專利名稱：一種抗雞球蟲病的融合蛋白及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗雞球蟲病的融合蛋白及其制備和應用。
背景技術：
球蟲是嚴重危害家禽生長發(fā)育的一類重要寄生性原蟲，隸屬于艾美耳科 (Eimeriidae)的4個屬，即艾美耳屬(Eimeria)、等孢屬(Isospora)、泰澤屬(Tyzzeria)和溫揚屬(Wenyonella)。雞球蟲病是由艾美耳球蟲寄生于雞腸道上皮細胞引起以下痢，血便為主要特征的腸道寄生蟲病，其中以柔嫩艾美耳球蟲毒力較強。其發(fā)病率為50% 70%， 死亡率為20% 30%，嚴重時可達80%。除發(fā)病死亡外，還可導致飼料報酬降低和胴體質量下降等其他損失。它是集約化養(yǎng)雞業(yè)最為多發(fā)，危害嚴重且防治困難得疾病之一，也是所有動物疾病中經濟損失最為嚴重的疾病之一。該病分布廣泛，世界各地普遍發(fā)生，全球每年因球蟲病引起的經濟損失高達20億美元；我國雖沒有具體的統(tǒng)計數(shù)字，但隨著集約化養(yǎng)雞業(yè)的迅速發(fā)展，因球蟲病造成的直接經濟損失和防治球蟲病所造成的間接損失是可想而知的。估計我國僅抗球蟲藥的年消費就高達2. 4億 4. 8億元人民幣。雖然人們采取了穿梭用藥、輪換用藥、聯(lián)合用藥等各種措施，但耐藥蟲株的出現(xiàn)仍是防不勝防。而新藥研制費用增加(約為5億美元)、審批周期長(可能達10年)、嚴格的藥物檢測殘留標準等原因，使抗球蟲藥的研制和使用受到了極大限制。因此，從20世紀80 年代開始，對球蟲病的控制研究逐漸轉向了疫苗的研制。由于不可能直接從球蟲純化出大量的可作為疫苗的抗原蛋白質，而應用DNA重組技術則有可能達到這一目的。因此大大推動了球蟲分子生物學的迅猛發(fā)展。但由于球蟲基因組龐大，生活史復雜，同一球蟲不同的發(fā)育階段存在各自特異性抗原和共同的特異性抗原。目前為止，只有部分基因和基因片段被克隆出來，并證實克隆出的單一重組抗原只具有部分保護性，球蟲的保護性抗原可能是由各階段蟲體所具有的保護性抗原共同組成，并且有些抗原對某一種球蟲有保護性，而球蟲感染往往是兩種或以上球蟲混合感染。因此，急需研究尋找一些具有交叉免疫保護的抗原。

發(fā)明內容
為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種融合基因、其表達的蛋白及其制備和應用。將雞E. tenellaYL株相關抗原基因3-1E基因和TA4基因構建融合基因，后進行原核表達，可得到多抗原共表達重組疫苗，更好地防治雞球蟲病。本發(fā)明提供的融合基因，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。上述融合基因的合成方法，包括如下步驟1)采用RT-PCR方法擴增3-1E基因和TA4基因；2)分別將3-1E基因和TA4基因連接到載體pMD18_T上，構建克隆載體 PMD18-T-3-1E 和 pMD18_T_TA4 ；3)以步驟2)所得載體PMD18-T-3-1E為模板，進行PCR擴增，上游引物為P5:5' -GCCGGATCCTTTCCTTACTCAGTTAAAATG-3 ‘，下游引物 P6 5 ‘ -ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGAAGCCGCCCTGGTACAG-3‘；4)以步驟2)所得載體PMD18-T-TA4為模板，進行PCR擴增，上游引物P7 :5' -GG TTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGAACAAGCTGAGAAAAGCAGCAG-3 ‘；下游引物為 P8 5 ‘ -CATGTCGACCGCCGCCATATCTGTCCAAT-3‘；5)以步驟3)和步驟4)的PCR產物為模板，進行PCR擴增，上游引物為P5: 5 ‘ -GCCGGATCCTTTCCTTACTCAGTTAAAATG-3 ‘，下游引物為 P8 :5 ‘ -CATGTCGACCGCCG CCATATCTGTCCAAT-3 ‘，得到 3-1E-TA4 融合基因。本發(fā)明提供一種重組質粒，含有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。進一步地，上述重組質粒是指pET-32a-3-lE_TA4。本發(fā)明提供一種抗雞球蟲病的融合蛋白，由上述3-1E-TA4融合基因表達而得。上述的融合蛋白的制備方法，包括如下步驟1)將所述3-1E-TA4的融合基因連接到載體pMD18_T上，構建載體 PMD18-T-3-1E-TA4 ；2)對分別對所述載體PMD18-T-3-1E-TA4和表達載體pET_3h (+)進行雙酶切，將回收的3-1E-TA4融合基因，與表達載體pET-32a(+)連接，得到重組質粒 pET-32a-3-lE-TA4 ；3)步驟2~)所述的重組質粒pET-3h-3-lE_TA4轉化大腸桿菌；4)培養(yǎng)步驟幻所得大腸桿菌，制備與純化融合蛋白。本發(fā)明還提供上述融合蛋白在預防雞艾美耳球蟲病中的應用。本發(fā)明提供的技術方案能夠達到以下技術效果3-1E基因對堆型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲具有交叉保護性； TA4基因也同時對柔嫩艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲有保護性。3-1E-TA4融合基因進行原核表達可得到多抗原共表達蛋白，更好的防治雞球蟲病。經動物實驗表明融合基因表達抗原免疫組抗球蟲指數(shù)明顯高于單一抗原免疫組。


