10mmol/毫升磷酸鹽緩沖液，用同樣的液體，4℃透析過夜，換液三次。以考馬斯亮藍(Coomassie)蛋白分析試劑(PIERC，Cat，No.ED62976)定量。測定蛋白濃度后-80℃保存。單克隆抗體活性測定采用實施例1所描述間接ELISA法測定免疫血清效價的方法進行，純化的抗體作倍比稀釋至0.1微微克/ml，結果本發(fā)明的4株單克隆抗體的活性見表1。
實施例5單克隆抗體親和常數(shù)測定抗體親和常數(shù)測定選用間接ELISA方法測定，該法參照Beatey等人在JImmunol Methods，100173-179(1983)中有全面的描述。按照這一方法，用50mM pH9.6碳酸鹽緩沖液將抗原分別以1微克/毫升和10微殼/毫升包被聚苯乙烯微96孔板，0.1毫升/孔，4℃過夜。次日，含1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)的封閉液0.3毫升/孔4℃過夜，加入不同稀釋濃度的單克隆抗體，0.1毫升/孔37℃30分鐘，10mM PBS含0.1％ Tween-20洗滌液洗板五次后，加入1∶2000倍稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG(美國ZYMEDLABORATORIES，INC.)，0.1毫升/孔37℃30分鐘，同上洗板后，TMB顯色測OD值。以抗體濃度的對數(shù)為橫座標，以OD值為縱座標，每種單克隆抗體得出2條反應曲線，以每條曲線上部平坦段的OD值作為100％，在曲線上查出50％OD值時相對應的抗體濃度，按Beatty推導公式Kaff＝(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)計算親和常數(shù)。結果本發(fā)明的4株單克隆抗體親和常數(shù)見表1。
實施例6辣根過氧化物酶-單克隆抗體結合物制備辣根過氧化物酶標記抗體制備采用改良過碘酸鈉法，將5mg辣根過氧化物酶攪拌溶解于1毫升蒸餾水中，加入0.2毫升新配0.1M過碘酸鈉30分鐘，置1mM pH4.4醋酸鈉緩沖液中，4℃透析過夜，次日加入20μl 0.2M pH9.5碳酸鹽緩沖液后加預先在0.01M碳酸鹽緩沖液中pH 9.5透析平衡的10mg抗體，在室溫避光輕輕攪拌2～3小時，加入0.1毫升新配4mg/毫升硼氫化鈉，4℃避光過夜，冰浴上避光攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨(硫酸銨用前先用氨水調pH至7.0-7.2)，置4℃6小時。10000g，4℃離心30分鐘，棄上清，沉淀溶于適量10mM磷酸鹽緩沖液，用同樣的液體，4℃透析過夜，換液三次。收集結合物加入2％BSA PBS 50％甘油保護劑，分裝置-70℃保存并進行酶標抗體工作濃度測定。酶標抗體效價測定采用實施例1所描述間接ELISA法測定免疫血清效價的方法進行，酶標抗體作倍比稀釋。結果本發(fā)明的4株單克隆抗體的酶標抗體的工作濃度見表1。
實施例7鑒定SARS-CoV N蛋白單克隆抗體的特異性1、間接ELISA法進行單克隆抗體特異性分析用純化SARS-CoV全病毒裂解液抗原包被微孔板，按實施例1建立測定免疫血清效價的間接ELISA法的步驟進行，在包被的微孔板中加入本專利發(fā)明的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液，37℃再孵育1小時，加入1∶2000稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG(美國ZYMED LABORATORIES，INC.)，0.1毫升/孔37℃30分鐘，加TMB顯色液室溫避光10分鐘，加0.2M H2SO2終止反應，測450nm吸收值。表2結果顯示本專利發(fā)明的SARS-CoV單克隆抗體與SARS-CoV抗原產生很強的特異性的免疫反應。
表2SARS-CoV單克隆抗體與SARS冠狀病毒全病毒裂解液抗原反應間接ELISA結果

