專利名稱：一種大腸桿菌不耐熱腸毒素新型突變體及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種大腸桿菌不耐熱腸毒素新型突變體，可作為疫苗中的免疫原性成分，例如抗腸毒素引起的腹瀉的疫苗或作為其他疫苗的佐劑。該突變體可以通過重組DNA技術從編碼野生型大腸桿菌不耐熱腸毒素的基因獲得。
背景技術：
絕大多數(shù)傳染性疾病都是通過粘膜途徑而進入人體。對傳染性疾病的治療，疫苗顯然是一種較為方便、經濟的手段?，F(xiàn)有疫苗大部分仍采用注射方式接種，通過注射途徑的免疫雖能大量增加血液內特異抗體水平，但局部的粘膜抗體水平—抵御病原入侵的第一道屏障—卻較低下，因而疫苗的對機體的保護作用就不可避免地大打折扣另外，不潔注射器還可能帶來新的傳染，如艾滋等。鑒于此，通過粘膜途徑的免疫接種方式便受到越來越多的重視，成為當今免疫學的一個研究熱點。但是，許多抗原單獨作用粘膜部位后，不能誘使機體產生特異的局部分泌抗體，也不能產生系統(tǒng)性的特異抗體，它們必須由具有很強免疫原性的佐劑的輔佐才能發(fā)揮其免疫作用。在粘膜免疫佐劑中，大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)因其強烈的佐劑效應[Rappuoli R，Pizza M，Douce G，Dougan G.Structure and mucosal adjuvanticity of choleraand Escherichia coli heat-labile enterotoxins(霍亂毒素和大腸桿菌不耐熱腸毒素的結構與粘膜佐劑活性).Immunol Today.1999，20(11)493-500.]和免疫調節(jié)作用[Ryan EJ，McNeela E，Pizza M，Rappuoli R，ONeill L，Mills KH. Modulation of innate and acquired immune responsesby Escherichia coli heat-labile toxindistinct pro- and anti-inflammatory effects of the nontoxic ABcomplex and the enzyme activity(大腸桿菌不耐熱腸毒素對先天和獲得免疫響應的調節(jié)無毒AB復合體和具酶活性毒素對促進和抵抗炎癥反應的顯著不同的效應).J Immunol.2000，165(10)5750-5759.Plant A，Williams NA.Modulation of the Immune Response by theCholera-like Enterotoxins(霍亂毒素樣毒素的免疫響應調節(jié)).Curr Top Med Chem.2004，4(5)509-519]而受到更多的關注。
大腸桿菌不耐熱腸毒素是產毒大腸桿菌產生的一種能導致人畜腹瀉的毒素。該毒素為一六聚體蛋白，由一個分子量約28kD的A亞基和5個分子量約為12kD的B亞基(LTB)構成的六聚體(Mr～90kD)。LTA具有ADP-核糖基轉移酶活性，可使胞內cAMP水平升高，細胞流體及電解質流失，進而導致腹瀉。五聚體的B亞單位含有細胞表達神經節(jié)苷脂(GM1)結合位點，通過LTB與GM1的結合，LT得以進入胞內并進而發(fā)揮毒性[Pizza M，Giuliani MM，F(xiàn)ontana MR，Monaci E，Douce G，Dougan G，Mills KH，Rappuoli R，Del Giudice G.Mucosalvaccinesnon toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants(粘膜疫苗大腸桿菌不耐熱腸毒素和霍亂毒素的無毒衍生物作為粘膜佐劑).Vaccine.2001，19(17-19)2534-2541]。野生型LT基因定位于產毒性大腸桿菌的大質粒上[Yamomoto T，Yolota T.Host-dependent，thermosensitive replication of an R plasmid，PJY5，isolated from enterobacter cloacae(從enterotbactercloacae中分離的一R質粒-pJY5-的宿主依賴，溫度敏感復制).J.Bacteriol.