專利名稱：高效低毒的系列功能蛋白的制作方法
技術領域：
目前癌癥仍然是嚴重威脅人類健康的疾病，發(fā)病率和死亡率都很高。癌癥的傳統(tǒng)治療方法主要有3種方法化療，放療和手術治療。手術療法僅限于早斯，而化療和放療雖然有效，但是其嚴重的毒副作用限制了這種方法不能使用大劑量和長期應用，從而大大影響了其治療效果，并且這種方法治療后容易產生耐藥性腫瘤細胞，從而在復發(fā)的時候腫瘤變得無法控制。
因此，人們致力于研究一種低毒高效治療腫瘤的新方法，就是消除放、化療方法在殺傷腫瘤細胞的同時電大量殺傷正常細胞的缺點，特異性地針對腫瘤細胞進行殺傷，而對正常細胞低毒性或沒有毒性。這種方法就是應用靶向分子，包括腫瘤細胞表面過量表達的受體的配體和單克隆抗體等，這種靶向分子進入體內以特異性地到達腫瘤部位，而與其相連的效應蛋白或與其偶聯(lián)的化療藥物可以在腫瘤部位殺傷腫瘤細胞，從而達到特異性治療腫瘤的目的。
背景技術：
靶向性藥物的研究是癌癥治療的一大進步，由于很多腫瘤細胞過量表達一些激素、細胞因子以及生長因子的受體，所以藥物的導向部分可以應用激素類小分子，如人促黃體生成激素釋放因子(GnRH)，生長因子，如EGF，細胞因子，如白細胞介素-2，白細胞介素-6等，電可以應用這些分子受體的單克隆抗體作為導向。導向部分通常連接一個毒素蛋白，如假單胞菌外毒素(PE)，白喉毒素(DT)，蓖麻毒素等，現(xiàn)在較常用的是假單胞菌外毒素A(PE)，PE是由假單胞桿菌分泌的，由613個氨基酸組成，其分為3個區(qū)域，I區(qū)為動物細胞受體識別區(qū)，通過此區(qū)與動物細胞相結合，II區(qū)為跨膜區(qū)，通過此區(qū)毒素分子進入細胞，III區(qū)為活性區(qū)，通過對細胞蛋白合成過程中的延伸因子進行核糖基化，使蛋白合成終止，從而導致細胞的死亡(Allured.V etc.Proc Natl Acad Sci.1986，83，1320-1324)。通過刪除N末端1-252個氨基酸后就得到了截短的PE分子，剩下從N末端253-613的一段，為PE40，在去掉I區(qū)后，失去了動物細胞受體結合區(qū)，因為PE分子的細胞毒性作用發(fā)揮的前提是PE分子必須進入細胞內，所以PE40分子對于正常細胞基本沒有毒性，由此PE40分子同各種導向分子連接，就構成了各種靶向毒素，應用于腫瘤的治療以及其他疾病。通過缺失PE分子1-252和365-380兩段序列，剩下的253-364和381-631兩段序列按原順序相連，就得到PE38分子。通過缺失PE分子的1-279位氨基酸，剩下280-613部分，就得到了PE37分子(TheuerCP etc.J Biol Chem.1992，267，(24)16872-7)。PE37，PE38和PE40都是PE分子的各種衍生物。

發(fā)明內容
本發(fā)明是通過人促黃體激素釋放因子(GnRH)與PE分子的各種衍生物通過一段Linker序列相連形成多種具有對腫瘤細胞具有導向性的融合蛋白。
權利要求書中的融合蛋白1是由GnRH與改進的PE40通過Linker相連得到，融合蛋白2是由GnRH與改進的PE38通過Linker相連得到，融合蛋白3是由GnRH與改進的PE37通過Linker相連得到，融合蛋白4是由改進的PE37與GnRH通過Linker相連得到。
GnRH的氨基酸序列為Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly，文獻表明，其第6位氨基酸Gly改變?yōu)镈-Ala，可增強與受體的結合能力，本發(fā)明將GnRH的第6位的Gly突變?yōu)锳la，一定程度上提高了受體的結合能力。
