專利名稱：一種高通量克隆構(gòu)建重組桿狀病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是生物基因克隆表達技術(shù)，特別是一種高通量直接定向克隆構(gòu)建重組桿狀病毒的方法。特別適合用于表達來源真核生物的基因和構(gòu)建基于真核生物cDNA的表達文庫。
背景技術(shù)：
隨著更多物種全基因組測序的完成，發(fā)展高通量的表達克隆技術(shù)研究基因和蛋白質(zhì)的功能受到了人們的迫切關(guān)注。目前已有一些公司和研究單位構(gòu)建了桿狀病毒的克隆表達系統(tǒng)，如Invitrogen公司的Bac-to-BacTM系統(tǒng)，BD公司的BaculoGoldTMBright系統(tǒng)，奧地利農(nóng)業(yè)大學(xué)Ernst等人提出的直接克隆的方法。這幾個方法采用的技術(shù)路線各不相同，但代表了當(dāng)前構(gòu)建桿狀病毒3種主要的方法。第一種是以BaculoGoldTMBright為代表，通過將目的基因首先克隆到穿梭載體上，帶外源基因的穿梭載體與線性化的桿狀病毒基因組質(zhì)粒在昆蟲細胞進行重組，經(jīng)過篩選得到重組桿狀病毒。第二種以Bac-to-BacTM系統(tǒng)為代表，將目的基因首先克隆到穿梭載體上，在含有輔助質(zhì)粒的大腸桿菌中帶外源基因的穿梭載體將表達盒式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)座到桿狀病毒基因組質(zhì)粒上，得到的重組桿狀病毒質(zhì)粒在昆蟲細胞內(nèi)包裝得到重組桿狀病毒。第三種以直接連接的方法為代表，在桿狀病毒基因組上引入稀有的限制性內(nèi)切酶I-Sce I，將目的基因克隆到經(jīng)I-Sce I消化的桿狀病毒基因組載體上，在昆蟲細胞內(nèi)包裝得到重組桿狀病毒。這些方法在一定程度上提高了實驗效率，降低了實驗成本，但這些方法存在不足，主要表現(xiàn)在以下三方面一、實驗周期長，得到重組桿狀病毒的效率低。這兩種方法都需要借助一種中間載體實現(xiàn)目的基因的克隆，然后通過在昆蟲細胞或大腸桿菌內(nèi)重組。因此整個構(gòu)建過程需要多次連接和轉(zhuǎn)化。第一種方法需要在昆蟲細胞內(nèi)重組，這種重組效率是很低的，因此在后續(xù)階段需要對病毒進行鑒定，將帶有目的基因的重組病毒與不帶目的基因的桿狀病毒分開，需要經(jīng)過多輪的空斑純化，這個過程費時費力。第二種方法需要在大腸桿菌內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)座，這種轉(zhuǎn)座的效率也很低，需要用藍白斑的方法篩選成功轉(zhuǎn)座的重組桿狀病毒質(zhì)粒，最后在昆蟲細胞內(nèi)包裝得到重組桿狀病毒。第三種方法雖然可以直接克隆目的基因，但桿狀病毒基因組不能在大腸桿菌中復(fù)制，需要用超速離心的方法分離桿狀病毒基因組，并且需要用去磷酸化反應(yīng)消除背景，實驗過程復(fù)雜。
二、不適合于構(gòu)建真核生物cDNA表達文庫。前兩種方法都需要先將目的基因通過限制性內(nèi)切酶克隆于穿梭載體上，所得的重組質(zhì)粒要與桿狀病毒骨架載體在昆蟲細胞內(nèi)或大腸桿菌內(nèi)重組而得到重組桿狀病毒，經(jīng)過二次轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致庫容量非常有限，很難滿足構(gòu)建文庫對庫容量的基本要求。第三種方法雖然可以建庫，但需要超速離心的方法分離病毒基因組，需要用稀有酶進行連接克隆，需要用去磷酸化酶消除背景，并且需要設(shè)計很長的引物，實驗成本較高，并不適合進行大規(guī)模的研究。
三、很難實現(xiàn)同時表達多個基因，前兩種系統(tǒng)需要共轉(zhuǎn)化，步驟繁瑣并且鑒定過程復(fù)雜費時，后一種方法很難表達多基因。
