專利名稱：一種具有抗腫瘤作用的融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤作用的融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及一種具有抗腫瘤作用的融合蛋白及其編碼基因與以該融合蛋白為活性成分的預(yù)防和/或治療由人乳頭瘤病毒感染引起的腫瘤疫苗。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)屬乳多孔病毒科A亞組，是異族主要侵犯人體皮膚粘膜的小DNA病毒，引起上皮的增生改變，具有明顯的組織特異性。按照HPV感染與子宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)性，將HPV分為低危型(HPV1、5、6、11等)和高危型(HPV16、18、31、33、45等)。低危型HPV可引起表皮細(xì)胞良性增生，如乳頭狀瘤或疣；高危型HPV與子宮頸上皮內(nèi)瘤的發(fā)生和惡變以及其它上皮型腫瘤的發(fā)生相關(guān)。其中HPV16與子宮頸癌的關(guān)系最為密切，在所有子宮頸癌標(biāo)本中HPV16的檢出率在50％以上。
根據(jù)核苷酸序列進(jìn)行分型，現(xiàn)已鑒定出的HPV有100多個(gè)亞型。HPV病毒體直徑約55nm，為二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，有外膜包被。其基因組是一閉環(huán)雙鏈DNA，屬雙鏈DNA病毒，長(zhǎng)約8Kb，分早期區(qū)、晚期區(qū)和調(diào)節(jié)區(qū)。早期區(qū)(early region，ER)包括6個(gè)不同的開放閱讀框E1、2、4-7。E1通過與DNA多聚酶α結(jié)合啟動(dòng)DNA復(fù)制。E2蛋白質(zhì)是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)因子，有DNA結(jié)合特性。E4蛋白可能與病毒顆粒釋放有關(guān)，E5編碼一種疏水的膜蛋白，是血小板生長(zhǎng)因子/表皮生長(zhǎng)因子受體激活因子，具有一定轉(zhuǎn)化潛能。E6、E7編碼的蛋白有細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能，是高危型HPV致癌作用的主要蛋白質(zhì)。體內(nèi)體外研究表明他們有致腫瘤活性，主要表現(xiàn)在高危型HPV的E6、E7蛋白可使原代細(xì)胞永生化；抑制細(xì)胞終末分化；影響細(xì)胞周期調(diào)控；以及E6或E7蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的永生化細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)能形成腫瘤。E6基因編碼的E6蛋白可與細(xì)胞P53蛋白結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)化功能，E6蛋白質(zhì)與P53蛋白質(zhì)結(jié)合后，加速P53蛋白質(zhì)的降解，使之喪失“分子警察”的功能，失去抑癌活性；E7蛋白通過與抑癌基因產(chǎn)物Rb蛋白結(jié)合，從而影響Rb與轉(zhuǎn)錄因子E2F的結(jié)合，與Rb分離狀態(tài)下的E2F對(duì)細(xì)胞有轉(zhuǎn)錄激活作用，能刺激細(xì)胞增殖。E6或E7蛋白質(zhì)的單獨(dú)作用已具有一定的轉(zhuǎn)化功能，但兩者的協(xié)同作用可極大地提高轉(zhuǎn)化頻率。
HPV感染與人體多種癌癥，尤其是子宮頸癌的發(fā)病有關(guān)。不同型別HPV感染不同的上皮組織，引起的病理變化也不同，對(duì)身體不同部位的皮膚和粘膜的嗜向性不同，即HPV感染有明顯的組織特異性。根據(jù)所感染上皮的不同，將HPV分為皮膚型和粘膜型，并將前者進(jìn)一步分為尋常疣和疣狀表皮結(jié)構(gòu)不良兩種類型。粘膜型HPV感染下生殖道或下泌尿道粘膜上皮，感染口腔和呼吸道粘膜者較少。按照與生殖道腫瘤的關(guān)系，將之分為低危型和高危型，低危型(HPV6、11)引起生殖道乳頭狀疣或尖銳濕疣的形成；高危型(HPV16、18、33)引起子宮頸上皮內(nèi)瘤，并進(jìn)而與子宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。
HPV16至今還不能在體外組織中培養(yǎng)，且含有潛在致癌性DNA，故疫苗不能采用HPV減毒活疫苗或滅活疫苗。因此現(xiàn)在疫苗的研究重點(diǎn)在其他形式的疫苗，如基于晚期蛋白L1的亞單位疫苗、合成多肽疫苗、DNA重組活疫苗和DNA疫苗等。
(一)病毒樣顆粒HPV病毒體誘發(fā)的抗體，尤其是中和抗體，只能識(shí)別構(gòu)象依賴性表位，因此不能用它們作為抗原和免疫原進(jìn)行HPV16的抗體檢測(cè)或制備疫苗。HPV16的L1和L2基因編碼病毒衣殼蛋白，與病毒的侵襲性感染有關(guān)而無轉(zhuǎn)化活性。最初利用大腸桿菌表達(dá)的L1和L2蛋白只能形成線性表位，缺乏翻譯后修飾，用血清學(xué)檢測(cè)時(shí)結(jié)果缺乏特異性，也不與病情相關(guān)，免疫學(xué)研究證明所誘發(fā)的抗體滴度低，不能形成有效保護(hù)。用沙門氏菌表達(dá)的L1和L2蛋白能裝配成病毒樣顆粒(virus like particle，VLP)，可誘發(fā)高滴度抗體。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，真核系統(tǒng)表達(dá)的晚期蛋白更具有天然蛋白質(zhì)的免疫原性。動(dòng)物試驗(yàn)表明，用VLP免疫動(dòng)物可產(chǎn)生有效的保護(hù)作用。此疫苗正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
(二)DNA重組活疫苗DNA重組活疫苗的優(yōu)勢(shì)在于能使感染細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)目的基因，有正確的翻譯后修飾加工作用。痘苗病毒是最有吸引力的侯選表達(dá)載體，它對(duì)外源DNA容量大，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。HPV16L1重組痘苗病毒可以刺激小鼠產(chǎn)生CTL反應(yīng)，但它會(huì)引起免疫缺陷者的種痘后腦炎或進(jìn)行性牛痘等副作用。腺病毒作為載體的毒性相對(duì)較小，經(jīng)鼻腔免疫后可刺激肺和生殖道中IgA抗體分泌，這對(duì)HPV這種生殖道感染疾病具有吸引力，但臨床試驗(yàn)并非預(yù)期的那樣好。
(三)合成多肽疫苗安全性好，容易制備和儲(chǔ)存，有理想的靶特異性。但制備多肽疫苗的前提是明確抗原的決定簇結(jié)構(gòu)。至今HPV16的中和表位和T細(xì)胞表位尚未完全確定，因此這種方式還有一定難度。
(四)DNA疫苗DNA疫苗具有純化技術(shù)簡(jiǎn)單、制備迅速、成本低廉、易于儲(chǔ)存等特點(diǎn)。接種DNA疫苗后蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，直接與主要組織相容性復(fù)合體MHC I類或II類分子結(jié)合，同時(shí)引起細(xì)胞和體液免疫，免疫應(yīng)答全面，保護(hù)力強(qiáng)，維持時(shí)間久；尤其是在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原與其自然感染相似，按正常途徑加工、處理、修飾，并以天然構(gòu)象遞呈給宿主免疫系統(tǒng)，激發(fā)免疫應(yīng)答。HPV16L1的核酸疫苗動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示具有良好的效果，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生對(duì)HPV16L1的特異性體液和細(xì)胞免疫。但DNA疫苗在臨床試驗(yàn)中的效果并不理想，并且DNA疫苗的安全性還需要進(jìn)一步深入研究。
