專利名稱：痕量二惡英生物檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及二惡英類污染物的檢測，具體地說是涉及一種新的痕量二惡英類化合物檢測方法。
背景技術：
二惡英類化學物質(DLCs)是一類毒性很強的氯代三環(huán)芳香族化合物，DLCs能與芳香烴受體(aromatic hydrocarbon receptor，AhR)結合，并導致機體產(chǎn)生多種生物化學變化。DLCs主要包括多氯代二苯并二惡英，多氯代二苯并呋喃和共平面多氯聯(lián)苯，其中研究最多也是最典型和毒性最強的物質為2，3，7，8-四氯代二苯并二惡英(2，3，7，8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)。二惡英(Dioxins)的污染問題已引起了國際社會廣泛關注，二惡英的毒作用廣泛、毒性作用劑量低、易于在機體內富集，且在環(huán)境中廣泛存在，對人類健康危害極大，隨著我國加入WTO以及全球經(jīng)濟一體化的進展，二惡英的檢測對我國的經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。因此研究一種快速、簡便的二惡英檢測方法，應用于基層海關、檢疫、防疫、環(huán)保部門，不僅對我國的環(huán)境保護、提高人民生活質量，而且對我國的經(jīng)濟建設特別是對外貿(mào)易具有重要意義。
二惡英的檢測是一件十分困難的事情，目前檢測二惡英的成熟方法主要是色譜-質譜聯(lián)機檢測，該方法檢測費用昂貴，每檢測一次的費用在1000-2000美元左右；檢測過程復雜，對檢驗人員和實驗條件要求高，世界僅少數(shù)實驗室具備開展該方法的能力，不可能在基層開展。除色-質聯(lián)機檢測外，還有利用抗原-抗體反應建立的免疫學檢測方法，免疫法檢測過程較簡單，但抗體尚未商品化，自己制備的抗體種類不全，且各批實驗結果無可比性，沒有廣泛使用。此外還有生物篩選法，該法作為初步的篩選方法，不能作定量檢測，只能相對定量且線性范圍窄，適合于大量樣本的定性篩選和半定量檢測。由于即使較低的二惡英含量都會引起較大的環(huán)境和人體危害，檢測二惡英化合物需要一種極為靈敏的檢測方法，目前大多數(shù)二惡英檢測方法都只能檢測pg級的二惡英化合物，對痕量二惡英往往難以檢測，因此建立一種痕量二惡英的檢測方法顯得尤為重要。

發(fā)明內容
本發(fā)明的任務是提供一種二惡英檢測方法，使其具有靈敏度高、檢測費用低、檢測過程簡單、適用范圍廣、線性范圍寬、重復性好、準確可靠等特點。
實現(xiàn)本發(fā)明的技術方案是從動物肝臟組織或細胞中分離出芳香烴受體(AhR)及相關蛋白，AhR與二惡英化合物孵育形成二惡英-AhR復合物，該復合物能與特異的核酸(DRE)序列結合；將二惡英-AhR復合物與含有GCGTG序列的DRE序列DNA雙鏈共同孵育，使DRE序列與二惡英-AhR復合物結合，二惡英-Ah受體復合物能保護DRE序列免受核酸酶降解；用核酸外切酶III和核酸酶S1對含DRE序列DNA進行水解，使未與復合物結合的DNA被完全水解；而與復合物結合的DNA則受到保護不能被水解，然后可用PCR檢測因復合物結合而被保留的DNA片段，被二惡英-AhR復合物結合而保留的DNA片段的量與加入的二惡英的量成比例關系；采用2，3，7，8-四氯代二苯并二惡英(TCDD)制定標準曲線，然后根據(jù)此標準曲線計算得出待測樣本中二惡英的量。
用動物肝臟組織制備含AhR、芳香烴受體核轉位子蛋白(ARNT)等的細胞溶質作為二惡英的特異受體，將該受體與二惡英化合物孵育形成二惡英復合物，該復合物能與含特異DRE核酸序列(GCGTG)的DNA雙鏈結合(參考文獻Yao EF and Denison MS.DNA sequencedetrerminants for binding of transformed Ah receptor to a dioxin response enhancer.Biochemistry1992 315060-5067)，用核酸外切酶III和核酸酶S1對含DRE序列DNA進行水解，使未與復合物結合的DNA被完全水解，而與復合物結合的DNA由于受到保護不能被核酸外切酶III和核酸酶S1水解，含DRE序列的DNA得以保存，然后可用PCR檢測因復合物結合而保留的DNA片段，被二惡英-AhR復合物結合而保留的DNA片段的量與加入的二惡英的量成比例關系。采用2，3，7，8-四氯代二苯并二惡英(TCDD)制定外切酶保護PCR檢測二惡英化合物的標準曲線，然后可根據(jù)此標準曲線(計算)得出的待測樣本的二惡英當量(TEQ量)。
