專利名稱：復(fù)合擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外一次性擴(kuò)增多個(gè)DNA目的片段的引物設(shè)計(jì)方法。
背景技術(shù)：
復(fù)合擴(kuò)增(multiplex PCR)又稱為多重PCR，是在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或兩個(gè)以上的基因座。具有高效、快速、節(jié)約檢材、減少成本的特點(diǎn)，特別是在法醫(yī)學(xué)鑒定中可以用極少量的檢材同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)遺傳標(biāo)志而更顯其優(yōu)越性。自1988年Chambercian等首次提出這一概念，該技術(shù)在基因組結(jié)構(gòu)與功能、病原體診斷、性別篩選、連鎖分析、遺傳疾病診斷、法醫(yī)學(xué)鑒定等許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
復(fù)合擴(kuò)增的最初幾個(gè)循環(huán)對(duì)PCR的靈敏度和特異性有實(shí)質(zhì)性的影響。在DNA模板充分變性的情況下，高效且特異性擴(kuò)增的實(shí)現(xiàn)直接取決于引物與目標(biāo)片段的結(jié)合速率和延伸速率。因此引物設(shè)計(jì)是復(fù)合擴(kuò)增成功的的首要決定因素。
根據(jù)引物設(shè)計(jì)的不同可以將復(fù)合擴(kuò)增分為以下幾類1、傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)的復(fù)合擴(kuò)增是將多對(duì)原始引物混合于一個(gè)擴(kuò)增體系，按照一個(gè)折衷的擴(kuò)增條件擴(kuò)增。由于人類基因組高度的復(fù)雜性，多重PCR反應(yīng)中隨著使用引物對(duì)數(shù)的增加，在擴(kuò)增體系中存在有大量各種序列的背景模板，為非特異性擴(kuò)增提供了機(jī)會(huì)，得到錯(cuò)誤擴(kuò)增產(chǎn)物的機(jī)會(huì)就增大，需經(jīng)過調(diào)換產(chǎn)生不需要產(chǎn)物的引物，調(diào)整引物之間的比例才能產(chǎn)生高度特異性的目的片段。同時(shí)還需經(jīng)過一系列的試驗(yàn)，優(yōu)化復(fù)合擴(kuò)增條件。因此，當(dāng)復(fù)合擴(kuò)增體系中的引物對(duì)達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，PCR條件的優(yōu)化會(huì)變得非常困難。
2、巢式PCR巢式PCR是通過采用兩套引物進(jìn)行兩次獨(dú)立的擴(kuò)增過程來達(dá)到提高靈敏度和特異性的目的。這種方法先將包含有目的序列的片段擴(kuò)增，將擴(kuò)增出的片段作為模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增，可在一定程度上降低基因組DNA的影響，在大多數(shù)情況下，這種方法對(duì)于提高擴(kuò)增的靈敏度和特異性無疑很有效，但其操作和應(yīng)用較為復(fù)雜，不利于自動(dòng)化操作，而且增加了交叉污染的機(jī)會(huì)。
3、GC鉗復(fù)合擴(kuò)增GC鉗的方法是將一段40個(gè)富含GC堿基的序列連在一對(duì)引物的一條上，通過PCR的方法引入擴(kuò)增的片段，這段富含GC的序列稱之為GC鉗(GC-clamp)。這個(gè)方法雖然靈敏度高，但是復(fù)合的引物對(duì)數(shù)量比較多，操作要求兩步擴(kuò)增，且擴(kuò)增的片段需在同一個(gè)基因內(nèi)，最大的缺點(diǎn)是，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)必須用變性梯度凝膠電泳，對(duì)檢測(cè)設(shè)備依賴性大。
4、同源加尾去二聚體系統(tǒng)這種方法是在復(fù)合擴(kuò)增的每一條引物5′端連接一條相同的序列，在反應(yīng)體系中同時(shí)加入同這一序列相同的引物，并且其退火溫度設(shè)計(jì)得高于特異引物，如果系統(tǒng)的特異引物之間可形成引物二聚體，在擴(kuò)增反應(yīng)的最初幾個(gè)循環(huán)產(chǎn)生的引物二聚體的產(chǎn)物，在擴(kuò)增反應(yīng)體系轉(zhuǎn)換為高的退火溫度時(shí)會(huì)形成“平鍋柄”結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)由于在每一個(gè)循環(huán)都不能進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，可以有效地抑制引物二聚體，從而消除了對(duì)擴(kuò)增系統(tǒng)的影響。在復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)3′端有互補(bǔ)序列的情況下，這種方法無疑是最佳選擇，但是對(duì)于非3′端的引物間相互作用，由于不能形成單鏈“平鍋柄”結(jié)構(gòu)，將起不到抑制二聚體的作用，所以這種方法的應(yīng)用非常局限。
5、PCR抑制法這種方法只用一條基因座特異性引物，另一條為公共引物。其做法是先將包含有目的片段的序列從整個(gè)基因組用限制性內(nèi)切酶切下，在兩端連上一段40個(gè)堿基長的富GC接頭序列，這一序列與公共引物互補(bǔ)。擴(kuò)增時(shí)，帶有接頭的單鏈片段首先形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，退火后，與接頭退火的引物延伸被抑制，只有特異引物可以延伸。此法的優(yōu)點(diǎn)是具有極高的特異性，另外也可節(jié)省引物的費(fèi)用，降低試驗(yàn)成本；缺點(diǎn)是效率低，操作繁瑣，而且需要目的片段的側(cè)翼序列存在酶切位點(diǎn)。