(參見刊物“Journal of Virology 1993年第67卷4566-4579頁”；“NucleicAcid Research 1994年第22卷2855-2856頁”)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的構(gòu)建重組桿狀病毒的技術(shù)，真正能做到高通量、直接、定向克隆表達目的基因，在構(gòu)建過程中不需要依賴中間載體；無需任何同源重組和轉(zhuǎn)座過程；也不需要費時費力的空斑純化過程，就能方便迅速地構(gòu)建重組桿狀病毒，既能融合表達，也能非融合表達。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。主要包括一個已有的桿狀病毒表達載體系統(tǒng)和經(jīng)PCR引物擴增的目的基因，通過對已有的桿狀病毒表達載體系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)座和電轉(zhuǎn)化篩選，在該載體上引入兩個唯一的Bsu 36 I酶切位點序列和一個帶有與前兩個Bsu 36 I酶切位點序列不同的另一個Bsu 36 I識別序列的熒光基因表達單元；在擴增目的基因的一對PCR引物的5′端分別引進4個特定的堿基，在dGTP，或者dATP，或者dCTP，或者dTTP存在的條件下，擴增產(chǎn)物經(jīng)T4DNA聚合酶消化后產(chǎn)生的粘性末端與載體雙酶切得到的粘性末端匹配，可以定向克隆在經(jīng)Bsu 36I的酶切的載體上，轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，在昆蟲細胞內(nèi)包裝成重組桿狀病毒粒子。
具體做法是，對已有的一套桿狀病毒載體系統(tǒng)(包括桿狀病毒基因組載體、轉(zhuǎn)運載體)進行分析，選擇合適的酶切位點Bsu 36 I，應(yīng)滿足的條件為1.酶切能得到5′突出的粘性末端的堿基種類不超過3種；2.載體本身存在的該酶切位點的數(shù)目盡可能的少。由于已有的桿狀病毒的基因組上不存在Bsu 36 I酶切位點，因此在一個熒光蛋白基因的兩端設(shè)計一個多核苷酸的接頭，使其兩端分別引進一個Bsu 36 I酶切位點；通過該接頭使熒光蛋白基因克隆到轉(zhuǎn)運載體上并將Bsu 36 I酶切位點引入。在大腸桿菌中帶有Bsu 36 I酶切位點的轉(zhuǎn)運載體將熒光蛋白基因表達單元轉(zhuǎn)座到桿狀病毒基因組上得到最終目標載體，該載體經(jīng)Bsu 36 I酶切后，產(chǎn)生這樣兩個粘性末端3′ CC —— CCACT 5′5′TAAGG —— GG3′目的基因一對PCR引物的5′端分別引入5′TTAC3′和5′TGAC3′這樣4個核苷酸，PCR擴增到的產(chǎn)物加dGTP，經(jīng)T4DNA聚合酶處理，產(chǎn)生這樣的粘性末端5′ TTAC —— G3′3′G —— CAGT 5′該粘性末端正好可與載體雙酶切產(chǎn)生的粘性末端匹配，從而使PCR產(chǎn)物直接克隆到載體上，轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，在昆蟲細胞內(nèi)包裝得到重組桿狀病毒病毒粒子。
多核苷酸的接頭兩端的限制性內(nèi)切酶可以是Asc I、Bsu 36 I、Cla I、CpoI、Ear I、Not I、Sap I、Sty I等中的任意兩種或Asc I、Bsu 36 I、Cla I、Cpo I、Ear I、Not I、Sap I、Sty I等中的任意一種。任何酶切后能得到的5′突出的粘性末端的堿基種類不超過3種(含3種)的限制性內(nèi)切酶均能使用。
由于在熒光蛋白基因內(nèi)定點誘變出一個與用于克隆目的基因的兩個限制性內(nèi)切酶不同的Bsu 36 I酶切位點。最終桿狀病毒基因組載體經(jīng)Bsu 36 I完全酶切，使得熒光蛋白基因被破壞，排除因為熒光蛋白基因重新連接到桿狀病毒載體而產(chǎn)生的載體背景。
本發(fā)明可以對已有的桿狀病毒載體進行修飾，消除載體本身帶有的用于克隆的目的基因的限制性內(nèi)切酶酶切位點，如Bsu 36 I，便于克隆目的基因。
本發(fā)明可與所有基于PCR建庫的方法相容。
本發(fā)明可用于構(gòu)建包括人在內(nèi)的多種真核生物細胞或組織作為宿主的重組桿狀病毒。