我們發(fā)現(xiàn)，GnRH與PE衍生物直接相連后對腫瘤細胞的殺傷效率不高，這可能是由于GnRH的分子太小，只有10個氨基酸，有可能被PE衍生物分子包住而無法與細胞表面受體結合。常規(guī)選用的柔性Linker如Gly-Ser-Gly-Gly-Gly也不適合GnRH與PE衍生物的連接。由于上述的原因，GnRH分子很小，PE衍生物分子很大，所以用柔性的Linker PE衍生物分子可能會干擾GnRH與其受體的結合。本發(fā)明選用了序列His-Met-Ala-Glu-Glu作為Linker，該序列是一種相對剛性的Linker，能夠有效地保證GnRH與PE衍生物兩部分功能的實現(xiàn)，并且該Linker含有2個Glu，能有效地中和GnRH的堿性氨基酸，并且利于融合蛋白1，2，3分子在大腸桿菌中的高效表達。
PE衍生物的后5個氨基酸序列為Arg-Glu-Asp-Leu-Lys，本發(fā)明將其改為Lys-Asp-Glu-Leu，使其活性增強。
本發(fā)明的特點是通過突變的GnRH與改進的PE衍生物以及Linker之間的組合，而形成四種靶向性強的高效融合蛋白，具有表達量高，活性強等特點。
通過基因工程的方法，本發(fā)明的4種融合蛋白基因在大腸桿菌中得到了高效表達，通過常規(guī)的純化方法得到了4種融合蛋白的純品，其純度在95％以上。
四.


圖1是四種融合蛋白表達，發(fā)酵并純化后的15％SDS-PAGE電泳圖譜，A表示融合蛋白1，B表示融合蛋白2，C表示融合蛋白3，D表示融合蛋白4，E表示蛋白分子量標準，從上到下依次是97.4kD，66.2kD，43kD，31kD，20.1kD，14.4kD。
圖2是融合蛋白細胞活性測定的曲線。
圖3是融合蛋白細胞活性測定的細胞變化的顯微照片。
五.
具體實施例方式
實例一.
根據(jù)Medline基因蛋白文庫報道與相關文獻報道，查出融合蛋白各部分天然蛋白序列與基因序列，再經(jīng)過設計把兩端天然蛋白經(jīng)過Linker序列連接成完整的序列，然后根據(jù)設計的融合蛋白一級結構，用計算機排列出對應的基因序列，在排列出融合蛋白的表達基因時，根據(jù)不同表達體系宿主對不同氨基酸有偏好密碼子的原則，分別排列出融合蛋白的原核序列與真核序列以便于在不同表達體系中進行高效表達。
以上述設計出的兩條序列為藍圖，全基因合成2條完整的融合蛋白基因，經(jīng)過測序確證后，將目的基因插入不同的表達載體，原核主要應用pET改進后系列質粒，真核系統(tǒng)主要采用pIC9K質粒系列，將確證后的重組子導入到宿主菌中，經(jīng)過表達、發(fā)酵得到目的菌，然后通過機械方法破菌后，離心取上清，通過疏水層析和離子交換層析的方法純化得到目的蛋白融合蛋白1。得到的產物經(jīng)過N末端分析，肽圖分析以及質譜分析，確定為理論的融合蛋白1。最后進行細胞殺傷試驗表明，融合蛋白1對Hela腫瘤細胞具有高特異性和高殺傷性。
測活方法(MTT法)首先對Hela細胞進行消化和收集，將細胞用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成6-8×104個/毫升的細胞懸液，接種于96孔板，100ul/孔，37度培養(yǎng)4小時。
樣品先用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成100ul/mL，作為起始孔，然后按每孔與上孔2.5倍的關系稀釋樣品，各加入稀釋的樣品每孔100ul，37度，培養(yǎng)24小時，取出，用MTT法染色，用酶標儀570nm進行測定。對照加入100ul培養(yǎng)液。
實例二.