6、嵌合引物法該方法每條引物的3′端序列是與基因組互補(bǔ)的特異序列，5′端是一段20個(gè)堿基的基因組無關(guān)序列，擴(kuò)增體系中還加有一對(duì)公共引物，其序列與與嵌合引物的5′端序列一致。這種方法由于特異引物濃度低，引物間的相互作用減少，引物濃度比例容易調(diào)節(jié)，擴(kuò)增條件易于優(yōu)化，可提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和靈敏度；缺點(diǎn)是原始引物和特異序列相加后長度過長，擴(kuò)增目的片段的產(chǎn)物較原始片段增加了40個(gè)堿基，且操作較為煩瑣。
根據(jù)分離檢測(cè)系統(tǒng)的不同，可以將復(fù)合擴(kuò)增分為聚丙烯酰胺凝膠電泳分離銀染顯色法和毛細(xì)管電泳激光熒光檢測(cè)法兩大類。
聚丙烯酰胺凝膠電泳分離銀染顯色法是對(duì)復(fù)合擴(kuò)增后的產(chǎn)物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、硝酸銀顯色。其中因分離目的不同，又分為變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種。前者是由于在凝膠中使用了變性劑，DNA以單鏈的形式在凝膠中運(yùn)動(dòng)，因此片段的分離是根據(jù)各自的長度和堿基的組成不同而彼此分開的；后者由于DNA是以雙鏈的形式運(yùn)動(dòng)，片段的分離是根據(jù)長度和DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的不同而分離的。兩種方法各具特色，用途也不相同?？傊朔椒ú僮飨鄬?duì)簡單，易于掌握，試劑、設(shè)備成本都不高。但是分析檢測(cè)無法自動(dòng)化，通量不高，增加了人為因素，對(duì)復(fù)合擴(kuò)增位點(diǎn)的片段大小限制多，對(duì)操作人員和環(huán)境也有一定污染，準(zhǔn)確性、重復(fù)性也難以保證。
毛細(xì)管電泳激光熒光檢測(cè)法是在普通的復(fù)合擴(kuò)增每個(gè)引物對(duì)中一條引物的5′端加上熒光標(biāo)記物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用毛細(xì)管電泳自動(dòng)激光熒光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管電泳的分離過程中是以單鏈形式運(yùn)動(dòng)的，因此運(yùn)動(dòng)的速度同片段的長度和堿基組成相關(guān)。由于毛細(xì)管電泳的快速分離效果，堿基組成相差一個(gè)的兩個(gè)片段，也可以得到完全分離。加上不同熒光標(biāo)記物的使用，可以使大小相近的片段由于熒光顏色的不同而彼此分開，增加了復(fù)合擴(kuò)增基因座的選擇范圍和數(shù)量，充分發(fā)揮了復(fù)合擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)。熒光檢測(cè)法雖然對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備及附屬耗材的要求較高，但是由于實(shí)現(xiàn)了全部操作自動(dòng)化，包括自動(dòng)灌膠、自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)數(shù)據(jù)收集分析，數(shù)據(jù)更為客觀、可靠，通量高；采用毛細(xì)管電泳技術(shù)，快速高效，分型準(zhǔn)確、重復(fù)性好，系統(tǒng)靈敏度成倍提高，復(fù)合擴(kuò)增的基因座的選擇余地較大；大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行熒光檢測(cè)復(fù)合擴(kuò)增都使用商品化試劑盒，結(jié)果易于比較和參考；總體成本同前者相差不多。因此應(yīng)用復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行熒光檢測(cè)分型是今后的發(fā)展方向。
目前在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用實(shí)踐中常用的商品化的試劑盒主要由AppliedBiosystems公司和Promega公司的生產(chǎn)。但這些試劑盒存在以下問題(1)商品化試劑盒涵蓋的基因座數(shù)量有限，以復(fù)合最多基因座的STRAmpFLSTRIdentifilerTMPCR Amplification Kit(Applied Biosystems生產(chǎn))為例，它包含了CSF1PO，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D2S1338和D19S433等15個(gè)STR基因座，采用它進(jìn)行親子鑒定時(shí)，在需要增加遺傳標(biāo)記時(shí)則遇到困難。其它公司的情況也相似。(2)這些STR基因座都是針對(duì)中國群體以外的群體(主要是白人群體)資料而開發(fā)的，其中有些基因座，比如TPOX，在中國群體的基因頻率分布較差，個(gè)人識(shí)別能力較低。(3)國外商品化試劑盒價(jià)格昂貴，不符合實(shí)際應(yīng)用的需求。
綜上所述，以上不同種類的復(fù)合擴(kuò)增方式，各有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。傳統(tǒng)的復(fù)合擴(kuò)增方法，由于操作簡便，容易實(shí)現(xiàn)，適用范圍廣泛，仍為大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)室所使用。