本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢一、特殊設(shè)計的引物擴增所得的PCR產(chǎn)物用T4DNA聚合酶消化，然后與經(jīng)過特殊的限制性內(nèi)切酶消化的被修飾過的桿狀病毒基因組載體直接并且定向進行連接和轉(zhuǎn)染，從而一步構(gòu)建得到重組桿狀病毒粒子。整個構(gòu)建過程不需要任何中間載體，也不需要在昆蟲細胞系中或大腸桿菌中進行同源重組或轉(zhuǎn)座的步驟，更不需要使用昂貴的稀有酶，操作簡便，無需二次連接和轉(zhuǎn)化，縮短了實驗周期，簡化構(gòu)建重組桿狀病毒的步驟。利用該方法大大提高了實驗效率，構(gòu)建一個重組桿狀病毒的工作可在一周內(nèi)完成。
二、在熒光蛋白基因內(nèi)定點誘變出一個與用于克隆目的基因的兩個限制性內(nèi)切酶不同的Bsu 36 I酶切位點。最終桿狀病毒基因組載體經(jīng)Bsu 36 I完全酶切，使得熒光蛋白基因被破壞，排除因為熒光蛋白基因重新連接到桿狀病毒載體而產(chǎn)生的載體背景，真正做到零背景構(gòu)建重組桿狀病毒。
三、與目前報道的所有基于PCR建庫的方法相容，能夠用來高通量的構(gòu)建基于桿狀病毒的真核生物cDNA表達文庫，可以盡可能真實的表達真核生物的cDNA。
四、如果在桿狀病毒基因組上引進兩種以上特定的限制性內(nèi)切酶酶切位點，可以實現(xiàn)多基因的同時克隆表達。
具體實施例方式
下面以實施例對本發(fā)明進一步說明實施例1利用該方法在昆蟲細胞Sf9細胞系中表達枯草芽孢桿菌的甘露聚糖酶。
選擇一套桿狀病毒載體(包括桿狀病毒基因組載體Bacmid和轉(zhuǎn)運載體pFast)進行分析，由于在Bacmid上沒有Bsu 36 I位點，所以選擇Bsu 36 I酶切位點作為目的基因的克隆位點。設(shè)計兩個多核苷酸接頭，分別引進不同的Bsu 36 I酶切位點，中間連接一個熒光蛋白基因，將此接頭引入到pFast上，得到的重組質(zhì)粒在大腸桿菌DH10Bac中將熒光蛋白表達單元轉(zhuǎn)座到Bacmid，得到的混合質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B篩選得到最終的目標載體pHBMBacmid1.1。針對目標基因甘露聚糖酶基因序列設(shè)計一對引物，其5′端分別引進5′TTAC3′和5′TGAC3′這幾個額外的核苷酸，以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，用高保真DNA聚合酶(Pfu)進行PCR擴增，得到的產(chǎn)物在dGTP存在的情況下，經(jīng)T4DNA聚合酶處理后，其PCR產(chǎn)物兩端各有一個5′端突出3個堿基的粘性末端，該產(chǎn)物能定向克隆到經(jīng)Bsu 36I酶切的pHBMBacmid1.1上，直接轉(zhuǎn)染昆蟲細胞系Sf9細胞，72小時后檢測到酶活，五天后收集重組桿狀病毒粒子重新感染Sf9細胞，檢測到甘露聚糖酶蛋白的高水平表達。
實施例2紅熒光蛋白在Sf9細胞中表達。
按實施例1的方法在質(zhì)粒pDsRed2-1上設(shè)計擴增紅熒光蛋白基因DsRed的PCR引物，用高保真DNA聚合酶(Pfu)擴增紅熒光蛋白基因，擴增產(chǎn)物在dGTP存在的情況下，同樣經(jīng)T4DNA聚合酶處理后，定向克隆到經(jīng)Bsu 36 I酶切的pHBMBacmid1.1上，直接轉(zhuǎn)染昆蟲細胞系Sf9細胞，72小時后用熒光顯微鏡觀察，經(jīng)激光激發(fā)，可以觀察到有細胞發(fā)出的紅色熒光，五天后收集重組桿狀病毒粒子重新感染Sf9細胞，觀察到感染的細胞發(fā)出明顯的紅色熒光。
中間載體(轉(zhuǎn)運載體)pFast是購置于美國Invitrogen公司，用于發(fā)生轉(zhuǎn)座的大腸桿菌DH10Bac及用于電轉(zhuǎn)化篩選的大腸桿菌DH10B均購置于美國Invitrogen公司，桿狀病毒基因組載體Bacmid是大腸桿菌DH10Bac內(nèi)自身帶有的質(zhì)粒。紅熒光蛋白基因是從我們購買的美國BD公司質(zhì)粒pDsRed2-1上PCR擴增得的。
權(quán)利要求
