用Alu重復序列基因擴增引物且無需DNA抽提的檢測血漿游離DNA的定量PCR方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明旨在提供一種能反映運動員過度訓練情況的人血漿游離DNA水平的定量PCR檢測方法，該方法的擴增引物特別設計，只需一滴指尖或靜脈血、無需DNA抽提、3小時就可檢測出血漿游離DNA水平。若想數(shù)值能更準確，以及動態(tài)反應過度訓練過程，可以選擇訓練前、訓練后即刻以及訓練后的不同時間來指尖采血或靜脈抽血，檢測血漿游離DNA的水平，動態(tài)觀察和比較。
【背景技術】
[0002]目前檢測血漿游離DNA水平的方法有彗星檢測或稱為單細胞凝膠電泳試驗、血漿DNA的熒光定量測定和定量PCR方法。第一種方法的長處是可檢測單細胞水平的DNA損傷，但取材到的細胞不一定能反映血漿總的DNA損傷程度；第二種方法要進行血漿DNA的抽提之后才可進行，且敏感性不是很高，而第三種的定量PCR方法所選用的擴增基因有肌肉生長抑制素基因(擴增片段88 bp)、β球蛋白基因(擴增片段189 bp)和多位點L1PA2基因(擴增片段90 bp和222 bp)的擴增，盡管它們的敏感性高，但大多也需先進行血漿或血清的DNA抽提才能有較好的擴增結果。在應用中需要一種用血量少且無需進行血漿DNA抽提的測試方法。
[0003]目前，應用七大類生理指標(血睪酮水平、皮質醇水平，睪酮/皮質醇比值，晨脈，Hb水平，血尿素、血清肌酸激酶)的綜合評定來反映是否出現(xiàn)過度訓練及過度訓練的程度，但這些指標均沒有特異性、且常常滯后，不能早期、敏感、準確地反映運動員過度訓練情況。因此，體育界非常迫切地希望有某種分子能成為反映過度訓練的早期、敏感監(jiān)測指標，并且檢測方法簡便、快速、需血量少。近年來的研究顯示，血漿游離DNA的水平是一個很好的候選分子。自1982年首次報道了運動通過增多的自由基損傷組織，引起DNA斷裂，使血中出現(xiàn)游離 DNA (cell free DNA) (Davies KJ, Quintanilha AT, Brooks GA, et al.Freeradicals and tissue damage produced by exercise.B1chemB1phys Res Commun.1982;107(4):1198-205.運動產生的自由基和組織損傷。生物化學和生物物理研究通訊。)之后，近幾年來關于運動對血漿游離DNA的影響及意義越來越受到研究者的關注。目前的研究認為不論是一次的大強度訓練(1.Atamaniuk J，Vidotto C，Tschan H，et al.1ncreased concentrat1ns of cell-free plasma DNA after exhaustive exercise.Clin Chem.2004; 50 (9): 1668-70.力竭運動后血漿游離DNA的濃度增加。臨床化學。2.Atamaniuk J， Stuhlmeier KM, Vidotto C， et al.Effects of ultra-marathonon circulating DNA and mRNA express1n of pro- and anti—apoptotic genes inmononuclear cells.Eur J Appl Phys1l.2008; 104(4):711-7.馬拉松對單核細胞促凋亡和抗凋亡的游離DNA和mRNA的影響。歐洲應用生理學雜志。3.Beiter Tl，F(xiàn)ragassoA， HudemannJ， et al.Short-term treadmill running as a model for studyingcell-free DNA kinetics in viv0.Clin Chem.2011; 57 (4):633-636.短期的跑臺跑步運動是一個研究體內游離DNA動態(tài)變化的模型。臨床化學。4.Velders Ml, TreffGl， Machus Kl， et al.Exercise is a potent stimulus for enhancing circulatingDNase activity.ClinB1chem.2014; 47 (6): 471-474.運動是一個增強循環(huán) DNA 酶活性的潛在刺激因素。臨床生化。5.Atamaniuk J，Vidotto C，Kinzlbauer M，et al.Cell-free plasma DNA and purine nucleotide degradat1n markers followingweightlifting exercise.Eur J Appl Phys1l.2010; 110 (4): 695-701.舉重后的血楽游離DNA和嘌呤核苷酸降解標記物。歐洲應用生理學雜志。)，還是持續(xù)一段時間(慢性)的大強度或大負荷訓練(1.Fatouros IG，Destouni A，Margonis K，et al.Cell-freeplasma DNA as a novel marker of aseptic inflammat1n severity related toexercise overtraining.Clin Chem.2006; 52 (9): 1820-4.