但是在實(shí)際應(yīng)用中，DNA聚合酶，特別是Taq聚合酶在PCR反應(yīng)過程中，除了依據(jù)堿基互補(bǔ)原則，將引物由5′端向3′端沿單鏈模板DNA向前延伸外，常常在PCR產(chǎn)物的3′末端加一個(gè)額外的堿基，這種非模板延伸的堿基通常是腺苷酸(腺苷酸簡寫為A)，我們把這種現(xiàn)象稱為“加A”。非模板延伸的結(jié)果是PCR產(chǎn)物的雙鏈DNA比目標(biāo)序列長一個(gè)堿基或堿基對(duì)。但是這種“加A”現(xiàn)象并不是百分之百完成。對(duì)于銀染檢測(cè)方法，相同片段相差一個(gè)堿基(或堿基對(duì))會(huì)表現(xiàn)為異常電泳行為，造成分型錯(cuò)誤；而基于熒光檢測(cè)平臺(tái)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)靈敏度大大提高，“加A”不全而導(dǎo)致的“雙尖峰”會(huì)造成分型的混亂。只有清晰尖銳的帶型或峰型才能準(zhǔn)確進(jìn)行分型。因此，要使PCR產(chǎn)物要么全部“加A”，或者全部不加。
有兩個(gè)途徑可促進(jìn)完全“加A”在PCR循環(huán)后加一個(gè)步驟，60℃或72℃孵育30-45分鐘，可以改善“加A”情況。
Magnuson等人(Substrate nucleotide-determined non-templated addition ofadenine by Taq DNA polymeraseimplications for PCR-based genotyping and cloning，Biotechniques，1996年21期700-709頁)研究發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物“加A”程度依賴于模板序列，也就是反向引物序列。這樣每一個(gè)基因座由于反向引物序列的不同“加A”程度也不同。ABI310檢測(cè)PCR產(chǎn)物時(shí)，實(shí)際檢測(cè)的是由熒光標(biāo)記引物延伸的PCR產(chǎn)物的單鏈，5′端標(biāo)記熒光分子，3′末端延伸的模板就是反向引物序列。Brownstein等人(Modulation of non-templated nucleotideaddition by Taq DNA polymeraseprimer modifications that facilitate genotyping，Biotechniques，1996年20期1004-1010頁)發(fā)現(xiàn)，在反向引物5′端加一個(gè)鳥苷酸(簡寫為T)可有效增加“加A”程度；Butler等人(The development of reducedsize STR amplicons as tools for analysis of degraded DNA，Journal of ForensicScience，2003年48期1054-1064頁)采用在反向引物5′端加GTTTCTT的方法來促進(jìn)PCR產(chǎn)物的完全“加A”；Hanson等人(A highly discriminating 21 locusY-STR“Megaplex”system designed to augment the minimal haplotype loci forforensic casework，Journal of Forensic Science，2004年49期40-51頁)在循環(huán)完成后使用72℃孵育120分鐘的方法促進(jìn)“加A”。上述Brownstein和Butler等人的方法雖然可以促進(jìn)單鏈PCR產(chǎn)物的“加A”，但是由于僅僅是在一對(duì)引物中的一條上增加特殊序列，兩條引物的長度相差增大，引物與目標(biāo)片段的結(jié)合速率和延伸速率不匹配，結(jié)果造成擴(kuò)增效率的下降。
發(fā)明內(nèi)容
鑒于TaqDNA聚合酶在PCR過程中的非模板擴(kuò)增會(huì)引起PCR產(chǎn)物長短不一(一些加A而一些沒有加A)，造成分型判斷的錯(cuò)誤，本發(fā)明特別地提出一種新的復(fù)合擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方法。
本發(fā)明的復(fù)合擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方法是在各個(gè)待擴(kuò)增基因座的原始引物對(duì)中的每一引物的5′端分別加上一段非人類基因組的特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)，構(gòu)成待擴(kuò)增基因座的復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)。
在本發(fā)明中，上述待擴(kuò)增基因座的原始引物對(duì)是指可以通過互聯(lián)網(wǎng)從GDB(The Genome Database)數(shù)據(jù)庫(http//www.gdb.org)中檢索到的待擴(kuò)增基因座寡核苷酸引物對(duì)，該原始引物對(duì)能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合，它們被現(xiàn)有的常規(guī)擴(kuò)增方法所采用。同時(shí)，該原始引物對(duì)的序列由待擴(kuò)增基因座的人類基因組序列所決定，且因待擴(kuò)增基因座序列的不同而不同。
