專利名稱：耐放射性異常球菌海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種海藻糖的制備方法，特別是利用生物技術獲得的酶用于制造海藻糖的方法。
背景技術：
海藻糖，更確切地說是α，α-1，1-海藻糖是由兩分子葡萄糖以α，α-1，1-糖苷鍵相連而成。海藻糖是一種天然性二糖，廣泛地存在于微生物、蝦類、釀酒酵母、蘑菇及各種真菌、昆蟲、植物等。但含量甚微。過去主要是從干酵母中提取。由于含量低，提取過程較復雜，成本極高。如此昂貴的海藻糖只能局限于某些特殊領域如醫(yī)學生物制品的活性保持的應用。隨著人類社會的發(fā)展和進步，要求將海藻糖應用于各類食品的鮮味保持與質地改善的趨勢越來越明顯，因此必須要盡快地找到廉價而高效的海藻糖制造方法。
株式會社林原生物化學研究所在中國專利CN1106065A(1995年)中講述了一種海藻糖制造方法。該法從Pimelobacter、Psceudomonas和Thermus三種菌屬中分離純化了海藻糖合成酶(TRES)，該酶能夠以麥芽糖為原料制成海藻糖。這為廉價制造適合應用于食品、農業(yè)等需量大的領域的低價位海藻糖產品提供了極大的可能性。1996年，株式會社林原生物化學研究所的K.Tsusaki等人披露了克隆自Pimelobacter sp R48和Thermus aquaticus的海藻糖合成酶基因的DNA(脫氧核糖酸)序列及其構成該酶的氨基酸序列(K.Tsusaki，etal.1996，Biochim.Biophys，Acta，12901-3；K.Tsusaki，etal.1997，Biochim.Biophys.Acta，133428-32)。2000年，De Smet等人通過生物信息學的方法從測序完成的結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis CDC1551)的基因組中分離，鑒定了海藻糖合成酶基因(K、A、L、De Smet etal.2000，Microbiology，146199-208)。發(fā)現它與來自Pimerlobacter sp R48的TRES在組成該酶的氨基酸序列有70％的同源性，而DNA水平上的同源性為69％，分離自Thermus aquaticus(水棲嗜熱菌)的TRES是一種大分子酶蛋白，由963個氨基酸的單鍵多肽組成。Thermus aquaticus的與Pimerlobacter sp R48的TRES的氨基酸序列的同源性是55％，而DNA的同源性是36.4％。來自Thermus caldophilus GK24的TRES與Thermus aquaticus的非常相似。它由965個氨基酸組成，兩者的氨基酸同源性為99％，DNA的同源性為98.9％，很可能是在進化進程中基因平移(genelateral transfer)造成的結果。
另外，通過檢索，還查到有關海藻糖合成酶的一些科技文獻1、中國專利<申請?zhí)?amp;gt;99816517<<發(fā)明名稱>海藻糖合酶蛋白質、基因、質粒、微生物和生產海藻糖的方法<申請人>第一制糖株式會社，韓國漢城<文摘>本發(fā)明涉及生產海藻糖的微生物和生產海藻糖的方法。本發(fā)明還涉及新的海藻糖合酶蛋白質、海藻糖合酶基因、攜帶所述海藻糖合酶基因的重組質粒以及用所述重組質粒轉化的微生物。
2、中國專利<申請?zhí)?amp;gt;01100417<發(fā)明名稱>海藻糖基水解酶及其制備和用途<申請人>中國科學院微生物研究所，北京市海淀區(qū)中關村北一條13號<文摘>本發(fā)明公開了一種新型嗜酸耐熱海藻糖基水解酶及其制備和用途，該酶可以從埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、酵母屬的微生物中獲得，能夠在高溫酸性條件下高效水解具有海藻糖結構作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵。該酶分子量約55000到65000道爾頓；等電點約為5.5到6.6。該酶很容易通過微生物發(fā)酵大量制備，并用于工業(yè)化制備海藻糖。該海藻糖可廣泛地用于食品、化妝品和藥品組合物中。
3、中國專利<申請?zhí)?amp;gt;01123521<發(fā)明名稱>新型嗜酸耐熱海藻糖基合成酶及其制備和用途<申請人>吳襟，北京市海淀區(qū)中關村北一條13號<文摘>本文公開了一種新型嗜酸耐熱海藻糖基合成酶及其制備和用途，該酶從埃希氏菌屬、酵母屬的微生物中獲得，能夠在高溫酸性條件下不需海藻糖為底物，而利用還原性淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖結構作為末端單元的非還原性淀粉糖。該酶分子量約75000到85000道爾頓；等電點約為6.2到7.2。該酶很容易通過微生物發(fā)酵大量制備，并用于工業(yè)化制備非還原性淀粉糖和海藻糖。該非還原性淀粉糖和海藻糖可廣泛地用于食品、化妝品和藥品組合物中。
4、透性化細胞海藻糖合酶特性的研究作者薛璐 馬鶯機構哈爾濱工業(yè)大學生命科學與工程系，東北農業(yè)大學食品學院，刊名食品科學.2003，24(3).關鍵詞海藻糖 透性化細胞海藻糖合酶 酶學特性文摘海藻糖是一種新型食品添加劑，目前多以微生物酶法生產。海藻糖合酶是近年來新發(fā)現的一種海藻糖合成酶。本文研究了經滲透細胞技術處理得到的透性化細胞海藻糖合酶的酶學特性。結果表明，該細胞酶的反應最適溫度為35℃，最適pH7.4，Mg^2+及K^+對該細胞酶有明顯激活作用，Zn^2+，Mn^2+及Cu^2+則可強烈地抑制酶活力。該酶對底物特異性極強，能特異性地將麥芽糖轉化為海藻糖。
5、海藻糖微生物酶法合成機制的研究作者王紹校 吳襟 高春霄 陳萌 蔡同一 張樹政機構中國科學院微生物研究所，中國農業(yè)大學食品學院刊名微生物學通報.2003，30(2).關鍵詞海藻糖 麥芽寡糖基海藻糖合酶 麥芽寡糖基海藻糖海藻基水解酶 淀粉 微生物酶法合成 二糖文摘來源于嗜酸熱古菌芝田硫化葉菌(Sulfolobus shibatae)B12的麥芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶(MTHase)基因在大腸桿菌中獲得表達。將獲得純化的兩個酶，分別以麥芽寡糖和淀粉為轉化底物，在pH5.5，60℃條件下合成海藻糖。從反應產物分析結果可知，兩個酶合成海藻糖時能利用的最小底物是麥芽四糖，海藻糖產率與麥芽寡糖鏈長正相關。同時還發(fā)現兩個酶都具有輕微的□-1，4-葡萄糖苷酶活性，能在麥芽寡糖還原末端水解□-1，4糖苷鍵，生成葡萄糖分子，其反應最小底物分別是麥芽三糖和四糖。推測海藻糖合成酶可能有兩個不同的催化活性中心。