圖1是E. tenella YL株3-1E和TA4基因PCR產物電泳檢測結果M. Trans2K Plus DNA 標準；1. 3-1E PCR 產物；2. TA4 PCR 產物。圖2是E. tenella YL株3-1E-TA4基因PCR產物電泳檢測結果M. Trans2K Plus DNA 標準；1· 3-1E-TA4 PCR 產物。圖 3 是 pET_3h (+) -3-1E-TA4 表達產物 SDS-PAGE 分析結果M.蛋白分子質量標準；1. 0. 4mmol/L IPTG誘導菌液；2. 0. 6mmol/L IPTG誘導菌液；3. 0. 8mmol/L IPTG誘導菌液；4.誘導池后菌液；5.誘導證后菌液；6.誘導后菌液； P.誘導的空載體菌液。圖4是pET_3h (+) -S07酶切鑒定結果M. Trans2K Plus DNA 標準；1.雙酶切產物。 圖 5 是 6pET_32a (+) -3-1E-TA4 表達融合蛋白的 Western bloting 結果M.免疫印跡標準Marker ;1.共表達融合蛋白。圖6 重組質粒 pET-3h (+) -3-1E-TA4 的構建。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。1 3-1E基因的克隆1. 1引物的設計與合成參照NCBI上所提供的登錄號應用I^rimer Premier 5軟件合成1對引物，上游引物Pl 5' -GTT TGT AGT TTC TTT GTA TTT CC-3'；下游引物P2 5' -CTG GAG ATC AAT TAG AAG CC-3'。引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。1. 2球蟲卵囊的復蘇與純化用單卵囊繁殖的雞E. tenella 1株孢子化卵囊，按每羽1 X IO5個卵囊經口感染9 日齡無球蟲小公雛，分別于感染后第6、7、8、9天四天連續(xù)收取糞便。(1)將采集來的新鮮雞糞樣本加少量飽和食鹽水捻碎，加飽和食鹽水，調勻后，靜置15min，對糞便濾液進行初步的離心沉淀(3000r/min，離心20min)。(2)得到的糞便濾液，棄去沉淀，收取上清液，加5倍體積的蒸餾水，(3000r/min， 離心 20mim)。(3)棄上清液，收沉淀，加入2倍體積的飽和食鹽水，靜置15min，(3000r/min,離心 20min)。重復步驟⑵，收沉淀，即為卵囊。對于研究工作收集的雞球蟲卵囊需要進行孢子化。其操作過程為將分離純化后的卵囊放于5倍體積的2. 5%重鉻酸鉀溶液中(要求置于培養(yǎng)皿中)，溶液深度為0. 4 0. 6cm,放入到恒溫箱中(要求溫度在)，培養(yǎng)3 5d。在此期間每天對培養(yǎng)液進行3 4次輕輕地攪拌，并涂片鏡下觀察孢子化情況，當達到85%以上的卵囊完成孢子化時，停止培養(yǎng)，即得到球蟲孢子化卵囊，4°C保存?zhèn)溆谩?. 3E. tenella YL株子孢子總RNA的提取(1)孢子化卵囊和器材的準備無核酶水雙蒸水加入DEPC至終濃度0. 1% V/V，放置過夜，然后120°C下高壓滅菌30min，4°C保存?zhèn)溆?。氯?°C避光保存。異丙醇4°C避光保存。75%乙醇溶液用無核酶水依實驗中所需的量現(xiàn)配制，4°C保存?zhèn)溆谩７崔D錄試劑盒、DEPC、Trizol試劑均購自陜西寶鑫科技有限公司無RNase實驗器材的準備所用的槍頭、塑料制品和玻璃制品用0. 1 % DEPC水溶液在37°C處理過夜，然后在120°C下高壓滅菌30min以去除殘留的DEPC。孢子化卵囊的準備離心收集純化后培養(yǎng)的E. tenella YL株孢子化卵囊，先用雙蒸水洗2次，再用含0. 1 % DEPC的無核酶水洗3次，去除重鉻酸鉀，最后用含0. 1 % DEPC無核酶水垂懸。(2)子孢子總RNA的提取
破碎子孢子洗好的子孢子中加入玻璃砂，漩渦振蕩器中震蕩5 6min，每次都要觀察一下看破碎了沒有。約80%破碎時，將上清吸入另一 EP管中，用DEPC水洗剩下的玻璃砂，洗兩次，洗液均收集。8000r/min離心3min，收集子孢子。每管按ImL Trizol處理1 X IO7子孢子(實際用了 0. 8mL iTrizol)，混勻，吹打幾次。每ImL起始Trizol加0. 2mL氯仿，蓋緊管蓋，震蕩1 后，在2°C 8°C條件下冰上孵育IOmin (實際用4°C )。然后12000r/min，離心15min。此時混合物分為3層。RNA完全存在于上層無色水相層，約為Trizol體積的60%。將小于80%的水相層轉移至另一新的EP管中，并棄下面的有機相(要小心避免吸到中間層)。按每管ImL起始Trizol加0. 5mL異丙醇，置15°C 30°C溫水浴IOmin(此步驟沒做，可以不做)。4°C，于12000r/min，離心lOmin。RNA沉淀在管壁或管底，為膠狀顆粒。RNA的洗滌棄上清，每ImL起始Trizol加75%乙醇至少lmL，混勻。4°C，12000r/ min,離心 15min。小心吸走乙醇，置空氣中約IOmin (15min)風干RNA顆粒，然后將RNA重溶于無核酶水中QOuL)。用吸頭反復吹吸幾次，放于冰箱中保存(_70°C或_20°C)。1· 4Ε· tenella RT-PCR用上述所提孢子化純化卵囊。卵囊總RNA為模版，按反轉錄試劑盒說明進行反轉錄合成cDNA第1鏈，反轉錄反應體系為總RNA約12. 5 μ L，下游Pr 1 μ L，混勻后70°C變性lOmin，立即置冰上冷卻，再加入下列成分dNTP 1 μ L，5 Xbuffer 4 μ L，RNase 1 μ L, AMV 0. 