專利名稱：抑制端粒酶活性的核酶基因hTERT－5'RZ cDNA、重組載體與核酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及抑制端粒酶活性的核酶基因、含該基因的重組載體及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物核酶和核酶的藥學(xué)用途。
背景技術(shù)：
端粒是真核生物染色體末端的一種保護(hù)性結(jié)構(gòu)，正常體細(xì)胞由于末端復(fù)制問(wèn)題，端粒隨細(xì)胞分裂而進(jìn)行性縮短。端粒酶(telomerase)是一種特殊的核糖核酸蛋白質(zhì)聚合物，它能以自身RNA作為模板合成端粒，以彌補(bǔ)復(fù)制造成的端?？s短，使細(xì)胞不會(huì)因端粒耗盡而出現(xiàn)凋亡。另一方面，端粒酶是細(xì)胞周期重要的調(diào)控因素之一，影響著細(xì)胞周期的進(jìn)程。腫瘤細(xì)胞由于端粒酶的激活，一方面維持了端粒的長(zhǎng)度，使細(xì)胞獲得永生；另一方面使細(xì)胞周期縮短，生長(zhǎng)變快。大量的研究已表明，端粒酶的活化與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，端粒酶已成為抗腫瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。
核酶是具有一定結(jié)構(gòu)的小分子RNA，能定點(diǎn)切割靶mRNA，從而抑制基因表達(dá)。劉柏林、屈藝等在“Ribozyme抑制端粒酶活性的腫瘤基因治療”(見《中國(guó)科學(xué)(C輯)》第32卷第2期，P159-164，2002年4月)一文中公開了一種抑制端粒酶活性的teloRZ核酶，將該核酶導(dǎo)入體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞和裸鼠移植瘤，可定點(diǎn)切割hTR(人的端粒酶RNA，即human telomerase RNA)，使之喪失合成端粒DNA的模板功能，從而抑制腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織的生長(zhǎng)。因此，開發(fā)高效、特異抑制端粒酶活性的核酶，是人類攻克癌癥疾病的一項(xiàng)新戰(zhàn)略和重要措施。
屈藝等在“端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核酶hTERT-5’RZ抑制Hela細(xì)胞端粒酶活性的實(shí)驗(yàn)研究”(見《中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志》2002年10月第19卷第5期，P389-392)一文中公開了端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核酶hTERT-5’RZ具有抑制Hela細(xì)胞端粒酶活性的效力，且其端粒酶活性抑制效力優(yōu)于teloRZ核酶，但未公開端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核酶基因hTERT-5’RZ cDNA與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核酶hTERT-5’RZ的結(jié)構(gòu)等關(guān)鍵技術(shù)內(nèi)容，致使所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員無(wú)法實(shí)施。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抑制端粒酶活性的核酶基因——端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核酶基因hTERT-5’RZ cDNA、含該基因的重組載體和重組載體轉(zhuǎn)錄的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核酶hTERT-5’RZ，以實(shí)現(xiàn)核酶作為腫瘤基因治療藥物的應(yīng)用。
現(xiàn)有研究成果表明人類端粒酶由RNA和蛋白質(zhì)組成，它的3個(gè)主要成分包括人端粒酶RNA(human Telomerase RNA，hTR)，端粒酶相關(guān)蛋白(Telomerase Protein 1，TPI)和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT)。hTR和hTERT與端粒酶活性具有密切相關(guān)性，hTERT是端粒酶的催化亞基和活性中心，是決定端粒酶活性的關(guān)鍵因素(見Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of humantelomerase activity with immortal cells and cancer.Science，1994，2662011-2015及Nakamura TM，Morin GB，Chapman KB，et al.Telomerase catalytic subunit homologs fromfission yeast and human.Science，1997，277955-959.)。