，1977，132(3)923-930]，LTA與LTB的通過一完整的DNA序列表達，在LT基因上存在一移碼閱讀框，帶信號肽的LTA前體與帶信號肽的LTB前體被分別表達并被轉運到胞周質而完成切去信號肽的全毒素的組裝。野生LT基因的表達效率極其低下，而要產生具正?；钚缘闹亟MLT須將LT基因完整插入表達載體，但這大大限制了其產率的提高，現(xiàn)報道的最高表達效率也僅46mg/L培養(yǎng)基[馮強 蔡紹皙 楊珺 鄒全明等大腸桿菌不耐熱腸毒素的表達及純化保存策略生物工程學報，2003，19(5)532-537]，很難滿足大規(guī)模生產的需要。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有LT表達效率不高，不利于大規(guī)模生產以作為粘膜免疫佐劑的問題，其首要目的是構建一種大腸桿菌不耐熱腸毒素新型突變體，提高LT的表達效率。
本發(fā)明的第二個目的是在新構建LT突變體的基礎上結合LTA1結構域的突變構建新型無毒或低毒粘膜免疫佐劑。
實現(xiàn)本發(fā)明目的，采用以下技術實現(xiàn)方案根據(jù)LT的X射線衍射結果分析[Sixma TK，Pronk SE，Kalk KH，Wartna ES，van Zanten BA，Witholt B，Hol WG.Crystal structure of a cholera toxin-related heat-labile enterotoxin from E.coli(與霍亂毒素相關的大腸桿菌不耐熱腸毒素的晶體結構).Nature.1991，351(6325)371-377]，LTA與LTB五聚體的直接聯(lián)系在于LTA的A2結構域與LTB五聚體環(huán)孔的相互作用。我們推測LT全毒素的穩(wěn)定性與這一相互作用密切相關，而穩(wěn)定性的增加可能會使得全毒素在胞周質內組裝的增加從而導致LT表達效率的提高。
本發(fā)明構建的一種大腸桿菌不耐熱腸毒素新型突變體LTDITH，是采用定點突變技術將大腸桿菌不耐熱腸毒素A亞單位的相應氨基酸突變而得。
大腸桿菌不耐熱腸毒素由240個氨基酸的LTA亞單位及五個含103氨基酸的LTB亞單位構成，其DNA序列及氨基酸組成如下式表示
LTAAAT GGC GAC AAA TTA TAC CGT GCT GAC TCT AGA CCC CCA GAT GAA ATA AAA CGT TCC GGAAsn Gly Asp Lys Leu Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Pro Pro Asp Glu Ile Lys Arg Ser Gly10 20GGT CTT ATG CCC AGA GGG CAT AAT GAG TAC TTC GAT AGA GGA ACT CAA ATG AAT ATT AATGly Leu Met Pro Arg Gly His Asn Glu Tyr Phe Asp Arg Gly Thr Gln Met Asn Ile Asn30 40CTT TAT GAT CAC GCG AGA GGA ACA CAA ACC GGC TTT GTC AGA TAT GAT GAC GGA TAT GTTLeu Tyr Asp His Ala Arg Gly Thr Gln Thr Gly Phe Val Arg Tyr Asp Asp Gly Tyr Val50 60TCC ACT TCT CTT AGT TTG AGA AGT GCT CAC TTA GCA GGA CAG TCT ATA TTA TCA GGA TATSer Thr Ser Leu Ser Leu Arg Ser Ala His Leu Ala Gly Gln Ser Ile Leu Ser Gly Tyr70 80TCC ACT TAC TAT ATA TAT GTT ATA GCG ACA GCA CCA AAT ATG TTT AAT GTT AAT GAT GTASer Thr Tyr Tyr Ile Tyr Val Ile Ala Thr Ala Pro Asn Met Phe Asn Val Asn Asp Val90 100TTA GGC GTA TAC AGC CCT CAC