專利名稱：端粒酶抑制肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制端粒酶的肽，以及所述肽的用途，特別是在癌癥治療方法中的用途。
背景技術(shù)：
端粒酶是一種能穩(wěn)定和延長真核細胞染色體端粒的特化核糖核蛋白復合體，其在細胞存活和復制性壽命中發(fā)揮重要作用。
端粒酶在很多人體體細胞組織中是受到抑制的，但在大部分人類癌癥的腫瘤發(fā)展早期端粒酶則被激活。
端粒酶是保持基因組的完整性和控制細胞壽命所必需的。癌癥細胞通過端粒酶維持端粒結(jié)構(gòu)從而獲得永生化和無限增殖。
端粒酶活性在多種體細胞組織中是受到抑制的，而在大部分癌癥的腫瘤發(fā)展期間則被激活。端粒酶出現(xiàn)在大多數(shù)類型的癌癥中，端粒酶的出現(xiàn)是癌癥發(fā)展所必需的。
目前對端粒酶陽性細胞中端粒酶如何被激活以及其功能是如何受調(diào)節(jié)的所知甚少。激活被認為是腫瘤細胞永生化所必需的；端粒酶的激活誘導基因組不穩(wěn)定化和細胞凋亡。但是，盡管端粒酶活性在癌癥和其它增殖病癥中發(fā)揮作用，但端粒酶的有效抑制劑和抑制端粒酶的方法仍有待于闡明。
因此，本發(fā)明的一個方面是克服或至少減輕現(xiàn)有技術(shù)中的某些問題。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種肽序列，其編碼具有GARTFRRXKRAXRLTSRVK(SEQ ID NO1)、其功能等效物、變體或片段的氨基酸序列的端粒酶抑制肽(TEIPP)，其中X為E或Q。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種肽序列，其編碼具有GARTFRREKRAERLTSRVK(SEQ ID NO2)或GARTFRRQKRAQRLTSRVK(SEQ ID NO3)、其功能等效物、變體或片段的氨基酸序列的端粒酶抑制肽(TEIPP)。
優(yōu)選地，TEIPP的氨基酸序列對應(yīng)于天然TERT氨基酸序列的641至659位氨基酸。
本發(fā)明還包括(作為另一實施方案)編碼端粒酶抑制肽(TEIPP)的核苷酸序列，所述序列選自如下序列a)核苷酸序列，其編碼具有GARTFRRXKRAXRLTSRVK(SEQID NO1)、其功能等效物、變體或片段的氨基酸序列的肽，其中X為E或Q。
b)核苷酸序列，其編碼具有GARTFRREKRAERLTSRVK(SEQID NO2)的氨基酸序列的肽。
c)核苷酸序列，其編碼具有GARTFRRQKRAQRLTSRVK(SEQID NO3)的氨基酸序列的肽。
d)能夠與a)、b)或c)中的序列雜交的核苷酸序列。
e)由于遺傳密碼簡并性而與a)、b)或c)中的序列簡并的核苷酸序列；和f)a)-e)中任一序列的功能等效物、變體或片段。
在本發(fā)明另一實施方案中，提供了抑制端粒酶的組合物，所述組合物包括端粒酶抑制肽(TEIPP)和載體，所述端粒酶抑制肽含有GARTFRRXKRAXRLTSRVK(SEQ ID NO1)、其功能等效物、變體或片段的氨基酸序列，其中X為E或Q；GARTFRREKRAERLTSRVK(SEQ ID NO2)或GARTFRRQKRAQRLTSRVK(SEQ ID NO3)、其功能等效物、變體或片段的氨基酸序列本發(fā)明的另一個實施方式中，抑制端粒酶的組合物還包括另外的端粒酶抑制肽、端粒酶抑制肽1(TEIPP1)、其功能等效物、變體或片段。
本發(fā)明的另一個實施方式中提供了抑制細胞培養(yǎng)物中細胞生長的方法，所述方法包括向細胞培養(yǎng)物施以有效量的端粒酶抑制肽，所述端粒酶抑制肽選自TEIPP、TEIPP1或其組合、其功能等效物、變體或片段。
本發(fā)明的另一個實施方式中提供了誘導細胞死亡的方法，所述方法包括施以有效量的端粒酶抑制肽，所述端粒酶抑制肽選自TEIPP、TEIPP1或其組合、其功能等效物、變體或片段。
本發(fā)明的另一個實施方式中提供了在個體中治療癌癥或其它增殖病癥的方法，所述方法包括對個體施以有效量的端粒酶抑制肽，其中端粒酶抑制肽包括至少一種選自TEIPP和TEIPP1或其功能性等效物變體的肽。
本發(fā)明的另一個實施方式中提供了治療或預(yù)防癌癥或其它增殖病癥的疫苗，其中疫苗包括端粒酶抑制肽，其中端粒酶抑制肽包括至少一種選自TEIPP或TEIPP1的肽。
本發(fā)明的另一個實施方式中提供了通過抑制細胞內(nèi)端粒酶抑制肽的生成而誘導細胞增殖的方法，其中端粒酶抑制肽至少為TEIPP或TEIPP1之一。


圖1.人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的圖示以及TEIPP肽的來源。檢測了來自hTERT的五種肽，分別將其標為A至E。顯示了TEIPP的序列和其推定的α-螺旋結(jié)構(gòu)，并且在兩側(cè)標出了帶正電的殘基和帶負電的殘基。
圖2.顯示了來自端粒酶催化亞基的肽，命名為TEIPP，其以序列-和酶/底物濃度依賴性的方式抑制端粒酶活性。(A)通過從1泳道至10泳道的每一泳道中相差6個核苷酸的重生端粒梯度的定量，放射自顯影顯示出TEIPP對端粒酶活性的抑制作用。來自人乳腺癌細胞的核端粒酶提取物(0.4μg)在存在或不存在不同濃度TEIPP或非規(guī)則(Scrambled)對照肽的情況下在典型端粒酶活性測定實驗中以30℃溫育30分鐘，凝膠電泳分析合成的端粒DNA。顯示了端粒梯度，合成的對照非端粒DNA，不同濃度的TEIPP和非規(guī)則肽。N，存在RNase而阻斷端粒酶活性的陰性對照。(B)端粒酶提取物濃度的增加對TEIPP抑制端粒酶活性的影響。在存在或不存在TEIPP的端粒酶活性分析中使用所示不同濃度的核端粒酶提取物。每泳道內(nèi)的端粒水平顯示了端粒酶活性。(C)端粒酶底物(TS)濃度的增加對TEIPP抑制端粒酶活性的影響。在存在或不存在TEIPP的端粒酶活性分析中包括所示不同濃度的TS。每泳道內(nèi)的端粒水平顯示了端粒酶活性。全部結(jié)果來自至少兩個相似實驗中的一個。
圖3.顯示了TEIPP1和TEIPP協(xié)同地抑制端粒酶活性。(A)通過端粒酶活性測定法，在存在或不存在TEIPP1(0.2～0.8μM)加或減TEIPP非規(guī)則對照肽(0.2～0.8μM)的情況下溫育端粒酶提取物從而測定TEIPP1聯(lián)合TEIPP非規(guī)則肽對端粒酶活性的影響。(B)TEIPP1聯(lián)合TEIPP所產(chǎn)生的影響。結(jié)果為來自三個相似實驗的均值±SD。
圖4.顯示了TEIPP對端粒酶活性的影響以及人乳腺癌細胞培養(yǎng)物中細胞的存活情況。(A)完整細胞中TEIPP1和TEIPP對端粒酶活性的影響。培養(yǎng)的MCF-7細胞與用penetratin偶聯(lián)的TEIPP(7泳道)，TEIPP(6泳道)，TEIPP1加TEIPP(5泳道)，TEIPP1非規(guī)則肽(S1，4泳道)，非規(guī)則TEIPP(S2，3泳道)或S1加S2(2泳道)一起溫育15小時，然后在核裂解物中檢測端粒酶活性。N，端粒酶活性的陰性對照。(B，C)TEIPP1和TEIPP誘導了快速的細胞死亡。在用所示的TEIPP1和TEIPP處理24小時后，相差顯微鏡顯示出大量死亡的漂浮細胞(floating cell)(B)。48小時后，在MCF-7細胞培養(yǎng)物中，細胞數(shù)目大量減少(C)。結(jié)果代表了三個獨立的實驗。