本發(fā)明的技術(shù)方案針對(duì)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT mRNA 5’端區(qū)GUC切點(diǎn)設(shè)計(jì)合成端粒酶逆轉(zhuǎn)錄核酶基因，核酶基因由兩條40nt的互補(bǔ)鏈組成。為便于構(gòu)建重組載體，互補(bǔ)鏈兩端分別設(shè)有內(nèi)切酶位點(diǎn)序列和2～3個(gè)保護(hù)堿基，共長(zhǎng)57bp。將兩條互補(bǔ)單鏈退火形成核酶基因，該核酶基因命名為hTERT-5’RZ cDNA，其核苷酸序列如附圖1所述。將合成的核酶基因hTERT-5’RZ cDNA插入兼具體外轉(zhuǎn)錄功能的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的EcoRI-XhoI位點(diǎn)，即獲重組載體，該重組載體命名為pcDNA3.1 hTERT-5’RZ。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1 hTERT-5’RZ用XhoI和EcoRI酶切使之線性化，采用T7/SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，經(jīng)T7RNA聚合酶催化即可轉(zhuǎn)錄出本發(fā)明所述的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核酶，該核酶命名為hTERT-5’RZ，其二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3所述。核酶hTERT-5’RZ和核酶teloRZ組合可形成雙核酶，核酶hTERT-5’RZ與核酶teloRZ的質(zhì)量比為1∶1。
將本發(fā)明所述重組載體pcDNA3.1 hTERT-5’RZ轉(zhuǎn)染至人宮頸癌Hela細(xì)胞株并進(jìn)行端粒酶活性檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，導(dǎo)入核酶hTERT-5’RZ后Hela細(xì)胞端粒酶活性顯著下降，其端粒酶活性抑制效力優(yōu)于TeloRZ核酶，大約為TeloRZ核酶的兩倍左右。
將核酶hTERT-5’RZ和雙核酶用于治療人肝癌裸鼠移植瘤的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，核酶hTERT-5’RZ和雙核酶均能有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。


圖1是本發(fā)明所述核酶基因hTERT-5’RZ cDNA的核苷酸序列；圖2是將合成的核酶基因hTERT-5’RZ cDNA插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)構(gòu)建重組載體的過(guò)程示意圖；
圖3是核酶hTERT-5’RZ的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖；圖4是重組載體的電泳鑒定圖；圖5是端粒酶活性檢測(cè)的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，圖中，1表示第1組(hTERT-5’RZ+teloRZ)，2表示第2組(hTERT-5’RZ)，3表示第3組(teloRZ)，4表示第4組(control RNA)，5表示陰性對(duì)照(lysis-buffer)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1核酶基因hTERT-5’RZ cDNA的設(shè)計(jì)、合成針對(duì)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT mRNA 5’端區(qū)GUC切點(diǎn)，借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)成核酶基因序列，核酶基因由兩條40nt的互補(bǔ)鏈組成(如圖1所示)。為了便于克隆，在核酶基因的5’和3’末端分別設(shè)有EcoRI和XhoI酶切點(diǎn)的序列，并加2～3個(gè)保護(hù)堿基。采用固相亞磷酰胺三酯法(Pon R.T.，Buck G.A.，Hager K.M.et al.DeoxynucleosidephosphoramidatesA new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis.Tetrahedron Lett.221859-1862，1981)，用ABI 3900高通量DNA合成儀(PE公司、BIO-RAD公司有售)合成。使用的固相支持物為可控微孔玻璃珠(購(gòu)自NEW Life Science公司)，單體為核苷亞磷酰胺(購(gòu)自PE Applied Biosystems公司)。從90年代起，國(guó)內(nèi)外有關(guān)核苷酸序列的合成均已專業(yè)化、商品化。因此，也可將所設(shè)計(jì)的核酶基因序列交由有關(guān)專業(yè)公司合成(本發(fā)明中的核酶基因hTERT-5’RZ cDNA曾交由GIBCO-BRL生命技術(shù)公司合成)。
實(shí)施例2重組載體的構(gòu)建構(gòu)建重組載體的過(guò)程如圖2所示。取實(shí)施例1合成并純化的單鏈核酶基因hTERT-5’RZ cDNA片段各33μg，退火成互補(bǔ)雙鏈。用EcoRI和XhoI(均購(gòu)自TakaRa公司)雙酶切、凝膠電泳回收大片段。載體pcDNA3.1(+)(可從Invitrogen公司購(gòu)買)，用EcoRI和XhoI酶切后，電泳回收大片段。載體與核酶基因按摩爾比1∶4用DNA Ligationkit ver.2(購(gòu)自TakaRa公司)方法連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌JM109(購(gòu)自TakaRa公司)，用氨芐青霉素篩選出轉(zhuǎn)化子。用柱式抽提試劑盒(購(gòu)自TakaRa公司)提取質(zhì)粒，酶切鑒定重組子并測(cè)序，得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1 hTERT-5’RZ。隨機(jī)挑選6個(gè)pcDNA3.1 hTERT-5’RZ菌落擴(kuò)增培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI和XhoI酶切后，10％聚丙烯酰胺(PAGE，系Fluka公司產(chǎn)品)凝膠電泳均呈現(xiàn)46bp條帶(見圖4)，與預(yù)期的核酶基因hTERT-5’RZcDNA片段大小一致。挑選克隆1進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與設(shè)計(jì)合成的核酶基因hTERT-5’RZcDNA序列完全一致。