CCA TAT GAA CAG GAG GTT TCT GCG TTA GGT GGA ATA CCALeu Gly Val Tyr Ser Pro His Pro Tyr Glu Gln Glu Val Ser Ala Leu Gly Gly Ile Pro110 120TAT TCT CAG ATA TAT GGA TGG TAT CGT GTT AAT TTT GGT GTA ATT GAT GAA CGA TTA CATTyr Ser Gln Ile Tyr Gly Trp Tyr Arg Val Asn Phe Gly Val Ile Asp Glu Arg Leu His130 140CGT AAC AGG GAA TAT AGA GAC CGG TAT TAC AGA AAT CTG AAT ATA GCT CCG GCA GAG GATArg Asn Arg Glu Tyr Arg Asp Arg Tyr Tyr Arg Asn Leu Asn Ile Ala Pro Ala Glu Asp150 160GGT TAC AGA TTA GCA GGT TTC CCA CCG GAT CAC CAA GCT TGG AGA GAA GAA CCC TGG ATTGly Tyr Arg Leu Ala Gly Phe Pro Pro Asp His Gln Ala Trp Arg Glu Glu Pro Trp Ile170 180CAT CAT GCA CCA CAA GGT TGT GGA AAT TCA TCA AGA ACA ATT ACA GAT GAT ACT TGT AATHis His Ala Pro Gln Gly Cys Gly Asn Ser Ser Arg Thr Ile Thr Gly Asp Thr Cys Asn190 200GAG GAG ACC CAG AAT CTG AGC ACA ATA TAT CTC AGG AAA TAT CAA TCA AAA GTT AAG AGGGlu Glu Thr Gln Asn Leu Ser Thr Ile Tyr Leu Arg Lys Tyr Gln Ser Lys Val Lys Arg210 220CAG ATA TTT TCA GAC TAT CAG TCA GAG GTT GAC ATA TAT AAC AGA ATT CGG GAT GAA TTAGln Ile Phe Ser Asp Tyr Gln Ser Glu Val Asp Ile Tyr Asn Arg Ile Arg Asn Glu Leu230 240LTBGCT CCC CAG TCT ATT ACA GAA CTA TGT TCG GAA TAT CGC AAC ACA CAA ATA TAT ACG ATAAla Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile
10 20AAT GAC AAG ATA CTA TCA TAT ACG GAA TCG ATG GCA GGT AAA AGA GAA ATG GTT ATC ATTAsn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile30 40ACA TTT AAG AGC GGC GCA ACA TTT CAG GTC GAA GTC CCG GGC AGT CAA CAT ATA GAC TCCThr Phe Lys Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser50 60CAA AAA AAA GCC ATT GAA AGG ATG AAG GAC ACA TTA AGA ATC ACA TAT CTG ACC GAG ACCGln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu Thr70 80AAA ATT GAT AAA TTA TGT GTA TGG AAT AAT AAA ACC CCC AAT TCA ATT GCG GCA ATC AGTLys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser90 100ATG GAA AACMet Glu Asn103上式中的數(shù)字表示氨基酸序號。