圖5.顯示了TEIPP1和TEIPP的氨基酸缺失對TEIPP抑制端粒酶活性的影響。(A)TEIPP的N-或C-末端區(qū)域的缺失都可以阻斷TEIPP的抑制性活性。測定包括TEIPP和其所示的截短形式的五種肽對端粒酶活性的影響。Ctl，存在RNaseA的對照。TE，不存在合成肽。給出三個相似實驗中的一個實驗的結(jié)果。(B)來自hTERT的多種肽以及多種TEIPP衍生物對端粒酶活性的抑制效果。(C)來自hTEP1的多種肽以及TEIPP1對端粒酶活性的抑制效果。
圖6.顯示了不同蛋白激酶對TEIPP的磷酸化作用。(A)蛋白激酶Cα(PKCα)，ERK1和cdc 2蛋白激酶(CDK1)對TEIPP的磷酸化作用。TEIPP和其非規(guī)則對照肽與所示的不同蛋白激酶在適于蛋白磷酸化的條件下一起溫育(詳見實施例)。(B)不同蛋白激酶對TEIPP的磷酸化差異性地調(diào)節(jié)TEIPP對端粒酶活性的抑制作用。檢測用所示的多種蛋白激酶磷酸化的(P，4和6泳道)和未磷酸化的(N，3和5泳道)的TEIPP的端粒酶抑制活性。C(1泳道)，存在RNaseA的對照。T(2泳道)，不存在任何形式TEIPP時的端粒酶活性。(C)模擬蛋白磷酸化的TEIPP的單氨基酸突變降低了TEIPP的抑制活性。檢測TEIPP、非規(guī)則對照肽(A)、具有T644D突變的TEIPP突變體(B)和具有T655D突變的TEIPP突變體(C)對端粒酶活性的影響。在所示的三種濃度下，T644D和T655D都完全阻斷了TEIPP對端粒酶活性的抑制作用。結(jié)果代表了三個獨立的相似實驗。
發(fā)明詳述本發(fā)明的第一個方面中提供了一種肽序列，其編碼具有GARTFRRXKRAXRLTSRVK(SEQ ID NO1)、其功能等效物、變體或片段的氨基酸序列的端粒酶抑制肽(TEIPP)，其中X為E或Q。
本發(fā)明一個優(yōu)選的方面中提供了一種肽序列，其編碼具有GARTFRREKRAERLTSRV(SEQ ID NO2)或GARTFRRQKRAQRLTSRVK(SEQ ID NO3)、其功能等效物、變體或片段的氨基酸序列的端粒酶抑制肽(TEIPP)。
優(yōu)選地，該氨基酸序列對應(yīng)于天然TERT氨基酸序列的641至659位氨基酸。
申請人已經(jīng)鑒定了代表端粒酶復合體的抑制單元的肽。將所述肽施用于癌細胞培養(yǎng)物導致體內(nèi)端粒酶活性的特異性抑制作用，并誘導所培養(yǎng)癌細胞的顯著性凋亡。此外，申請人發(fā)現(xiàn)所述肽的抑制作用可通過改變帶電殘基和蛋白磷酸化的方法而進一步調(diào)節(jié)。因此，本發(fā)明提供了在治療病癥如惡性腫瘤的治療方式開發(fā)中有用的端粒酶和癌癥抑制劑。
人端粒酶由RNA亞基和一些蛋白組分組成。RNA亞基(hTR)包含端粒DNA逆轉(zhuǎn)錄的模板，而蛋白組分包括人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和與端粒酶共純化的端粒酶相關(guān)蛋白1(hTEP 1)。hTR和hTEP 1廣泛表達于人正常組織中，但hTERT是在細胞永生化的過程中的限速點且伴隨端粒酶活性而表達。重構(gòu)實驗顯示出hTERT和hTR構(gòu)成了端粒酶全酶的最小核心結(jié)構(gòu)。在非永生人類細胞中強制性異位表達hTERT能誘導端粒酶延長和細胞持久生長，這提示hTERT是端粒酶活性的限速點，而抑制端粒酶則導致端粒溶蝕、細胞生長能力削弱，以及高增殖性細胞凋亡。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，hTERT和hTEP 1都是磷蛋白，蛋白激酶Cα將其磷酸化，而蛋白磷酸酶2A將其去磷酸化。磷酸化和去磷酸化可逆地增加和降低端粒酶的活性。
hTERT和hTEP 1是大蛋白，它們的酶活性由端粒酶蛋白亞基之間和之內(nèi)的分子內(nèi)和分子間的相互作用來控制。
端粒酶和端粒酶抑制肽，可來自任意物種，包括人、牛、綿羊、豬、鼠、馬，優(yōu)選哺乳動物。優(yōu)選地，在腫瘤中抑制端粒酶。
此處使用的“端粒酶抑制肽”包括降低端粒酶活性和/或與端粒的相互作用的肽。優(yōu)選地，該肽與端粒酶組分結(jié)構(gòu)相競爭從而降低端粒酶活性。最優(yōu)選地，活性降低是由端粒酶活性的抑制引起的。此處使用的術(shù)語“抑制”或“抑制性”是指活性基本終止的基本抑制作用。
為方便起見，除另有所指外，本發(fā)明的端粒酶抑制劑命名為TEIPP。當用TEIPP時，都包括其功能性等效物，變體和片段。TEIPP是來自TERT序列的端粒酶抑制肽。最優(yōu)選的，TEIPP來自人TERT序列。
此處使用的“來自”包括基本上與TERT區(qū)域相應(yīng)的肽，也包括功能性活性變體。
此處使用的“功能等效物或變體”是指能以相似方式發(fā)揮功能，但可含有缺失、添加或替換而基本上不改變肽序列的活性或功能的序列。所述改變基本上不改變肽活性，而且有效的是，生物學功能沒有或僅有微小的降低。
術(shù)語“片段”是指部分肽序列，其短于全長序列，但以全長序列肽相似的方式發(fā)揮功能。
本說明書全文中，詞語“包含”和該詞語的其它形式，如“comprising”和“comprises”并不排除其它附加物、組分、實體(integers)或步驟。
TEIPP的制備可采用對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說眾所周知的任何技術(shù)，包括但不限于，使用商用肽合成儀器的合成法或TEIPP可從自然來源分離和純化，或隨后進行片段化以獲得所需要的肽。合成TEIPP肽還可獲自商業(yè)來源如Auspep International Pty.Ltd.(維多利亞，澳大利亞)或Chiron Technologies Pty.Ltd.(維多利亞，澳大利亞)本發(fā)明包括的另一個方面為編碼端粒酶抑制肽(TEIPP)的核苷酸序列，所述序列選自如下序列a)核苷酸序列，其編碼具有GARTFRRXKRAXRLTSRVK(SEQID NO1)、其功能等效物、變體或片段的氨基酸序列的肽，其中X為E或Q；b)核苷酸序列，其編碼具有GARTFRREKRAERLTSRVK(SEQID NO2)的氨基酸序列的肽；c)核苷酸序列，其編碼具有GARTFRRQKRAQRLTSRVK(SEQID NO3)的氨基酸序列的肽；d)能夠與a)、b)或c)中的序列雜交的核苷酸序列；e)由于遺傳密碼簡并性而與a)、b)或c)中的序列簡并的核苷酸序列；和f)a)-e)中任一序列的功能等效物、變體或片段。
因此可采用表達編碼TEIPP的核苷酸序列的方法重組制備本發(fā)明的肽序列。
術(shù)語“片段”涉及核酸序列時，是指其短于全長序列，但其能與編碼此處所述端粒酶抑制肽的氨基酸序列的全長核苷酸雜交。
當這些術(shù)語涉及改變的核酸分子時，所述改變不會導致肽編碼區(qū)閱讀框的改變，并且優(yōu)選編碼生物學功能沒有改變或僅有較小降低的肽。
由于遺傳密碼的簡并性，本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括其它編碼相同或功能等效氨基酸序列的核酸序列。所述核苷酸序列的改變可包括能產(chǎn)生相同或功能等效基因產(chǎn)物的不同核苷酸的替換。
