專利名稱：一種新型的產(chǎn)植酸酶基因工程菌及其培養(yǎng)方法
專利說明一種新型的產(chǎn)植酸酶基因工程菌及其培養(yǎng)方法 本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，提出一種針對自主構(gòu)建的產(chǎn)植酸酶基因工程菌以及本工程菌的培養(yǎng)方法。
1.菌種現(xiàn)在國內(nèi)外研究了巴斯德畢赤酵母新型分泌表達(dá)載體pPICINU的構(gòu)建，具有與帶有表達(dá)載體PPIC9K的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因重組相同的分泌效率；用化學(xué)合成方法合成INUA，INUB，INUC三個先導(dǎo)肽DNA片段，經(jīng)酶切處理質(zhì)粒PPIC3.5K重組構(gòu)建了新型分泌型畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)即PPICINUA，設(shè)計并合成一對引物，得到表達(dá)質(zhì)粒PPICINUA-ASN和PPIC9K-ASN(參見汪世華，等植酸酶的現(xiàn)狀及其研究進(jìn)展。廣州食品工業(yè)科技。18(1)54-57))構(gòu)建了phyAI的酵母轉(zhuǎn)化載體PPIC9K/phyAII，采用PCR擴增無花果曲霉As3.324的植酸酶基因phyAI的方法(參見張苓花植酸酶基因工程研究)；將煙曲霉植酸酶基因可隆到誘導(dǎo)型畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K上，構(gòu)建質(zhì)粒Phbm108；霍丹群等以黑曲霉菌株F246基因組為模板，對植酸酶基因phyA的成熟肽進(jìn)行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物可隆入PMD18T質(zhì)粒，獲得表達(dá)載體pPET30a+和pMG36e，成功構(gòu)建了phyA基因2種新型載體。(參見張晚鳴，馬立新.土曲霉CCTCCAF93044植酸酶基因的克隆及序列分析。湖北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版).2001，23(2)174-77)植酸酶基因現(xiàn)已成功在畢赤酵母(Pichia pastoris)、漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)家蠶等多個表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)成功，各國對這些表達(dá)系統(tǒng)的研究也比較多，但普遍都存在以下問題菌種的產(chǎn)酶量有待進(jìn)一步提高；基因工程菌發(fā)酵用培養(yǎng)基成本較昂貴；基因工程菌的相關(guān)中試生產(chǎn)工藝還應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化。(參見王紅寧，陳惠基因工程產(chǎn)植酸酶性質(zhì)的研究2003年30(3))王紅寧已獲得生產(chǎn)性能比較好的植酸酶基因工程菌(參見王紅寧，吳琦黑曲霉N25植酸酶phyA基因的克隆及序列分析微生物學(xué)報2001；王紅寧，劉世貴黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德畢赤酵母中高效表達(dá)的研究菌物系統(tǒng)2001)，對于工程菌的培養(yǎng)條件有待進(jìn)一步研究、完善。本研究從植酸酶PhyA基因出發(fā)，對其活性中心81、85位精氨酸的密碼子進(jìn)行突變，突變?yōu)榻湍钙珢鄣拿艽a子，以期提高植酸酶在酵母中的表達(dá)量；同時對工程菌培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的工程菌酶活最高可達(dá)85067U/ml，是培養(yǎng)條件未優(yōu)化時酶活力(47600U/ml)的1.8倍。