2、用間接免疫熒光法進行單克隆抗體特異性分析用SARS-CoV感染Vero-E6細胞，當有2/3細胞出現(xiàn)病變時，收集細胞，用預冷的1×PBS洗細胞二遍，然后將細胞滴于無菌干燥的玻片上，干燥后，制備成涂片，充分干燥，用冷丙酮固定30分鐘，用PBS和去離子水各洗3次，吹干，將雜交瘤細胞培養(yǎng)上清按不同的稀釋度分別用10μl滴在不同的孔中，同時設陰性和陽性對照血清，置37℃水浴箱中，作用45分鐘后，取出將抗原片放于染色缸中用0.01mM pH7.2 PBS和蒸餾水各洗3次，吹干，加入熒光標記羊抗小鼠IgG抗體，置37℃水浴箱中，45分鐘后作用，取出將抗原片放于染色缸中用0.01mmol/LpH7.2PBS和蒸餾水各洗3次，吹干，熒光顯微鏡下觀察熒光圖像，以熒光的強度和染色形態(tài)進行結果判定，檢測抗體強度以(+～++++)計為陽性，抗體強度(±)和(-)計為陰性。如附圖中圖3和表3結果顯色SARS-CoV單克隆抗體與固定在玻片上SARS-CoV抗原特異性結合。
表3、單克隆抗體的免疫熒光檢測結果

3、免疫印跡分析法進行單克隆抗體特異性分析將滅活SARS-CoV培養(yǎng)液或重組的N蛋白，用2×SDS加樣緩沖液稀釋一倍，將樣品加到10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，電泳分離蛋白質，通過電洗脫使在凝膠上分離出來的蛋白質轉印到硝酸纖維膜上，轉印膜用1×PBS含7％脫脂奶和3％BSA，4℃封閉6小時，將轉印膜剪成數(shù)根小條，分別加入雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中，4℃反應過夜，用含有0.5％Tween 20的1×PBS洗滌膜后，加入1∶500倍稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG，置室溫反應1小時，用同樣的洗滌液洗滌膜后，AEC顯色后，用去離子水終止顯色。
免疫印跡結果如附圖的圖1和圖2顯示本發(fā)明的4株單克隆抗體與N蛋白特異性結合，結合蛋白相對分子質量為46千道爾頓。SARS-CoV液在分子量為46千道爾頓可見一條單一的蛋白質免疫結合帶，特異性蛋白質結合帶與預測分子量為46千道爾頓相一致。說明獲得的單克隆抗體能夠特異性識別SARS-CoV抗原。
實施例8單克隆抗體識別自然抗原位點的分析采用固相抗原的間接競爭抑制法，主要步驟如下(1)1微克/毫升重組N蛋白0.1毫升的50mM pH9.6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，4℃過夜。次日，含1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)的封閉液0.3毫升/孔4℃過夜后，(2)A50微升雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清和50微升SARS-CoV N區(qū)陽性病人的血清，37℃共同孵育1小時，此步驟稱為相互競爭抑制，B100微升SARS-CoV N區(qū)陽性病人的血清37℃孵育1小時后，將血清吸出，然后加100微升雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清，37℃再孵育1小時，此步驟稱為先后競爭抑制。(3)加入1∶2000稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG(美國ZYMED LABORATORIES，INC.)，0.1毫升/孔37℃30分鐘，加TMB顯色液室溫避光10分鐘，加0.2M H2S02終止反應，測450nm吸收值，以正常人血清作為抑制陰性對照，以SARS-CoV N區(qū)陽性病人的血清OD測定值/正常人血清OD測定值≤05判斷為抑制陽性。表4結果顯示12份SARS-CoV抗體陽性病人的血清相互競爭抑制試驗時對本發(fā)明4株單抗沒有產生抑制作用，而在先后競爭抑制試驗時對這4株細胞產生明顯的抑制作用，由此顯示自然感染后產生的抗體可抑制單抗與重組抗原的反應，說明這組單抗所識別的位點存在于自然抗原上，同時也提示本發(fā)明的4株單抗由于親和力高，能夠與病人的血清相互競爭固相抗原。
表4SARS陽性血清分別對4株單抗的抑制作用