6、釀酒酵母海藻糖合成酶基因的克隆和在大腸村菌中的表達作者楊波 戴秀玉等機構中國科學院微生物研究所，刊名遺傳學報.2001，28(4).關鍵詞TPS1基因 海藻糖 PCR克隆 表達 釀酒酵母 海藻糖合成酶文摘用PCR方法克隆了1.5kb的釀酒母Sacchromycescerevisiae海藻糖合成酶基因TPSI，將該片段連接到pUC19載體，通過轉化分別引入海藻糖合成酶基因缺失和缺陷的大腸桿菌Escherichia coli FF4169和FF4050，對轉化株的質粒DNA酶切分析表明均含有1.5kb PCR克隆片段，生長曲線實驗證明，帶有克隆片段的轉化株在含0.5mol/L NaCl的高滲透壓基礎培養(yǎng)基中生長良好；用高效液相色譜(HPLC)結合蒸發(fā)散射(ELSD)技術測定細胞內海藻糖實驗證明轉化株能夠合成海藻糖。
7、HPLC/RI與HPLC/ESI-MS方法研究細菌D-97酶合成海藻糖的過程作者榮紹豐 戴軍等機構江南大學生物工程學院，中國發(fā)酵工業(yè)協(xié)會功能性低聚糖檢測室，刊名色譜.2002，20(3).關鍵詞細菌D-97酶合成 高效液相色譜 示差折光檢測 電噴霧電離質譜 海藻糖 寡糖 定性分析 胞內酶 定量分析文摘通過高效液相色譜/示差折光檢測系統(tǒng)(HPLC/RI)分析可獲得細菌D-97利用糊精或淀粉水解物合成海藻糖的基本生物學信息，包括微生物培養(yǎng)碳源對細菌D-97胞內海藻糖合成酶系的影響以及該酶系利用不同種類或不同分子鏈長度的麥芽寡糖合成海藻糖的能力及作用過程。采用HPLC與RI及電噴霧電離質譜(ESI-MS)聯(lián)用并結合其他生物學手段對由細菌D-97獲得的純酶組分(酶A)作用產物進行定量和定性分析，從而基本明確了D-97胞內合成海藻糖的過程。
8、腸桿菌海藻糖合成酶基因的克隆和表達作者戴秀玉 吳大鵬機構中國科學院微生物研究所，刊名遺傳學報.2000，27(2).關鍵詞OtsBA基因 海藻糖 細胞內克隆 抗逆性 作物育種文摘利用Mu轉座子細胞內克隆了大腸桿菌海藻糖合成酶ots BA基因，克隆頻率為1.45×10-3/KanΓ轉導子。經遺傳互補、酶切和部分序列分析表明ots BA基因位于克隆質粒。亞克隆2.87kb的DNA片段到表達質粒并分別轉化大腸桿菌ots BA基因缺失菌株，轉化菌株恢復在0.5mol/L NACI培養(yǎng)基上生長的功能，高滲透壓誘導實驗表明，轉化株能夠合成海藻糖。
這些公開文獻雖然給出了一些通過微生物分離及克隆到與海藻糖合成相關的酶及技術方案，然后把這些酶用于制備海藻糖，但這些海藻糖合成酶的菌種來源不同，DNA序列和氨基酸序列相差甚遠，酶活力不同，目前大部分還沒有得到應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明人在分析上百種微生物的基因組時，發(fā)現可以用生物信息學的方法在一系列未注釋的脫氧核糖核酸中發(fā)現非常有用的信息。結合基因的克隆和異源基因表達技術，以及通過對表達的蛋白質進行特性特征鑒定，發(fā)現了在蛋白質的序列數據庫Genbank中注釋為“未知蛋白”或“推測是蛋白質”的極為有用基因，其中包括至今為止人們并未發(fā)現的海藻糖合成酶基因(treS)，并用這種合成酶基因經過克隆和培養(yǎng)，在麥芽糖漿或淀粉漿中用于制備得到產率極高的海藻糖。
本發(fā)明是這樣實現的本發(fā)明所述的海藻糖合成酶基因選自耐放射性異常球菌(Deinococcus radiodurans)。該菌種可以從微生物中心購買，也可以通過野外采集和其他途徑獲得。
從耐放射性異常球菌(Deinococcus radiodurans)克隆得到的海藻糖合成酶具有以下特征1、分子量為62.8kD2、等電點約為PI＝4.93、酶的最適反應溫度為30～37℃4、酶的反應的pH在6.5～8.5，優(yōu)選pH為7.0～7.55、當Cu2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+等二價金屬離子的濃度在5ppm時，該酶的活力不受影響。
6、酶對底物的轉化率會隨著反應溫度的提高而逐漸降低，例如在60℃反應的底物轉化率要比在30℃的轉化率低40％以上。
7、海藻糖合成酶在以麥芽糖漿為底物時，可催化底物生成40～70％的海藻糖。
8、該海藻糖合成酶在以麥芽糖為底物時，除了催化生成海藻糖外，還合成高達5～15％的葡萄糖。
7、葡萄糖對該酶的轉化率有較強的抑制作用，即葡萄糖存在時會影響海藻糖生成量。
本發(fā)明的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法，包括以下工藝步驟1)對選定的菌種接種進行擴大培養(yǎng)；2)從獲得的擴大菌種中克隆海藻糖合成酶基因(Tres)；3)將海藻糖合成酶基因(Tres)在大腸桿菌中表達；4)收集重組海藻糖合成酶；5)以麥芽糖漿或淀粉漿為原料，用重組的海藻糖合成酶制造海藻糖，。
在上述5)中，所述的淀粉漿可以選用玉米淀粉、大米淀粉、小麥淀粉、木薯淀粉、馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉與水配成的淀粉溶液，優(yōu)選大米淀粉和木薯淀粉。
在以上所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法中，對選定的菌種接種進行擴大培養(yǎng)的工藝是將耐放射性異常球菌Deinococcus radiodurans接種于以下原料液體培養(yǎng)基中(克/升)葡萄糖5，酵母粉(yeast extract)5，蛋白胨(peptone)10，氯化鈉(NaCl)5，pH7.4，然后在28-30恒溫搖床上振蕩18-36小時，于5000rpm離心10分鐘收集菌體。
在以上所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法中，從所獲得的擴大菌種中克隆海藻糖合成酶基因(Tres)的工藝是先設計以下引物；1、上游引物(Sense primer)5-GAGCCATGGCCCAGGCACACCCGGAGTGGT-3；2、下游引物(Antisense Primer)5-TGGTCTCTGCAGTCAATTCAACCGCAGCCAGTAATAG-3，然后用聚合酶鏈式反應(PCR)技術獲得目的基因，然后用Takara的專用試劑盒對PCR產物進行初步純化，然后用NcoI和PstI對PCR產物進行雙酶切，再與同樣用NcoI和PstI酶切過的pSE380質粒連接，得到重組質粒pSE380-treS。