2.培養(yǎng)基在高密度培養(yǎng)研究時，大多數(shù)采用invitrogen公司的畢赤酵母發(fā)酵工藝手冊上提供的FM21基礎(chǔ)鹽配成含4％甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基，組成為85％H3PO426.7ml，CaSO4·2H2O0.93g，K2SO418.2g，MgSO4·7H2O 14.9g，KOH 4.31g，甘油40.0g，加水定容至1L。發(fā)酵時流加PTM1微量元素鹽，組成為CuSO4·5H2O 6.0g，NaI 0.08g，MnSO4·H2O 3.0g，H3BO30.02g，CoCl20.5g，ZnCl220.0g，Biotin 0.2g，Na2MoO4·2H2O 0.2g，F(xiàn)eSO4·7H2O 65.0g，濃H2SO45.0ml定容至1L，其工作濃度為4.35ml/L發(fā)酵培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基成分相對較為復(fù)雜，且主要以鹽類元素為主，營養(yǎng)單一，且價格昂貴(參見Pichia Fermentation ProcessGuidelines)約為1.962元/100000U，而王紅寧自己所篩的麥芽培養(yǎng)基價格約為0.009元/100000U。培養(yǎng)基成本降低了218倍。尤其是BMGY/BMMY這類培養(yǎng)基不能混合高溫滅菌，否則容易形成沉淀。當(dāng)流加的PTM1鹽過高時，同樣容易形成沉淀，給發(fā)酵帶來不便。而其他廉價而有效的適合畢赤工程菌培養(yǎng)的具有產(chǎn)業(yè)化傾向的培養(yǎng)基尚無報道。
3.關(guān)于培養(yǎng)方法3.1種齡對于前期酵母的生長來說，應(yīng)積累其菌體濃度和使細(xì)胞處于最佳生長狀態(tài)，而種子的種齡對其影響是較大的，選擇合適的種齡對于生長階段酵母，可縮短其延滯期，加速其進(jìn)入對數(shù)生長期。現(xiàn)在報道種齡的選擇從5-12小時不等。(參見張梅申，沈愛光等.植酸酶產(chǎn)生菌株的液體深層發(fā)酵條件研究.華北農(nóng)學(xué)報.1999，14(4)63-67)3.2接種量接種量通過影響菌體生長狀態(tài)和密度影響到外源蛋白的表達(dá)?，F(xiàn)國內(nèi)外報道植酸酶基因工程菌的接種量為1-15％不等。(參見Jagadish C.Tarafdar，Ranjeet S.Yadav，RamNiwas Relative of fungal intra-and extracellular phosphatases and phytase.J.Plant Nutr.Soil Sci.2002，16517-19)3.3收獲時間植酸酶的收獲時間因菌種而不同，所以沒有統(tǒng)一定論3.4誘導(dǎo)培養(yǎng)基的起始PH值現(xiàn)報道認(rèn)為，如果用兩步法來誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)，則誘導(dǎo)時的起始pH可能是畢赤酵母高效表達(dá)重組蛋白的關(guān)鍵之一，通過改變誘導(dǎo)時的pH值，可使表達(dá)量提高50％以上?，F(xiàn)PH的設(shè)置通常為4.0-7.5。(參見邱榮德，朱建蓓，王壘等.人p53蛋白在巴氏德畢赤酵母中的表達(dá).生物工程學(xué)報.999，15(4)477-481)。
3.5甲醇甲醇誘導(dǎo)的方式、用量都會對外源蛋白的表達(dá)水平產(chǎn)生影響。由于工程菌甲醇利用型的不同，甲醇的添加量應(yīng)做相應(yīng)變化，但不能太高，過量的甲醇對菌體有毒害作用，甲醇濃度過低，誘導(dǎo)出的酶蛋白不足，所以要選擇合適的甲醇誘導(dǎo)濃度。甲醇濃度一般選則為4.5-10％。分別采用甲醇誘導(dǎo)法(BMMY培養(yǎng)基)和甘油補料甲醇誘導(dǎo)法(BMGY培養(yǎng)基)發(fā)酵表達(dá)人重組白蛋白，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)相同時間，兩種誘導(dǎo)方法所表達(dá)的產(chǎn)物產(chǎn)量相差較大。(參見崔蘊霞，明文玉，銀巍等.人重組白蛋白在巴斯德畢赤酵母中的高效表達(dá).微生物學(xué)報，2001，41(2)244-246.
3.6誘導(dǎo)時間現(xiàn)報道誘導(dǎo)時間應(yīng)該在100-150h左右，外源基因的表達(dá)才能達(dá)到最高，而有些菌表達(dá)時需要誘導(dǎo)200h以上。過短的時間(3d)表達(dá)量很低。過長的時間外源蛋白的降解增加。因此尋求一個最佳產(chǎn)量時間比就特別重要。而且甲醇與甘油兩種誘導(dǎo)方法表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量達(dá)到最高所需的時間也不同。甲醇誘導(dǎo)所表達(dá)的產(chǎn)物培養(yǎng)24小時后即開始有明顯的蛋白分泌，在48小時后達(dá)到高峰，而甘油補料甲醇誘導(dǎo)法培養(yǎng)24小時開始有微量的蛋白分泌，以后則隨時間的增加而呈梯度增加，150小時后蛋白的含量達(dá)到最大值。(參見鄔小兵，樂國偉，張必武等.影響畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的因素.生物技術(shù).2002，12)。