TEIPP可獲自序列親水性和電特性分析，該分析鑒定參與端粒酶組分內(nèi)部或之間的分子內(nèi)和/或分子間的相互作用的氨基酸序列。與這些特征相應(yīng)的天然TERT的區(qū)域可選自下述序列CRAVRSLLRSHYREV(SEQ ID NO4)、GPPSTSRPPRPWDTPC(SEQ ID NO5)、CAREKPQGSVAAPEEEDTD(SEQ ID NO6)、GARTFRREKRAERLTSRVK(SEQ ID NO2)、GARTFRRQKRAQRLTSRVK(SEQ ID NO3)和ANPALSSDFKTILD(SEQ ID NO7)或其功能等效物、變體或片段，等等。更優(yōu)選地該區(qū)域相應(yīng)于選自如下的序列7CRAVRSLLRSHYREV21(SEQ IDNO4)、306GPPSTSRPPRPWDTPC321(SEQ ID NO5)、426CAREKPQGSVAAPEEEDTD444(SEQ ID NO6)、641GARTFRREKRAERLTSRVK659(SEQ ID NO2)、641GARTFRRQKRAQRLTSRVK659(SEQ ID NO3)和1119ANPALSSDFKTILD1132(SEQ ID NO7)或其功能等效物變體，等等。優(yōu)選地，TEIPP肽是641GARTFRREKRAERLTSRVK659(SEQ IDNO2)或641GARTFRRQKRAQRLTSRVK659(SEQ ID NO3)或其功能等效物、變體或片段。通過改變帶電殘基可獲得其它功能等效物。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)帶電殘基在端粒酶抑制肽和端粒酶全酶之間的相互作用中起著重要的作用。
優(yōu)選地，TEIPP的分子量約為2421道爾頓。更優(yōu)選地，端粒酶抑制肽顯著小于端粒酶的組分TERT和TEP1(分別為～130,000和300,000道爾頓)優(yōu)選地，TEIPP肽形成α-螺旋，該螺旋的一側(cè)上為帶正電的氨基酸殘基而另一側(cè)上為帶負電/潛在帶負電(磷酸化位點)的氨基酸殘基。更優(yōu)選地，TEIPP螺旋通過受蛋白磷酸化(加入磷酸部分)調(diào)節(jié)的彼此靜電吸引而與端粒酶表面的電化學極化溝發(fā)生相互作用。因此，不受理論限制，本發(fā)明的端粒酶抑制劑可通過如下機制致使癌細胞死亡，所述機制包括通過一種包括靜電力的相互作用與端粒酶內(nèi)部序列競爭，由此抑制端粒酶與端粒之間的相互作用。
優(yōu)選地，TEIPP與端粒酶全酶相互作用。更優(yōu)選地，TEIPP肽形成α-螺旋，該螺旋的一側(cè)上為帶正電的氨基酸殘基而另一側(cè)上為帶負電/潛在帶負電(磷酸化位點)的氨基酸殘基。更優(yōu)選地，TEIPP螺旋通過彼此靜電吸引而與端粒酶表面的電化學極化溝發(fā)生相互作用。所述彼此靜電吸引可受蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)。
磷酸化，和推定磷酸化位點的磷酸化模擬突變可抑制本發(fā)明的肽的抑制功能。因此，磷酸化機制的調(diào)節(jié)，例如降低或抑制蛋白激酶C的磷酸化可增強本發(fā)明的肽對端粒酶的抑制作用。磷酸化機制的實例包括但不限于，涉及蛋白激酶Cα、ERK1和cdc2蛋白激酶的機制。
優(yōu)選的磷酸化調(diào)節(jié)包括但不限于，蘇氨酸或絲氨酸殘基的磷酸化。最優(yōu)選地，通過對至少一個或多個這些潛在磷酸化的殘基去磷酸化而增加對端粒酶的抑制。
在本發(fā)明的另一個方面中提供了抑制端粒酶的組合物，所述組合物包括包含GARTFRREKRAERLTSRVK(SEQ ID NO2)或GARTFRRQKRAQRLTSRVK(SEQ ID NO3)、其功能等效物、變體或片段的氨基酸序列的端粒酶抑制肽(TEIPP)和載體。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面中，抑制端粒酶的組合物還包括另外的端粒酶抑制肽、端粒酶抑制肽1(TEIPP1)、其功能等效物、變體或片段。
TEIPP1和TEIPP可彼此聯(lián)合施用，以提供協(xié)同效應(yīng)，和/或與作為復合物一部分的其它因子聯(lián)合施用。適用的復合物可包括放射性同位素或毒素。優(yōu)選地，低濃度的TEIPP與TEIPP1聯(lián)合使用來抑制端粒酶。不受理論限制，TEIPP1和TEIPP可在受反式機制協(xié)調(diào)的不同位點發(fā)揮其作用。
優(yōu)選地，TEIPP1肽選自下述序列HRAKRHPRRPPRSPG(SEQID NO8)、TRNEKNRPRRRFLC(SEQ ID NO9)、WGVTEEETRRNRQLEVC(SEQ ID NO10)、DSEPTPHLKTRQRR(SEQ ID NO11)或其功能等效物或變體，等等。更優(yōu)選地，所述肽選自下述序列385HRAKRHPRRPPRSPG399(SEQ ID NO8)、599TRNEKNRPRRRFLC612(SEQ ID NO9)、943WGVTEEETRRNRQLEVC959(SEQ ID NO10)、2538DSEPTPHLKTRQRR2551(SEQ ID NO11)或其功能等效物變體，等等，其中數(shù)字對應(yīng)天然TERT分子相應(yīng)的氨基酸。最優(yōu)選地，TEIPP1肽是385HRAKRHPRRPPRSPG399(SEQ ID NO8)或其功能等效物或變體。
優(yōu)選地，施用微摩爾劑量的端粒酶抑制肽。更優(yōu)選地，施用0.1-100μM的端粒酶抑制肽。最優(yōu)選地，TEIPP肽的最大抑制濃度的一半約1.8μM而在約4.2μM時接近完全抑制。
本發(fā)明的組合物可按對個體的如下施用途徑而配制口服、經(jīng)直腸、腸道外(即靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、或皮下)、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(如通過粉劑、軟膏劑或滴劑)、經(jīng)皮、口腔內(nèi)，或作為口或鼻噴霧劑。
本發(fā)明的組合物還可包括能促進肽攝取的適用載體，或者藥學可接受的賦形劑?？稍陔闹屑尤脒m用的載體以便于肽的遞送，所述載體包括那些現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的，包括但不限于，DrosophilaAtennapedia同源域來源的載體肽，即penetratin(C-RQIKIWFQNRRMKWKK)(SEQ ID NO12)。優(yōu)選地，載體和端粒酶抑制劑以等摩爾比制備。
用于胃腸外注射的本發(fā)明的藥用組合物包括藥學可接受的滅菌水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳劑以及用于在使用前重構(gòu)成滅菌注射用溶液或分散液的滅菌粉末。適用的水性和非水性載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑的實例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)及其適用的混合物，植物油(如橄欖油)、和注射用有機酯如油酸乙酯。可通過例如，使用包覆物質(zhì)如卵磷脂、保持需要的微粒大小(在分散液的情況下)和使用表面活性劑來保持合適的流動性。