在以上所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法中，將海藻糖合成酶基因(Tres)在大腸桿菌中表達的工藝是制備大腸桿菌BL21的感受態(tài)細胞，然后用pSE380-treS轉化BL21感受態(tài)細胞，于30～37℃培養(yǎng)10～16小時，然后加入IPTG至終濃度為0.5mM，再繼續(xù)于28～32℃培養(yǎng)24～36小時。離心收集菌體后，即可進行細胞破碎和重組海藻糖合成酶的提取和底物轉化試驗。
在以上所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法中，收集含有重組海藻糖合成酶的工藝是將轉化試驗合格的大腸桿菌菌體接種到500ml的下述培養(yǎng)基中氨芐青霉素50μg/ml，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉3g/L。在33℃培養(yǎng)13小時，然后用2×500ml種子接種到含20升同樣培養(yǎng)基的40升發(fā)酵罐中。在33℃，200rpm，通風量為0.9vvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)15小時。然后加入終濃度為0.5mM的IPTG進行誘導。再繼續(xù)培養(yǎng)17小時即終止。于5000rmp離心10分鐘以收集菌體。用等體積的去離子水洗滌細胞一次，同樣條件離心后重懸于二分之一體積的細胞破碎液液(含有3mg/ml溶菌酶，1％ Triton-X100，0.05mMEDTA，用pH為6.9的磷酸緩沖液配制)中，在37℃振蕩反應20小時，然后在45℃水浴中處理2小時。于3000g離心15分鐘，收集上清液得到重組海藻糖合成酶。
在以上所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法中，用重組海藻糖合成酶制造海藻糖的工藝是以麥芽糖漿或淀粉漿為原料，先加去離子水兌成含30％的溶液。取100升置于200升容積的不銹鋼反應罐中，加入磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配成的緩沖液，使該緩沖液的終濃度為5mM，pH為6.9左右。取上述第1步中制得的海藻糖合成酶10升，加入到100升30％麥芽糖漿或淀粉漿中，然后在25-30℃條件下反應24-36小時。用高效液相色譜儀(HPLC)如安捷倫Agilent 1100型對反應液進行測定其海藻糖含量。
以下給出本發(fā)明海藻糖合成酶的研究過程及制備方法本發(fā)明人在研究海藻糖合成酶的過程中，對耐放射性異常球均Deinococcus radiodurans的基因組序列中的一段在Genbank中標記為“假定海藻糖合成酶基因”(putative trehalose synthase)的基因作了深入細致的研究。發(fā)現這一段DNA序列與已發(fā)表的海藻糖合成酶基因有較高的同源性，其DNA序列的平均同源性接近50％，而其編碼的假定的蛋白質的氨基酸序列與已發(fā)表的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的氨基酸同源性平均相差不大，一般57％，很難通過氨基酸序列確定其為何種酶。
本發(fā)明人用基因克隆方法，包括眾所周知的聚合酶鏈式反應(PCR)技術、酶切、連接等把這一段標記為“假定蛋白質”(hypothetical protein)克隆到質粒上，例如pGEM-3zf，pUC19等專用于克隆的商品質粒上，然后再轉移到諸如pET5a、pSE380等表達質粒上，再通過已成熟的質粒轉化技術，例如通過制備細胞膜的通透性大為增加的大腸桿菌感受態(tài)細胞等技術，把質粒導入到大腸桿菌中。后者在培養(yǎng)生長過程中就會把此段DNA所含的信息翻譯成為某種蛋白質，而其DNA序列也一一對應于該種蛋白質的氨基酸序列。宿主大腸桿菌在一定生長條件下，特別是在有“誘導物”如IPTG、半乳糖、乳糖等存在的情況下，會大量地合成該種蛋白質。
經過細胞破碎，例如利用溶菌酶、超聲波或機械碾磨法等破碎細胞后，可以對該段DNA所編碼的蛋白質進行特性特征研究，特別是鑒別出這段DNA所編碼的蛋白質是一種什么東西？是一種酶還是結構蛋白質？如果是酶，又是一種什么酶？發(fā)明者經過基因克隆，外源基因表達，表達產物的提取和純化，以及將目標基因產物進行酶學研究等多種復雜的實驗步驟，證實這一段“假定蛋白質”編碼的是一種特性特征與前人發(fā)現的完全不同的海藻糖合成酶。這些不同的特性特征包括了氨基酸序列和DNA序列的不同，酶的分子大小不同，酶的最適反應溫度不同，酶的最適pH，反應條件的不同以及酶對底物麥芽糖轉化為海藻糖比例的差異等特性，因此判定是一種新的發(fā)現。
本發(fā)明所述的海藻糖合成酶的基因是耐放射性異常球菌，拉丁學名是Deinococcusradiodurans。該種細菌能夠耐受高劑量的放射性輻射，這可能和它含有較高的海藻糖有關。通過本發(fā)明才知道該細菌還含有編碼海藻糖合成酶基因，并且能產生海藻糖合成酶，該酶在天然的耐放射性異常球菌中是一種胞內酶，需要用細胞破碎的方法才能檢查到；在天然菌中該酶的含量也非常低，經過高達500～800倍濃縮都不一定檢驗到海藻糖合成酶的活力。而應用基因重組菌來表達本發(fā)明所述的海藻糖合成酶基因?？梢允姑傅幕盍Ρ忍烊痪旮邤登П丁?br> 編碼本發(fā)明所述的海藻糖合成酶的基因(treS)是一段以前未知的DNA片段，長度為1659個堿基對，編碼552個氨基酸?；虻膲A基組成是表1 耐放射性異常球菌Deinococcus radiodurans的海藻糖合成酶基因的堿基組成