以上所介紹的各種HPV疫苗大多處于研究階段，并且重點(diǎn)主要放在預(yù)防性疫苗上。其中效果最好的是病毒樣顆粒，現(xiàn)正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。對(duì)于由HPV16感染引起的宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)等疾病這些預(yù)防性疫苗就會(huì)失去作用。針對(duì)這些疾病，需要開發(fā)相應(yīng)的治療性疫苗。
高危型HPV16E7基因編碼的蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)化活性，在子宮頸癌組織中持續(xù)表達(dá)，被認(rèn)為是病毒的癌基因，其表達(dá)的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是腫瘤排斥抗原，因而是治療HPV相關(guān)腫瘤和子宮頸癌高度特異型增生的最富有吸引力的靶抗原基因。
以E7為基礎(chǔ)開發(fā)疫苗的方法主要有三種(1)用細(xì)菌、酵母或昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備野生型E7的完整蛋白質(zhì)作抗原；(2)將E7的完整或突變基因重組入不同的載體系統(tǒng)，如腺病毒、痘苗病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，直接構(gòu)建DNA疫苗；(3)E7蛋白的CTL表位多肽作為亞單位疫苗。
現(xiàn)在已經(jīng)知道，以上幾種疫苗形式均可以激活體液或細(xì)胞免疫，但是本身都有其內(nèi)在的缺點(diǎn)，如DNA疫苗，到目前為止國(guó)際上尚未有成熟產(chǎn)品上市；單獨(dú)用E7蛋白的CTL表位多肽作為亞單位疫苗，疫苗的保護(hù)作用不能持久等。
熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一類在分子進(jìn)化上高度保守、廣泛存在于細(xì)菌、原蟲、蠕蟲、酵母菌、植物、動(dòng)物乃至人類的家族蛋白，其功能極為相似，具有分子伴侶作用，參與多種胞內(nèi)蛋白的折疊、裝配及轉(zhuǎn)運(yùn)；近年來發(fā)現(xiàn)，病原體Hsp與病原體抗原表位相結(jié)合可以成為免疫優(yōu)勢(shì)抗原(immunodominantantigens)引起抗感染免疫；Hsp還可以作為腫瘤病毒疫苗的載體，誘導(dǎo)機(jī)體腫瘤特異性CTL反應(yīng)，其研究策略是熱休克蛋白和腫瘤特異性抗原肽融合表達(dá)，融合肽疫苗注射人體后可激活針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)。其理論基礎(chǔ)是，Hsp可以通過受體介導(dǎo)的抗原提呈細(xì)胞(APC)的內(nèi)吞作用對(duì)與其融合的抗原肽進(jìn)行加工、遞呈給樹突狀細(xì)胞的MHC-I分子，后者可被特異性CD8+T細(xì)胞識(shí)別，從而激活機(jī)體特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)效應(yīng)。
結(jié)核分支桿菌熱休克蛋白65(HSP65)屬于HSP70家族，結(jié)核分支桿菌的胞壁蛋白。在感染結(jié)核分支桿菌的患者的血清抗體中，有20％的抗體是針對(duì)這個(gè)蛋白的，說明它有很強(qiáng)的免疫原性。另外，它和人的HSP70有較高的同源性，如果和抗原肽結(jié)合，也可以進(jìn)入人或小鼠MHC-I限制性抗原遞呈途徑，進(jìn)而激活細(xì)胞免疫。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤作用的融合蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的具有抗腫瘤作用的融合蛋白，名稱為HEZ，是具有序列表中的SEQ ID №5的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或是將序列表中SEQ ID №5的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有抗腫瘤作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №5由696個(gè)氨基酸殘基組成。
HEZ由HSP65、HPV16E7和Z-tag結(jié)構(gòu)域組成。Z-tag結(jié)構(gòu)域使HEZ通過陽離子交換層析得到了有效純化，并且提高了HEZ的疫苗活性。
上述具有抗腫瘤作用的融合蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
上述具有抗腫瘤作用的融合蛋白的編碼基因，具體可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №4的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的序列4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
其中，所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID №4由2091個(gè)堿基組成，其融合蛋白的編碼序列為自5’端第1到第1620位堿基為HSP65基因，第1621到第1914位堿基為HPV E7基因，第1915到第2088位堿基為Z-tag結(jié)構(gòu)域基因片段，第2089到第2091位堿基為融合蛋白編碼框的終止密碼子。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系及工程菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，如pET28a-HEZ，含有pET28a-HEZ的大腸桿菌BL21(DE3)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)上述具有抗腫瘤作用的融合蛋白的方法。
本發(fā)明所提供的表達(dá)上述具有抗腫瘤作用的融合蛋白方法，是將含有上述具有抗腫瘤作用的融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌，得到工程菌，培養(yǎng)所述工程菌，表達(dá)得到具有抗腫瘤作用的融合蛋白。
所述宿主菌可為大腸桿菌、酵母菌或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。
所述大腸桿菌優(yōu)選為大腸桿菌BL21(DE3)，大腸桿菌DH5α，大腸桿菌BL21(DE3)Plys。
所述工程菌優(yōu)選為含有pET28a-HEZ的大腸桿菌BL21(DE3)。
用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體可為在上述宿主中表達(dá)外源基因的任何表達(dá)載體，如可在大腸桿菌中表達(dá)的pET28a、pBV220、pUC18、pUC19等表達(dá)載體。
上述重組表達(dá)載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
為了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)本發(fā)明的具有抗腫瘤作用的融合蛋白，根據(jù)大腸桿菌的微生物特性，采用了二階段、高密度和分批補(bǔ)料的發(fā)酵方法(fermentationprotocol)1.第一階段，也稱為生長(zhǎng)期，將表達(dá)具有抗腫瘤作用的融合蛋白的工程菌作為種子菌接種在大腸桿菌高密度培養(yǎng)基內(nèi)，所述培養(yǎng)基內(nèi)的碳源為葡萄糖型碳源(葡萄糖、甘露糖或甘油)。當(dāng)生長(zhǎng)于含這種碳源的培養(yǎng)基時(shí)，該大腸桿菌工程菌表達(dá)外源基因被完全抑制，即只允許細(xì)胞分裂、增殖，細(xì)胞密度增加，而外源基因不被表達(dá)。該階段具體可為在碳源為葡萄糖型碳源(葡萄糖、甘露糖或甘油)、pH為6-7的培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。2.第二階段，也稱生產(chǎn)階段，在這個(gè)階段培養(yǎng)基內(nèi)加入了化學(xué)誘導(dǎo)劑IPTG(0.5-1mmol/L)，繼續(xù)發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)3-8小時(shí)，在這期間表達(dá)產(chǎn)物開始源源不斷累積，然后終止發(fā)酵。這種發(fā)酵方式稱為分批補(bǔ)料方式(limited methanol fed-batch mode)。