突變體LTDITH的特征在于該蛋白質在229、230、232、233位氨基酸殘基的改變，它們由Glu、Val、Ile、Tyr分別改變?yōu)樘於彼酇sp、異亮氨酸Ile、蘇氨酸Thr和組氨酸His。由于有這4個氨基酸的突變，LTDITH具有比重組LT產率高、結構穩(wěn)定、毒性低的優(yōu)點，而免疫原性則沒有改變。
上述突變體的制備包括以下步驟1、新型大腸桿菌不耐熱腸毒素突變體的構建2、重組工程菌的表達3、重組LT及重組LTDITH的純化與保存以下是對上述獲得的新型大腸桿菌不耐熱腸毒素突變體的性質的測定1、表達產率的比較重組LT及重組LT突變體LTDITH 5L發(fā)酵，取發(fā)酵各時點重組菌進行Tricine-SDS-PAGE觀察LT表達的差異[附圖1]。發(fā)酵結束后收集細菌，破菌收取上清液進行純化，統(tǒng)計純化得率得到如下結果。重組LT為46mg/L培養(yǎng)基；重組LTDITH為160mg/L。
2、結構穩(wěn)定性的比較(1)純化的重組LT及LTDITH進行10％SDS-PAGE，觀察二者的電泳行為[附圖2]，LTDITH六聚體成分保持得更好。
(2)LT及LTDITH突變體在胰酶(胰酶毒素＝1∶100摩爾濃度)37□作用15min、30min和1h后，進行Tricine-SDS-PAGE[附圖3]，由圖可見重組LT在胰酶消化后大量出現(xiàn)LTA1片段，而重組LTDITH則更加穩(wěn)定。
(3).HPLC檢測LT與LTDITH的穩(wěn)定性A.平衡層析柱將裝于Agilent HPLC儀上的OHpak SB-800柱用TEAN(pH7.3)在0.25mL/min流速下進行平衡。
B.上樣將LT及LTDITH用上樣針上樣50μL，確保上樣量一致。
C.用TEAN(pH7.3)在0.25mL/min流速下洗脫樣品。
D.記錄280nm的吸收值A280。
E.用含1％SDS的TEAN(pH7.3)平衡層析柱。
F.各樣品上樣前加SDS至終濃度為1％，用與B中同體積同樣品量上柱。
G.用含1％SDS的TEAN(pH7.3)對柱內樣品進行洗脫。
H.記錄280nm的吸收值A280。
I.得結果如附圖4所示，由圖可見，在含1％SDS緩沖液洗脫下LTDITH六聚體保持得更好，即穩(wěn)定性更好。
3、毒性的比較用Patent-mouse毒性檢測實驗進行。具體如下(1)3組(5只/組)6周齡雌性C57BL/6小鼠斷食不斷水24h，先飼以300μL胃酸中和液。
(2)10min后，3組分別飼以300μL TEAN(pH7.3)、含100μgLT的TEAN(pH7.3)、含100μgLTDITH的TEAN(pH7.3)。
(3)繼續(xù)斷食不斷水，3h后將動物處死，小心從幽門至肛門取其腸段(gut)并稱重，同時稱取剩下的畜體(carcass)重量，算出每只小鼠的Gut/Carcass比值(G/C值)，并求出每組的平均值及標準差。
(4)得結果如附圖5所示，由圖可見，重組LTDITH比重組LT的毒性顯著降低。
4、免疫原性的比較3組(5只/組)6周齡雌性C57BL/6小鼠分別用200μL TEAN(pH7.3)，含15μg重組LT的200μL TEAN(pH7.3)，含15μg LTDITH的200μL TEAN進行腹腔免疫，免疫在第0、7、14、21天進行，小鼠在第31天處死，取血清。血清中抗重組LT及抗LTDITH的效價用ELISA法測定。顯色后測定A492nm，血清抗rLTB或抗CTB的效價表示為實驗組A492nm/陰性對照A492nm＞2.1的最高稀釋倍數(shù)，并以平均值±標準差顯示。
結果顯示血清中抗重組LT與抗LTDITH的IgG水平，前者的滴度為105.4±0.55，后者的滴度為105.2±0.84，二者的免疫原性沒有區(qū)別。


附圖1是重組LT(a)與重組LTDITH(b)在M9-CAA培養(yǎng)基中的表達比較LTA用箭頭示出LTB用空心三角示出1.種子菌2.0.5mmol/L IPTG誘導前細菌3-7.0.5mmol/L IPTG誘導后1-5小時細菌。
附圖2是重組LT(a)及重組LTDITH(b)的10％SDS-PAGE比較由圖可見重組LTDITH的六聚體成分保持得更好，即穩(wěn)定性更高。