本發(fā)明二惡英檢測方法包括以下步驟(1)用以動物肝臟組織制備的含芳香烴受體(AhR)和芳香烴受體核轉位子蛋白(ARNT)的細胞溶質作為二惡英的特異受體；(2)將含芳香烴受體(AhR)和芳香烴受體核轉位子蛋白(ARNT)的細胞溶質與含二惡英化合物的待測樣本共同孵育形成二惡英-AhR-ARNT復合物；(3)將所形成的二惡英-AhR-ARNT復合物與含有編碼為GCGTG的DRE序列的DNA雙鏈共同孵育，使DRE序列與二惡英-AhR-ARNT復合物結合；(4)用核酸外切酶III和核酸酶S1對含DRE序列的DNA進行水解，使未與二惡英-AhR-ARNT復合物結合的DRE序列DNA被水解，已與復合物結合的DRE序列DNA由于受到保護，不能被核酸外切酶III和核酸酶S1水解，得以保存；
(5)用PCR檢測因復合物結合而被保留的DNA片段，根據(jù)與二惡英-AhR-ARNT等組成的復合物結合而保留的DNA片段的量與其所結合的二惡英的量成比例關系的特點，采用2，3，7，8-四氯代二苯并二惡英(TCDD)制定標準曲線，然后根據(jù)此標準曲線計算得出待測樣本中二惡英毒當量(TEQ量)。
用動物肝臟組織制備含芳香烴受體(AhR)的細胞溶質的方法是取SD雄性大鼠一只，剖腹后用HEDG緩沖液(25mM HEPES，pH7.5，1mM EDTA，1mM DTT，10％甘油)+1.15％的氯化鉀進行肝臟灌注，然后切取肝臟用3倍體積的HEDG緩沖液勻漿，10,000g離心20分鐘，收集上清，105,000g離心60分鐘，取上清即為含有AhR的肝細胞溶質(cytosol)，測定蛋白含量，調整蛋白質含量為10mg/ml，-80℃儲存或凍干備用。
將含芳香烴受體(AhR)等的細胞溶質與含二惡英化合物的待測樣本孵育形成二惡英-AhR-ARNT復合物的方法是在0.5ml細胞溶質中加入含不同濃度二惡英化合物的樣本，20℃水浴2小時；將所形成的二惡英-AhR-ARNT復合物與含有編碼為GCGTG的DRE序列的DNA雙鏈共同孵育而使DRE序列與二惡英-AhR-ARNT復合物結合的方法是加入含DRE序列的DNA雙鏈1μg，加入poly(dI·dC)1μg，20℃孵育15分鐘，然后加入含DRE序列的DNA雙鏈～50ng，反應總體積不超過20μl，20℃孵育15分鐘，即形成二惡英-AhR-ARNT復合物與DRE序列DNA的結合物。
用核酸外切酶III和核酸酶S1對未與二惡英-AhR-ARNT復合物結合的DRE序列DNA進行水解的方法是在20μl形成了二惡英-AhR-ARNT復合物與DRE序列DNA結合物的反應液中，加入100mM的MgCl2，100U核酸外切酶III，25℃水浴5分鐘，取5μl混合液加入15μl核酸酶S1緩沖液(40mM KAc，pH4.6，340mM NaCl，1.35mMZnSO4，0.8％甘油，300U/ml核酸酶S1)，室溫30分鐘，然后加入2μl的S1酶終止緩沖液(0.3M Tris-base，0.05METDA)，65℃加熱15分鐘終止外切酶反應。
用PCR檢測因復合物結合而被保留的DNA片段的方法是取上述酶切反應液1μl作為模板，加入序列4所示引物B1和序列5所示引物B2加入引物B1和B2各10pmol，10×緩沖液(含Mg++)5μl，dNTPs(每種25mmol/L)1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl(2U/μl)，總體積50μl，94℃變性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共進行25-30次循環(huán)，然后用分子燈標熒光探針檢測PCR產(chǎn)物，或用定量PCR儀進行定量PCR直接擴增檢測與二惡英-AhR復合物結合的DNA的量。
本發(fā)明二惡英檢測方法的檢測原理如附圖1所示，當反應體系中有二惡英化合物(DLCs)存在時，形成二惡英-AhR-ARNT等組成的復合物，復合物與DRE序列DNA結合保護其免受外切酶III和核酸酶S1降解；反之，若反應體系中無DLCs存在時，不能形成復合物，DRE序列DNA因沒有保護而被降解；然后用PCR檢測因復合物結合而被保留的DNA片段，根據(jù)與二惡英-AhR復合物結合而保留的DNA片段的量與其所結合的二惡英的量成比例關系的特點，采用2，3，7，8-四氯代二苯并二惡英(TCDD)制定標準曲線，然后根據(jù)此標準曲線計算得出待測樣本中TEQ量。