在本發(fā)明中，無論是在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)還是兩個(gè)以上的基因座，都應(yīng)該在各個(gè)待擴(kuò)增基因座的原始引物對(duì)中的每一引物的5′端分別加上一段非人類基因組的特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)，以構(gòu)成各個(gè)待擴(kuò)增基因座的復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)。由于每個(gè)待擴(kuò)增基因座都具有一個(gè)原始引物對(duì)，即兩個(gè)原始引物，因此，就每個(gè)待擴(kuò)增基因座來說，都應(yīng)該在其兩個(gè)原始引物的5′端分別加上一段非人類基因組的特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)，從而構(gòu)成用于該待擴(kuò)增基因座的兩個(gè)新的復(fù)合擴(kuò)增引物，即復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)。
若將本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)方法應(yīng)用于二個(gè)基因座的復(fù)合擴(kuò)增體系中，而由互聯(lián)網(wǎng)上得到的該二基因座的原始引物對(duì)假定為Fl-R1和F2-R2，則應(yīng)當(dāng)以上述特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)與該二基因座的原始引物對(duì)Fl-R1、F2-R2構(gòu)成新的復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)，即第一個(gè)基因座的復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)為5′-GTTCTT-F1-3′5′-GTTCTT-R1-3′第二個(gè)基因座的復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)為5′-GTTCTT-F2-3′5′-GTTCTT-R2-3′將上述新的復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)用于復(fù)合擴(kuò)增體系中，所得到的PCR產(chǎn)物可以采用銀染方式檢測(cè)。
若在上述復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)中的引物之一的5′端上進(jìn)一步標(biāo)記與熒光檢測(cè)儀配套的熒光標(biāo)記物“YG”，就可以構(gòu)成如下二對(duì)帶熒光標(biāo)記物的熒光復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)5′-GTTCTT-F1-3′5′-YG-GTTCTT-R1-3′5′-GTTCTT-F2-3′5′-YG-GTTCTT-R2-3′當(dāng)然，也可以構(gòu)成如下二對(duì)帶熒光標(biāo)記物的熒光復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)5′-YG-GTTCTT-F1-3′5′-GTTCTT-R1-3′5′-YG-GTTCTT-F2-3′5′-GTTCTT-R2-3′
另外，還可以構(gòu)成如下二對(duì)帶熒光標(biāo)記物的熒光復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)5′-GTTCTT-F1-3′5′-YG-GTTCTT-R1-3′5′-YG-GTTCTT-F2-3′5′-GTTCTT-R2-3′或者構(gòu)成如下二對(duì)帶熒光標(biāo)記物的熒光復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)5′-YG-GTTCTT-F1-3′5′-GTTCTT-R1-3′5′-GTTCTT-F2-3′5′-YG-GTTCTT-R2-3′利用這種帶熒光標(biāo)記物的熒光復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，所得到的PCR產(chǎn)物可以使用熒光檢測(cè)方式進(jìn)行檢測(cè)。在上述帶熒光標(biāo)記物的熒光復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)中，“YG”表示熒光標(biāo)記物，它可以采用現(xiàn)有的市售熒光標(biāo)記物，如FAM、HEX、VIC、NED、PET等。
本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)方法也可應(yīng)用于二個(gè)以上基因座的復(fù)合擴(kuò)增體系中，如三個(gè)或四個(gè)、六個(gè)基因座的復(fù)合擴(kuò)增體系中，其復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)或熒光復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)的產(chǎn)生方法與上面的方式完全相同。
如圖1所示，在使用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增時(shí)，每一個(gè)PCR反應(yīng)實(shí)際包含兩個(gè)連續(xù)的過程。
第一個(gè)過程在開始的幾個(gè)循環(huán)時(shí)，是5′端加有非人類基因組序列GTTCTT的位點(diǎn)特異性引物(即復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)或熒光復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)，圖1中所示為采用熒光復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì))在起作用，啟動(dòng)復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)，將目標(biāo)靶序列擴(kuò)增，同時(shí)將非人類基因組序列整合到所擴(kuò)增的片段上。