本發(fā)明的具有減肥作用的融合蛋白HEZ在大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌獲得可溶性高表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到細(xì)胞周質(zhì)，發(fā)酵液內(nèi)分泌表達(dá)的水平高達(dá)1g/L融合蛋白，約占菌體總蛋的15％。如果通過發(fā)酵生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，大腸桿菌工程菌還有進(jìn)一步提高表達(dá)量的潛力。
表達(dá)得到的具有減肥作用的融合蛋白經(jīng)硫酸銨沉淀、陰離子色譜、疏水色譜和陽離子色譜純化，其純度達(dá)到90％以上。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種預(yù)防和/或治療由人乳頭瘤病毒感染引起的適應(yīng)癥疫苗。
本發(fā)明所提供的預(yù)防和/或治療由人乳頭瘤病毒感染引起的適應(yīng)癥疫苗，它的活性成分是上述具有減肥作用的融合蛋白。
所述適應(yīng)癥可為宮頸癌、宮內(nèi)上皮瘤樣病變或肛門發(fā)育不全。
需要的時(shí)候，在上述疫苗中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、吸收促進(jìn)劑等。
本發(fā)明的疫苗可以制成注射液，該劑型的疫苗可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述疫苗的用量一般為20-200μg具有抗腫瘤治療作用的融合蛋白/kg體重/次，基礎(chǔ)免疫一次，14天后加強(qiáng)免疫一次，共需免疫2-4次。
以表達(dá)E7蛋白的小鼠細(xì)胞系TC-1作為宮頸癌的細(xì)胞模型，使用純度達(dá)到90％以上的本發(fā)明的具有減肥作用的融合蛋白進(jìn)行免疫治療和預(yù)防試驗(yàn)，結(jié)果表明預(yù)防免疫可以使小鼠免受TC-1細(xì)胞的攻擊；治療免疫可使小鼠已有的腫瘤消退。說明本發(fā)明的具有減肥作用的融合蛋白可作為預(yù)防和/或治療由人乳頭瘤病毒感染引起的適應(yīng)癥，特別是宮頸癌、宮內(nèi)上皮瘤樣病變、肛門發(fā)育不全疫苗。本發(fā)明初步建立起基于熱休克蛋白的治療性疫苗的技術(shù)平臺(tái)，為開發(fā)其它由病毒感染引起的疾病及腫瘤治療性疫苗打下技術(shù)基礎(chǔ)。


圖1是HSP65基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定圖譜圖2是pET28a-hsp65的重組表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖譜圖3是pET28a-hsp65的酶切鑒定圖譜圖4是HPV16 E7基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定圖譜圖5是pET28a-E7的物理圖譜圖6是pET28a-E7的酶切鑒定圖譜圖7是pET28a-HE的物理圖譜圖8是pET28a-HE的酶切鑒定圖譜圖9是pET28a-HEZ的物理圖譜圖10是pET28a-HEZ的酶切鑒定圖譜圖11是表達(dá)的HEZ的15％SDS-PAGE圖譜圖12是融合蛋白HEZ純化后的SDS-PAGE分析圖譜圖13是HEZ的Western印跡圖譜圖14a是預(yù)防組小鼠和對(duì)照組小鼠的腫瘤發(fā)生率-接種細(xì)胞時(shí)間的曲線圖14b是對(duì)照組小鼠注射TC-1細(xì)胞14天時(shí)的照片圖14c是對(duì)照組小鼠注射TC-1細(xì)胞28天時(shí)的照片圖14d是預(yù)防組小鼠注射TC-1細(xì)胞14天時(shí)的照片圖14e是預(yù)防組小鼠注射TC-1細(xì)胞28天時(shí)的照片圖15是治療組小鼠和對(duì)照組小鼠注射腫瘤細(xì)胞時(shí)間-腫瘤體積百分比曲線圖16是治療組小鼠注射TC-1細(xì)胞14天時(shí)的照片圖17是治療組小鼠注射TC-1細(xì)胞28天時(shí)的照片
具體實(shí)施例方式
菌株、質(zhì)粒大腸桿菌宿主菌DH5α，BL21(DE3)，BL21(DE3)Plys和原核表達(dá)載體pET28a購(gòu)自博大生物公司。
限制性內(nèi)切酶及工具酶限制性內(nèi)切酶NdeI、NcoI、NheI、EcoRI、XhoI和pyrobest高保真DNA聚合酶購(gòu)自寶生物工程公司。Taq DNA聚合酶購(gòu)自華美生物工程公司。
核酸及蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000(寶生物工程公司)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(14.4，20.1，30.0，43.0，67.0，94.0kDa)(Pharmacia公司)。
所有合成的引物本發(fā)明涉及的所有寡聚DNA核苷酸片段分別在ABI DNA合成儀進(jìn)行合成，所合成的引物如表1所示表1.所有合成的引物


注以上引物均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所技術(shù)保障室合成。
培養(yǎng)基大腸桿菌搖瓶培養(yǎng)基為L(zhǎng)B；大腸桿菌高密度上罐培養(yǎng)基(g/L)13g KH2PO4，3g(NH4)2HPO4，4.6gNaH2PO4，2g MgSO4·7H2O，5g酵母抽提物，10g葡萄糖，1ml微量元素溶液。微量元素溶液的組成如下(g/L)40g FeSO4·7H2O，40g CaCl2·2H2O，10gAlCl3·6H2O，10g MnSO4·H2O，4g CoCl2·6H2O，2g NaMoO4·2H2O，2g ZnSO4·7H2O，1g CuCl2·2H2O，0.5g H3BO3。
細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO)1mM丙酮酸鈉，2mM非必需氨基酸，50單位/ml青霉素，0.05mg/ml鏈霉素，以上成分占90％，另外補(bǔ)加10％小牛血清。非必需氨基酸濃度如下L-丙氨酸890mg/ml，L天東酰胺1320mg/ml，L-天東氨酸1330mg/ml，L-谷氨酸1470mg/ml，甘氨酸750mg/ml，L-脯氨酸1150mg/ml，L-絲氨酸1050mg/ml下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1、HEZ的表達(dá)一、HEZ基因的制備1、HSP65基因的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建(1)HSP65基因的克隆利用表1中的引物9和4組成的引物對(duì)，以結(jié)核分支桿菌基因組DNA為模板，利用寶生物公司的高保真酶pyrobest PCR擴(kuò)增hsp65基因。采用降落PCR(touchdownPCR)，反應(yīng)條件如下94℃預(yù)變性5min，94℃變性30sec，59℃退火30sec，72℃延伸1min50sec，5個(gè)循環(huán)；然后退火溫度改為55℃，其它條件不變，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，表明得到一條1600bp左右的條帶。擴(kuò)增條帶經(jīng)回收后，克隆至pGEM-T載體，進(jìn)行基因序列分析，結(jié)果表明擴(kuò)增得到的hsp65基因具有序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列(M15467)完全一致。其編碼序列為自5’端第1到第1623位堿基。