5 μ L,總體積 20 μ L,混勻， 42°C水浴反應lh，然后70°C IOmin滅活反轉錄酶，4°C保存。E. tenel la 3-1E 基因的 PCR 擴增以反轉錄獲得的球蟲cDNA為模板，PCR擴增E. tenella 3-1E基因。反應體系見表1。表1 PCR擴增E. tenella 3-1E的反應體系(單位μ L)Table 1 Amplification of Ε. tenella 3—1E genes by PCR(Unit μ L)_組分(Components)反應(Reactionl)_DEPC 水16Premix20cDNA2上游Pl1下游P21總體積(Total Volume) 40_反應條件為94°C預變性5min ；94°C變性50sJ4°C退火50s，72°C延伸60s，30個循環(huán)，然后72°C延伸lOmin。反應結束后將PCR產物于10g/L的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，檢測正確后，進行膠回收。
1. 5RT-PCR產物的回收純化(1)制備10g/L瓊脂糖凝膠稱取0. 25g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入25mL IX TAE, 微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，冷卻到65°C左右的瓊脂糖凝膠液加入 0. 5 μ g/mL的溴化乙錠，即成10g/L瓊脂糖凝膠液。(2)膠板制備取制膠槽洗干凈，晾干，放入制膠板。將槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將混勻的10g/L瓊脂糖凝膠液小心地倒入槽內，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內槽放入電泳槽中，添加IXTAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。(3)取40 μ L擴增產物在10g/L瓊脂糖凝膠電泳并觀察結果。RT-PCR產物的回收純化電泳完畢后，取出凝膠，在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。紫外燈下切下含目的條帶的瓊脂糖凝膠，放入干凈的離心管中，用天根瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒回收純化目的片段(1)柱平衡步驟向吸附柱CA2中加入500 μ L平衡液BL, 12000r/min離心Imin,
倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(2)向裝有膠塊的離心管中加入3倍體積溶膠液PN，50°C水浴放置lOmin，其間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解。(3)將上一步所得溶液加入一個吸附柱CA2中，室溫放置2min，12000r/min離心 30 60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。(4)向吸附柱CA2中加入60(^1^票洗液1^，1200017/1^11離心30 608，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。(5)向吸附柱CA2中加入60(^1^票洗液1^，1200017/1^11離心30 608，倒掉收集
管中的廢液。(6)將吸附柱CA2放入收集管中，12000r/min離心aiiin，盡量除盡漂洗液。將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的試驗。(7)將吸附柱CA2放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置anin。12000r/min離心^iin收集DNA溶液。1. 6RT-PCR 產物與 pMD18_T Vector 的連接將回收的RT-PCR產物與pMD18-T Vector進行連接，連接反應體系見表2。表2RT-PCR產物與載體pMD18_T Vector的連接反應(單位μ L)Table 2 Ligation of the RT-PCR products with pMD 18-T Vector(Unit μ L)_組份(Components)反應(Reaction)_pMD18-T Vector0.5純化的PCR產物4.5Solution I5總體積(TotalVolume) 10_
4 °C連接過夜。1. 7DH5a感受態(tài)細胞的制備配培養(yǎng)基所用試劑均購自楊凌天成化玻站?？瞻滓后w培養(yǎng)基200mL胰蛋白胨2g酵母提取物2gNaClIg加入約180mL 去離子水，溶解，加入NaOH 2g/50mL (lmol/L) 0. 5mL (PH >7.0),加水至200mL，高壓滅菌25min，4°C保存。配制氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，需在使用前按1 μ L/mL 的量加入配好的氨芐青霉素(lOOmg/mL)。配LB 平板(A+) 150mL胰蛋白胨 1.5g酵母提取物0. 75gNaCl1. 5g加水至150mL,加入 2. 25g 瓊脂，加 NaOH 0. 75mL (PH > 7. 