附圖3是重組LT(a)及重組LTDITH(b)在胰酶消化15min、30min和1h后比較。ALTA，A1LTA1，BmLTB由圖可見重組LT在胰酶消化后大量出現(xiàn)LTA1片段，而重組LTDITH則更加穩(wěn)定。
附圖4是重組LT(a)及重組LTDITH在有(下圖)無(上圖)含1％SDS緩沖液洗脫下的HPLC圖形。AB5全毒素六聚體B5LTB五聚體BLTB單體。由圖可見，在含1％SDS緩沖液洗脫下LTDITH六聚體保持得更好，即穩(wěn)定性更好。
附圖5是Patent-mouse毒性檢測實驗檢測到的重組LT及重組LTDITH的毒性差異*P＜0.05。由圖可見，重組LTDITH比重組LT的毒性顯著降低。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作詳細描述實施例1新型的大腸桿菌不耐熱腸毒素突變體的構建1、克隆野生大腸桿菌不耐熱腸毒素基因(1)用改良的基因組提取方法從野生型產毒性大腸桿菌中提取攜帶編碼LT基因的質粒[馮強 鄒全明蔡紹皙等LT質粒的新法提取及無毒突變體LTS63K的構建和序列分析免疫學雜志，2002，18(5)385-388](2)按GenBank公布的大腸桿菌不耐熱腸毒素基因序列設計如下引物P1GGAATTCCCATATGAAAAATATAAC，P2TAGGATCCTCCTAGCATTAGACAT。
(3)用PCR法從編碼LT基因的質粒上擴增出lt基因，并將該基因克隆入pMD18-T。2、野生型大腸桿菌不耐熱腸毒素基因的第一次改造
為了將大腸桿菌不耐熱腸毒素基因從多克隆位點Nde及BamH插入表達載體pET11c，先將基因內的Nde酶切位點進行不改變氨基酸組成的突變，突變引物如下P3CTCCTGTTCGTATGGGTGAGGGCTG；P4CTCACCCATACGAACAGGAGGTTTC。P3、P4結合1、(2)中的引物P1、P2通過重疊延伸法將編碼LTY109的堿基由TAT突變?yōu)門AC。該突變不被Nde I識別，但編碼的氨基酸殘基不變[馮強 鄒全明蔡紹皙等LT質粒的新法提取及無毒突變體LTS63K的構建和序列分析免疫學雜志，2002，18(5)385-388]，突變后的lt基因片段重新克隆入pMD18-T形成pMD18-LT。
3、大腸桿菌不耐熱腸毒素新型突變體(LTDITH)的構建設計如下引物P5CAGATATTGACACACATAACAGAATTC；P6ACTGATAGTCTGAAAATATCTGCCT，以pMD18-LT作模板，用TaKaRa MutanBEST Kit(大連)按產家給出的操作步驟進行突變得pMD18-LTDITH，由TaKaRa(大連)公司測序驗證突變正確性。
4、重組表達載體及重組工程菌的構建將pMD18-LT及pMD18-LTDITH分別用Nde和BamH雙酶切獲得目的基因后插入經同樣雙酶切的載體pET11c，得到pET11c-LT及pMD11c-LTDITH，重組質粒轉化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)獲得重組工程菌。
實施實例2新型大腸桿菌不耐熱腸毒素突變體的表達取新轉重組質粒的E.coli BL21(DE3)單菌落于含4mL LB培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)8h。按50μL菌液接種500mL LB培養(yǎng)基在燒瓶中繼續(xù)培養(yǎng)8h至A600nm≈1.5。同時對試管中細菌質粒進行鑒定，取質粒正確的種子菌500mL接種。將種子菌接種于5L改良M9-CAA培養(yǎng)基，抗生素濃度為Amp 100μg/mL。在BIOSTAT 10L自控發(fā)酵罐中發(fā)酵3h后流加補料2L，補料成分20％葡萄糖，8％胰蛋白胨，8％酵母提取物。A600nm≈30時加IPTG至終濃度為0.5mmol/L進行誘導。誘導5小時后4離心收菌[馮強 蔡紹皙 楊珺 鄒全明等大腸桿菌不耐熱腸毒素的表達及純化保存策略生物工程學報，2003，19(5)532-537]。