實施例9單克隆抗體識別位點分析5微克/毫升重組N蛋白0.1毫升的50mM pH9.6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，4℃過夜。次日，含1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)的封閉液0.3毫升/孔4℃過夜后，先加單抗10毫克/毫升50微升及后加系列稀釋HRP標記單抗1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶2000 50微升，37℃，封閉1小時；PBST洗滌五次后加底物100微升/孔，10～20分鐘，OD450測定吸收值。以單抗對同一HRP標記的單抗抑制為100％，以已知無關單抗對標記單抗的抑制為陰性對照，計算各單抗間的抑制率。即抑制率為(1-測定值OD/陰性對照值OD)×100。抑制率＞75％為相關，＞50％為不完全相關，＜50％為不相關，＜25％為完全不相關。表5結果顯示4株單抗識別4個不完全相同的抗原位點。
表5抗SARS冠狀病毒核殼蛋白單克隆抗體識別位點測定

實施例10雙抗體夾心ELISA法單克隆抗體最佳配對的篩選和ELISA參數(shù)的優(yōu)化從實施例4的腹水純化的單克隆抗體用于進行一組矩陣格式實驗以選出最適合于下面實施例11所述的夾心ELISA法中用作捕獲和標記的單克隆抗體對。簡單地說，用辛酸-硫酸銨沉淀法純化的4株雜交瘤細胞(編號為1E8A11、8E1A17、10E4A4、14A3A3A19)衍生而來的腹水包被96孔板，以實施例獲得的重組N蛋白作為抗原篩選抗體對。用實施例6中所述的4株辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體，采用矩陣格式，也就是上述4株單克隆抗體將每株進行包被作為捕獲或混合包被作為捕獲，分別與每一株酶標記單克隆抗體進行配對，以快速篩選夾心ELISA中捕獲和標記的單克隆抗體對。初步實驗顯示單克隆抗體1E8A11、8E1A17、10A4A1和10E4A4分別作為捕獲抗體，與酶標記14A3A3A19單克隆抗體配對時，可產生較強的信號。而在此基礎上，分別組合上述4株單克隆抗體進行捕獲的抗體和標記的抗體的配對，以信號強度和特異性而言，用1E8A11、8E1A17和10E4A4組合作為捕獲的單克隆抗體，用14A3A3A19抗體作為標記的單克隆抗體，產生最強的信號。
實施例11用抗SARS-CoV N蛋白單克隆抗體檢測SARS-CoV抗原的雙抗體夾心ELISA法試劑盒建立本發(fā)明的檢測SARS-CoV抗原試劑盒建立的操作流程描述如下1、將本發(fā)明單克隆抗體1E8A11、8E1A17和10E4A4用50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋至10微克/毫升，用0.1毫升/孔包被聚苯乙烯96微孔板，于4℃過夜。以0.05％Tween 20/10mMPBS沖洗1次，然后拍干。每孔加入0.3毫升的1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)的封閉液，于4℃過夜以封閉非特異性結合位點。用10mM磷酸鹽緩沖液含10％蔗糖處理包被板條，真空干燥2～12小時，用鋁膜袋真空包裝4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、將各種待測的樣品用樣品稀釋液稀釋后，各加入100微升于聚苯乙烯96孔微量測試板中，每份樣品設復孔，37℃溫育1小時，用10mM PBS含0.1％Tween-20洗滌液洗板五次后，用酶稀釋液稀釋對辣根過氧化物酶標記14A3A3A19單克隆抗體作1∶1000倍稀釋，每孔加入100微升，37℃1小時，同上洗板后，加入含有0.05％(W/V)TMB和0.06％(W/V)雙氧水pH5.0檸檬酸緩沖液，每孔加入100微升，37℃避光10～15分鐘，每孔加入100微升2MH2SO2終止反應。
3、結果判定以空白孔調零，于450nm波長測定A值。陽性對照平均值≥0.50，陰性對照平均值≤0.10，實驗成立。樣品A值≥陰性對照A值平均值×2.1，則判為陽性。反之為陰性。
本發(fā)明雙抗體夾心ELISA法檢測SARS-CoV抗原試劑盒結果的分析描述如下1、抗體夾心ELISA法試劑盒對不同來源的SARS-CoV株和不同病毒的特異性測定分析取從廣州、北京和香港地區(qū)分離的SARS-CoV株、動物冠狀病毒以及其他病毒的培養(yǎng)物，用上述的雙抗體夾心ELISA法分別進行檢測。表6結果顯示，對不同地區(qū)的分離SARS-CoV株均有特異性反應，對人冠狀病毒(OC43和229E)、其他動物冠狀病毒(禽冠狀病毒IBV和犬冠狀病毒CCV)、呼吸道病毒(流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒)以及肺炎衣原體、肺炎支原體均無交叉反應。說明用本發(fā)明的單克隆抗體建立的雙抗體夾心ELISA法對SARS-CoV具有高度的特異性。