所述這些組合物還可包括佐劑如防腐劑、保濕劑、乳化劑和分散劑。用多種抗菌素和抗真菌劑例如尼泊金酯類、氯代丁醇、苯酚山梨酸等能夠確保阻止微生物的作用。適當?shù)兀溥€可包括等滲劑如糖、氯化鈉等?？赏ㄟ^包含能延遲吸收的因子如單硬脂酸鋁和明膠而延長注射用藥劑的吸收。
如有需要，以及為了更有效的分配，化合物可結(jié)合緩釋或靶向遞送系統(tǒng)，如聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和微球。
注射用劑型的滅菌處理可采用如下方法，如通過截留細菌的濾器的過濾，或通過結(jié)合無菌固體組合物形式的滅菌劑，其可在使用前溶解在或分散在無菌水中或其它無菌注射用介質(zhì)。
口服給藥的固體劑型包括膠囊、片劑、丸劑、粉劑和顆粒劑。在所述固體劑型中，活性化合物與至少一種惰性、藥學可接受賦形劑和載體混合，所述賦形劑和載體例如檸檬酸鈉或磷酸氫鈣和/或a)填充料或補充劑如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合劑，如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯樹膠，c)保濕劑如甘油，d)崩解劑如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、海藻酸、特定硅酸鹽和碳酸鈉，e)緩溶劑如石蠟，f)吸收促進劑如季銨化合物，g)潤濕劑如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油，h)吸附劑如高嶺土和皂土，和i)潤滑劑如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉和其混合物。在膠囊、片劑和丸劑的情況中，劑型還可包括緩沖劑。
相似類型的固體組合物還可在使用所述賦形劑如乳糖或奶糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的情況下，用作軟和硬填充明膠膠囊的填料。
片劑、糖衣劑、膠囊、丸劑和顆粒劑的固體劑型可采用包衣和外殼如腸衣和其它現(xiàn)有的藥學制劑技術(shù)中眾所周知的包衣進行制備。它們可任選地包含乳濁劑且還可以是一種組合物，所述組合物僅僅或優(yōu)選地在腸道的特定區(qū)域任選地以一種延遲方式釋放活性組分?？捎玫陌窠M合物的實例包括聚合物和蠟。
如有需要，以及為了更有效的分配，化合物可結(jié)合緩釋或靶向遞送系統(tǒng)，如聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和微球。
如果適當，活性化合物還可以是包含一種或多種上述賦形劑的微膠囊劑型。
口服給藥的液體劑型包括藥學可接受的乳化液、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑。除活性化合物外，液體劑型還可包含本領(lǐng)域中通常使用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，助溶劑和乳化劑如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲替甲酰胺、油(特別是，棉籽油、落花生油、胚(germ)油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖脂肪酸酯及其混合物。
除了惰性溶劑，口服組合物還可包括佐劑如濕潤劑、乳化和助懸劑、甜味劑、調(diào)味劑和加香劑。
除活性化合物外，懸浮液還可包含懸浮劑，例如乙氧基化的異十八烷醇、聚氧乙烯山梨糖醇和山梨糖醇酐酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁(aluminum metahydroxide)、皂土、瓊脂-瓊脂、西蓍膠和其混合物。
可將本發(fā)明的化合物與適用的無刺激性賦形劑或載體如可可油、聚乙二醇或栓劑用蠟相混合來制備用于直腸或陰道給藥的組合物其優(yōu)選為栓劑，所述栓劑用蠟在室溫下為固態(tài)而在體溫下為液態(tài)，因此可在直腸內(nèi)或陰道內(nèi)融化而釋放出活性化合物。
本發(fā)明化合物的局部施用劑型包括粉劑、噴霧劑、軟膏劑和吸入劑?；钚曰衔镌跓o菌條件下與藥學可接受載體以及任何需要的穩(wěn)定劑、緩沖液或可能需要的推進劑相混合。
組合物中的TEIPP1或TEIPP還可以綴合或連接其它分子，如抗原、抗體、配體或細胞毒性劑如毒素或放射性同位素。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種抑制細胞培養(yǎng)物中細胞生長的方法，所述方法包括對細胞培養(yǎng)物施以有效量的端粒酶抑制肽，所述端粒酶抑制肽選自TEIPP1、TEIPP或其組合、其功能等效物、變體或片段。
此處使用的“抑制細胞生長”包括但不限于，誘導細胞死亡，顯著降低細胞增殖或誘導細胞衰老。優(yōu)選地，抑制細胞生長與細胞內(nèi)的凋亡相關(guān)。
細胞培養(yǎng)物包括但不限于，原代培養(yǎng)物、轉(zhuǎn)化的細胞系、癌細胞、永生化細胞系或外植體培養(yǎng)物。優(yōu)選地，細胞培養(yǎng)物為乳腺癌細胞培養(yǎng)物。更優(yōu)選地，細胞培養(yǎng)物為PMC42或MCF-7細胞培養(yǎng)物。
優(yōu)選地，施用微摩爾劑量的端粒酶抑制肽。更優(yōu)選地，施用0.1-100μm的端粒酶抑制肽。最優(yōu)選地，TEIPP1和TEIPP肽的最大抑制濃度的一半分別約為0.4μM和1.8μM，而在分別約為1.0μM和4.2μM時接近完全抑制。
TEIPP1和TEIPP可彼此聯(lián)合施用以提供協(xié)同效應(yīng)，和/或與作為復合物一部分的其它因子聯(lián)合施用。適用的復合物可包括放射性同位素或毒素。優(yōu)選地，低濃度的TEIPP與TEIPP1聯(lián)合使用來抑制端粒酶。不受理論限制，TEIPP1和TEIPP可在受反式機制協(xié)調(diào)的不同位點發(fā)揮其作用。
在本發(fā)明的另一個方面中提供了誘導細胞死亡的方法，所述方法包括施以有效量的端粒酶抑制肽，所述端粒酶抑制肽選自TEIPP、TEIPP1或其組合、其功能等效物、變體或片段。
此處使用的“細胞死亡”包括但不限于，凋亡、壞死或溶胞。優(yōu)選地，細胞死亡與凋亡相關(guān)。可以采用(但不限于)漿膜出泡、細胞容積減少、核凝縮和核小體間隙DNA的核內(nèi)降解來表征細胞死亡。
本發(fā)明的另一個方面提供了一種治療個體癌癥或其它增殖病癥的方法，所述方法包括對個體施以有效劑量的端粒酶抑制肽，其中端粒酶抑制肽包括至少一種選自TEIPP1、TEIPP或其功能等效物變體的肽。
TEIPP1和TEIPP可彼此聯(lián)合施用和/或與作為復合物一部分的其它因子聯(lián)合施用。適用的復合物可包括放射性同位素或毒素。優(yōu)選地，低濃度的TEIPP與TEIPP1聯(lián)合使用來抑制端粒酶。不受理論限制，TEIPP1和TEIPP可在受反式機制協(xié)調(diào)的不同位點發(fā)揮其作用。