本發(fā)明的二惡英檢測方法的具體步驟是①AhR混合物的制備參照Denison等人的方法(J.Biol Chem.1986；2613987-3995)制備含AhR的細胞溶質，方法如下取雄性大鼠一只，剖腹后用HEDG緩沖液(25mM HEPES，pH7.5，1mM EDTA，1mM DTT，10％甘油)+1.15％的氯化鉀進行肝臟灌注，然后切取肝臟用3倍體積的HEDG緩沖液勻漿，10,000g離心20分鐘，收集上清，105,000g離心60分鐘，取上清即為含有AhR的肝細胞溶質(cytosol)，測定蛋白含量，調整蛋白質含量為10mg/ml，-80℃儲備用。該細胞溶質含有AhR(芳香烴受體)，ARNT(芳香烴受體核轉位子蛋白)等成分，能與DLCs形成復合物，該復合物能與DRE序列結合。
②DRE序列DNA的設計和合成該雙鏈DNA序列結構如下圖所示5’CGGAGTTGCGTGAGAAGAGGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAACTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACGGAGTTGCGTGAGAAGAG3’DRE序列以CGG AGT TGC GTAG AGA AGA G為基準可進行個別堿基的調整，5’引物A1序列為5’-CGGAGTTGCGTGAGAAGAG G TTG ATA TAT CCC AAT G-3’；3’引物A2序列為5’-CTCTTCTCACGCAACTCCG TG TAA CAA GGG TGA ACA C-3’。
整個DNA序列長度約285bp。分子燈標探針結合區(qū)的序列為ATCCGGCCTTTATTCACA。
③二惡英-AhR-ARNT等組成的復合物的形成在0.5ml細胞溶質中加入含不同濃度二惡英化合物的樣本，20℃水浴2小時④二惡英-AhR-ARNT等組成的復合物與DRE序列DNA的結合反應取二惡英-AhR-ARNT等組成的復合物14μl，加入poly(dI·dC)1μg，20℃孵育15分鐘，然后加入含DRE序列的DNA雙鏈～50ng，反映總體積不超過20μl，20℃孵育15分鐘，即形成二惡英-AhR-ARNT復合物與DRE序列DNA的結合物。
⑤外切酶保護PCR分析參照Han等人的方法(Han B，hamana H，Shinozawa T，Sensitive detection of bingding ofE2F to its promoter by exonuclease III and Bss HI-protection PCR assays.J Biochem BiophysMethod 1999；85-92)進行外切酶保護分析復合物與DRE序列DNA結合后，加入100mM的MgCl2，100U核酸外切酶III，25℃水浴5分鐘，取5μl混合液加入15μl核酸酶S1緩沖液(40mM KAc，pH4.6，340mM NaCl，1.35mMZnSO4，0.8％甘油，300U/ml核酸酶S1)，室溫30分鐘，然后加入2μl的S1酶終止緩沖液(0.3M Tris-base，0.05M ETDA)，65℃加熱15分鐘終止外切酶反應。
⑥PCR擴增及PCR產(chǎn)物檢測取上述酶切反應液1μl作為模板，加入引物B1和B2各10pmol，10×緩沖液(含Mg++)5μl，dNTPs(每種25mmol/L)1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl(2U/μl)，總體積50μl，94℃變性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共進行25-30次循環(huán)，被保護的含DRE序列的DNA的量即被放大。然后用熒光探針檢測PCR產(chǎn)物的量，或進行定量PCR直接擴增檢測與二惡英-AhR復合物結合的DNA的量。
⑦標準曲線在0.5ml細胞溶質中加入含不同濃度TCDD標準，20℃水浴2小時，取14μl，加入poly(dI·dC)1μg，含DRE序列的DNA雙鏈～50ng，加HEDG緩沖液至20μl，20℃孵育20-30分鐘，即形成二惡英-AhR-ARNT復合物與DRE序列DNA的結合物。取上述酶切反應液1μl作為模板，加入引物B1(序列為5’-CAT TTC AGT CAG TTG CTC-3’)和B2(序列為5’-CGTCCT TCA TTG CCA TAC-3’)各10pmol，10×緩沖液(含Mg++)5μl，dNTPs(每種25mmol/L)1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl(2U/μl)，總體積50μl，94℃變性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共進行25-30次循環(huán)，被保護的含DRE序列的DNA的量即被放大。