第二個(gè)過程整合了非人類基因組序列GTTCTT的擴(kuò)增片段在經(jīng)過第一個(gè)過程的逐漸成倍增加，做為PCR反應(yīng)體系中的主要模板DNA，同新的熒光復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)(或復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì))完全匹配結(jié)合，使得擴(kuò)增反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。這一過程中由于模板DNA同熒光復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)(或復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì))的匹配堿基數(shù)量的增加，引物同模板DNA的結(jié)合速率相應(yīng)提高，從而提高了擴(kuò)增效率。
在本發(fā)明中，使用特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)同原始引物相加后，具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)(1)可以促進(jìn)目的片段正反雙鏈的完全加A，消除相同片段加A不全造成的分型錯(cuò)誤。(2)引物對(duì)中的每條引物均加上特殊序列，兩條引物的長度差距較原來減少或相同，兩條引物同目標(biāo)片段的結(jié)合速率和延伸速率更加匹配，提高了擴(kuò)增效率。(3)在擴(kuò)增進(jìn)行幾個(gè)周期后，新的復(fù)合擴(kuò)增引物組合同待擴(kuò)增片段的匹配堿基數(shù)較原始引物對(duì)增加了六個(gè)，可以提高復(fù)合擴(kuò)增的特異性和效率。(4)本發(fā)明方案中的總引物數(shù)目沒有新的增加，有利于擴(kuò)增條件的優(yōu)化和復(fù)合擴(kuò)增的進(jìn)行。(5)新的復(fù)合擴(kuò)增引物組合的5′端結(jié)構(gòu)相同，引物間相互反應(yīng)的可能性相對(duì)較小，有利于復(fù)合PCR的進(jìn)行。
與普通原始引物的PCR產(chǎn)物作比較，在采用原始引物進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增時(shí)，由于TaqDNA聚合酶的非模板擴(kuò)增作用，產(chǎn)物中加A和不加A的兩種片段在變性和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中會(huì)造成帶型的模糊和混亂，如圖2所示。
而采用本發(fā)明的復(fù)合擴(kuò)增引物進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增時(shí)，PCR產(chǎn)物的所有片段完全加A，PCR產(chǎn)物在變性和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中不會(huì)造成帶型的模糊和混亂，如圖3所示。
如圖4所示，應(yīng)用毛細(xì)管電泳激光熒光檢測(cè)法(用ABI310熒光檢測(cè)儀)對(duì)原始引物的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測(cè)時(shí)，加A不全的影響則更為明顯，其PCR產(chǎn)物的峰型變寬，雙尖峰型說明有兩種不同的PCR產(chǎn)物。
如圖5所示，應(yīng)用毛細(xì)管電泳激光熒光檢測(cè)法對(duì)本發(fā)明中復(fù)合擴(kuò)增引物的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測(cè)時(shí)可以看到，PCR產(chǎn)物的峰型尖銳，易于判讀和分析。
需要說明的是Butler等人使用在反向引物的5′端增加GTTTCTT序列的方法來促進(jìn)熒光標(biāo)記引物的3′端完全加A(其PCR反應(yīng)的過程如圖6、7所示)，這個(gè)方法從檢測(cè)意義上可以滿足分型準(zhǔn)確的要求，但是卻會(huì)影響復(fù)合擴(kuò)增的效率。由于反向引物較原引物增加了GTTTCTT序列，根據(jù)Tm＝4(G+C)+2(A+T)的計(jì)算公式，反向引物的退火溫度較原引物增加了18℃，造成兩條引物退火溫度的差異較原來也相應(yīng)增加了18℃；同時(shí)標(biāo)記熒光分子的正向引物和帶有GTTTCTT序列的反向引物長度不相同，正向引物同基因組DNA、產(chǎn)物1和產(chǎn)物3的連接速率快，延伸效率高，而堿基數(shù)量長了7個(gè)的反向引物同基因組DNA、產(chǎn)物2和產(chǎn)物4的連接速率慢，延伸效率低，直接影響擴(kuò)增效率。
因此，與Butler等人使用的方法相比較，本發(fā)明的方法可以明顯地提高擴(kuò)增效率。
本發(fā)明的內(nèi)容結(jié)合以下實(shí)施例作更進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于實(shí)施例中所涉及的內(nèi)容。
圖1是使用本發(fā)明所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增時(shí)的PCR反應(yīng)過程圖。
圖2是使用原始引物的PCR產(chǎn)物使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
圖3是使用本發(fā)明復(fù)合擴(kuò)增引物的PCR產(chǎn)物使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
圖4是使用原始引物(帶熒光標(biāo)記物)的PCR產(chǎn)物熒光檢測(cè)結(jié)果圖。
圖5是使用本發(fā)明熒光復(fù)合擴(kuò)增引物的PCR產(chǎn)物熒光檢測(cè)結(jié)果圖。