0)，高壓 25min,倒平板前呆溫度降至50°c時，按1 μ L/mL的量加入配好的氨芐青霉素(100mg/mL)，倒平板，4°C保存。感受態(tài)細胞的制備(CaCl2法)(1)從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5 α單菌落，接種于3 5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C下振蕩培養(yǎng)1 左右，直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1 100 1 50 的比例接種于IOOmL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2 3h至0D600 = 0. 5左右。(2)將培養(yǎng)液轉入預冷的50mL離心管中，冰上放置lOmin，然后于4°C下8000r/ min 離心 lOmin。(3)棄去上清，用預冷的0. 05mol/L的CaCl2溶液IOmL輕輕懸浮細胞，冰上放置 15 30min 后，4°C下 8000r/min 離心 IOmin0(4)重復步驟(3)。(5)棄去上清，加入3mL預冷含15%甘油的0. 05mol/L的CaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，即成感受態(tài)細胞懸液。分裝于預冷的滅菌Ep管中，每管200 μ L，貯存于-70°C。1.8 連接產物轉化 Ε. coli DH5 α(1)從-70°C冰箱中取200 μ L感受態(tài)細胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后即置冰上。加入3-1Ε基因的質粒DNA溶液1(^1^，輕輕搖勻，冰上放置301^11后。(2)42°C水浴中熱擊90s，熱擊后迅速置于冰上冷卻3 5min。(3)向管中加入600 μ L LB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，搖菌，250/150r/min，45min，混勻后37°C振蕩培養(yǎng)lh，使細菌恢復正常生長狀態(tài)，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因。然后4000r/min離心5min后，棄上清，管底留下100 200 μ L液體。(4)輕輕吹打，混勻后，取100 μ L菌液涂布于含氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基平板上， 待板上的菌液溶到培養(yǎng)基上之后，將平板放于37°C溫箱中倒置培養(yǎng)18 Mh。隨機挑取LB 平板上的白色菌落，接種于4mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)過夜。用培養(yǎng)物作模板，進行PCR鑒定。反應體系和程序同步驟2. 2. 3。將經PCR鑒定為陽性的克隆， 按50%的甘油和菌液3 7的比例進行保菌，并送西安新方舟生物科技有限公司去測序。
2 TA4基因的克隆2.1引物的設計與合成參照NCBI上所提供的登錄號應用I^rimer Premier 5軟件合成1對引物，上游引物P3 5' -GAT TAC CCAACA GCA GTT ACG C-3'；下游引物P4:5' -CGC CGC CATATC TGT CCA AT-3'。引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。2. 2E. tenella TA4 基因的 PCR 擴增以步驟1. 4反轉錄獲得的球蟲cDNA為模板，PCR擴增E. tenella TA4基因。反應體系見表3。表3PCR擴增E. tenella TA4的反應體系(單位μ L)Table 3 Amplification of Ε. tenella TA4 genes by PCR(Unit μ L)_組分(Components)反應(Reaction”_DEPC 水16Premix20cDNA2上游P31下游P41總體積(Total Volume)40_反應條件為94°C預變性5min ；94°C變性50s，58°C退火50s，72°C延伸60s，30個循環(huán)，然后72°C延伸lOmin。反應結束后將PCR產物于10g/L的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，檢測正確后，進行膠回收。2. 3PCR產物的回收純化(1)制備10g/L瓊脂糖凝膠稱取0. 25g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入25mL IX TAE, 微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，冷卻到65°C左右的瓊脂糖凝膠液加入 0. 5 μ g/mL的溴化乙錠，即成10g/L瓊脂糖凝膠液。(2)膠板制備取制膠槽洗干凈，晾干，放入制膠板。將槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將混勻的10g/L瓊脂糖凝膠液小心地倒入槽內，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內槽放入電泳槽中，添加IXTAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。(3)取40 μ L擴增產物在10g/L瓊脂糖凝膠電泳并觀察結果。RT-PCR產物的回收純化電泳完畢后，取出凝膠，在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。紫外燈下切下含目的條帶的瓊脂糖凝膠，放入干凈的離心管中，用天根瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒回收純化目的片段(1)柱平衡步驟向吸附柱CA2中加入50(^1^平衡液虬，1200017/1^11離心Imin, 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