(2)HSP65表達(dá)載體pET28a-hsp65的構(gòu)建引物9的5’端有NcoI酶切位點(diǎn)，引物4的5’端有NotI酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的片段切膠回收后用玻璃奶試劑盒回收，回收片段按照常規(guī)方法經(jīng)Nco I、Nde I雙酶切后用T4DNA連接酶連接入經(jīng)同樣酶切的pET28a載體(購(gòu)自博大生物公司)。取大腸桿菌DH5α加入含有上述連接產(chǎn)物的連接反應(yīng)體系中，冰浴30min，然后42℃熱休克90秒，快速將管轉(zhuǎn)移冰浴中冷卻2min。加入LB培養(yǎng)基，在37℃搖床溫浴30min，然后涂布到含有卡那霉素(濃度為30μg/ml)的LB平板上，37℃培養(yǎng)12小時(shí)。待平板上長(zhǎng)出菌落，挑選菌落，利用引物9和4進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆。將陽性克隆接種到試管培養(yǎng)12小時(shí)后采用promega公司的質(zhì)粒小抽試劑盒抽提質(zhì)粒，得到表達(dá)載體pET28a-hsp65(其物理圖譜如圖2所示)，表達(dá)載體pET28a-hsp65經(jīng)Nco I、Nhe I雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示，表明得到1650bp左右的條帶，與理論預(yù)測(cè)一致。圖3中，泳道1為pET28a-hsp65經(jīng)Nco I、Nhe I雙酶切的電泳結(jié)果，泳道M為Marker(DL2000)。
(3)沒有終止密碼的HSP65表達(dá)載體pET28a-hsp65’的構(gòu)建在hsp65基因終止密碼子之前有一個(gè)NdeI酶切位點(diǎn)，為便于E7基因的插入，按照如下方法構(gòu)建沒有終止密碼子的HSP65表達(dá)載體pET28a-hsp65’以pET28a-hsp65質(zhì)粒作模板，用表1中的引物9、10擴(kuò)增hsp65基因，擴(kuò)增反應(yīng)條件同步驟(1)。擴(kuò)增產(chǎn)物和pET28a載體經(jīng)NcoI、Nhe I雙酶切后，用T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物按照步驟(2)中的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并涂布含有卡那霉素(濃度為30μg/ml)的平板。平板上長(zhǎng)出菌落后，利用引物9和10進(jìn)行經(jīng)菌落PCR篩選陽性克隆，搖瓶抽質(zhì)粒后酶切鑒定，結(jié)果表明得到結(jié)構(gòu)正確的pET28a-hsp65’。
2、HPV16 E7基因的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建(1)HPV16 E7基因的克隆從山東一宮頸癌患者體內(nèi)分離的被HPV16感染的細(xì)胞標(biāo)本作為起始材料，抽提其基因組DNA，以此基因組DNA為模板，利用引物11和12進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆出HPV16基因組的E7基因片段，具體的PCR反應(yīng)體系如下
人基因組DNA模板(0.5μg) 0.5μldNTP(濃度為20mmol/L) 2μl引物11(濃度為10μmol/L) 2μl引物12(濃度為10μmol/L) 2μl10×擴(kuò)增緩沖液 5μlpyrobest高保真酶(3-5單位)0.3μlddH2O38.2μl總體積 50μl循環(huán)條件為94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 1分鐘，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。
擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4所示，得到一條300bp左右的條帶。圖4中，泳道M為Marker(DL2000)，泳道1為E7基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
擴(kuò)增條帶經(jīng)回收后連接入pGEM-T載體，進(jìn)行基因序列分析，結(jié)果表明擴(kuò)增得到的HPV16 E7基因具有序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列，其編碼序列為自5’端第1到第297位堿基。與NCBI數(shù)據(jù)庫中HPV16 E7基因序列基本一致。該序列共編碼98個(gè)氨基酸，其中，自5′端第229-231位堿基為多態(tài)性位點(diǎn)，從Stressgen所報(bào)道的密碼子tgt突變?yōu)閏gt，氨基酸由C突變?yōu)镽。
(2)HPV16 E7基因的表達(dá)載體PET28a-E7的構(gòu)建E7基因經(jīng)Nde I和EcoR I雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的pET28a質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物按照步驟1的(2)中的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并涂布含有卡那霉素(濃度為30μg/ml)的平板。平板上長(zhǎng)出菌落后，利用引物11和12進(jìn)行經(jīng)菌落PCR篩選陽性克隆，搖瓶抽質(zhì)粒后進(jìn)行Nde I和EcoR I酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖6所示，表明得到大小為300bp、5400bp的兩個(gè)片段，說明得到結(jié)構(gòu)正確的pET28a-E7(圖5)。圖6中，泳道M為Marker(DL2000)，泳道1為pET28a-E7的雙酶切結(jié)果。
3、Z-tag結(jié)構(gòu)域的化學(xué)合成及其表達(dá)載體的構(gòu)建(1)Z-tag結(jié)構(gòu)域的化學(xué)合成Z-tag結(jié)構(gòu)域的核酸序列片段在ABI DNA合成儀上進(jìn)行合成。Z-tag編碼的多肽中含有3個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，合成的DNA片段經(jīng)HPLC用C18柱脫鹽，收集液用真空抽干，鑒定純度。供合成基因用的每個(gè)DNA寡核苷酸片段的純度應(yīng)達(dá)到或超過90％，如果純度不夠，必須被重新純化。合成的Z-tag結(jié)構(gòu)域的DNA片段具有序列表中SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，其編碼序列為自5’端第1到第177位堿基。
(2)pET28a-Zag載體的構(gòu)建Z-tag基因通過17、18、19、20四對(duì)引物的重疊PCR獲得，PCR反應(yīng)體系如下
引物17(濃度為10μmol/L) 2μl引物18(濃度為10μmol/L) 1μl引物19(濃度為10μmol/L) 2μl引物20(濃度為10μmol/L) 2μldNTP(濃度為20μmol/L) 2μl10×擴(kuò)增緩沖液 5μlpyrobest聚合酶(3-5單位) 3μlddH2O 33μl總體積 50μl循環(huán)條件為94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 20秒，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Xho I和EcoR I雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的pET28a質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物按照步驟1的(2)中的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(購(gòu)自博大生物公司)，并涂布含有卡那霉素(濃度為30μg/ml)的平板。平板上長(zhǎng)出菌落后，利用引物18和20進(jìn)行經(jīng)菌落PCR篩選陽性克隆，搖瓶提質(zhì)粒后進(jìn)行Xho I和EcoR I酶切鑒定，鑒定結(jié)果表明得到結(jié)構(gòu)正確的pET28a-Zag。