對來源于黑曲霉(Arpergillus niger)N25植酸酶phyA基因(GenBank注冊號AF218813)表達(dá)片段進(jìn)行定點突變，在不改變其所編碼氨基酸的情況下，選用畢赤酵母偏愛的密碼子對該基因最保守序列中81位和85位的Arg密碼子進(jìn)行了同義突變改造，構(gòu)建了突變基因phyAm的酵母表達(dá)載體pPIC9k-phyAm，將其轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115，，獲得一株產(chǎn)植酸酶的基因工程菌PP-NPm-8。該菌種經(jīng)傳代實驗證實具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
產(chǎn)植酸酶的基因工程菌PP-NPm-8在王紅寧自制的麥芽汁高溫浸提培養(yǎng)基上獲得了很好的培養(yǎng)。研究了麥芽汁培養(yǎng)基和麥芽高溫浸提培養(yǎng)基，能有效用于畢赤酵母工程菌的培養(yǎng)。培養(yǎng)基成本比BMGY/BMMY降低了218倍。
對突變植酸酶基因工程菌PP-NPm-8的培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，確定了其最佳培養(yǎng)條件將種齡為16h的工程菌液體種子，以3％接種量接種pH4.5的麥芽汁生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h后換為pH值為5.0、甲醇終濃度為4％的麥芽汁高溫浸提液誘導(dǎo)培養(yǎng)36h后測定酶活。
本發(fā)明的第一個目的是提供一種產(chǎn)植酸酶的基因工程菌PP-NPm-8。
本發(fā)明的第二個目的為提供麥芽汁培養(yǎng)基(生長培養(yǎng)基)和麥芽高溫浸提培養(yǎng)基(產(chǎn)酶培養(yǎng)基)的制做方法，及其比例。
本發(fā)明的第三個目的為提供PP-NPm-8的最佳種齡。
本發(fā)明的第四個目的為提供PP-NPm-8的最佳接種量。
本發(fā)明的第五個目的為提供本工程菌產(chǎn)植酸酶的最佳收獲時間。
本發(fā)明的第六個目的為提供PP-NPm-8的最佳PH。
本發(fā)明的第七個目的為提供PP-NPm-8的最適誘導(dǎo)初始PH。
本發(fā)明的第八個目的為提供PP-NPm-8所需誘導(dǎo)劑甲醇的最佳劑量。
從下面給出的說明結(jié)合附圖，本發(fā)明的上面和其他目的特征變明了。其中

圖1表示植酸酶工程菌PP-NPm-8的生長曲線。
圖2表示植酸酶工程菌PP-NPm-8的種齡曲線。
圖3表示接種量與菌體濃度和產(chǎn)酶的關(guān)系。
圖4表示誘導(dǎo)時間與產(chǎn)酶的關(guān)系。
圖5表示誘導(dǎo)過程中菌體濃度和PH的變化。
圖6表示。生長階段初始PH與菌體濃度和產(chǎn)酶的關(guān)系。
圖7表示誘導(dǎo)階段初始PH與菌體濃度和產(chǎn)酶的關(guān)系。
圖8表示甲醇誘導(dǎo)濃度和產(chǎn)酶的關(guān)系。
本發(fā)明的詳細(xì)描述從黑曲霉N25得到植酸酶phyA基因表達(dá)片段，對該基因進(jìn)行定點突變，然后構(gòu)建了突變基因phyAm的酵母表達(dá)載體pPIC9k-phyAm，轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115，獲得重組基因工程酵母菌株P(guān)P-NPm-8。該菌種具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
對突變植酸酶基因工程菌PP-NPm-8的培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，確定了其最佳培養(yǎng)條件將種齡為16h的工程菌液體種子，以3％接種量接種pH4.5的麥芽汁生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h后換為pH值為5.0、甲醇終濃度為4％的麥芽汁高溫浸提液誘導(dǎo)培養(yǎng)36h后測定酶活。在下面的實施中進(jìn)一步說明了了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。菌種采用黑曲霉N25植酸酶phyA基因表達(dá)片段，選用畢赤酵母偏愛的密碼子對該基因最保守序列中81位和85位的Arg密碼子進(jìn)行同義突變，構(gòu)建了突變基因phyAm的酵母表達(dá)載體pPIC9k-phyAm，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)和產(chǎn)物的酶活測定篩選出轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Southern blotting分析，結(jié)果表明phyA基因以單交換方式單拷貝整合到了酵母染色體DNA中；表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析表明，重組酵母中的植酸酶能有效分泌和表達(dá)，酶蛋白分子大小為70.15KD。