此處使用的“癌癥”包括惡性腫瘤及其細胞，還包括癌癥和癌前組織和細胞。個體可以來自任何物種，包括人、牛、綿羊、豬、鼠、馬，優(yōu)選哺乳動物。優(yōu)選地，癌癥為上皮組織癌癥如乳腺癌、前列腺癌、腎癌、甲狀腺癌或肺癌、源自中胚層的肉瘤、或源自血液的白血病。
此處使用的術(shù)語“癌前細胞”是指表現(xiàn)出與癌發(fā)展高風險相關(guān)的組織學改變的細胞。實例包括結(jié)腸腺瘤性息肉、皮膚發(fā)育不良的痣和乳腺非典型性過度增生。通常顯示癌前細胞的特定癥狀也用術(shù)語“癌前”來表示，包括發(fā)育不良性痣綜合癥和結(jié)腸息肉綜合癥?！鞍┣啊笔侵付喾N組織的這些細胞或綜合征，而不管所述細胞在臨床上是否可識別。
本發(fā)明的增殖病癥包括，但不限于，與端粒酶活性相關(guān)的或與相對正常狀態(tài)而言增高的端粒酶活性相關(guān)的病癥。
肽的氨基酸序列短于構(gòu)成我們身體組件的蛋白，肽作為營養(yǎng)物要比蛋白更易于吸收且作為藥物更易于遞送至體內(nèi)。
本發(fā)明的端粒酶抑制肽可按對個體的如下施用途徑而配制口服、經(jīng)直腸、腸道外(如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、或皮下)、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(如通過粉劑、軟膏劑或滴劑)、經(jīng)皮、口腔內(nèi)、或作為口或鼻噴霧劑、或用或不用內(nèi)窺鏡進行腫瘤內(nèi)注射。
端粒酶抑制肽可在任何時間施用。優(yōu)選地，在癌癥或增殖病癥診斷后施用端粒酶抑制肽。優(yōu)選地，施用微摩爾抑制劑量的端粒酶抑制肽。更優(yōu)選地，施用0.1-100μM的端粒酶抑制肽。
端粒酶抑制肽可結(jié)合載體施用以便于肽的攝取。適用的載體包括那些現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的，包括但不限于，Drosophila Atennapedia同源域來源的載體肽，即penetratin(C-RQIKIWFQNRRMKWKK)(SEQ ID NO12)。優(yōu)選地，載體和端粒酶抑制劑以等摩爾比制備。
優(yōu)選地，TEIPP肽形成α-螺旋，該螺旋的一側(cè)上為帶正電的氨基酸殘基而另一側(cè)上為帶負電/潛在帶負電(磷酸化位點)的氨基酸殘基。更優(yōu)選地，TEIPP螺旋通過受蛋白磷酸化(加入磷酸部分)調(diào)節(jié)的彼此靜電吸引而與端粒酶表面的電化學極化溝發(fā)生相互作用。
此處使用的“有效量”是指能抑制癌生長或擴散，或緩解增殖病癥或誘導細胞死亡的量。優(yōu)選地，用端粒酶抑制肽對個體進行治療導致癌細胞或增殖病癥細胞的死亡。更優(yōu)選地，端粒酶抑制肽可通過如下機制致使細胞死亡，所述機制包括通過包括靜電力的相互作用與端粒酶內(nèi)部序列競爭，由此抑制端粒酶與端粒之間的相互作用。最優(yōu)選地，用端粒酶抑制肽治療導致與細胞凋亡相關(guān)的細胞死亡。
在本發(fā)明的另一個方面中提供了治療或預(yù)防癌癥或其它增殖病癥的疫苗，其中疫苗包括端粒酶抑制肽，其中端粒酶抑制肽包括至少一種選自TEIPP和TEIPP1的肽。
在本發(fā)明的另一個方面中提供了通過抑制細胞內(nèi)端粒酶抑制肽的生成而誘導細胞增殖的方法，其中端粒酶抑制肽至少為TEIPP或TEIPP1之一。
所附實施例和附圖是對本發(fā)明更詳細的描述。但是其應(yīng)被理解為下面的描述只是用來說明而不是在任何方式上對本發(fā)明的范圍作出限制。
實施例實施例1端粒酶抑制肽對端粒酶活性的競爭性抑制作用使用下述化學試劑、蛋白激酶和肽來檢測抑制劑。ATP，Taq DNA聚合酶，dNTP和T4基因32蛋白獲自Boehringer Mannheim AustraliaPty.有限公司(新南威爾士，澳大利亞)。[α-32P]ATP和[γ-32P]ATP獲自Amersham Australian Pty.有限公司(新南威爾士，澳大利亞)。凝膠電泳試劑獲自Bio-Rad。其它全部化學試劑獲自Sigma Chemical。蛋白激酶Bα(Akt1)，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1(ERK1)和cdc2蛋白激酶(細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶1，CDK1)獲自Upstate Biotechnology公司(Lake Placid，紐約)。蛋白激酶Cα獲自BIOMOL ResearchLaboratories公司(Plymouth Meeting，PA)。酪蛋白激酶I，酪蛋白激酶II和DNA依賴性蛋白激酶獲自Promega Corporation(Madison，WI)。
序列親水性和電荷特性的分析用于鑒定與端粒酶組分內(nèi)部或之間的分子內(nèi)和分子間相互作用有關(guān)的潛在氨基酸序列。合成與人端粒酶相關(guān)蛋白1(hTEP1)和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的高兩性區(qū)域相應(yīng)的肽，并經(jīng)Auspep International Pty.有限公司(Victoria，澳大利亞)或Chiron Technologies Pty.有限公司(Victoria，澳大利亞)將所述肽純化至純度＞90％。
按照人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的不同區(qū)域制備了五種肽，按照人端粒酶相關(guān)蛋白1(hTEP1)的不同區(qū)域合成了四種肽。來自hTEP1的所述四種肽為385HRAKRHPRRPPRSPG399(TEIPPI)(SEQ IDNO8)、599TRNEKNRPRRRFLC612(SEQ ID NO9)、943WGVTEEETRRNRQLEVC959(SEQ ID NO10)和2538DSEPTPHLKTRQRR2551(SEQ ID NO11)。所述五種hTERT肽為7CRAVRSLLRSHYREV21(SEQ ID NO4)、306GPPSTSRPPRPWDTPC321(SEQ ID NO5)、426CAREKPQGSVAAPEEEDTD444(SEQ ID NO6)、641GARTFRREKRAERLTSRVK659(TEIPP)(SEQ ID NO2)和1119ANPALSSDFKTILD1132(SEQ ID NO3)。另外，如各實施例中所示，從相同供應(yīng)者也獲得了一些截短的和突變的肽。