(2)向裝有膠塊的離心管中加入3倍體積溶膠液PN，50°C水浴放置lOmin，其間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解。(3)將上一步所得溶液加入一個吸附柱CA2中，室溫放置2min，12000r/min離心 30 60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。(4)向吸附柱CA2中加入60(^1^票洗液1^，1200017/1^11離心30 608，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。(5)向吸附柱CA2中加入60(^1^票洗液1^，1200017/1^11離心30 608，倒掉收集
管中的廢液。(6)將吸附柱CA2放入收集管中，12000r/min離心aiiin，盡量除盡漂洗液。將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的試驗。(7)將吸附柱CA2放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置anin。12000r/min離心^iin收集DNA溶液。2. 4PCR 產物與 pMD18_T Vector 的連接將回收的PCR產物與pMD18-T Vector進行連接，連接反應體系見表4。表4PCR產物與載體pMD18-T Vector的連接反應(單位μ L)Table4 Ligation of the PCR products with pMD 18-T Vector(Unit μ L)_組份(Components)反應(Reaction)_pMD18-T Vector0.5純化的PCR產物4.5Solution I5總體積(TotalVolume) 10_4°C連接過夜。2. 5連接產物轉化DH5 α感受態(tài)細胞(1)從-70°C冰箱中取200 μ L感受態(tài)細胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后即置冰上。加入3-1Ε基因的質粒DNA溶液1(^1^，輕輕搖勻，冰上放置301^11后。(2)42°C水浴中熱擊90s，熱擊后迅速置于冰上冷卻3 5min。(3)向管中加入600 μ L LB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，搖菌，250/150r/min，45min，混勻后37°C振蕩培養(yǎng)lh，使細菌恢復正常生長狀態(tài)，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因。然后4000r/min離心5min后，棄上清，管底留下100 200 μ L液體。(4)輕輕吹打，混勻后，取100 μ L菌液涂布于含氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基平板上， 待板上的菌液溶到培養(yǎng)基上之后，將平板放于37°C溫箱中倒置培養(yǎng)18 Mh。隨機挑取LB 平板上的白色菌落，接種于4mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)過夜。用培養(yǎng)物作模板，進行PCR鑒定。反應體系和程序同步驟2. 2. 3。將經PCR鑒定為陽性的克隆， 按50%的甘油和菌液3 7的比例進行保菌，并送西安新方舟生物科技有限公司去測序。3 3-1E基因和TA4基因原核共表達3. 1引物設計
參照Ge neBank上登錄的3-1E基因序列，用I^rimerS. 0軟件設計一對引物P5/P6， 其中上游引物P5帶有BamH I酶切位點P5 5' -GCCGGATCCTTTCCTTACTCAGTTAAAATG-3‘；P6 5' -ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGAAGCCGCCCTGGTACAG-3'。參照GeneBank上登錄的TA4基因序列，設計一對引物P7/P8，其中下游引物P8帶有Ml I酶切位點P7 5 ‘ -GGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGAACAAGCTGAGAAAAGCAGCA G-3'；P8 5' -CATGTCGACCGCCGCCATATCTGTCCAAT-3‘。中間通過一條(GGGGS)3 15個氨基酸的柔性片段連接。3. 2PCR 擴增以本實驗室構建的柔嫩艾美耳球蟲克隆載體PMD18-T-3-1E和pMD18_T_TA4為模板，采用PCR技術擴增3-1E基因和TA4基因片段。反應體系見表3。