酶活測定結(jié)果表明，經(jīng)密碼子優(yōu)化的突變重組酵母酶活力明顯高于未進(jìn)行優(yōu)化的重組酵母轉(zhuǎn)化子，經(jīng)密碼子優(yōu)化的突變重組酵母株P(guān)P-NPm-8于麥芽汁培養(yǎng)基中誘導(dǎo)36h后酶活力可達(dá)85067U/ml(植酸酶活性單位定義為在37℃、pH4.6的條件下，1分鐘內(nèi)從0.0051摩爾(mol/L)的植酸鈉溶液中釋放出1納摩爾(nmol)無機磷所需要的植酸酶量為一個酶活性單位(U))。該菌種具有良好的遺傳穩(wěn)定性。麥芽汁培養(yǎng)基及制備稱取100g粉碎麥芽，置于500ml或1000ml三角瓶中，按料水比為1∶6加入600ml蒸餾水，混合，作好體積標(biāo)記，放入預(yù)先調(diào)好溫度為65℃左右的水浴箱中進(jìn)行糖化，攪拌數(shù)次，碘反應(yīng)檢測糖化程度(遇碘不變色，則糖化完全)，糖化時間約2h。待糖化完全后，補失水，離心過濾，測定麥芽汁的糖度和最終麥汁體積。121℃滅菌20min備用。
麥芽高溫浸提液培養(yǎng)基及制備各稱取100g粉碎麥芽，置于三角瓶中，按料水比為1∶6加入蒸餾水，混勻，做好體積標(biāo)記。電爐加熱煮沸5-10min后(注意攪拌)，置于90℃以上的水浴箱中，適當(dāng)攪拌，浸提時間約3h。冷卻后，補充失水，離心過濾，測定浸提液體積，121℃滅菌20min后備用。種齡對產(chǎn)酶的影響從液體種子中按2％接種量接種一瓶10ml麥芽汁生長培養(yǎng)基后分別于12h、14h、16h、18h、20h、22h取樣測定600nm時的OD值(獲得PP-NPm-8菌株的生長曲線)，見圖1。
以各時間點取樣的菌液做為種子按2％接種量轉(zhuǎn)接另10ml麥芽汁生長培養(yǎng)基中生長培養(yǎng)18h取樣測定OD600后換1ml麥芽汁高溫浸提液，以2％甲醇誘導(dǎo)36h后測定酶活，獲得PP-NPm-8菌株的種齡曲線，見圖2。
由生長曲線可知在前16h菌體量呈指數(shù)增長，處于對數(shù)生長期，菌體的生長狀態(tài)最好，以后生長趨于平穩(wěn)，在18h菌體濃度達(dá)最大。由種齡曲線可知，當(dāng)種齡為16h時菌體量最大，但由14h至18h菌體量變化幅度很小，OD600都在12左右；當(dāng)以不同種齡的種子接種誘導(dǎo)產(chǎn)酶時，種齡為16h可獲得植酸酶最大表達(dá)量，當(dāng)種齡大于或小于16h，培養(yǎng)液中酶含量都會下降，所以PP-NPm-8菌株的種齡16h為最佳，即最佳種齡為16h。接種量對產(chǎn)酶的影響按1％-5％的接種量分別接種為最佳種齡16h的PP-NPm-8液體種子于10ml麥芽汁生長培養(yǎng)基中生長培養(yǎng)18h后，各取50μl菌液做60倍稀釋測定600nm時的OD值，靜置4h后換為含2％甲醇的誘導(dǎo)液誘導(dǎo)36h后測定酶活，結(jié)果見圖3。
由圖中OD600的比較可見，接種量為3-5％時，生長20h后菌體濃度都很大，酵母生長較好，但由酶活測定結(jié)果可見接種量為3％時培養(yǎng)液中酶含量最高，高于或低于3％接種量酶含量均減少，故接種量為3％最佳，即最佳接種量為3％。植酸酶的收獲時間按最佳接種量3％接種種齡為16h的液體種子于10ml麥芽汁生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h后靜置4h，換為含2％甲醇的誘導(dǎo)液誘導(dǎo)，分別于6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h取樣測定菌體濃度、pH和酶活。產(chǎn)酶曲線見圖4。誘導(dǎo)產(chǎn)酶過程中不同時間菌體濃度和pH變化規(guī)律見圖4。通過對PP-NPm-8菌株培養(yǎng)過程中酶活監(jiān)測，前24h酶活呈指數(shù)增加迅速上升至42h達(dá)最高峰，以后呈平穩(wěn)狀態(tài)并略有下降，故在42h-48h收獲植酸酶最佳。該重組酵母為甲醇利用快型即Mut+，可迅速利用甲醇并誘導(dǎo)產(chǎn)酶，比Muts優(yōu)越，可大大縮短收獲時間，對降低生產(chǎn)成本有重要意義。同時在誘導(dǎo)過程中可發(fā)現(xiàn)工程菌的菌體濃度在前24h內(nèi)呈指數(shù)增長，以后呈緩慢上升和平穩(wěn)狀態(tài)；誘導(dǎo)過程中PH值也呈一定規(guī)律變化，在誘導(dǎo)前期PH逐漸增加，至24h左右維持在5.5-6.0之間不再有變化。生長階段最適初始pH用5M氫氧化鈉和65％硝酸調(diào)節(jié)麥芽汁生長培養(yǎng)基至初始pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，同時設(shè)立不調(diào)pH的麥芽汁做對照，按3％接種量接種種齡為16h的PP-NPm-8液體種子于生長培養(yǎng)基中生長培養(yǎng)18h后測定菌體濃度，靜置4h后去上清，換為1ml麥芽汁高溫浸提液以2％甲醇誘導(dǎo)36h后測定酶活。見圖5。