4、表達(dá)載體pET28a-HEZ表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定(1)Hsp65、E7融合基因表達(dá)載體pET28a-HE的構(gòu)建按照構(gòu)建pET28a-E7載體時(shí)E7基因的擴(kuò)增條件，以引物11、12擴(kuò)增E7基因。pET28a-hsp65’載體和E7基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Nde I和EcoR I雙酶切，酶切后的載體和基因用T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物按照步驟1的(2)中的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并涂布含有卡那霉素(濃度為30μg/ml)的LB平板。平板上長(zhǎng)出菌落后利用引物9和12進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆，搖瓶抽質(zhì)粒后進(jìn)行Nde I，Nco I和EcoR I酶切鑒定，結(jié)果如圖8所示，表明得到大小為300bp，1650bp，5400bp的酶切片段，結(jié)果與理論預(yù)測(cè)一致，得到結(jié)構(gòu)正確的pET28a-HE(圖7)。圖8中，泳道M為Marker(DL2000)，泳道1為pET28a-HE的酶切結(jié)果。
(2)Hsp65、E7和Zag融合基因表達(dá)載體pET28a-HEZ的構(gòu)建以pET28a-HE質(zhì)粒為模板，用引物9、16擴(kuò)增hsp65-E7融合基因，擴(kuò)增條件如下，94℃預(yù)變性5min，94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min30sec，30個(gè)循環(huán)。pET28a-Zag載體和hsp65-E7融合基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Nco I和EcoR I雙酶切，酶切后的載體和基因用T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并涂布含有卡那霉素(濃度為30μg/ml)的LB平板。平板上長(zhǎng)出菌落后利用引物9和20進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆，搖瓶抽質(zhì)粒后進(jìn)行Xho I，Nde I，Nco I和EcoR I酶切鑒定，結(jié)果如圖10所示，表明得到多條條帶(hsp65基因內(nèi)部有兩個(gè)Xho I酶切位點(diǎn))，各個(gè)片段及其大小與理論預(yù)測(cè)一致，得到結(jié)構(gòu)正確的pET28a-HEZ(圖9)。圖10中，泳道M為Marker(DL2000)，泳道1為pET28a-HEZ的酶切結(jié)果。HEZ基因測(cè)序結(jié)果表明HEZ基因具有序列表中序列4的核苷酸序列，編碼序列表中序列5的氨基酸殘基序列。
二、HEZ基因的表達(dá)將pET28a-HEZ通過CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(購(gòu)自博大生物公司)，在含有卡那霉素(濃度為30μg/ml)的LB平板上篩選得到陽性克隆，挑取單菌落接種到含有卡那霉素(濃度為30μg/ml)的LB培養(yǎng)基中37℃搖床振蕩培養(yǎng)。定時(shí)取樣測(cè)定OD600，當(dāng)OD600約為0.5時(shí)，加入終濃度為1mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)3小時(shí)后，離心沉淀菌體，超聲破碎菌體，離心，取上清和沉淀(鏡檢全部為細(xì)胞碎片)分別進(jìn)行15％SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖11所示，表明在75KD處有一特異性的目的蛋白表達(dá)條帶，與分子量理論值相符；融合蛋白大部分以可溶形式存在。圖11中，M為蛋白分子量，泳道1為空菌(該空菌是指沒有目的基因的空表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主菌)，2為超聲破碎后的上清，3為超生破碎后的沉淀。凝膠掃描顯示，融合蛋白的表達(dá)量約占菌體總蛋白的15％。
實(shí)施例2、重組融合蛋白HEZ的純化和純度分析表達(dá)重組融合蛋白HEZ的菌體經(jīng)超聲破碎、離心、過濾處理后，先用30％的硫酸銨沉淀，陰離子柱(陰離子交換介質(zhì)為Q高效瓊脂糖凝膠介質(zhì)，即Q Sepharose Highperformance)(購(gòu)自瑞典安發(fā)瑪西亞公司，Amersham Biosciences)層析純化；經(jīng)陰離子柱純化后的融合蛋白再經(jīng)調(diào)整鹽濃度和pH值后進(jìn)行疏水柱(疏水介質(zhì)為苯基高效瓊脂糖凝膠介質(zhì)，即Phenyl Sepharose High Performance)(購(gòu)自瑞典安發(fā)瑪西亞公司，Amersham Biosciences)純化，蛋白純度達(dá)到80％。融合蛋白再經(jīng)陽離子柱(陽離子交換介質(zhì)為S快速瓊脂糖凝膠介質(zhì)，即S Sepharose F.F.1.6×20cm)(購(gòu)自瑞典安發(fā)瑪西亞公司，Amersham Biosciences)純化后，樣品獲得了較高的純度，凝膠掃描分析顯示純度達(dá)到了90％以上(圖12)。圖12中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為上樣前樣品，2為穿過峰，3-6為各個(gè)洗脫峰。
實(shí)施例3、HEZ的Western印跡以小鼠抗人乳頭瘤病毒E7蛋白抗體(購(gòu)自TBD生物工程公司)，小鼠抗人熱休克蛋白65抗體(購(gòu)自TBD生物工程公司)為一抗，以HRP標(biāo)記山羊抗小鼠抗體(購(gòu)自華美生物工程公司)為二抗，按照常規(guī)方法對(duì)實(shí)施例2中純化得到的HEZ蛋白樣品進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖13所示，只有融合蛋白一條帶。
實(shí)施例4、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測(cè)定HEZ的活性1、預(yù)防腫瘤形成實(shí)驗(yàn)疫苗的活性測(cè)定采用TC-1細(xì)胞系，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(American Typeculture conservation，ATCC)，TC-1來源于C57BL/6小鼠上皮細(xì)胞，它是由人乳頭瘤病毒16 E6、E7基因和Ras基因共轉(zhuǎn)化而引起永生化的一株細(xì)胞，皮下注射給C57BL/6小鼠，4000個(gè)細(xì)胞的致腫瘤率為100％；被攻擊小鼠為C57BL/6，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