表3PCR擴增反應體系(單位μ L)Table 3 Amplification by PCR(Unit μ L)_組分(Components) 反應(Reaction)_DEPC 水16Premix20pMD18-T-3-ΙΕ/pMD18-T-TA4 2上游Pr1下游Pr1總體積(Total Volume)40_以上游引物P5，下游引物P6擴增3-IE基因，以上游引物P7，下游引物P8擴增TA4基因。反應條件為95°C預變性5min -MV 50s，59/58°C 50s，72°C lmin，共進行 30 個循環(huán)；最后再在72°C延伸lOmin。反應結束后將PCR產物于10g/L的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，檢測正確后，切膠進行膠回收。以膠回收的兩種PCR產物為模板，以P5和P8為引物，擴增3_1E和TA4的融合基因，反應體系見表4。表4PCR擴增反應體系(單位μ L)Table 4 Amplification by PCR(Unit μ L)_組分(Components)反應(Reaction)_DEPC 水16Premix20
3-1E1TA41上游引物P51下游引物P81總體積(TotalVolume)40_反應條件為95°C預變性5min -MV 50s,59°C 50s,72°C lmin，共進行30個循環(huán)； 最后再在72°C延伸lOmin。反應結束后將PCR產物于10g/L的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測， 檢測正確后，切膠進行膠回收，得融合基因3-1E-TA4，其核苷酸序列見SEQ ID NO. 1。3. 3共表達載體的構建及鑒定3. 3. lpMD18-T-3-lE-TA4 的構建將回收純化的3-1E-TA4融合基因連接到pMD18-T Simple Vector上(選取合適比例進行連接反應)，連接體系見表5。表5PCR產物與載體pMD18-T Simple Vector的連接反應(單位μ L)Table 5 Ligation of the PCR products with pMD 18-T Simple Vector(Unit μ L)_組份(Components)反應(Reaction)
pMD18-T Simple Vector0. 5
純化的3-1E-TA4融合基因4. 5
Solution I5
總體積(Total Volume)10
4°C連接過夜。連接產物轉化DH5a感受態(tài)細胞，涂布含氨芐青霉素的LB平板， 37°C過夜培養(yǎng)。挑取單個菌落接種含氨芐青霉素的LB中，用天跟普通質粒小提試劑盒提質粒，用BamH I, Sal I進行酶切鑒定，見表6。表6pMD18-T-3-lE_TA4 酶切反應體系(單位μ L)Table 6 Restriction enzyme digestion of pMD 18-T-3-1E-TA4(Unit μ L)_組份(Components)反應(Reaction)PMD18-T-3-1E-TA4810XT Buffer1BamH I0. 5Sal I0. 5總體積(Total volume)10 酶切Ih后，于lOg/L的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，鑒定正確后，送去測序。
3. 3. 2pET-32a (+) -3-1E-TA4 載體的構建將測序正確的pMD18-T-3-lE-TA4和表達載體pET_32a(+)分別用BamH I，Sal I 進行雙酶切，酶切體系見表7。表7質粒pET_3h (+) /3-1E酶切反應體系(單位μ L)Table 7 Restriction enzyme digestion of plasmid pET_32a (+)and 3-lE(Unit μ L)_組份(Components)體系(System)
pET-32a(+)/pMD-18T-3-lE-TA432
10XH Buffer4
BamH I2
Sal I2
總體積(Total volume)40
酶切池后，于lOg/L的瓊脂糖凝膠上進行電泳，切膠進行膠回收，回收基因與載體片段進行連接，連接體系表見8。表8 3-1E-TA4與載體pET_3h (+)的連接反應(單位μ L)Table 8 Ligation of the PCR products with pET~32a (+) vector and
3-lE(Unit μ L)_組份(Components)反應(Reaction)_Digested pET-32a(+)1.5Digested pMD-18T-3_lE- 6. 5TA41T4DNALigase110XT4DNA Ligase10總體積(TotalVolume)20_
4°C連接過夜。連接產物轉化DH5 α感受態(tài)細胞，挑取單個菌落接種含氨芐青霉素的LB中。提質粒分別用BamH I，Sal I進行雙酶切鑒定，酶切體系見表9。表9pET_3h (+) -3-1E-TA4 酶切反應體系(單位μ L)Table 9 Restriction enzyme digestion of pET_32a(+)-3-1E—TA4(Unit : μ L)_組份(Components)反應(Reaction)_pET-32a(+)-3-lE_TA4 810XT Buffer1