表2.克隆自D.radiodurans的海藻糖合成酶基因全序列和氨基酸序列D.radiodurans海藻糖合成酶基因的DNA序列ATGACCCAGG CACACCCGGA GTGGTACAAG AGCGCTGTCT TCTACGAACT GTCCGTGCGG ACCTTTCAGGACGGCAACGG CGACGGCAAG GGCGATTTTC CCGGCCTGAC CTCGCGGCTG GACTACCTGA AAAACCTCGGCGTGGACTGC CTGTGGTTGC TGCCCTGGTT TCCCAGCCCA CTGCGCGACG ACGGGTACGA CGTGGCCGACTACCGGGGGA TTCACCCTGA CCTCGGCACG CTCGACGACT TCAAGGTCTT TCTGCGCGAA GCCCACGCCCGGGGCCTGCG GGTCATCGGC GACCTGGTGA CCAACCACAC GTCCAGCGAC CACCCCTGGT TTCAGGCGGCGCGGCGCGGC CCGACCCTGC CCGACGGCTC GCCCAACGAG TACCACGACT ACTACGTCTG GAGCGACGAGGGCAAGGAAT ACGCCGACAC CCGCATCATC TTCACCGACA CCGAGGTCAG CAACTGGACG CTCGACGAGCAGGCAGGCAA GTATTACTGG CACCGCTTTT TCGCCAGCCA GCCGGACCTG AACTACGACA ACCCGAAAGTGGTGGAAGAA CTTCACGGCG CCGCCCGCTT CTGGCTCGAC CTCGGCCTCG ACGGGTTCCG GGTGGACGCCGTGCCCTACC TCATCGAGCG CGAGGGCACG AGCTGCGAGA ATCTGCCCGA AACACACGAG ATTCTCAAGG
GCTTCCGGGC GATGGTGGAC CGCGAGTATC CGGGGCGGCT GCTGCTTGCC GAGGCGAACC AGTGGCCCGAGGAAGTCGTC GAGTACTTCG GCACCGAAGC CGAGCCCGAG TTCCACATGT GCTTCAACTT CCCGGTGATGCCCCGGCTGT ACATGAGCCT GAAAAGGGAG GACACCTCCA GCATCCGCGA GATCATGGGC CGCCTGCCGAAAATCCCGAG TTTCGGCCAG TGGTGCACCT TCCTGCGCAA CCACGACGAA CTGACGCTGG AAATGGTCACCGACGACGAG CGCGCCTTCA TGTATGCCGC CTACGCGCCC GACGCCCGCA TGAAAATCAA CGTGGGCATCCGCCGTCGCC TCGCGCCGCT GCTCGACAAC GACCGGCGCC GCATCGAGCT GCTGAACACT GTGCTCCTCGCCCTGCCCGG CAGCCCCATC CTGTACTACG GCGACGAAAT CGGCATGGGC GACGACCTCG GCCTGCCCGACCGCAACGGC GTGCGCACCC CGATGCAGTG GAACGCGGGC ACCAGCGGCG GTTTTTCCAC TGCGCAGCCCTCCGACTGCT TTTTCCCGCC GATTCAGGAC CCGGTGTACG GCTTCGGGCG CGTCAACGTG CAGAGCCAGCTCCAAGACCC CAGCAGCCTG CTGAAGTGGA CCGCCCGGCA ACTCGAACTG CGCCGCGCCC ACCCCGCCTTTGCGCACGGC GACCTCACCT TCATCGAAAC CGGCAACCCC GCCATCCTCG CCTTTACCCG CCAGTACGACGGCGAAACGC TGCTCATCGT CAGCAACTTC GCGGGCAACG CCCAGGCCGG GCTGCTCGAT CTCGCGCCCTTCGTGGGCCG CGCCCCGGTC ACACTTTCCG GGGCCAGCCC GCTGCCGGTG GTCACTGGAA ACGGCCAGTACCCGGTGGTG ATGGGCAAGT ACGACTATTA CTGGCTGCGG TTGAATTGAD.radiodurans海藻糖合成酶基因的氨基酸序列Met Thr Gln Ala His Pro Glu Trp Tyr Lys Ser Ala Val Phe Tyr Glu Leu Ser Val ArgThr Phe Gln Asp Gly Asn Gly Asp Gly Lys Gly Asp Phe Pro Gly Leu Thr Ser Arg LeuAsp Tyr Leu Lys Asn Leu Gly Val Asp Cys Leu Trp Leu Leu Pro Trp Phe Pro Ser ProLeu Arg Asp Asp Gly Tyr Asp Val Ala Asp Tyr Arg Gly Ile His Pro Asp Leu Gly ThrLeu Asp Asp Phe Lys Val Phe Leu Arg Glu Ala His Ala Arg Gly Leu Arg Val Ile GlyAsp Leu Val Thr Asn His Thr Ser Ser Asp His Pro Trp Phe Gln Ala Ala Arg Arg GlyPro Thr Leu Pro Asp Gly Ser Pro Asn Glu Tyr His Asp Tyr Tyr Val Trp Ser Asp GluGly Lys Glu Tyr Ala Asp Thr Arg Ile Ile Phe Thr Asp Thr Glu Val Ser Asn Trp ThrLeu Asp Glu Gln Ala Gly Lys Tyr Tyr Trp His Arg Phe Phe Ala Ser Gln Pro Asp LeuAsn Tyr Asp Asn Pro Lys Val Val Glu Glu Leu His Gly Ala Ala Arg Phe Trp Leu AspLeu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Val Asp Ala Val Pro Tyr Leu Ile Glu Arg Glu Gly ThrSer Cys Glu Asn Leu Pro Glu Thr His Glu Ile Leu Lys Gly Phe Arg Ala Met Val AspArg Glu Tyr Pro Gly Arg Leu Leu Leu Ala Glu Ala Asn Gln Trp Pro Glu Glu Val ValGlu