實(shí)驗(yàn)采用6周齡的C57BL/6雄性小鼠20只，隨機(jī)分成兩組，每組10只。預(yù)防實(shí)驗(yàn)組小鼠每只在后頸皮下注射100μg溶于PBS中的實(shí)施例2純化的HEZ蛋白，14天后再加強(qiáng)注射一次；對(duì)照組每只注射相同體積的PBS緩沖液。加強(qiáng)注射12天后，兩組小鼠分別在右后肢上部皮下注射1.3×105個(gè)用PBS懸浮的TC-1細(xì)胞，定期用游標(biāo)卡尺測(cè)量所成腫瘤的大小。采用成組設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)方法即t檢驗(yàn)處理數(shù)據(jù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和表3以及圖14a-14c所示。表2和圖14a表明預(yù)防組小鼠在接種TC-1細(xì)胞42天時(shí)腫瘤全部消失，而對(duì)照組小鼠則全都長(zhǎng)了腫瘤；圖14b表明，對(duì)照組小鼠注射TC-1細(xì)胞14天后，可見到明顯的腫瘤生長(zhǎng)與瘤體的形成；圖14c表明，對(duì)照組小鼠注射TC-1細(xì)胞28天時(shí)，小鼠的腫瘤已經(jīng)非常碩大；圖14d表明預(yù)防組小鼠注射TC-1細(xì)胞14天時(shí)，小鼠的腫瘤明顯小于相應(yīng)的對(duì)照組；圖14e表明預(yù)防組小鼠注射TC-1細(xì)胞28天時(shí)，小鼠的腫瘤已基本消失，與相應(yīng)的對(duì)照組小鼠比較存在顯著性差異。圖14-14e中，圓圈示腫瘤位置及大小。表3的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明從第一周開始兩組小鼠的腫瘤大小具有顯著性差異(P＜0.01)，預(yù)防組小鼠腫瘤大小明小于對(duì)照組，說明疫苗有較好的預(yù)防作用。
表2.接種TC-1細(xì)胞后不同時(shí)間后的預(yù)防組和對(duì)照組的腫瘤發(fā)生率(％) 表3.接種TC-1細(xì)胞后不同時(shí)間后的預(yù)防組和對(duì)照組的腫瘤瘤體的大小比較

2、治療腫瘤實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)采用6周齡的C57BL/6雄性小鼠20只，隨機(jī)分成兩組，每組10只。這20只小鼠首先每只在右后肢上部皮下注射1.3×105個(gè)用PBS懸浮的TC-1細(xì)胞。在注射后的第7天和第21天治療組在頸后皮下注射100μg溶于PBS中的實(shí)施例2純化的HEZ蛋白進(jìn)行治療。而對(duì)照組僅用PBS治療。定期用游標(biāo)卡尺測(cè)量所成腫瘤的大小并做記錄。采用成組設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)方法即t檢驗(yàn)處理數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4、5、6及圖15-圖17所示，表4和圖15表明出治療組小鼠在7周時(shí)腫瘤已基本消失；表5的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示在前兩周治療組與對(duì)照組兩組的腫瘤大小沒有顯著性差異；從第三周開始兩組小鼠的腫瘤大小有顯著性差異，P＜0.01，圖16和圖17表明治療組小鼠的腫瘤明顯小于對(duì)照組，說明疫苗有較好的治療價(jià)值。圖16和圖17中，圓圈示腫瘤的位置及大小。圖6表明兩組小鼠的生存時(shí)間有明顯差異，治療組小鼠的存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組，P＜0.01。
表4.接種TC-1細(xì)胞后不同時(shí)間的治療組和對(duì)照組的腫瘤體積百分比(％)

表5.接種TC-1細(xì)胞后不同時(shí)間的治療組和對(duì)照組的小鼠腫瘤瘤體的大小比較

注*代表因數(shù)據(jù)嚴(yán)重偏離均值，而在統(tǒng)計(jì)處理時(shí)舍棄的數(shù)據(jù)。
表6.接種TC-1細(xì)胞后的治療組和對(duì)照組的小鼠存活天數(shù)的比較

注“-”表示到觀察結(jié)束時(shí)小鼠仍然存活序列表<160>5<210>1<211>1623<212>DNA<213>分枝桿菌屬結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)<400>1atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac 60gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa 120aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag 180ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc 240gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc 300gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa 360aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag 420gagcagattg cggccaccgc agcgatttcg gcgggtgacc agtccatcgg tgacctgatc 480gccgaggcga tggacaaggt gggcaacgag ggcgtcatca ccgtcgagga gtccaacacc 540tttgggctgc agctcgagct caccgagggt atgcggttcg acaagggcta catctcgggg 600tacttcgtga ccgacccgga gcgtcaggag gcggtcctgg aggaccccta catcctgctg 660gtcagctcca aggtgtccac tgtcaaggat ctgctgccgc tgctcgagaa ggtcatcgga 720gccggtaagc cgctgctgat catcgccgag gacgtcgagg gcgaggcgct gtccaccctg 780gtcgtcaaca agatccgcgg caccttcaag tcggtggcgg tcaaggctcc cggcttcggc 840gaccgccgca aggcgatgct gcaggatatg gccattctca ccggtggtca ggtgatcagc 900gaagaggtcg gcctgacgct ggagaacgcc gacctgtcgc tgctaggcaa ggcccgcaag 960gtcgtggtca ccaaggacga gaccaccatc gtcgagggcg ccggtgacac cgacgccatc1020gccggacgag tggcccagat ccgccaggag atcgagaaca gcgactccga ctacgaccgt1080gagaagctgc aggagcggct ggccaagctg gccggtggtg tcgcggtgat caaggccggt1140gccgccaccg aggtcgaact caaggagcgc aagcaccgca tcgaggatgc ggttcgcaat1200gccaaggccg ccgtcgagga gggcatcgtc gccggtgggg gtgtgacgct gttgcaagcg1260gccccgaccc tggacgagct gaagctcgaa ggcgacgagg cgaccggcgc caacatcgtg1320aaggtggcgc tggaggcccc gctgaagcag atcgccttca actccgggct ggagccgggc1380
gtggtggccg agaaggtgcg caacctgccg gctggccacg gactgaacgc tcagaccggt1440gtctacgagg atctgctcgc tgccggcgtt gctgacccgg tcaaggtgac ccgttcggcg1500ctgcagaatg cggcgtccat cgcggggctg ttcctgacca ccgaggccgt cgttgccgac1560aagccggaaa aggagaaggc ttccgttccc ggtggcggcg acatgggtgg catggatttc1620tga 1623<210>2<211>297<212>DNA<213>乳多孔病毒科A亞組人乳頭瘤病毒<400>2atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa297<210>3<211>177<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gttgacaaca aattcaacaa agaacgtcgt cgtgctcgtc gtgaaatccg tcacctgccg 60aacctgaacc gtgaacagcg tcgtgctttc atccgttctc tgcgtgacga cccgtcccag 120tctgctaacc tgctggctga agctaagaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaataa177<210>4