隨后對這些肽進行端粒酶活性實驗以確定它們是否能競爭性調(diào)節(jié)端粒酶活性。采用端粒酶活性(TRAP)測定法。基本上按照Kim，N.W.，Piatyszek，M.A.，Prowse，K.R.，Hraley，C.B.，West，M.D.，Ho，P.L.，Coviello，G.M.，Wright，W.E.，Weinrich，S.L.和Shay，J.W.(1994)Science 266，2011-2015中所記載的內(nèi)容來實施TRAP測定法以確定多種肽對端粒酶活性的影響。簡單地說，相同量的核端粒酶提取物(0.4μg)在存在或不存在如各實施例所示的不同合成肽的情況下進行溫育。溫育后，用PCR擴增重生的端粒，得到的32P標記的產(chǎn)物用聚丙烯酰胺平板凝膠進行電泳分析，隨后放射自顯影。為排除肽對PCR反應(yīng)任何的潛在影響，在溫育后，用酚和氯仿將重生的合成端粒進行提取，在PCR擴增中使用端粒酶和分離的端粒。另外，通過使用附加引物NT(ATCGCTTCTCGGCCTTTT)(SEQ ID NO13)和TSNT(AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT)(SEQ ID NO14)來使用內(nèi)部對照以便監(jiān)測非特異性PCR影響。每個測定端粒酶活性的實驗中都包括陰性對照，所述陰性對照包含加入的RNase-A、堿性磷酸酶，或通過加熱至80℃從而滅活端粒酶的樣品。
在不同濃度下，兩種肽，即TEIPP1和TEIPP都顯示出能抑制端粒酶活性。對應(yīng)于hTEP1385-399的區(qū)域的TEIPP1的最大抑制濃度的一半為0.4μM并在1μm時接近完全抑制(Li，H.，Cao，Y.，Berndt，M.C.，F(xiàn)under，J.W.，和Liu，J.P.(1999)Oncogene 18，6785-6794)。對應(yīng)于hTERT641-659的TEIPP(圖1)的最大抑制濃度的一半為1.8μM并在4.2μM時接近完全抑制(圖2A)。不規(guī)則對照肽和來自hTEP1和hTERT不同區(qū)域的其它肽(如圖1圖例所示)不具有抑制端粒酶活性的效果，這證實了TEIPP1和TEIPP所產(chǎn)生抑制作用的特異性，其依賴于氨基酸序列和肽濃度兩方面因素。
為揭示TEIPP1和TEIPP對端粒酶活性的抑制是否依賴端粒酶提取物的量和/或端粒酶底物DNA(TS)的量，在存在或不存在不同濃度端粒酶提取物或TS(增加或減少TEIPP1或TEIPP)的情況下分析了端粒酶的活性。增高的核端粒酶提取物量能夠引起基礎(chǔ)端粒酶活性的增加，而TEIPPI(未顯示)和TEIPP(圖1B)對端粒酶的抑制則克服了劑量依賴性方式。這一作用并非由于肽降解，這是因為增高的核端粒酶提取物量能夠引起基礎(chǔ)端粒酶活性的增加(圖1B)且不同蛋白水解酶抑制劑不同濃度的混合體系不能在逆轉(zhuǎn)端粒酶抑制作用上發(fā)揮作用(數(shù)據(jù)未顯示)。另外，增加TS的濃度至1μM并不能在不存在TEIPP的情況下改變端粒酶活性，而且也不能影響TEIPP1(未顯示)或TEIPP(圖1C)的對端粒酶活性的抑制作用。因此，TEIPP通過與端粒酶組分的特定結(jié)構(gòu)而不是與端粒酶底物DNA相競爭從而抑制端粒酶活性。
由于TEIPP1和TEIPP都是帶凈正電的而且富含精氨酸，通過測定不同濃度的TEIPP1加TEIPP對端粒酶活性的影響就可以確定這兩種肽是否與端粒酶全酶的相同位點相互作用。盡管TEIPP的非規(guī)則肽在不同濃度(1-4μM)不能影響TEIPP1對端粒酶活性的抑制作用(圖3A)，低濃度的TEIPP增強了TEIPP1對端粒酶活性的抑制效果，但是單獨使用TEIPP的這些濃度對基礎(chǔ)端粒酶活性的影響是極小的(圖3B)。這些數(shù)據(jù)提示了TEIPP1和TEIPP在通過反式機制協(xié)調(diào)的不同位點發(fā)揮作用。
實施例2TEIPP對端粒酶活性以及細胞培養(yǎng)物中的細胞活力的作用。
為確定端粒酶抑制肽在細胞增殖中的生物活性，培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞，并用或不用TEIPP1、TEIPP、二者的組合、或不規(guī)則對照肽進行處理以進行其端粒酶活性和細胞生物學分析。
TEIPP1，TEIPP和它們各自的非規(guī)則肽不進行修飾，或借助N-末端Cys-Cys鍵交聯(lián)至penetratin(Drosophila Antennapedia同源域來源的載體肽(C-RQIKIWFQNRRMKWKK)(SEQ ID NO12)，其描述于Schwarze，S.R.，和Dowdy，S.F.(2000)Trends Pharmacol Sci 21，45-48)。在培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細胞中以載體-肽綴合物的形式引入肽，并以載體-載體和載體-非規(guī)則肽作為對照(見圖)。簡言之，penetratin或端粒酶抑制肽(600μM)分別用三-(2-羧乙基)膦氫氯化物(TCEP，Molecular Probes)以等摩爾比進行處理。在將最終濃度～100μM的TEIPP用于細胞培養(yǎng)物之前，混合等摩爾量的penetratin和TEIPP，于37℃溫育1小時。于處理后24小時，48小時和72小時檢測細胞形態(tài)學和計數(shù)。
用TEIPP1和TEIPP處理MCF-7細胞24小時誘發(fā)端粒酶活性的顯著抑制作用，聯(lián)合使用TEIPP1和TEIPP進行處理結(jié)果導致了MCF-7細胞培養(yǎng)物中針對端粒酶活性的增高的抑制作用。
用相差顯微鏡觀察用肽處理的細胞的死亡和活力，在肽轉(zhuǎn)導后的不同時間拍攝顯微照片。將固定的且透過性的細胞在合適的緩沖液中在存在或不存在末端轉(zhuǎn)移酶，熒光素-dUTP和四甲基羅丹明-5-dUTP的情況下進行溫育，按照標準步驟進行TUNEL(TdT-介導的dUTP-生物素切口末端標記(TdT-mediated dUTP-biotin nick endlabelling))。每個實驗中均包括陽性和陰性對照。用熒光顯微鏡檢測熒光標記的特異性抗原或斷裂的染色體DNA。
在用TEIPP1或TEIPP處理24小時后，均出現(xiàn)細胞死亡，表現(xiàn)為培養(yǎng)基中漂浮的脫壁圓形細胞(圖4B)。在用TEIPP1或TEIPP處理48小時后，沖洗并從培養(yǎng)基中去除死細胞，在培養(yǎng)基中均觀察到超過50％的細胞損失(圖4C)。TEIPP1和TEIPP聯(lián)合使用的結(jié)果導致細胞死亡中度增加，TUNEL確定了由端粒酶抑制肽誘導的細胞死亡與細胞凋亡有關(guān)(未作圖示)。
實施例3肽序列和活性分析為研究端粒酶抑制肽的最小結(jié)構(gòu)，缺失TEIPP的N-和C-端區(qū)域的氨基酸殘基，然后用端粒酶活性測定法檢測截短的TEIPP。如圖5所示，缺失TEIPP的N-或者C-端區(qū)域都可使其不具有對端粒酶活性的抑制作用(圖5A和B)。
TEIPP酸性殘基的突變能夠增強TEIPP的端粒酶抑制活性，這提示帶負電的殘基在肽的端粒酶抑制作用中發(fā)揮重要作用，而且通過修飾這些殘基可獲得保持了特異性的有效端粒酶抑制肽。
將谷氨酸殘基替換為谷氨酰胺能夠增強TEIPP的端粒酶抑制活性，而用天冬氨酸替換蘇氨酸或絲氨酸則消除了抑制活性(圖5B)。相似的，將TEIPP1中的絲氨酸殘基替換為天冬氨酸也可以降低肽的抑制活性(圖5C)。特別地，將潛在磷酸化位點蘇氨酸644、蘇氨酸655或絲氨酸656替換為天冬氨酸則消除了TEIPP的抑制活性。因此TEIPP螺旋可能通過受蛋白磷酸化調(diào)節(jié)的彼此靜電吸引而與端粒酶表面的電化學極化溝發(fā)生相互作用。
這些數(shù)據(jù)顯示了帶電殘基在端粒酶抑制肽和端粒酶全酶之間的相互作用中起重要作用。