Tyr Phe Gly Thr Glu Ala Glu Pro Glu Phe His Met Cys Phe Asn Phe Pro Val MetPro Arg Leu Tyr Met Ser Leu Lys Arg Glu Asp Thr Ser Ser Ile Arg Glu Ile Met GlyArg Leu Pro Lys Ile Pro Ser Phe Gly Gln Trp Cys Thr Phe Leu Arg Asn His Asp GluLeu Thr Leu Glu Met Val Thr Asp Asp Glu Arg Ala Phe Met Tyr Ala Ala Tyr Ala ProAsp Ala Arg Met Lys Ile Asn Val Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ala Pro Leu Leu Asp AsnAsp Arg Arg Arg Ile Glu Leu Leu Asn Thr Val Leu Leu Ala Leu Pro Gly Ser Pro IleLeu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Gly Asp Asp Leu Gly Leu Pro Asp Arg Asn GlyVal Arg Thr Pro Met Gln Trp Asn Ala Gly Thr Ser Gly Gly Phe Ser Thr Ala Gln ProSer Asp Cys Phe Phe Pro Pro Ile Gln Asp Pro Val Tyr Gly Phe Gly Arg Val Asn ValGln Ser Gln Leu Gln Asp Pro Ser Ser Leu Leu Lys Trp Thr Ala Arg Gln Leu Glu LeuArg Arg Ala His Pro Ala Phe Ala His Gly Asp Leu Thr Phe Ile Glu Thr Gly Asn ProAla Ile Leu Ala Phe Thr Arg Gln Tyr Asp Gly Glu Thr Leu Leu Ile Val Ser Asn PheAla Gly Asn Ala Gln Ala Gly Leu Leu Asp Leu Ala Pro Phe Val Gly Arg Ala Pro ValThr Leu Ser Gly Ala Ser Pro Leu Pro Val Val Thr Gly Asn Gly Gln Tyr Pro Val ValMet Gly Lys Tyr Asp Tyr Tyr Trp Leu Arg Leu Asn
本發(fā)明與現有技術相比，具有的實質性特點和顯著的進步是1、與日本林原研究所報道的來自Pimerlobacter sp.R48的海藻糖合成酶相比，本發(fā)明的酶的氨基酸個數少了46個，而又比同樣是林原研究所報道的來自水棲嗜熱菌Thermus aquaticus的海藻糖合酶又少412個氨基酸，但催化的又是同一個反應。這是已經鑒定功能分子量最小的海藻糖合成酶，酶的分子少412個氨基酸這意味著小分子的蛋白質更加容易地通過基因重組與表達技術來進行工業(yè)化生產，因而更有市場競爭力。
2、酶的最適反應溫度為30～37℃，工業(yè)化生產中可節(jié)省能源。
3、一些金屬離子，如Cu2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+等二價金屬離子的濃度在5ppm時，該酶的活力不受影響，這樣反應的條件就不受限制。
4、葡萄糖對該酶具有較強的抑制作用。
5、它能夠在正常的生化反應條件下將麥芽糖轉化為海藻糖，該酶的底物轉化率會隨著反應溫度的降低而升高。
具體實施例方式
以下是本發(fā)明的實驗和實例，下述實驗和實例所述內容屬于本發(fā)明的主要內容，但并不僅僅限于這些內容。有些可以顯而易見地擴展的內容雖然并未在本專利說明書中出現，但也應屬于本發(fā)明的專利請求范圍。
實施例1一、海藻糖合成酶基因(treS)的克隆將耐放射性異常球菌(Deinococcus radiodurans)接種于以下液體培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖5，酵母粉(yeast extract)5，蛋白胨(peptone)10，氯化鈉(NaCl)5，pH7.4，然后在30℃恒溫搖床上振蕩24小時，于5000rpm離心10分鐘收集菌體。然后按《分子克隆實驗室手冊(第二版)》(Sambrook，et al.1989，Molecular Cloninga Laboratory Manual)中所述的方法進行耐放射性異常球菌的總DNA提取。
設計以下引物1、上游引物(Sense primer)5-GAGCCATGGCCCAGGCACACCCGGAGTGGT-32、下游引物(Antisense Primer)5-TGGTCTCTGCAGTCAATTCAACCGCAGCCAGTAATAG-3然后按PCR Cloning Protocols中所講的步驟進行94℃60秒，然后進行27個環(huán)徑95℃45秒，55℃60秒，72℃10分鐘。
用Takara的專用試劑盒對PCR產物進行初步純化，然后用NcoI和PstI對PCR產物進行雙酶切，再與同樣用NcoI和PstI酶切過的pSE380質粒連接，獲得重組質粒pSE380-treS。
二、海藻糖合成酶基因(Tres)在大腸桿菌中的表達表達質粒pSE380-treS構建完畢，先轉化DH5α大腸桿菌，大量制備pSE380-treS表達質粒，所得質粒可用一部分用于DNA測序以確認讀碼框的正確性，另一部分則可以用來進行海藻糖合成酶基因表達試驗。
按《分子克隆實驗室手冊》(1989年第二版)所述的方法，制備大腸桿菌BL21的感受態(tài)細胞，然后用pSE380-treS轉化BL21感受態(tài)細胞，于37℃培養(yǎng)10～16小時，然后加入IPTG至終濃度為0.5mM，再繼續(xù)于32℃培養(yǎng)24～36小時。離心收集菌體后，即可進行細胞破碎和重組海藻糖合成酶的提取和底物轉化試驗。