圖6是使用Butler等人所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增時(shí)的PCR第一階段反應(yīng)過程圖。
圖7是使用Butler等人所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增時(shí)的PCR第二階段反應(yīng)過程圖。
圖8是實(shí)施例1中采用熒光復(fù)合擴(kuò)增引物的PCR產(chǎn)物熒光檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1在本實(shí)施例中，我們選用以下四個(gè)基因座DYS510、DYS520、DYS542和DYS561。
通過互聯(lián)網(wǎng)，從GDB(The Genome Database)數(shù)據(jù)庫(http//www.gdb.org)中檢索到上述四個(gè)基因座的原始引物對(duì)為DYS510 Y4C113F′ (5′--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)Y4C113R′ (5′--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)DYS520 Y4C16fF′ (5′--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)Y4Cl6fR′ (5′--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)DYS542 Y4C37F′ (5′--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)Y4C37R′ (5′--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)
DYS561 Y4C87F′ (5′--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)Y4C87R′ (5′--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)依照本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)方法，得到新的復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)為NDP 510 510F′(5′--GTTCTT--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)510R′(5′--GTTCTT--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)NDP 520 520F′(5′--GTTCTT--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)520R′(5′--GTTCTT--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)NDP 542 542F′(5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)542R′(5′--GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)NDP 561 561F′(5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)561R′(5′--GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)由于DYS520/DYS561與DYS542/DYS561的擴(kuò)增片段大小彼此兩兩重疊，我們使用了市售的兩種顏色的熒光標(biāo)記物FAM和HEX標(biāo)記每個(gè)基因座的引物對(duì)中的后引物。藍(lán)色熒光標(biāo)記物FAM標(biāo)記DYS520和DYS542，綠色熒光標(biāo)記物HEX標(biāo)記DYS510和DYS561，得到帶熒光標(biāo)記物的熒光復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)NDP 510 510F′(5′--GTTCTT--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)510R′(5′--HEX--GTTCTT--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)NDP 520 520F′(5′--GTTCTT--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)520R′(5′--FAM--GTTCTT--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)NDP 542 542F′(5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)542R′(5′--FAM--GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)NDP 561 561F′(5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)561R′(5′--HEX--GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)為了進(jìn)一步說明本實(shí)例中所設(shè)計(jì)引物的使用方法和使用效果，下面繼續(xù)說明本實(shí)施例中所設(shè)計(jì)引物用于復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)的具體過程及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果。