實(shí)施例3體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取核酶hTERT-5’RZ重組質(zhì)粒pcDNA3.1 hTERT-5’RZ用上述XhoI和EcoRI酶切使之線性化，采用T7/SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自寶靈曼公司)，經(jīng)T7RNA聚合酶(購(gòu)自GIBCO-BRL公司)催化以轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的小片段核酶hTERT-5’RZ，用紫外檢測(cè)法進(jìn)行定量，得率為3.5μg RNA/μg質(zhì)粒。核酶hTERT-5’RZ的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3所示。
實(shí)施例4雙核酶的制備將實(shí)施例3所獲取的核酶hTERT-5’RZ與核酶teloRZ按質(zhì)量比1∶1配料，即核酶hTERT-5’RZ10μg、核酶teloRZ10μg與40μl脂質(zhì)體Lipofectamine(購(gòu)自Roche公司)混合即可制成雙核酶hTERT-5’RZ-teloRZ。
核酶teloRZ按劉柏林、屈藝等在“Ribozyme抑制端粒酶活性的腫瘤基因治療”(見《中國(guó)科學(xué)(C輯)》第32卷第2期，P159-164，2004年4月)一文中公開的方法制備。
實(shí)施例5細(xì)胞轉(zhuǎn)染在6孔板中接種5×104個(gè)人宮頸癌Hela細(xì)胞/孔(人宮頸癌Hela細(xì)胞可從ATCC公司購(gòu)買)，用1640培養(yǎng)基(購(gòu)自GIBCO-BRL公司)常規(guī)培養(yǎng)2天后，換用OPTi-MEM培養(yǎng)基(購(gòu)自Roche公司)2ml培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為4組，第1組為10μg hTERT-5’RZ+10μgteloRZ+40μl Lipofectamine；第2組為15μg hTERT-5’RZ+40μl Lipofectamine；第3組為15μg teloRZ+40μl Lipofectamine；第4組為對(duì)照，加入空載體pcDNA-3.1(可從Invitrogen公司購(gòu)買)/XhoI轉(zhuǎn)錄合成的小片段RNA與40μl Lipofectamine。上述各實(shí)驗(yàn)組中的脂質(zhì)體Lipofectamine(購(gòu)自Roche公司)與小片段核酶RNA(溶于160μl OPTi-MEM中)混合后，室溫靜置20min，滴入6孔板培養(yǎng)液中，6小時(shí)后改用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。每24h重復(fù)轉(zhuǎn)染一次，72h后收集細(xì)胞，用于端粒酶活性檢測(cè)。
實(shí)施例6端粒酶活性檢測(cè)離心收集HeLa細(xì)胞，并用無(wú)K+、Ca2+的PBS(購(gòu)自GBC-BRL公司)洗二次，加入100μl TRAP-lysis buffer[10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、1mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA、0.1mmol/L PMSF、5mmol/L β-硫基乙醇，0.5％CHAPs，10％甘油]，充分混勻后冰上放置30min，12000r/min 4℃離心20min，收集上清液，按說(shuō)明書方法進(jìn)行考馬斯亮蘭染色，于紫外分光光度計(jì)(751-GW分光光度計(jì)，惠普上海分析儀器有限公司，產(chǎn)品編號(hào)910389)波長(zhǎng)595nm處測(cè)定蛋白質(zhì)濃度并稀釋為2μg/μl，-70℃凍存?zhèn)溆?。采用kim報(bào)道的TRAP法(見Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of human telomeraseactivity with immortal cells and cancer.Science，1994，2662011-2015)，用端粒酶檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自O(shè)ncogene公司)進(jìn)行端粒酶活性測(cè)定。各實(shí)驗(yàn)組分別取2μg蛋白提取物，加反應(yīng)液[5μlTRAP-buffer，50umol/L dNTP，1μl TS引物，PCR-Grade Water]至終體積50μl。室溫孵育30min，以完成端粒酶介導(dǎo)的在TS引物3’末端進(jìn)行的端粒延伸反應(yīng)。97℃ 10min滅活端粒酶，在冰上向反應(yīng)體系加入1μl Primer Mix和2u Taq酶。在PCR擴(kuò)增儀(PERKINELMER CETUS公司)中進(jìn)行35次循環(huán)擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)94℃，30s；50℃，30s；72℃，90s，最后一次循環(huán)再在72℃延長(zhǎng)10min。并以裂解緩沖液替代細(xì)胞裂解液作為陰性對(duì)照，取40μl PCR產(chǎn)物行12％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，SYBR Green染料(購(gòu)自FMCBioproducts公司)染色，36bp帶顯示定量?jī)?nèi)標(biāo)，梯度帶顯示端粒酶活性。用凝膠掃描分析儀(GIS-1000數(shù)碼凝膠圖象分析系統(tǒng))對(duì)電泳膠條帶灰度進(jìn)行掃描計(jì)數(shù)，36bp帶灰度計(jì)為A1，端粒酶梯度帶灰度總計(jì)為A2，則A2/A1為細(xì)胞端粒酶相對(duì)量。