取100ml上述發(fā)酵液，在5000r/min離心10分鐘，用pH6.5的5mM磷酸緩沖液洗滌一次。然后將懸于100ml含有2mg/ml溶菌酶的5mM磷酸緩沖液中，于37℃水溶中進行破胞12小時。于8000r/min離心15分鐘，取上清液1ml，與1ml 30％的麥芽糖溶液混合，置于25℃中反應24小時，還原糖下降至原來的60％，徑HPLC檢測，25℃反應24小時后溶液中含有海藻糖、麥芽糖和葡萄糖的濃度如下

*HPLC檢測樣品稀釋20倍，進樣10μl，30℃、壓力46bar，流動相為乙腈∶水(84∶16)三、從麥芽糖漿制造海藻糖1、基因重組海藻糖合成酶的制備按《分子克隆實驗室手冊》(第二版)所述方法，將連接有海藻糖合成酶基因(序列如表1所示)的表達質粒pSE380-treS轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞。在每毫升含有100微克氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基涂布并分離出單菌落。將單菌落接種到5ml含有10g/L葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，在33℃培養(yǎng)12小時，然后接種到500ml的下述培養(yǎng)基中氨芐青霉素50μg/ml，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉3g/L。在33℃培養(yǎng)13小時，然后用2×500ml種子接種到含20升同樣培養(yǎng)基的40升發(fā)酵罐中。在33℃，200rpm，通風量為0.9vvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)15小時。然后加入終濃度為0.5mM的IPTG進行誘導。再繼續(xù)培養(yǎng)17小時即終止。于5000rmp離心10分鐘以收集菌體。用等體積的去離子水洗滌細胞一次，同樣條件離心后重懸于二分之一體積的細胞破碎液液(含有3mg/ml溶菌酶，1％Triton-X100，0.05mM EDTA，用pH為6.9的磷酸緩沖液配制)中，在37℃振蕩反應20小時，然后在45℃水浴中處理2小時。于3000g離心15分鐘。收集含有重組海藻糖合成酶的上清液。
1、麥芽糖漿轉化為海藻糖取70％的市售麥芽糖漿，加去離子水兌成含30％麥芽糖的溶液。取100升置于200升容積的不銹鋼反應罐中，加入磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配成的緩沖液，使該緩沖液的終濃度為5mM，pH為6.9左右。取上述第1步中制得的海藻糖合成酶10升，加入到100升30％麥芽糖漿中，然后在25℃條件下反應32小時。用高效液相色譜儀(HPLC)如安捷倫Agilent 1100型對反應液進行測定，結果如下來自D.radiodurans的海藻糖合成酶催化麥芽糖轉化為海藻糖

即底物麥芽糖中有57.6％轉化為海藻糖(由于底物濃度是30％/(100升+10升)＝27.27％，總的轉化率便是15.7％/27.27％＝57.6％)。也就是說，在110升總反應體積中共形成了17.28千克海藻糖。
實施例2以木薯淀粉為出發(fā)原料，經α淀粉酶液化后再由β-淀粉酶作用后生成的麥芽糖，將獲得的麥芽糖按實例1進行反應，實驗表明100公斤淀粉可以得到約40公斤的海藻糖，除去淀粉中水份和雜質，轉化效率和利用直接用麥芽糖做底物的轉化效率相同。
權利要求
1.一種新的海藻糖合成酶，其特征在于海藻糖合成酶基因是從耐放射性異常球菌(Deinococcus radiodurans)中獲得。
2.如權利1要求所述的海藻糖合成酶，其特征在于其基因的DNA和氨基酸如下所示D.radiodurans的海藻糖合成酶基因DNA序列ATGACCCAGG CACACCCGGA GTGGTACAAG AGCGCTGTCT TCTACGAACT GTCCGTGCGG ACCTTTCAGGACGGCAACGG CGACGGCAAG GGCGATTTTC CCGGCCTGAC CTCGCGGCTG GACTACCTGA AAAACCTCGGCGTGGACTGC CTGTGGTTGC TGCCCTGGTT TCCCAGCCCA CTGCGCGACG ACGGGTACGA CGTGGCCGACTACCGGGGGA TTCACCCTGA CCTCGGCACG CTCGACGACT TCAAGGTCTT TCTGCGCGAA GCCCACGCCCGGGGCCTGCG GGTCATCGGC GACCTGGTGA CCAACCACAC GTCCAGCGAC CACCCCTGGT TTCAGGCGGCGCGGCGCGGC CCGACCCTGC CCGACGGCTC GCCCAACGAG TACCACGACT ACTACGTCTG GAGCGACGAGGGCAAGGAAT ACGCCGACAC CCGCATCATC TTCACCGACA CCGAGGTCAG CAACTGGACG CTCGACGAGCAGGCAGGCAA GTATTACTGG CACCGCTTTT TCGCCAGCCA GCCGGACCTG AACTACGACA ACCCGAAAGTGGTGGAAGAA CTTCACGGCG CCGCCCGCTT CTGGCTCGAC CTCGGCCTCG ACGGGTTCCG GGTGGACGCCGTGCCCTACC TCATCGAGCG CGAGGGCACG AGCTGCGAGA ATCTGCCCGA AACACACGAG ATTCTCAAGGGCTTCCGGGC GATGGTGGAC CGCGAGTATC CGGGGCGGCT GCTGCTTGCC GAGGCGAACC AGTGGCCCGAGGAAGTCGTC GAGTACTTCG GCACCGAAGC CGAGCCCGAG TTCCACATGT GCTTCAACTT CCCGGTGATGCCCCGGCTGT ACATGAGCCT GAAAAGGGAG GACACCTCCA GCATCCGCGA GATCATGGGC CGCCTGCCGAAAATCCCGAG TTTCGGCCAG TGGTGCACCT TCCTGCGCAA CCACGACGAA CTGACGCTGG AAATGGTCACCGACGACGAG CGCGCCTTCA TGTATGCCGC CTACGCGCCC GACGCCCGCA TGAAAATCAA CGTGGGCATCCGCCGTCGCC TCGCGCCGCT GCTCGACAAC GACCGGCGCC GCATCGAGCT GCTGAACACT GTGCTCCTCGCCCTGCCCGG