表6雙抗體夾心ELISA法試劑盒檢測檢測細胞培養(yǎng)的SARS-CoV抗原


2、抗體夾心ELISA法試劑盒檢測的靈敏度檢測分析以純化的SARS-CoV N重組蛋白作為標準檢測品(0、50、100、200、400、800及1600pg/毫升)，以非相關蛋白作為陰性對照，用上述的雙抗體夾心ELISA法分別進行檢測，繪制標準曲線，如附圖中圖4結果所示。此試劑盒靈敏度可達10-50pg/毫升。通過檢測樣品的OD值，從標準曲線中計算樣品的含量。
實施例12SARS-CoV單克隆抗體的臨床應用研究檢測SARS病人肺組織中SARS-CoV抗原用SARS-CoV單克隆抗體，通過免疫組化染色法檢測SARS病人肺組織中SARS-CoV抗原的表達。按常規(guī)方法對肺組織石蠟包埋后組織切片進行免疫組化染色法，簡述如下切片置于58℃烤箱烤1小時，浸入二甲苯中脫蠟，常規(guī)水化后，3％H2O2室溫作用15分鐘，以封閉內源性過氧化物酶活性。然后用冷1×PBS洗片，3次，每次5分鐘。加SARS-CoV單克隆抗體腹水1∶1000于濕盒中4℃過夜。用冷PBS洗片3次。辣根過氧化物酶標記的標記羊抗鼠IgG，37℃孵育1小時，充分洗片后，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化后，梯度脫水，透明，中性樹膠封固。顯微鏡下鏡檢。附圖中圖6、7所示，結果表明本發(fā)明的單抗檢測到SARS病人肺組織中肺泡上皮細胞中的SARS-CoV抗原。說明SARS-CoV單克隆抗體具有很高的特異性和敏感性。
雙抗體夾心ELISA法試劑盒檢測檢測細胞培養(yǎng)的SARS-CoV抗原通過本發(fā)明提供高特異性的抗SARS-CoV單克隆抗體建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測SARS-CoV抗原，以實施例11描述的抗體1E8A11、8E1A17和10E4A4作為俘獲抗體，在聚苯乙烯微96孔板上將純化的單抗制成固并用牛血清白蛋白(BSA，Sigma)封閉多余的位點，以滅活的SARS-CoV感染的Vero細胞的培養(yǎng)上清作為SARS-CoV抗原來源，37℃孵育洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記14A3A3A19單抗，再次37℃孵育洗滌后，加TMB酶底物液避光顯色，加H2SO2終止反應，測450nm吸收值。使用這一方法，對來自不同地區(qū)的3株SARS-CoV感染的細胞培養(yǎng)上清均呈陽性反應。而與沒有感染SARS-CoV的細胞培養(yǎng)物無交叉反應。附圖中的圖5給出分析結果。
雙抗體夾心ELISA法試劑盒檢測檢測病人血清中的SARS-CoV抗原。
實施例11建立的方法檢測SARS病人血清中的SARS-CoV抗原，對廣東省CDC提供165份SARS病人急性期和恢復期血清樣品進行檢測，檢出SARS冠狀病毒抗原陽性率為40％，對15例實驗室診斷(恢復期IgG 4倍增高)的急性期10天內的血中SARS冠狀病毒抗原檢出陽性率為93.3％(14/15)。對北京CDC提供20份SARS病人急性期5天內的血中SARS冠狀病毒抗原檢出陽性率為90％(18/20)。對2000份對照樣品檢測的特異性為99％。檢測結果證明本發(fā)明建立的試劑盒在發(fā)病的早期第一天血清中，測到SARS-CoV抗原，而且通過本發(fā)明建立的檢測方法發(fā)現(xiàn)在SARS發(fā)病6-10天血清中的抗原達到高峰，發(fā)病的10天后開始下降，如附圖中的圖8所示。該發(fā)現(xiàn)證明本發(fā)明的一組單克隆抗體以及用該組單克隆抗體建立的檢測方法不僅可用于SARS的早期診斷而且用于SARS的發(fā)病機制研究具有非常重要的科學價值。
上面所述的以1E8A11、8E1A17和10E4A4混合包被固相表面，以辣根過氧化物酶標記14A3A3A19抗體作為液相的檢測抗體所組成的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測SARS-CoV抗原，可用于檢測檢測人或動物的血清或血漿樣品痰液、漱口水、鼻拭子、咽拭子、尿液以及糞便中的SARS-CoV抗原，用于SARS-CoV感染的早期診斷，達到早期發(fā)現(xiàn)、早期隔離。避免轉播的目的。