BamH I0. 5Sal I0. 5總體積(Total volume) 10_酶切Ih后，于10g/L的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，鑒定正確后，轉BL21感受態(tài)細胞，同樣用BamH I，Sal I進行雙酶切鑒定，酶切體系同表7。酶切Ih后，于10g/L的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，結果表明成功構建pET-32a(+)-3-lE-TA4載體，按50%的甘油和菌液3 7的比例進行保菌。3. 3. 3pET-32a (+) -3-1E-TA4 重組質粒誘導表達(1) SDS-PAGE。a.將保存的重組菌液接種于3mL LB培養(yǎng)基/ (含100 μ g/mL Amp)中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜以獲得飽和培養(yǎng)物。b. 100 μ L過夜培養(yǎng)物接種于3mL LB培養(yǎng)基(含100 μ g/mL Amp)中，37°C振蕩培養(yǎng) OD600 值為 0. 6 左右時，力口 IPTG (0. Imo 1/L) 18 至 IPTG 終濃度為 0. 6mmol/L，培養(yǎng) 5h。cjh后取將培養(yǎng)物轉移至一微量離心管中，迅速在室溫下以12000r/min離心 Imin,棄上清液，收集細菌沉淀，加500 μ L氯化鈉注射液吹打混勻，室溫下以12000r/min離心lmin，用100 μ L氯化鈉注射液定容，吹打混勻。按樣品和緩沖液4 1的比例加25 μ L 5XSDS凝膠加樣緩沖液，100°C加熱IOmin處理樣品。然后取15 μ L進行SDS-PAGE電泳， 點IOyL ProteinRuler I，電泳條件為12g/L分離膠80V，30min ;120V，1.釙。電泳結束后取下凝膠，經考馬斯亮藍染色液100°C加熱煮沸染色5min，回收染色液，100°C沸水脫色數(shù)次至背景色退去，觀察結果，進行拍照。(2)不同誘導濃度、不同誘導時間蛋白表達量。a. 100 μ L過夜培養(yǎng)物接種于3mL LB培養(yǎng)基(含100 μ g/mLAmp)中，分別接種3管， 37°C振蕩培養(yǎng)OD600值達到0. 6左右時，分別加入IPTG (0. lmol/L) 12mLU8mL,24mL至IPTG 終濃度為 0. 4mmol/L、0. 6mmol/L、0. 8mmol/L，培養(yǎng)。分別在培養(yǎng) 3h、5h、7h 后取 IPTG 終濃度為0. 4mmol/L誘導的菌液lmL，4°C保存。在培養(yǎng)證時分別取三種濃度誘導的菌液各 lmL，六個樣品按2. 3.3(1)中c所述步驟處理樣品。b.取15 μ L處理好的樣品進行SDS-PAGE，電泳條件為12g/L分離膠80V，30min ； 120V, 1.證。電泳結束后取下凝膠，經考馬斯亮藍染色液100°C加熱煮沸染色5min，回收染色液，10(TC沸水脫色數(shù)次至背景色退去，觀察結果，進行拍照。3. 3. 4ffestern blotting(1)試驗所用試劑的準備大濾紙、PVDF膜，均購自北京全式金生物技術有限公司。膜轉移緩沖液Glycine 2. 9g, Tris 5. 8g, SDS 0. 37g，加少量水溶解后，加 200mL 甲醇，定容至
1L，室溫保存。TBS 緩沖液(Western 雜交膜清洗液):lmol/LTris .HCl (ρΗ7· 5) 1 OmL, NaCl 8. 8g, 加蒸餾水定容至1000mL。TBST 緩沖液(Western 雜交膜清洗液)Nacl 8. 8g, lmol/L Tris-Hcl (pH8. 0) 20mL加入約800mL去離子水溶解，加入0. 5mL Tween20后混勻，定容至1L，4°C保存。封閉緩沖液5g脫脂奶粉溶于IOOmL TBST Buffer中，4°C保存(現(xiàn)配現(xiàn)用)。(2)Western blottinga. SDS-PAGE電泳誘導表達的重組蛋白15 μ L上樣，用12g/L分離膠，在80V， 30min, 120V 電壓下電泳 1. 5h，點 10 μ L EasySee Western Marker。在此期間將濾紙、PVDF 膜剪成與膠塊大小一樣，然后將其和海綿墊子一起浸泡在蛋白轉移Buffer中。b.轉膜電泳結束后，剝膠，放入上述蛋白轉移Buffer中，在正極板上按海綿、四層濾紙、PVDF膜、凝膠、四層濾紙、海綿的順序疊放整齊，確定無氣泡后蓋上負極板，60V轉移 2. 5h。c.封閉轉移完成后，取下PVDF膜，用鉛筆標記膜的正反面。將膜放入一個干凈的培養(yǎng)皿中，用雙蒸水沖洗幾次，然后倒入封閉液，室溫輕輕振搖池或4°C過夜。d.與抗體結合封閉結束后，倒出封閉液，先用TBS振搖洗兩次，再用TBST漂洗一次。加入TBST稀釋的1 200的雞抗E. tenella陽性血清，4°C過夜。然后先用TBS洗兩次，再用TBST漂洗一次，加入TBST稀釋的1 500兔抗雞IgG，37°C結合池，取出后先用 TBS洗兩次，再用TBST漂洗一次，每次lOmin。e.暗室曝光在暗室內將PVDF膜放一個預先準備的干凈的塑料袋內，將配好的顯色試劑DAB底物溶液加到袋中膜的正面一側，在暗室中來回晃動，使試劑與膜充分結合 lmin。然后將膜正面小心放在壓片夾中的X-光片上，壓aiiin，將膜拿出，分別在顯影液、蒸餾水、定影液的盆中浸潤aninUmiruaiiin。取出光片在水龍頭上沖洗，條帶出現(xiàn)后，立即用水終止反應，觀察顯色情況，在凝膠成像系統(tǒng)中照像、保存。3. 3. 5 結果含pET-32a(+)-3-lE-TA4重組質粒的大腸埃希氏菌BL21 (DE3)用IPTG誘導表達后取樣品進行SDS-PAGE分析，其融合蛋白的分子質量大小為60ku左右。通過不同誘導劑和不同誘導時間誘導，可以看出在相同的誘導時間內0.6mmol/L IPTG誘導的菌液表達的蛋白量最多；在相同的誘導劑濃度下，誘導紐的菌液表達的蛋白量最多。