CAGCCCCATC CTGTACTACG GCGACGAAAT CGGCATGGGC GACGACCTCG GCCTGCCCGACCGCAACGGC GTGCGCACCC CGATGCAGTG GAACGCGGGC ACCAGCGGCG GTTTTTCCAC TGCGCAGCCCTCCGACTGCT TTTTCCCGCC GATTCAGGAC CCGGTGTACG GCTTCGGGCG CGTCAACGTG CAGAGCCAGCTCCAAGACCC CAGCAGCCTG CTGAAGTGGA CCGCCCGGCA ACTCGAACTG CGCCGCGCCC ACCCCGCCTTTGCGCACGGC GACCTCACCT TCATCGAAAC CGGCAACCCC GCCATCCTCG CCTTTACCCG CCAGTACGACGGCGAAACGC TGCTCATCGT CAGCAACTTC GCGGGCAACG CCCAGGCCGG GCTGCTCGAT CTCGCGCCCTTCGTGGGCCG CGCCCCGGTC ACACTTTCCG GGGCCAGCCC GCTGCCGGTG GTCACTGGAA ACGGCCAGTACCCGGTGGTG ATGGGCAAGT ACGACTATTA CTGGCTGCGG TTGAATTGAD.radiodurans的海藻糖合成酶基因的氨基酸序列Met Thr Gln Ala His Pro Glu Trp Tyr Lys Ser Ala Val Phe Tyr Glu Leu Ser Val ArgThr Phe Gln Asp Gly Asn Gly Asp Gly Lys Gly Asp Phe Pro Gly Leu Thr Ser Arg LeuAsp Tyr Leu Lys Asn Leu Gly Val Asp Cys Leu Trp Leu Leu Pro Trp Phe Pro Ser ProLeu Arg Asp Asp Gly Tyr Asp Val Ala Asp Tyr Arg Gly Ile His Pro Asp Leu Gly ThrLeu Asp Asp Phe Lys Val Phe Leu Arg Glu Ala His Ala Arg Gly Leu Arg Val Ile GlyAsp Leu Val Thr Asn His Thr Ser Ser Asp His Pro Trp Phe Gln Ala Ala Arg Arg GlyPro Thr Leu Pro Asp Gly Ser Pro Asn Glu Tyr His Asp Tyr Tyr Val Trp Ser Asp GluGly Lys Glu Tyr Ala Asp Thr Arg Ile Ile Phe Thr Asp Thr Glu Val Ser Asn Trp ThrLeu Asp Glu Gln Ala Gly Lys Tyr Tyr Trp His Arg Phe Phe Ala Ser Gln Pro Asp LeuAsn Tyr Asp Asn Pro Lys Val Val Glu Glu Leu His Gly Ala Ala Arg Phe Trp Leu AspLeu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Val Asp Ala Val Pro Tyr Leu Ile Glu Arg Glu Gly ThrSer Cys Glu Asn Leu Pro Glu Thr His Glu Ile Leu Lys Gly Phe Arg Ala Met Val AspArg Glu Tyr Pro Gly Arg Leu Leu Leu Ala Glu Ala Asn Gln Trp Pro Glu Glu Val ValGlu Tyr Phe Gly Thr Glu Ala Glu Pro Glu Phe His Met Cys Phe Asn Phe Pro Val MetPro Arg Leu Tyr Met Ser Leu Lys Arg Glu Asp Thr Ser Ser Ile Arg Glu Ile Met GlyArg Leu Pro Lys Ile Pro Ser Phe Gly Gln Trp Cys Thr Phe Leu Arg Asn His Asp GluLeu Thr Leu Glu Met Val Thr Asp Asp Glu Arg Ala Phe Met Tyr Ala Ala Tyr Ala ProAsp Ala Arg Met Lys Ile Asn Val Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ala Pro Leu Leu Asp AsnAsp Arg Arg Arg Ile Glu Leu Leu Asn Thr Val Leu Leu Ala Leu Pro Gly Ser Pro IleLeu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Gly Asp Asp Leu Gly Leu Pro Asp Arg Asn GlyVal Arg Thr Pro Met Gln Trp Asn Ala Gly Thr Ser Gly Gly Phe Ser Thr Ala Gln ProSer Asp Cys Phe Phe Pro Pro Ile Gln Asp Pro Val Tyr Gly Phe Gly Arg Val Asn ValGln Ser Gln Leu Gln Asp Pro Ser Ser Leu Leu Lys Trp Thr Ala Arg Gln Leu Glu LeuArg Arg Ala His Pro Ala Phe Ala His Gly Asp Leu Thr Phe Ile Glu Thr Gly Asn ProAla Ile Leu Ala Phe Thr Arg Gln Tyr Asp Gly Glu Thr Leu Leu Ile Val Ser Asn PheAla Gly Asn Ala Gln Ala Gly Leu Leu Asp Leu Ala Pro Phe Val Gly Arg Ala Pro ValThr Leu Ser Gly Ala Ser Pro Leu Pro Val Val Thr Gly Asn Gly Gln Tyr Pro Val ValMet Gly Lys Tyr Asp Tyr Tyr Trp Leu Arg Leu Asn