血楽游離 DNA 是一個與過度訓練有關的反映無菌性炎癥嚴重程度的新標記。運動醫(yī)學。2.Breitbach Sl，Tug S，Simon P.Circulating cell-free DNA: an up-coming molecular marker in exercisephys1logy.Sports Med.2012; 42 (7): 565-86.循環(huán)中的游離 DNA:—個將來的運動生理學的分子標記。運動醫(yī)學。)都可使血漿游離DNA的水平迅速(多在運動后的數(shù)分鐘到一、二小時內)升高，且增加幅度明顯(從幾倍到幾十、上百倍不等)。如果是單次的大強度運動則血漿游離DNA清除較快，通常在12小時內恢復正常，而慢性的大強度和大負荷運動則升高的游離DNA水平維持較久，從1天到十來天不等，由運動強度和負荷決定(1.Fatouros IG， Destouni A， Margonis K， et al.Cell-free plasma DNA as a novelmarker of aseptic inflammat1n severity related to exercise overtraining.Clin Chem.2006; 52 (9): 1820-4.血漿游離DNA是一個與過度訓練有關的反映無菌性炎癥嚴重程度的新標記。運動醫(yī)學。2.Breitbach Sl，Tug S，Simon P.Circulatingcell-free DNA: an up-coming molecular marker in exercise phys1logy.SportsMed.2012;42(7):565-86.循環(huán)中的游離DNA: —個將來的運動生理學的分子標記。運動醫(yī)學。)。已發(fā)現(xiàn)多種運動方式，如馬拉松(1.Atamaniuk J，Vidotto C，Tschan H，etal.1ncreased concentrat1ns of cell-free plasma DNA after exhaustive exercise.Clin Chem.2004; 50 (9): 1668-70.力竭運動后血漿游離DNA的濃度增加。臨床化學。2.Atamaniuk J， Stuhlmeier KM, Vidotto C， et al.Effects of ultra-marathonon circulating DNA and mRNA express1n of pro- and anti—apoptotic genes inmononuclear cells.Eur J Appl Phys1l.2008; 104(4):711-7.馬拉松對單核細胞促凋亡和抗凋亡的游離DNA和mRNA的影響。歐洲應用生理學雜志。3 Beiter T1，F(xiàn)ragasso A，HudemannJ, et al.Short-term treadmill running as a model forstudying cell-free DNA kinetics in viv0.Clin Chem.2011; 57 (4):633-636.短期的跑臺跑步運動是一個研究體內游離DNA動態(tài)變化的模型。臨床化學。)、舉重(AtamaniukJ， Vidotto C， Kinzlbauer M， et al.Cell-free plasma DNA and purine nucleotidedegradat1n markers following weightlifting exercise.Eur J Appl Phys1l.2010;110(4):695-701.舉重后的血漿游離DNA和嘌呤核苷酸降解標記物。歐洲應用生理學雜志。)等抗阻或耐力的力竭運動會使血漿游離DNA水平增加。且血中游離DNA的水平與過度運動所致的無菌性炎癥的嚴重程度(Fatouros IG, Destouni A，Margonis K，etal.Cell-free plasma DNA as a novel marker of aseptic inflammat1n severityrelated to exercise overtraining.Clin Chem.2006; 52 (9): 1820-4.血衆(zhòng)游離 DNA是一個與過度訓練有關的反映無菌性炎癥嚴重程度的新標記。運動醫(yī)學。)或運動強度(Fogarty MCI, Hughes CM, Burke G, et al.Exercise-1nduced lipid peroxidat1n:1mplicat1ns for deoxyribonucleic acid damage and systemic free radicalgenerat1n.Environ Mol Mutagen.2011; 52 (1): 35-42.運動誘導的脂質過氧化:DNA損傷和系統(tǒng)性自由基產生的含義。環(huán)境分子突變。)成正比。所以，血漿游離DNA水平被認為是現(xiàn)在最有希望成為反映過度訓練的指標(Breitbach Sl, Tug S, Simon