然后用熒光探針檢測PCR產(chǎn)物的量，或進行定量PCR直接擴增檢測與二惡英-AhR復合物結合的DNA的量。利用上述方法測定不同濃度的二惡英標準化合物，繪制出標準曲線，利用2，3，7，8-四氯代二苯并二惡英(2，3，7，8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)繪制的標準曲線如附圖3所示，可根據(jù)此標準曲線計算出樣本中的二惡英化合物的毒性當量濃度。由該標準曲線可知，本方法的檢測限為1fg/LTCDD。
⑧本方法的重復性通過多次測量不同濃度的二惡英標準品，結果表明本方法具有較好的重復性。
⑨本方法與現(xiàn)有方法的比較分別用本方法和現(xiàn)有的生物分析方法(CLAUX分析法)測定了同一批樣本中的二惡英濃度，結果表明本方法結果與現(xiàn)有的生物學方法結果有很好的相關性和一致性。


圖1外切酶保護PCR檢測痕量二惡英化合物的原理2含DRE序列雙鏈DNA的結構示意3外切酶保護PCR檢測二惡英化合物的標準曲線具體實施方式
1、利用本方法測定二惡英標準樣品①含Ah受體的細胞溶質的制備取SD雄性大鼠一只(購自同濟醫(yī)學院動物實驗中心)，剖腹后用HEDG緩沖液(25nMHEPES，pH7.5，1mM EDTA，1mM DTT，10％甘油)+1.15％的氯化鉀進行肝臟灌注，然后切取肝臟用3倍體積的HEDG緩沖液勻漿，10,000g離心20分鐘，收集上清，105,000g離心60分鐘，取上清即為含有AhR的肝細胞溶質(cytosol)，測定蛋白含量，調整蛋白質含量為10～15mg/ml，-80℃儲存?zhèn)溆谩?br> ②含DRE序列DNA的制備利用質粒Palter Max(購自Promega公司)設計一對含DRE序列的引物A1(序列為5’CGGAGTTGCGTGAGAAGAGCGTTGATATATCCCAATG 3’)和引物A2(序列為5’CTCTTCTCACGCAACTCCGTGTAACAAGGGTGAACAC 3’)。引物A1和A2均由上海博亞生物技術公司合成，經(jīng)PCR擴增為雙鏈DNA，序列如下5’CGGAGTTGCGTGAGAAGAGGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAACTCCGTATGGCAATGAAAGACGGT
GAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACGGAGTTGCGTGAGAAGAG3’③二惡英-AhR-ARNT等組成的復合物的的形成在0.5ml細胞溶質中加入含不同濃度二惡英化合物的樣本，20℃水浴2小時④二惡英-AhR-ARNT等組成的復合物與DRE序列DNA的結合反應取二惡英-AhR-ARNT等組成的復合物14μl，加入上述含DRE序列的DNA雙鏈1μg，加入poly(dI·dC)1μg，20℃孵育15分鐘，然后加入含DRE序列的DNA雙鏈～50ng，反映總體積不超過20μl，20℃孵育15分鐘，即形成二惡英-AhR-ARNT復合物與DRE序列DNA的結合物。
⑤外切酶保護在上述混合液中加入100mM的MgCl2，100U核酸外切酶III，25℃水浴5分鐘，取5μl混合液加入15μl核酸酶S1緩沖液(40mM KAc，pH4.6，340mM NaCl，1.35mMZnSO4，0.8％甘油，300U/ml核酸酶S1)，室溫30分鐘，然后加入2μl的S1酶終止緩沖液(0.3MTris-base，0.05M ETDA)，65℃加熱15分鐘終止外切酶反應。
⑤PCR擴增PCR擴增引物B1(序列為5’-CAT TTC AGT CAG TTG CTC-3’)和引物B2(序列為5’-CGT CCT TCA TTG CCA TAC-3’)均由上海博亞生物技術公司合成，由其他PCR試劑均購自Promega公司。取上述混合反應液1μl、加入10×PCR緩沖液10μl，2mmol/L的dNTPs2μl、引物B1(10μmol/L)和引物B2(10μmol/L)各10pmol，10×緩沖液(含Mg++)5μl，dNTPs(每種25mmol/L)1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl(2U/μl)，總體積50μl，94℃變性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共進行25-30次循環(huán)后，72℃延伸5分鐘，冷卻至4℃。