由于hTEP1和hTERT都是磷蛋白，其磷酸化對端粒酶活性很重要，而且由于TEIPP包含推斷的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點，我們確定了TEIPP的抑制效應(yīng)是否可通過蛋白磷酸化進行可逆的調(diào)節(jié)。
端粒酶抑制多肽l(TEIPP1)和端粒酶抑制多肽2(TEIPP)的野生型和突變型分別在包含ATP(～40μM，3μCi[γ-32P]ATP)，Mg2+(1mM)和其它激酶特異性激活劑的磷酸化緩沖液(50μl)中與多種蛋白激酶一同溫育。該反應(yīng)于30℃下進行10分鐘，用酸化方法終止反應(yīng)，冷卻反應(yīng)物。純化的蛋白激酶包括酪蛋白激酶I(10個單位)，酪蛋白激酶II(10個單位)，蛋白激酶Bα(Akt1，500ng)，蛋白激酶Cα(25ng)，細胞外信號調(diào)節(jié)的蛋白激酶(ERK1，200ng)，cdc2蛋白激酶(15ng)和DNA依賴性蛋白激酶(15個單位)。使用前，在包含ATP(100μM)，Mg2+(10mM)，磷脂酰絲氨酸(80μg/ml)和甘油二油酸酯(8mg/ml)的合適的緩沖液(20ul)中用PI(3，4，5)P3-依賴性蛋白激酶1(PDK1，5ng)于30℃下活化蛋白激酶B30分鐘。使用磷脂酰絲氨酸(40μg/ml)，甘油二油酸酯(4mg/ml)和Ca2+(200μM)激活蛋白激酶Ca，和用線性DNA質(zhì)粒(300ng/μl)活化DNA依賴性蛋白激酶。用蛋白激酶B、蛋白激酶Cα和ERK1分別平行磷酸化的crostide、MARCKS肽和髓磷脂堿性蛋白(MBP)作為對照。將磷酸化的肽點在P81層析紙上，然后用75-mM磷酸沖洗層析紙以去除游離的32P-ATP，然后用β計數(shù)器進行計數(shù)。為確定肽磷酸化對端粒酶活性的影響，在冷ATP存在的條件下，于32℃下用多種蛋白激酶磷酸化TEIPP和對照肽30分鐘，通過加熱至80℃2分鐘而終止反應(yīng)。磷酸化混合物隨后用于端粒酶活性的分析。
如圖6A所示，將TEIPP與多種蛋白激酶溫育，結(jié)果酪蛋白激酶I，酪蛋白激酶II，蛋白激酶B和DNA依賴性蛋白激酶并沒有使肽磷酸化，但非規(guī)則對照組則通過蛋白激酶B而得以磷酸化。相反地，蛋白激酶Cα，ERK 1和cdc 2蛋白激酶磷酸化TEIPP的程度高于非規(guī)則對照組(圖6A)。將蛋白激酶B、蛋白激酶Cα或ERK 1的已知底物與TEIPP磷酸化相比較顯示了蛋白激酶Cα或ERK 1對TEIPP的磷酸化水平要高于對蛋白激酶C底物MARCKS肽和ERK1底物髓磷脂堿性蛋白(MBP)的磷酸化水平。
為確定TEIPP磷酸化的潛在效應(yīng)，分別通過蛋白激酶Cα，ERK 1和cdc 2蛋白激酶對TEIPP進行化學定量地磷酸化，隨后檢測磷酸化肽對端粒酶活性的效應(yīng)。盡管與蛋白激酶B或酪蛋白激酶II溫育的肽未顯示出能影響TEIPP對端粒酶活性的抑制作用，通過蛋白激酶Cα，cdc 2蛋白激酶(圖6B)或ERK 1(未顯示)磷酸化的肽均顯示出降低的抑制活性。推定的磷酸化位點蘇氨酸644，蘇氨酸655和絲氨酸656突變?yōu)樘於彼嵋阅M磷酸化，結(jié)果消除了TEIPP對端粒酶活性的抑制效應(yīng)(圖5B和6C)。
與靜電相互作用參與并受蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)的假說相一致，TEIPP通過蛋白激酶Cα，ERK 1和cdc 2蛋白激酶而磷酸化，而并非通過酪蛋白激酶I，酪蛋白激酶II，蛋白激酶B或DNA依賴性蛋白激酶磷酸化。磷酸化以及推定的磷酸化位點突變?yōu)樘於彼岬哪M磷酸化模擬突變，均抑制了FEIPP的抑制功能，這提示TEIPP序列是抑制元件，其可通過對蘇氨酸或絲氨酸殘基的磷酸化而關(guān)閉。這些發(fā)現(xiàn)由此提供了一種似是而非的機制，其中蛋白激酶C通過蛋白磷酸化從而關(guān)閉端粒酶全酶的自抑制性元件，進而誘導端粒酶活化。因此這些調(diào)節(jié)元件的分子靶向作用可以提供一種在高增殖或永生化細胞中抑制端粒酶的新方式。
最后，應(yīng)理解在不背離本發(fā)明所描述的精神的情況下，實施本發(fā)明可以有很多其他改變和/或修改。
組織申請人街道Alfred Lane城市Prahran州Victoria國家澳大利亞郵編3191電話613 8532 1111傳真Email地址<110>組織名稱The Baker Medical Research Institute自然人申請人街道21-23 Charles Street城市Prahran州Victoria國家澳大利亞郵編3181電話傳真Email地址<110>姓Jun-Ping<110>名Liu<110>Middlelnitial<110>Suffix自然人申請人街道21-23 Charles Street城市Prahran州Victoria
國家澳大利亞郵編3181電話傳真Email地址<110>姓He<110>名Li<110>Middlelnitial<110>Suffix申請項目<120>名稱端粒酶抑制肽及其用途<130>AppFileReference652689<140>本申請?zhí)?amp;lt;141>本申請?zhí)峤蝗招蛄?amp;lt;213>OrganismName智人<400>PreSequenceStringGARTFRRXKR AXRLTSRVK<212>類型PRT<211>長度19序列名SEQ ID NO1序列描述序列<213>OrganismName智人<400>PreSequenceStringGARTFRREKR AERLTSRVK
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<213>OrganismName果蠅<400>PreSequenceStringCRQIKIWFQN RRMKWKK<212>類型PRT<211>長度17序列名SEQ ID NO12序列描述序列<213>OrganismName人工的<400>PreSequenceStringatcgcttctc ggcctttt<212>類型DNA<211>長度18序列名SEQ ID NO13序列描述序列<213>OrganismName人工的<400>PreSequenceStringaatccgtcga gcagagttaa aaggccgaga agcgat<212>類型DNA<211>長度36序列名SEQ ID NO14序列描述
權(quán)利要求
1.一種肽序列，其編碼具有GARTFRRXKRAXRLTSRVK(SEQID NO1)、其功能等效物、變體或片段的氨基酸序列的端粒酶抑制肽(TEIPP)，其中X為E或Q。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽序列，其編碼具有GARTFRREKRAERLTSRVK(SEQ ID NO2)；或GARTFRRQKRAQRLTSRVK(SEQ ID NO3)、其功能等效物、變體或片段的氨基酸序列的端粒酶抑制肽(TEIPP)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽序列，其中所述氨基酸序列相應(yīng)于天然TERT的641至659位氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的肽序列，其中肽選自人、牛、綿羊、豬、鼠或馬。