1.一種高通量克隆構(gòu)建重組桿狀病毒的方法，主要包括一個已有的桿狀病毒表達載體和經(jīng)PCR引物擴增目的基因，其特征在于通過對已有的桿狀病毒載體系統(tǒng)進行電轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選得到可自主復(fù)制的桿狀病毒載體，在該載體上引入了兩個唯一的特殊限制性內(nèi)切酶酶切位點序列和熒光蛋白基因表達單元，在擴增目的基因的一對PCR引物的5′端分別引進3-4個特定的堿基，在dGTP，或者dATP，或者dCTP，或者dTTP存在條件下，擴增產(chǎn)物經(jīng)T4DNA聚合酶消化后產(chǎn)生的粘性末端與載體的雙酶切得到的粘性末端匹配，從而可以與在經(jīng)Bsu 36 I雙酶切的載體連接，連接物可直接轉(zhuǎn)染昆蟲細胞系，得到重組桿狀病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量克隆構(gòu)建重組桿狀病毒的方法，其特征在于在一個熒光蛋白表達單元的兩端設(shè)計一個多核苷酸的接頭，使其兩端分別引進兩個不同的Bsu 36 I酶切位點分別是5′CCTTAGG3′和5′CCTCAGG 3′；通過定點誘變在熒光蛋白基因內(nèi)產(chǎn)生一個與前兩個限制性內(nèi)切酶Bsu 36 I識別序列不同的Bsu 36 I酶切位點5′CCTAAGG 3′；通過該接頭使熒光蛋白基因克隆到轉(zhuǎn)運載體上并將Bsu 36 I酶切位點引入；轉(zhuǎn)運載體通過轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座以及電轉(zhuǎn)化篩選，從而得到最終的桿狀病毒載體，最終的載體經(jīng)Bsu 36 I完全酶切，產(chǎn)生這樣的兩個粘性末端3′ CC——————CCACT 5′5′TAAGG——————GG3′目的基因一對PCR引物的5′端分別引入5′TTAC3′和5′TGAC3′這樣4個核苷酸，PCR擴增到的產(chǎn)物加dGTP，經(jīng)T4DNA聚合酶處理，產(chǎn)生這樣的粘性末端5′TTAC——————G 3′3′ G——————CAGT 5′該粘性末端正好可與載體雙酶切產(chǎn)生的粘性末端匹配，從而使PCR產(chǎn)物直接克隆到載體上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高通量克隆構(gòu)建重組桿狀病毒的方法，其特征在于兩個特殊的限制性內(nèi)切酶，可以是酶切后能得到的5′突出粘性末端的堿基種類不超過3種(含3種)的限制性內(nèi)切酶，兩個特殊的限制性內(nèi)切酶具體可以是Asc I、Bsu 36 I、Cla I，、Cpo I、Ear I、Not I、Sap I、Sty I中的任意兩種或Asc I、Bsu 36 I、Cla I、Cpo I、Ear I、Not I、Sap I、Sty I中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高通量克隆構(gòu)建重組桿狀病毒的方法，其特征在于在熒光蛋白基因內(nèi)定點誘變出一個與用于克隆目的基因的兩個限制性內(nèi)切酶不同的Bsu 36 I酶切位點。最終桿狀病毒載體經(jīng)Bsu 36 I完全酶切，使得熒光蛋白基因被破壞，排除因為熒光蛋白基因重新連接到桿狀病毒載體而產(chǎn)生的載體背景。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高通量克隆構(gòu)建重組桿狀病毒的方法，其特征在于可與所有基于PCR建庫的方法相容。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高通量克隆構(gòu)建重組桿狀病毒的方法，其特征在于可用于構(gòu)建包括人在內(nèi)的多種真核生物細胞或組織作為宿主的重組桿狀病毒。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種高通量克隆構(gòu)建重組桿狀病毒的方法。它是利用特定限制性內(nèi)切酶雙酶切桿狀病毒載體與T
文檔編號C12N7/01GK1624117SQ20041006108
公開日2005年6月8日 申請日期2004年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月8日
發(fā)明者馬立新, 周莉, 馬琪 申請人:湖北大學(xué)