PCR反應(yīng)體系總體積37.5μl，DNA模板約10ng、dNTP 8.0μL(0.2mMol/l)、Taq酶(申能博采，國產(chǎn))2u、10×buffer 3.75μl、Mg2+3μl(2.25mmol/L)、引物混合物2.3μMol(含有四條熒光標(biāo)記引物，DYS5101μMol，DYS5200.42μMol，DYS5420.36μMol，DYS5610.52μMol)。
PCR擴(kuò)增參數(shù)94℃3分鐘94℃30秒58℃50秒72℃30秒30個(gè)循環(huán)72℃4 45分鐘4℃ 保存上述復(fù)合擴(kuò)增后所得到的PCR產(chǎn)物使用ABI310遺傳分析儀(PE美國)檢測(cè)分析。PCR產(chǎn)物0.1μl，LS300 ROX size standard 0.2μl，Hi-DiTMformamide13μl，混勻編號(hào)，放入自動(dòng)進(jìn)樣盤。電進(jìn)樣15000V、5s。電泳15000v，24分鐘。Date Collection軟件收集數(shù)據(jù)，Genescan3.7分析數(shù)據(jù)，用修改過的4-Y-STR在Genetype3.7自動(dòng)分型。等位基因的辨認(rèn)通過與等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物比較來確認(rèn)，窗口范圍+/-0.5bp。
本實(shí)施例中的PCR產(chǎn)物熒光檢測(cè)結(jié)果如圖8所示。圖中的藍(lán)色標(biāo)記(用標(biāo)號(hào)1指示)的為DYS520和DYS542，綠色標(biāo)記(用標(biāo)號(hào)2指示)的為DYS510和DYS561，紅色標(biāo)記(用標(biāo)號(hào)3指示)的為ROX內(nèi)標(biāo)，genescan軟件分析結(jié)果顯示檢測(cè)到FAM標(biāo)記的181bp和250bp大小的兩個(gè)片段，HEX標(biāo)記的202bp和270bp兩個(gè)片段。
采用本實(shí)施例設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行多基因座擴(kuò)增后，其擴(kuò)增產(chǎn)物生成量大，毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)器檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)，檢測(cè)到的產(chǎn)物峰型細(xì)長高挑，為進(jìn)一步的分型打下了良好的基礎(chǔ)。同時(shí)，所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過測(cè)序，證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA序列與目的DNA片段序列一致。
實(shí)施例2在本實(shí)施例中，我們選用以下六個(gè)基因座DYS510，DYS520，DYS531，DYS533，DYS542，DYS561。
通過互聯(lián)網(wǎng)，從GDB(The Genome Database)數(shù)據(jù)庫(http//www.gdb.org)中檢索到上述六個(gè)基因座的原始引物對(duì)為DYS510 Y4C113F′(5′--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)
Y4C113R′ (5′--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)DYS520Y4C16fF′ (5′--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)Y4C16fR′ (5′--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)DYS531Y4C212f′ (5′--GACCCACTGGCATTCAAATC--3′)Y4C212r′ (5′--TGCTCCCTTTCTTTGTAGACG--3′)DYS533Y4C215f′ (5′--CATCTAACATCTTTGTCATCTACC--3′)Y4C215r′ (5′--TGATCAGTTCTTAACTCAACCA--3′)DYS542Y4C37F′ (5′--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)Y4C37R′ (5′--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)DYS561Y4C87F′ (5′--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)Y4C87R′ (5′--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)依照本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)方法，得到新的復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)為NDP 510510F′ (5′--GTTCTT--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)510R′ (5′--GTTCTT--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)NDP 520520F′ (5′--GTTCTT--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)520R′ (5′--GTTCTT--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)NDP 