由圖5可見生長階段最適初始pH在4.5-5.0范圍內(nèi)菌體生長最好，濃度最大，所以最適生長初始pH為4.5。但對于最終酶產(chǎn)量而言，是初始pH為6.0時最高，說明對于PP-NPm-8菌株的培養(yǎng)生長階段和誘導(dǎo)階段對pH值要求不同，對于高密度培養(yǎng)可調(diào)節(jié)生長培養(yǎng)基初始pH在4.5-5.0，使菌體大量增殖，誘導(dǎo)階段再適當(dāng)調(diào)高pH使菌體大量產(chǎn)酶。從pH的變化可看出酵母在生長階段大量利用碳源，產(chǎn)酸，使溶液pH降低。誘導(dǎo)最適初始pH將生長階段初始pH調(diào)為4.5，生長18h后菌體濃度達(dá)OD600＝12.3。靜置去上清后換為1ml pH分別5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5麥芽汁高溫浸提液，同時設(shè)立不調(diào)pH的麥芽汁高溫浸提液做對照，以2％甲醇誘導(dǎo)36h后測定酶活和pH。見圖6。
結(jié)果表明誘導(dǎo)初始pH在5.0-5.5最佳，所以最適誘導(dǎo)初始pH為5.0。過高過低酶活性都下降，當(dāng)pH高于6.0時，隨pH增加酶活逐漸下降。從pH的變化可看出酵母在誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基堿性增加，pH有所升高。甲醇濃度對產(chǎn)酶的影響以上述確定的最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)PP-NPm-8菌株，僅把甲醇做1％、2％、3％、4％、5％濃度梯度誘導(dǎo)產(chǎn)酶，36h后測定酶活，結(jié)果如下，見圖7。
結(jié)果表明，甲醇誘導(dǎo)濃度對酶活性有很大影響，4％甲醇濃度最佳，即最佳甲醇濃度為4％。甲醇濃度在1％-4％范圍內(nèi)，隨著甲醇濃度的增加酶活性逐漸升高，但過高濃度甲醇反而導(dǎo)致酶活降低。見圖8。
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)人工改造的基因工程菌PP-NPm-8，其特征是具有產(chǎn)生高比活植酸酶的能力。
2.權(quán)利要求1所述的基因工程菌PP-NPm-8，其特征在于當(dāng)用麥芽汁培養(yǎng)基(生長培養(yǎng)基)和麥芽高溫浸提培養(yǎng)基(產(chǎn)酶培養(yǎng)基)培養(yǎng)的條件下可以獲得85067U/ml的產(chǎn)酶量。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征是在菌齡為16小時下進(jìn)行的。
4.權(quán)利要求2的方法，其特征是在接種量為3-5％時，生長20h后進(jìn)行的。
5.權(quán)利要求2的方法，其特征是在42h-48h收獲植酸酶下進(jìn)行的。
6.權(quán)利要求2的方法，其特征是在生長階段最適初始pH在4.5-5.0范圍內(nèi)進(jìn)行的。
7.權(quán)利要求2的方法，其特征是在最適誘導(dǎo)初始pH為5.0下進(jìn)行的。
8.權(quán)利要求2的方法，其特征是在4％甲醇濃度的誘導(dǎo)下進(jìn)行的。
全文摘要
本研究屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。采用PCR技術(shù)對來源于自主分離隆的黑曲霉(Arpergillusniger)N25的植酸酶phyA基因(GenBank注冊號AF218813)的表達(dá)片段進(jìn)行定點突變，構(gòu)建含突變基因phyA
文檔編號C12N1/19GK1644676SQ20041008144
公開日2005年7月27日 申請日期2004年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日
發(fā)明者王紅寧, 陳惠 , 吳琦, 趙海霞, 張瑞強, 王平章, 謝濤 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 王紅寧