實施實例3重組LT及重組LTDITH的純化與保存將離心收集的濕菌用10倍體積的TEAN(pH7.3)緩沖液重懸，高壓均質機70MPa破菌3次，油鏡檢查破菌效果；細胞破碎液16000g×30min 4℃離心收集上清液；上清液16000g×30min 4℃離心棄沉淀；上清過0.22μm濾膜，收集濾液；用TEAN(pH7.3)1.5mL/min流速平衡Immobilized D(+)-galactose親和柱(Pierce，美國)，調校A280nm基線。將經過超濾的上清以1.5mL/min流速上柱。待上樣200mL后，用TEAN(pH7.3)緩沖液沖洗雜蛋白至A280nm回復至基線；用含0.3mol/L半乳糖(Galactose)洗脫緩沖液洗脫結合于柱上的LT或LTDITH，收集洗脫峰；合并洗脫峰，測定蛋白濃度；純化出的LT通過Lowery法測定濃度馬上用凍干機凍干后保存于4[馮強 蔡紹皙 楊珺 鄒全明等大腸桿菌不耐熱腸毒素的表達及純化保存策略生物工程學報，2003，19(5)532-537]。
權利要求
1.一種大腸桿菌不耐熱腸毒素突變體，其特征在于在A亞單位第229、230、232、233位其中一個或多個氨基酸被突變?yōu)?，即在?29位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)樘於彼?，?30位氨基酸由纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?32位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸，第233位氨基酸由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸，該新型突變體命名為LTDITH。
2.權利要求1所述的一種大腸桿菌不耐熱腸毒素突變體的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟(一)新型大腸桿菌不耐熱腸毒素突變體的構建(1)克隆野生大腸桿菌不耐熱腸毒素基因(2)對野生型大腸桿菌不耐熱腸毒素基因的第一次改造為了將大腸桿菌不耐熱腸毒素基因從多克隆位點Nde及BamH插入表達載體pET11c，先將基因內的Nde酶切位點進行不改變氨基酸組成的突變，突變引物如下P3CTCCTGTTCGTATGGGTGAGGGCTG；P4CTCACCCATACGAACAGGAGGTTTC。P3、P4結合1、(2)中的引物P1、P2通過重疊延伸法將編碼LTY109的堿基由TAT突變?yōu)門AC，該突變不被Nde I識別，但編碼的氨基酸殘基不變，突變后的1t基因片段重新克隆入pMD18-T形成pMD18-LT；(3)大腸桿菌不耐熱腸毒素新型突變體LTDITH的構建設計如下引物P5CAGATATTGACACACATAACAGAATTC；P6ACTGATAGTCTGAAAATATCTGCCT，以pMD18-LT作模板，用TaKaRa MutanBEST Kit(大連)按廠家給出的操作步驟進行突變得pMD18-LTDITH，測序驗證突變正確性；(4)重組表達載體及重組工程菌的構建將pMD18-LT及pMD18-LTDITH分別用Nde和BamH雙酶切獲得目的基因后插入經同樣雙酶切的載體pET11c，得到pET11c-LT及pMD11c-LTDITH，重組質粒轉化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)獲得重組工程菌。(二)重組工程菌的表達(三)重組LT及重組LTDITH的純化與保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大腸桿菌不耐熱腸毒素新型突變體及其制備方法，可作為疫苗中的免疫原性成分，例如抗腸毒素引起的腹瀉的疫苗或作為其他疫苗的佐劑。該突變體通過重組DNA技術從編碼野生型大腸桿菌不耐熱腸毒素的基因獲得，其特征在于該蛋白質在229、230、232、233位氨基酸殘基的改變，它們由Glu、Val、Ile、Tyr分別改變?yōu)樘於彼酇sp、異亮氨酸Ile、蘇氨酸Thr和組氨酸His。由于有這4個氨基酸的突變，使其具有比重組LT產率高、結構穩(wěn)定、毒性低的優(yōu)點，而免疫原性則沒有改變。
文檔編號C12N15/31GK1696291SQ20041004023
公開日2005年11月16日 申請日期2004年7月15日 優(yōu)先權日2004年7月15日
發(fā)明者鄒全明, 馮強, 楊珺, 羅萍, 張衛(wèi)軍, 毛旭虎 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學