531531F′ (5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)531R′ (5′--GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)NDP 533533F′ (5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)533R′ (5′--GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)NDP 542542F′ (5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)542R′ (5′--GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)NDP 561561F′ (5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)561R′ (5′--GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)由于DYS520/DYS561與DYS542/DYS561/DYS533的擴(kuò)增片段大小彼此兩兩重疊，我們使用了三種顏色的熒光標(biāo)記物TEMRA(黃色)、FAM(藍(lán)色)和HEX(綠色)標(biāo)記每個(gè)基因座的引物對(duì)中的后引物。FAM標(biāo)記DYS531、DYS520和DYS542，HEX標(biāo)記DYS510和DYS561，TEMRA標(biāo)記DYS533，得到帶熒光標(biāo)記物的熒光復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)
NDP 510510F′ (5′--GTTCTT--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)510R′ (5′--HEX-GTTCTT--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)NDP 520520F′ (5′--GTTCTT--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)520R′ (5′--FAM-GTTCTT--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)NDP 531531F′ (5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)531R′ (5′--FAM-GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)NDP 533533F′ (5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)533R′ (5′-TEMRA-GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)NDP 542542F′ (5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)542R′ (5′--FAM-GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)NDP 561561F′ (5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)561R′ (5′--HEX-GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)本實(shí)施例中所設(shè)計(jì)引物用于復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)的具體過程及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例1相類似，此處不再贅述。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方法，其特征是在各個(gè)待擴(kuò)增基因座的原始引物對(duì)中的每一引物的5′端分別加上一段非人類基因組的特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)，構(gòu)成待擴(kuò)增基因座的復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方法，其特征是在所述復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)中的引物之一的5′端上標(biāo)記熒光標(biāo)記物，構(gòu)成帶熒光標(biāo)記物的熒光復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)。
全文摘要
一種復(fù)合擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方法，其特征是在各個(gè)待擴(kuò)增基因座的原始引物對(duì)中的每一引物的5′端分別加上一段非人類基因組的特殊序列YYP(5′－GTTCTT－3′)，構(gòu)成待擴(kuò)增基因座的復(fù)合擴(kuò)增引物對(duì)。與現(xiàn)有同類方法相比較，發(fā)明的方法可以明顯地提高擴(kuò)增效率。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1597976SQ20041004026
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月20日
發(fā)明者侯一平, 李英碧, 戴浩霖, 王旭東, 吳謹(jǐn) 申請(qǐng)人:四川大學(xué)