經(jīng)PCR擴增為雙鏈DNA，序列如下5’-CATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAACTCCGTATGGCAATGAAAGACG-3’⑥熒光探針檢測PCR產(chǎn)物在上述PCR產(chǎn)物中加入由DNA合成儀合成的熒光能量轉移核酸探針(FAM-5′-gagcaTGTGAATAAAGGCCGGATtgctc-3′-TAMRA，由上海博亞生物技術公司合成)，其中FAM為熒光基團，TAMRA為熒光淬滅基團，由上海博亞生物技術公司合成)0.1μg，利用日本產(chǎn)島津RFP-5401型熒光儀測定熒光強度。
按上述方法測定二惡英標準樣本的測定結果如表1所示，結果表明本方法有較好的重復性。
表1用本方法測定二惡英標準樣本及其變異系數(shù)

2.本發(fā)明方法測定環(huán)境和生物樣本中的二惡英。
利用本方法檢測了湖泊底泥、魚肝臟、及報紙紙張中的二惡英含量，同時還利用國際上的通用的生物分析方法(EROD法)比較，結果表明利用本方法檢測的結果魚化學方法分析的結果有很好的相關性和一致性(見表2)，說明本方法測定環(huán)境及生物樣本中的二惡英具有良好的準確性和可靠性。
表2本方法測定環(huán)境和生物樣本中的二惡英及與標準方法比較


以下為本發(fā)明涉及的DNA序列表，其中序列1為制備DRE序列的5’端A1；序列2為制備DRE序列的3’端A2；序列3為DRE序列；序列4為PCR擴增B1；序列5為PCR擴增B1；序列6為經(jīng)引物B1、B2擴增的雙鏈DNA序列。
序列表<110>華中科技大學<120>痕量二惡英生物檢測方法<130>1<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>36<212>DNA<213>人工<400>1cggagttgcg tgagaagagg ttgatatatc ccaatg36<210>2<211>37<212>DNA<213>人工<400>2ctcttctcac gcaactccgt gtaacaaggg tgaacac 37<210>3<211>285<212>DNA<213>人工<400>3cggagttgcg tgagaagagg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc 60atttcagtca gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt120tttaaagacc gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc acattcttgc180ccgcctgatg aatgctcatc cggaactccg tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat240atgggatagt gttcaccctt gttacacgga gttgcgtgag aagag285<210>4<211>18<212>DNA<213>人工<400>4catttcagtc agttgctc18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工<400>5cgtccttcat tgccatac18<210>6<211>168<212>DNA<213>人工<400>6catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat attacggcct 60ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt cacattcttg120
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權利要求