5.具有根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的肽序列的端粒酶抑制肽，其分子量約為2421道爾頓。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的肽，其中端粒酶抑制肽降低端粒酶活性和/或與端粒的相互作用。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的肽，其形成α-螺旋，所述螺旋的一側(cè)為帶正電的氨基酸殘基而另一側(cè)為帶負電/潛在帶負電(磷酸化位點)的氨基酸殘基。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項的肽，其與端粒酶中的電化學極化溝發(fā)生相互作用。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一項的肽，其與端粒酶全酶發(fā)生相互作用。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一項的肽，其受蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10中的肽，其中肽在蘇氨酸或絲氨酸殘基上發(fā)生磷酸化。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11中的肽，其中至少一個蘇氨酸或絲氨酸殘基上的磷酸化和去磷酸化分別可逆地增強或降低端粒酶的活性。
13.編碼端粒酶抑制肽(TEIPP)的核苷酸序列，所述序列選自下述序列a)核苷酸序列，其編碼具有GARTFRRXKRAXRLTSRVK(SEQID NO1)、其功能等效物、變體或片段的氨基酸序列的肽，其中X為E或Q；b)核苷酸序列，其編碼具有GARTFRREKRAERLTSRVK(SEQID NO2)的氨基酸序列的肽；c)核苷酸序列，其編碼具有GARTFRRQKRAQRLTSRVK(SEQID NO3)的氨基酸序列的肽；d)能夠與a)、b)或c)中的序列雜交的核苷酸序列；e)由于遺傳密碼簡并性而與a)、b)或c)中的序列簡并的核苷酸序列；和f)a)-e)中任一序列的功能等效物、變體或片段。
14.用于抑制端粒酶的組合物，所述組合物包括載體和端粒酶抑制肽(TEIPP)，所述端粒酶抑制肽具有GARTFRRXKRAXRLTSRVK(SEQ ID No1)、其功能等效物、變體或片段的氨基酸序列，其中X為E或Q，或具有GARTFRREKRAERLTSRVK(SEQ ID NO2)或GARTFRRQKRAQRLTSRVK(SEQ ID NO3)或其組合、其功能等效物、變體或片段的氨基酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14中的組合物，還包括端粒酶抑制肽1(TEIPP1)，其功能等效物、變體或片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求15中的組合物，其中TEIPP1肽選自HRAKRHPRRPPRSPG(SEQ ID NO8)、TRNEKNRPRRRFLC(SEQID NO9)、WGVTEEETRRNRQLEVC(SEQ ID NO10)、和DSEPTPHLKTRQRR(SEQ ID NO11)或其功能等效物或變體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16中的組合物，其中TEIPP1肽為HRAKRHPRRPPRSPG(SEQ ID NO8)或其功能等效物或變體。
18.根據(jù)權(quán)利要求14-17任一項中的組合物，其中組合物包含端粒酶抑制肽，所述肽的施用濃度為0.1～100μM。
19.一種抑制細胞內(nèi)端粒酶活性的方法，所述方法包括對細胞施以有效量的端粒酶抑制肽，所述端粒酶抑制肽選自TEIPP1、TEIPP或其組合、其功能等效物、變體或片段。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中端粒酶抑制肽的施用濃度為0.1～100μM。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中TEIPP1和TEIPP聯(lián)合施用。
22.一種抑制細胞培養(yǎng)物中細胞生長的方法，所述方法包括對細胞培養(yǎng)物施以有效量的端粒酶抑制肽，所述端粒酶抑制肽選自TEIPP1、TEIPP或其組合、其功能等效物、變體或片段。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中抑制細胞生長選自誘導細胞死亡、顯著降低細胞增殖或誘導細胞休眠。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中端粒酶抑制肽的施用濃度為0.1～100μM。
25.根據(jù)權(quán)利要求22-24中任一項的方法，其中TEIPP1和TEIPP聯(lián)合施用。
26.一種誘導細胞死亡的方法，所述方法包括對細胞施以有效量的端粒酶抑制肽，所述端粒酶抑制肽選自TEIPP1、TEIPP或其組合、其功能等效物、變體或片段。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中細胞死亡選自凋亡、壞死或溶胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中端粒酶抑制肽的施用濃度為0.1～100μM。
29.根據(jù)權(quán)利要求26-28中任一項的方法，其中TEIPP1和TEIPP聯(lián)合施用。
30.一種治療個體癌癥或增殖病癥的方法，所述方法包括對個體施以有效量的端粒酶抑制肽，其中端粒酶抑制肽包括至少一種選自TEIPP1、TEIPP、或其功能等效物或變體的肽。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中TEIPP1和TEIPP聯(lián)合施用。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31的方法，其中所述癌癥為乳腺癌。
33.根據(jù)權(quán)利要求30或31的方法，其中所述增殖病癥為與端粒酶活性或與相對正常狀態(tài)增高的端粒酶活性相關(guān)的病癥。
34.根據(jù)權(quán)利要求30-33中任一項的方法，其中端粒酶抑制肽的施用濃度為0.1～100μM。
35.一種通過抑制細胞內(nèi)端粒酶抑制肽的生成而誘導細胞增殖的方法，其中所述端粒酶抑制肽為至少一種TEIPP1或TEIPP。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制端粒酶的肽，以及所述肽的用途，特別是在癌癥治療方法中的用途。本發(fā)明包括端粒酶抑制肽，其具有GARTFRRXKRAXRLTSRVK(SEQ ID NO1)(其中X為E或Q)或其功能等效物或片段的氨基酸序列。本發(fā)明還包括編碼端粒酶抑制肽(TEIPP)的核苷酸序列。
文檔編號A61K38/00GK1575300SQ02820847
公開日2005年2月2日 申請日期2002年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月14日
發(fā)明者劉軍平, 李 赫 申請人:劉軍平, 李 赫