<211>2091<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac 60gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa 120aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag 180ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc 240gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc 300gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa 360aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag 420gagcagattg cggccaccgc agcgatttcg gcgggtgacc agtccatcgg tgacctgatc 480gccgaggcga tggacaaggt gggcaacgag ggcgtcatca ccgtcgagga gtccaacacc 540tttgggctgc agctcgagct caccgagggt atgcggttcg acaagggcta catctcgggg 600tacttcgtga ccgacccgga gcgtcaggag gcggtcctgg aggaccccta catcctgctg 660gtcagctcca aggtgtccac tgtcaaggat ctgctgccgc tgctcgagaa ggtcatcgga 720gccggtaagc cgctgctgat catcgccgag gacgtcgagg gcgaggcgct gtccaccctg 780gtcgtcaaca agatccgcgg caccttcaag tcggtggcgg tcaaggctcc cggcttcggc 840gaccgccgca aggcgatgct gcaggatatg gccattctca ccggtggtca ggtgatcagc 900gaagaggtcg gcctgacgct ggagaacgcc gacctgtcgc tgctaggcaa ggcccgcaag 960gtcgtggtca ccaaggacga gaccaccatc gtcgagggcg ccggtgacac cgacgccatc 1020gccggacgag tggcccagat ccgccaggag atcgagaaca gcgactccga ctacgaccgt 1080gagaagctgc aggagcggct ggccaagctg gccggtggtg tcgcggtgat caaggccggt 1140gccgccaccg aggtcgaact caaggagcgc aagcaccgca tcgaggatgc ggttcgcaat 1200gccaaggccg ccgtcgagga gggcatcgtc gccggtgggg gtgtgacgct gttgcaagcg 1260gccccgaccc tggacgagct gaagctcgaa ggcgacgagg cgaccggcgc caacatcgtg 1320aaggtggcgc tggaggcccc gctgaagcag atcgccttca actccgggct ggagccgggc 1380gtggtggccg agaaggtgcg caacctgccg gctggccacg gactgaacgc tcagaccggt 1440
gtctacgagg atctgctcgc tgccggcgtt gctgacccgg tcaaggtgac ccgttcggcg 1500ctgcagaatg cggcgtccat cgcggggctg ttcctgacca ccgaggccgt cgttgccgac 1560aagccggaaa aggagaaggc ttccgttccc ggtggcggcg acatgggtgg catggatttc 1620atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 1680gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 1740ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 1800tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 1860gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accagttgac 1920aacaaattca acaaagaacg tcgtcgtgct cgtcgtgaaa tccgtcacct gccgaacctg 1980aaccgtgaac agcgtcgtgc tttcatccgt tctctgcgtg acgacccgtc ccagtctgct 2040aacctgctgg ctgaagctaa gaaactgaac gacgctcagg ctccgaaata a 2091<210>5<211>696<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu1 5 10 15Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro20 25 30Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile35 40 45Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro50 55 60Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr65 70 75 80Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln
85 90 95Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro100 105 110Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu115 120 125Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala130 135 140Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile145 150 155 160Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu165 170 175Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg180 185 190Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg195 200 205Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys210 215 220Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly225 230 235 240Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala245 250 255Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val260 265 270Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln275 280 285Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Val Gly290 295 300Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys305 310 315 320Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ala Gly Asp325 330 335Thr Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu
340 345 350Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala355 360 365Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu370 375 380Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn385 390 395 400Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr405 410 415Leu Leu Gln Ala Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp420 425 430Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu435 440 445Lys Gln Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu450 455 460Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly465 470 475 480Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val485 490 495Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu500 505 510Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser515 520 525Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe Met His Gly Asp530 535 540Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr545 550 555 560Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp565 570 575Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr580 585 590Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys
595 600 605Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met610 615 620Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Val Asp625 630 635 640Asn Lys Phe Asn Lys Glu Arg Arg Arg Ala Arg Arg Glu Ile Arg His645 650 655Leu Pro Asn Leu Asn Arg Glu Gln Arg Arg Ala Phe Ile Arg Ser Leu660 665 670Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys675 680 685Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys690 69權(quán)利要求
1.具有抗腫瘤作用的融合蛋白，是具有序列表中的SEQ ID №5的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或是將序列表中SEQ ID №5的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有抗腫瘤作用的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤作用的融合蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述具有抗腫瘤作用的融合蛋白的編碼基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №4的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的序列4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系及工程菌。
5.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤作用的融合蛋白的方法，是將含有權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤作用的融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌，得到工程菌，培養(yǎng)所述工程菌，表達(dá)得到具有抗腫瘤作用的融合蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述宿主菌為大腸桿菌、酵母菌、或枯草桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述宿主菌為大腸桿菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述工程菌的培養(yǎng)方法為將所述工程菌在碳源為葡萄糖型碳源、pH為6-7的培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后以0.5-1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3-8小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述工程菌為含有pET28a-HEZ的大腸桿菌BL21(DE3)。
10.預(yù)防和/或治療由人乳頭瘤病毒感染引起的適應(yīng)癥疫苗，它的活性成分是權(quán)利要求1所述的具有減肥作用的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抗腫瘤作用的融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，其目的是提供一種具有抗腫瘤作用的融合蛋白及其編碼基因與以該融合蛋白為活性成分的預(yù)防和/或治療由人乳頭瘤病毒感染引起的腫瘤疫苗。該融合蛋白是具有序列表中的SEQ ID№5的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或是將序列表中SEQ ID№5的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有抗腫瘤作用的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的具有減肥作用的融合蛋白可作為預(yù)防和/或治療由人乳頭瘤病毒感染引起的適應(yīng)癥，特別是宮頸癌、宮內(nèi)上皮瘤樣病變、肛門發(fā)育不全疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1769298SQ20041008886
公開日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2004年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日
發(fā)明者劉志敏, 張士猛, 趙洪亮, 薛沖, 張偉, 黎明, 熊向華 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所