誘導菌液，將表達的蛋白電轉移至NC膜上，進行Western-blotting分析。分析結果表明，其表達的蛋白可與免疫雞陽性血清發(fā)生反應，其特異雜交帶的大小與該基因編碼的融合蛋白大小一致。4動物實驗分別用純化的pET-32a (+) -3-1E-TA4共表達融合蛋白和pET_32a (+) -3-1E， pET-32a(+)-TA4單一的融合蛋白免疫7日齡的雛雞，一周后進行二免，胸部肌肉注射。21 日齡經口感染E. tenella 1株孢子化卵囊1 X IO5個/羽。每日觀察并記錄雞只精神狀態(tài)、死亡情況，28日齡對所有雞只進行剖殺，稱重、進行盲腸病變記分、計數(shù)各組的克糞便卵囊數(shù)(OPG)，計算抗球蟲指數(shù)(ACI)。ACI =(相對增重率+成活率)-(病變值+卵囊值)。 ACI彡180為保護效果明顯，ACI = 160 179為保護效果較好，ACI = 160 120為保護效果一般，ACI < 120為無保護效果。設陰性(非感染非免疫)和陽性(感染非免疫)對照組。結果表明共表達抗原免疫組抗球蟲指數(shù)明顯高于單一抗原免疫組。以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護范圍不限于此。本技術領域的技術人員在本發(fā)明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā)明的保護范圍以權利要求書為準。
權利要求
1.一種融合基因，其特征在于，所述融合基因具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
2.權利要求1所述融合基因的合成方法，其特征在于，包括如下步驟1)采用RT-PCR方法擴增3-1E基因和TA4基因，并進行鑒定；2)分別將3-1E基因和TA4基因連接到載體pMD18-T上，構建克隆載體pMD18_T-3_lE 禾口 pMD18-T-TA4 ；3)以步驟2)所得載體pMDlS-T-3-ΙΕ為模板，進行PCR擴增，上游引物為P5:5'-GCC GGATCCTTTCCTTACTCAGTTAAMTG-3 ‘，下游引物 P6 5 ‘ -ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGMCCGCC TCCACCGAAGCCGCCCTGGTACAG-3‘；4)以步驟2)所得載體PMD18-T-TA4為模板，進行PCR擴增，上游引物P7:5' -GGTTCA GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGAACAAGCTGAGAAAAGCAGCAG-3 ‘；下游引物為 P8 5 ‘-CATGTCGACCGCCGCCATATCTGTCCAAT-3‘；5)以步驟3)和步驟4)的PCR產物為模板，進行PCR擴增，上游引物為P5:5 ‘-GCCGGATCCTTTCCTTACTCAGTTAAAATG-3 ‘，下游弓丨物為 P8 :5 ‘ -CATGTCGACCGCCG CCATATCTGTCCAAT-3 ‘，得到 3-1E-TA4 融合基因。
3.—種重組質粒，其特征在于，所述重組質粒含有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權利要求3所述的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒是指 pET-32a-3-lE-TA4。
5.一種抗雞球蟲病的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由所述3-1E-TA4融合基因表達而得。
6.權利要求5所述的融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟1)將所述3-1E-TA4的融合基因連接到載體PMD18-T上，構建載體pMD18-T-3-lE_TA4；2)對分別對所述載體PMD18-T-3-1E-TA4和表達載體pET_32a(+)進行雙酶切，將回收的3-1E-TA4融合基因，與表達載體pET-32a(+)連接，連接產物經鑒定正確后，即得到重組質粒 pET-32a-3-lE-TA4 ；3)步驟2~)所述的重組質粒pET-3h-3-lE-TA4轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞；4)培養(yǎng)步驟幻所得大腸桿菌，制備與純化融合蛋白。
7.根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述大腸桿菌感受態(tài)細胞為BL21感受態(tài)細胞。
8.權利要求5所述融合蛋白在制備預防雞艾美耳球蟲病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗雞球蟲病的融合蛋白及其制備和應用。本發(fā)明提供一種融合基因及其表達的融合蛋白，所述融合基因為SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還構建了包含上述融合基因的重組質粒。本發(fā)明提供的融合蛋白可用于制備預防雞球蟲病的藥物。
文檔編號C12N15/63GK102234657SQ20101016438
公開日2011年11月9日 申請日期2010年5月6日 優(yōu)先權日2010年5月6日
發(fā)明者于三科, 宋軍科, 戰(zhàn)美娜, 李健, 林青 申請人:西北農林科技大學