用本發(fā)明的單克隆抗體標記熒光后采用直接免疫熒光方法檢測被SARS-CoV感染的肺脫落細胞中和活組織中的病毒抗原，或用實施例7所描述的間接免疫熒光法即用本發(fā)明的單克隆抗體與細胞或組織中的的SARS-CoV抗原結合后，再用熒光標記羊抗小鼠IgG抗體與結合在細胞或組織中的單克隆抗體結合，同樣也可用于SARS-CoV感染的診斷的研究。
權利要求
1.一種對SARS冠狀病毒核衣殼蛋白具有特異反應性的單克隆抗體。
2.權力要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述SARS冠狀病毒核殼蛋白抗原分子量為46千道爾頓。
3.權利要求1所述單克隆抗體，其特征是由具有保存號包括雜交瘤1E8A11CCTCC-C200401，雜交瘤8E1A17CCTCC-C200402，雜交瘤10E4A4CCTCC-C200403，雜交瘤14A3A3A19CCTCC-C200404的細胞系分泌產生。
4.權力要求1所述的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體屬于免疫球蛋白類型IgG1或IgG2b。
5.權利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于免疫印跡法表明可特異性與SARS冠狀病毒裂解產物中核衣殼蛋白分子量為46千道爾頓發(fā)生反應。
6.權利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于免疫印跡法表明可特異性與基因重組的核衣殼蛋白分子量為46千道爾頓發(fā)生反應。
7.權利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于可在免疫熒光分析法中特異性識別被感染SARS冠狀病毒的非洲綠猴腎細胞中核衣殼蛋白。
8.權利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于可在免疫熒光分析法中特異性識別SARS病人的細胞或組織中SARS冠狀病毒核衣殼蛋白抗原。
9.權利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于可在免疫組化分析法中用于識別SARS病人的細胞或組織中SARS冠狀病毒核衣殼蛋白抗原。
10.權力要求1所述的單克隆抗體，其特征在于對人的冠狀病毒229E和OC43的核衣殼蛋白不具有反應性；且與其他動物冠狀病毒及呼吸道病毒沒有交叉反應。
11.權利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于可進行捕獲的抗體和標記的抗體的配對，用1E8A11、8E1A17和10E4A4組合作為捕獲的單克隆抗體，用14A3A3A19抗體作為標記的單克隆抗體，形成一種在免疫酶試驗中的抗體對。
12.具有保藏號為CCTCC-C200401、CCTCC-C200402、CCTCC-C200403和CCTCC-C200404的雜交瘤細胞株。
13.一種SARS冠狀病毒核衣殼蛋白抗原檢測試劑，其特征在于包括權利要求1～11任何一項所述的單克隆抗體。
14.一種SARS冠狀病毒核衣殼蛋白抗原檢測試劑盒，其特征在于包括權利要求13所述的試劑。
15.一種權利要求1～11所述的單克隆抗體，其特征在于能單獨或結合或與多克隆抗體結合在診斷SARS冠狀病毒感染的試劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了SARS冠狀病毒(SARS－CoV)核衣殼(N)蛋白的特異性單克隆抗體，產生該抗體的雜交瘤，含此單克隆抗體的試劑以及以此建立的試劑盒；該單克隆抗體是由保藏號為雜交瘤1E8A11CCTCC－C200401，雜交瘤8E1A17CCTCC－C200402，雜交瘤10E4A4CCTCC－C200403，雜交瘤14A3A3A19CCTCC－C200404細胞系分泌產生。利用此單克隆抗體建立的試劑盒可早期診斷SARS冠狀病毒感染，并具有簡易、方便、快速、敏感性高、特異性強等特點。
文檔編號C12N5/12GK1557838SQ200410015309
公開日2004年12月29日 申請日期2004年2月10日 優(yōu)先權日2004年2月10日
發(fā)明者車小燕, 丘立文, 溫坤, 郝衛(wèi), 王亞娣, 潘玉先, 廖志勇 申請人:第一軍醫(yī)大學珠江醫(yī)院