端粒酶活性檢測(cè)的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖5所示，各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)掃描定量分析所得到的HeLa細(xì)胞端粒酶相對(duì)量見表1。
表1

從圖5和表1可以看出，導(dǎo)入核酶hTERT-5’RZ后HeLa細(xì)胞端粒酶活性顯著下降，其端粒酶抑制效力明顯優(yōu)于核酶teloRZ。兩種核酶的混合物對(duì)端粒酶活性的抑制效果優(yōu)于單個(gè)核酶。
實(shí)施例7核酶治療人肝癌裸鼠移植瘤1.材料與方法1.1試劑與材料人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721(可從ATCC公司購(gòu)買)為本室傳代培養(yǎng)。BALB/C裸鼠(重約20g/只)購(gòu)于四川省抗生素研究所。
RNA轉(zhuǎn)染試劑TransMessangerTMTransfection Reagent為Qiagen公司產(chǎn)品。
1.2SMMC-7721裸鼠移植瘤的建立與程控光照飼養(yǎng)構(gòu)建肝癌裸鼠移植瘤，瘤塊至55mm3大小時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。
1.3用藥實(shí)驗(yàn)將裸鼠分為4組，每組6只(雌雄各半)。第1組為對(duì)照組，每日瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射5μg/只對(duì)照RNA(5μg Control RNA+10μl Enhancer R+TransMessanger Reagent 25μl)，第2組為teloRZ組，每日瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射5μg/只teloRZ(5μg teloRZ+10μl EnhancerR+TransMessanger Reagent 25μl)，第3組為hTERT-5’RZ組，每日瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射5μg/只hTERT-5’RZ(5μg hTERT-5’RZ+10μl Enhancer R+TransMessanger Reagent 25μl)，第4組為雙核酶組，每日瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射5μg/只雙核酶(5μg雙核酶hTERT-5’RZ與teloRZ的質(zhì)量比為1∶1+10μlEnhancer R+TransMessanger Reagent 25μl)。連續(xù)注射14天，14天后統(tǒng)一用斷頸法處死動(dòng)物，測(cè)量腫瘤濕重。
2.結(jié)果用藥14天后核酶對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響見表2。
表2

從表2可以看出，注射核酶的三組裸鼠其瘤塊生長(zhǎng)速度明顯慢于對(duì)照組裸鼠的瘤塊生長(zhǎng)速度。其中，hTERT-5’RZ組、雙核酶組的瘤塊小于teloRZ組。hTERT-5’RZ組的抑瘤率為61％、雙核酶組的抑瘤率為63％、teloRZ組的抑瘤率51％。表明，核酶hTERT-5’RZ和雙核酶較核酶teloRZ能更好地抑制腫瘤生長(zhǎng)。
權(quán)利要求
1.一種抑制端粒酶活性的核酶基因hTERT-5’RZ cDNA，其特征在于它具有附圖1所述的核苷酸序列。
2.一種重組載體，其特征在于它含有權(quán)利要求1所述的核酶基因hTERT-5’RZ cDNA插入序列。
3.一種抑制端粒酶活性的核酶hTERT-5’RZ，其特征在于它具有附圖3所述的結(jié)構(gòu)。
4.一種抑制端粒酶活性的雙核酶，其特征在于主要由核酶hTERT-5’RZ和核酶teloRZ組成，核酶hTERT-5’RZ與核酶teloRZ的質(zhì)量比為1∶1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制端粒酶活性的核酶基因hTERT－5’RZ cDNA、含該基因的重組載體和重組載體轉(zhuǎn)錄的核酶hTERT－5’RZ。核酶基因由兩條40nt的互補(bǔ)鏈組成，將兩條互補(bǔ)單鏈退火即形成核酶基因，其核苷酸序列如附圖1所述。將核酶基因hTERT－5’RZcDNA插入載體pcDNA3.1(+)的EcoRI－XhoI位點(diǎn)，即獲重組質(zhì)粒pcDNA3.1 hTERT－5’RZ。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1 hTERT－5’RZ用XhoI和EcoRI酶切使之線性化，采用T
文檔編號(hào)C12N9/22GK1597958SQ200410040520
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者劉柏林, 屈藝, 劉菽秋 申請(qǐng)人:四川大學(xué)