1.一種二惡英檢測方法，包括以下步驟(1)用以動物肝臟組織制備的含芳香烴受體(AhR)和芳香烴受體核轉位子蛋白(ARNT)的細胞溶質作為二惡英的特異受體；(2)將含芳香烴受體(AhR)和芳香烴受體核轉位子蛋白(ARNT)的細胞溶質與含二惡英化合物的待測樣本共同孵育形成二惡英-AhR-ARNT復合物；(3)將所形成的二惡英-AhR-ARNT復合物與含有編碼為GCGTG的DRE序列的DNA雙鏈共同孵育，使DRE序列與二惡英-AhR-ARNT復合物結合；(4)用核酸外切酶III和核酸酶S1對含DRE序列的DNA進行水解，使未與二惡英-AhR-ARNT復合物結合的DRE序列DNA被水解，已與復合物結合的DRE序列DNA由于受到保護，不能被核酸外切酶III和核酸酶S1水解，得以保存；(5)用PCR檢測因復合物結合而被保留的DNA片段，根據(jù)與二惡英-AhR-ARNT等組成的復合物結合而保留的DNA片段的量與其所結合的二惡英的量成比例關系的特點，采用2，3，7，8-四氯代二苯并二惡英(TCDD)制定標準曲線，然后根據(jù)此標準曲線計算得出待測樣本中二惡英毒當量(TEQ量)。
2.根據(jù)權利要求1所述的二惡英檢測方法，其特征在于所述的用動物肝臟組織制備含芳香烴受體(AhR)的細胞溶質的方法是取SD雄性大鼠一只，剖腹后用HEDG緩沖液(25mMHEPES，pH7.5，1mM EDTA，1mM DTT，10％甘油)+1.15％的氯化鉀進行肝臟灌注，然后切取肝臟用3倍體積的HEDG緩沖液勻漿，10,000g離心20分鐘，收集上清，105,000g離心60分鐘，取上清即為含有AhR的肝細胞溶質(cytosol)，測定蛋白含量，調整蛋白質含量為10mg/ml，-80℃儲存或凍干備用。
3.根據(jù)權利要求1所述的二惡英檢測方法，其特征在于所述的將含芳香烴受體(AhR)等的細胞溶質與含二惡英化合物的待測樣本孵育形成二惡英-AhR-ARNT復合物的方法是在0.5ml細胞溶質中加入含不同濃度二惡英化合物的樣本，20℃水浴2小時；
4.根據(jù)權利要求1所述的二惡英檢測方法，其特征在于所述的將所形成的二惡英-AhR-ARNT復合物與含有編碼為GCGTG的DRE序列的DNA雙鏈共同孵育而使DRE序列與二惡英-AhR-ARNT復合物結合的方法是加入含DRE序列的DNA雙鏈1μg，加入poly(dI·dC)1μg，20℃孵育15分鐘，然后加入含DRE序列的DNA雙鏈～50ng，反應總體積不超過20μl，20℃孵育15分鐘，即形成二惡英-AhR-ARNT復合物與DRE序列DNA的結合物。
5.根據(jù)權利要求1所述的二惡英檢測方法，其特征在于所述的用核酸外切酶III和核酸酶S1對未與二惡英-AhR-ARNT復合物結合的DRE序列DNA進行水解的方法是在20μl形成了二惡英-AhR-ARNT復合物與DRE序列DNA結合物的反應液中，加入100mM的MgCl2，100U核酸外切酶III，25℃水浴5分鐘，取5μl混合液加入15μl核酸酶S1緩沖液(40mM KAc，pH4.6，340mM NaCl，1.35mMZnSO4，0.8％甘油，300U/ml核酸酶S1)，室溫30分鐘，然后加入2μl的S1酶終止緩沖液(0.3M Tris-base，0.05M ETDA)，65℃加熱15分鐘終止外切酶反應。
6.根據(jù)權利要求1所述的二惡英檢測方法，其特征在于所述的用PCR檢測因復合物結合而被保留的DNA片段的方法是取上述酶切反應液1μl作為模板，加入序列4所示引物B1和序列5所示引物B2加入引物B1和B2各10pmol，10×緩沖液(含Mg++)5μl，dNTPs(每種25mmol/L)1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl(2U/μl)，總體積50μl，94℃變性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共進行25-30次循環(huán)，然后用分子燈標熒光探針檢測PCR產(chǎn)物，或用定量PCR儀進行定量PCR直接擴增檢測與二惡英-AhR復合物結合的DNA的量。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種全新的二惡英檢測方法，該發(fā)明根據(jù)二惡英與芳香受體所形成的復合物所具有的特異核酸結合特性，利用核酸擴增技術的高靈敏度建立起一種全新的二惡英痕量檢測方法。二惡英與芳香烴受體形成的復合物能與特異核酸序列結合并保護其免受核酸外切酶III和核酸酶S1的降解，然后利用核酸擴增技術檢測復合物結合保護的特異核酸序列，復合物結合的核酸序列與二惡英的量成比例關系。本發(fā)明方法簡便易行，成本低，靈敏度高，可廣泛用于環(huán)境樣本和食品等中二惡英化合物的檢測。
文檔編號C12Q1/25GK1661089SQ20041006147
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月31日 優(yōu)先權日2004年12月31日
發(fā)明者徐順清 申請人:華中科技大學