以實例一中全基因合成的2條基因序列為模板，利用PCR技術并合成多條引物，最后得到了對應于設計的融合蛋白2一級序列的目的基因序列片段，該片段經(jīng)基因序列測定后插入表達質粒的表達框中，經(jīng)檢測插入正確后，把重組表達載體導入表達宿主菌中。該基因工程菌經(jīng)過表達，發(fā)酵，純化后得到了融合蛋白2，該蛋白經(jīng)過實例1中的各項檢測后確定其結構正確。
測活方法同實例一。
實例三.
以實例一中全基因合成的2條基因序列為模板，利用PCR技術并合成多條引物，最后得到了對應于設計的融合蛋白3一級序列的目的基因序列片段，該片段經(jīng)基因序列測定后插入表達質粒的表達框中，經(jīng)檢測插入正確后，把重組表達載體導入表達宿主菌中。該基因工程菌經(jīng)過表達，發(fā)酵，純化后得到了融合蛋白3，該蛋白經(jīng)過實例1中的各項檢測后確定其結構正確。
測活方法同實例一。
實例四.
以實例一中全基因合成的2條基因序列為模板，利用PCR技術并合成多條引物，最后得到了對應于設計的融合蛋白4一級序列的目的基因序列片段，該片段經(jīng)基因序列測定后插入表達質粒的表達框中，經(jīng)檢測插入正確后，把重組表達載體導入表達宿主菌中。該基因工程菌經(jīng)過表達，發(fā)酵，純化后得到了融合蛋白4，該蛋白經(jīng)過實例1中的各項檢測后確定其結構正確。
測活方法同實例一。
測活的結果(每孔都重復一次，以下數(shù)據(jù)為2次的平均值) 從上表中及說明書附圖2和附圖3中可以看到，融合蛋白1-4對Hela腫瘤細胞具有很強的殺滅的作用。
權利要求
1.一種由小分子激素肽與效應蛋白組成的四種融合蛋白，分別為融合蛋白1，融合蛋白2和融合蛋白3和融合蛋白4。
2.根據(jù)權利要求1，所說的融合蛋白1的氨基酸序列為Met-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Glu-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Ala-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val-Ala-Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Leu-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Glu-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Val-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Asp-Leu-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Leu-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Glu-Val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Leu-Glu-Thr-lle-Leu-Gly-Trp-Pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Leu-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu
3.根據(jù)權利要求1，所說的融合蛋白2的氨基酸序列為Met-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Glu-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Leu-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Glu-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Val-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Asp-Leu-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Leu-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Glu-Val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Leu-Glu-Thr-Ile-Leu-Gly-Trp-Pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Leu-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu
4根據(jù)權利要求1，所說的融合蛋白3序列為Met-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Ser-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Glu-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Ala-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val-Ala-Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Leu-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Glu-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Val-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Asp-Leu-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Leu-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Glu-Val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Leu-Glu-Thr-lle-Leu-Gly-Trp-Pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Leu-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu
5根據(jù)權利要求1，所說的融合蛋白4序列為Met-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Ser-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Glu-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Ala-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val-Ala-Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Leu-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Glu-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-ValArg-Ala-Arg-Ser-Gln-Asp-Leu-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Leu-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Glu-Val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Leu-Glu-Thr-Ile-Leu-Gly-Trp-Pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Leu-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys-His-Met-Ala-Glu-Glu-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-Lys-Asp-Glu-Leu
6.權利要求1中，所說的四種融合蛋白使用的連接序列均為His-Met-Ala-Glu-Glu。
7.權利要求1中的融合蛋白使用大腸桿菌、酵母或真核細胞為宿主菌，應用基因工程的方法進行表達、純化獲得。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及一類由小分子肽與效應蛋白組成的系列融合蛋白，其具有特異殺滅過量表達該小分子肽受體細胞的特點，從而在多種疾病的治療方面有潛在的應用價值。
文檔編號C12N15/70GK1683416SQ20041003362
公開日2005年10月19日 申請日期2004年4月13日 優(yōu)先權日2004年4月13日
發(fā)明者張艷, 劉秀群 申請人:李相哲