3.如權利要求1所述的海藻糖合成酶，其特征在于分子量為62.8kD；等電點約為PI＝4.9；酶的最適反應溫度為30～37℃；酶的最適反應的pH是7.0～7.5；pH在6.5～8.5范圍內，酶的活力均表現為較高；當Cu2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+等二價金屬離子的濃度在5ppm時，該酶的活力不受影響；海藻糖合成酶在以麥芽糖漿為底物時，可催化底物生成40～70％的海藻糖；該海藻糖合成酶在以麥芽糖為底物時，除了催化生成海藻糖外，同時還合成高達5～15％的葡萄糖；葡萄糖對該酶的轉化律有較強的抑制作用。
4.如權利要求1所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法，其特征在于包括以下工藝步驟1)對選定的菌種接種進行擴大培養(yǎng)；2)從所獲得的擴大菌種中克隆海藻糖合成酶基因；3)將海藻糖合成酶基因在大腸桿菌中表達；4)收集含有重組海藻糖合成酶；5)以麥芽糖漿或淀粉漿為原料，用海藻糖合成酶再制造海藻糖，所述的淀粉漿可以選用玉米淀粉、大米淀粉、小麥淀粉、木薯淀粉、馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉與水配成的淀粉溶液，優(yōu)選大米淀粉和木薯淀粉。
5.根據權利要求4所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法，其特征在于對選定的菌種接種進行擴大培養(yǎng)的工藝是將耐放射性異常球菌(Deinococcus radiodurans)接種于以下葡萄糖5克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，pH7.4，然后在30℃恒溫搖床上振蕩24小時，于5000rpm離心10分鐘收集菌體提取DNA。
6.根據權利要求4所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法，其特征在于從所獲得的耐放射性異常球菌中克隆海藻糖合成酶基因的工藝是先設計以下引物1、上游引物5-GAGCCATGGCCCAGGCACACCCGGAGTGGT-3；2、下游引物5-TGGTCTCTGCAGTCAATTCAACCGCAGCCAGTAATAG-3，然后用聚合酶鏈式反應技術獲得目的基因，用Takara的專用試劑盒對PCR產物進行初步純化，然后用NcoI和PstI對PCR產物進行雙酶切，再與同樣用NcoI和PstI酶切過的pSE380質粒連接，待表達質粒pSE380-treS。
7.根據權利要求4所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法，其特征在于將海藻糖合成酶基因在大腸桿菌中表達的工藝是制備大腸桿菌BL21的感受態(tài)細胞，然后用重組質粒pSE380-treS轉化BL21感受態(tài)細胞，于30-37℃培養(yǎng)10～16小時，然后加入IPTG至終濃度為0.5mM，再繼續(xù)于28-32℃培養(yǎng)24～36小時，離心收集菌體后，即可進行細胞破碎和重組海藻糖合成酶的提取和底物轉化試驗。
8.根據權利要求4所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法，其特征在于收集含有重組海藻糖合成酶的工藝是將轉化試驗合格的大腸桿菌菌體接種到500ml的下述培養(yǎng)基中氨芐青霉素50μg/ml，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉3g/L，在33℃培養(yǎng)13小時，然后用2×500ml種子接種到含20升同樣培養(yǎng)基的40升發(fā)酵罐中，在33℃，200rpm，通風量為0.9vvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)15小時，然后加入終濃度為0.5mM的IPTG進行誘導，再繼續(xù)培養(yǎng)17小時即終止，于5000rmp離心10分鐘以收集菌體，用等體積的去離子水洗滌細胞一次，同樣條件離心后重懸于二分之一體積的含有3mg/ml溶菌酶，1％Triton-X100，0.05mM EDTA，用pH為6.9的磷酸緩沖液配制的細胞破碎液中，在37℃振蕩反應20小時，然后在45℃水浴中處理2小時，于3000g離心15分鐘，收集上清液得到重組海藻糖合成酶。
9.根據權利要求4所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法，其特征在于用重組海藻糖合成酶制造海藻糖的工藝是以麥芽糖漿或淀粉漿為原料，先加去離子水兌成含30％的溶液。取100升置于200升容積的不銹鋼反應罐中，加入磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配成的緩沖液，使該緩沖液的終濃度為5mM，pH為6.9左右，取上述第1步中制得的海藻糖合成酶10升，加入到100升30％麥芽糖漿或淀粉漿中，然后在25-30℃條件下反應24-36小時，用高效液相色譜儀(HPLC)如安捷倫Agilent 1100型對反應液進行測定其海藻糖含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種全新的海藻糖合成酶基因的克隆及其在相關宿主中的表達，該酶的基因克隆自耐放射性異常球(Deinococcus radioduran)菌，它能夠在正常的生化反應條件下將麥芽糖轉化為海藻糖，該酶的底物轉化率會隨著反應溫度的降低而升高，它可以利用麥芽糖或淀粉為原料，再由克隆得到的酶轉化為α，α－1，1－海藻糖。這種海藻糖可應用于食品工業(yè)，海產品冷藏以及藥物的活性保持等領域。
文檔編號C12N15/61GK1570098SQ200410013008
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月8日 優(yōu)先權日2004年4月8日
發(fā)明者韋宇拓, 黃日波, 蒙健宗, 盧福燊, 龐中文, 朱綺霞, 陳發(fā)忠, 羅兆飛, 盧運琨, 王青艷, 黃鯤 申請人:南寧中諾生物工程有限責任公司