專利名稱：蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的和/或相對(duì)不受銅影響的某些種類的絲氨酸蛋白酶，以及涉及編碼這些蛋白酶的DNA、其重組生產(chǎn)，及其在動(dòng)物飼料和清潔劑(detergent)中的用途。
背景技術(shù)：
Steven E.Screen和Raymond J.St.Leger在The Journal of BiologicalChemistry，Vol.275，No.9，2000，第6689-6694頁(yè)中公開了來(lái)源于金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)的蛋白酶的克隆和表達(dá)。序列表中SEQ ID NO3顯示了其核苷酸序列chyl，SEQ ID NO4(TREMBLQ9Y843)顯示了推導(dǎo)的氨基酸序列CHY1。
在WO 88/03947中描述了來(lái)源于擬諾卡氏菌種NRRL 18262和達(dá)松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)NRRL 18133的蛋白酶。在丹麥專利申請(qǐng)?zhí)?996 00013中顯示了來(lái)源于擬諾卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶的DNA和氨基酸序列。WO 01/58276描述了與來(lái)源于擬諾卡氏菌NRRL no.18262的蛋白酶相關(guān)的酸穩(wěn)定蛋白酶在動(dòng)物飼料中的用途。JP 2255081A描述了從擬諾卡氏菌FERM P-1-508純化的蛋白酶。德國(guó)專利號(hào)DD 2,004,328公開了來(lái)源于達(dá)松維爾擬諾卡氏菌ZIMET 43647的蛋白酶。
本發(fā)明的目的是提供用于各種工業(yè)用途，例如用于動(dòng)物飼料和/或清潔劑中的備選蛋白酶。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及肽酶家族S2A或S1E的蛋白酶，其i)在pH7和25℃，在補(bǔ)充有0.1％K-Sorbate的分析緩沖液中，并且在存在1mM的Cu2+時(shí)培養(yǎng)164小時(shí)后，測(cè)量的殘余活性相對(duì)于培養(yǎng)0小時(shí)后的活性，具有至少0.80的殘余活性；和/或ii)相對(duì)于沒有Cu2+的對(duì)照，在存在1mM的Cu2+時(shí)，具有至少0.66的相對(duì)活性；其中i)和ii)的活性測(cè)量是在pH7.0和25℃，在分析緩沖液中，在底物Suc-AAPF-pNA上測(cè)量的；并且其中對(duì)于i)的測(cè)量值，蛋白酶具有經(jīng)SDS-PAGE確定的至少90％的純度。
本發(fā)明也涉及編碼這種蛋白酶的分離核酸序列和包括該核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體、和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)和利用該蛋白酶的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是來(lái)源于擬諾卡氏菌NRRL 18262(蛋白酶10，SEQ ID NO2的第1-188位氨基酸)、金龜子綠僵菌(綠僵菌蛋白酶、SEQ ID NO4的第1-188位氨基酸)、Nocardiopsis prasina DSM 15648(蛋白酶11，SEQ ID NO6的第1-188位氨基酸)、Nocardiopsis prasina DSM 15649(蛋白酶35，SEQ ID NO8的第1-188位氨基酸)、Nocardiopsis alba DSM 15647(蛋白酶08，SEQ IDNO12的第1-188位氨基酸)、和Brachysporiella gayana CGMCC 0865(Brachysporiella蛋白酶，SEQ ID NO14的第1-186位氨基酸)的蛋白酶的成熟肽部分的多個(gè)序列對(duì)比。
發(fā)明詳述在標(biāo)題為″具有蛋白酶活性的多肽″中包括了肽酶家族S2A和S1E的絲氨酸蛋白酶的說(shuō)明。
存在銅時(shí)的穩(wěn)定性和抑制本發(fā)明涉及i)在存在Cu2+時(shí)相對(duì)穩(wěn)定的蛋白酶，和/或ii)被Cu2+抑制到相對(duì)低程度的蛋白酶。
確定特性i)為在pH7和25℃，在補(bǔ)充有0.1％K-山梨酸(Sorbate)(為了保存目的)的分析緩沖液中，和在存在1mM Cu2+時(shí)已經(jīng)孵育164小時(shí)后的殘余(＝靜止，或剩余)酶活性。相對(duì)于孵育0小時(shí)后的活性測(cè)量殘余活性。對(duì)于本發(fā)明的蛋白酶，殘余活性是至少0.80(＝80％)。
利用底物Suc-AAPF-pNA，在pH7.0和25℃，在分析緩沖液中測(cè)量蛋白酶活性。為了更詳細(xì)地說(shuō)明，請(qǐng)參閱在實(shí)施例4中描述的pNA分析，其也詳細(xì)描述了i)和ii)所述的測(cè)定。
目前預(yù)期測(cè)試蛋白酶的純度可能影響這些穩(wěn)定性結(jié)果，因此當(dāng)分析i)所述的穩(wěn)定性時(shí)，優(yōu)選蛋白酶經(jīng)SDS-PAGE測(cè)量是至少90％純的。在實(shí)施例2中公開了經(jīng)SDS-PAGE確定純度的方法。在特定的實(shí)施方案中，SDS-PAGE純度是至少91％、92％、93％、94％或至少95％。在可選的實(shí)施方案中，特別是為了測(cè)試i)的目的，吸光率純度(參見實(shí)施例3)，相應(yīng)于A280/A260比率至少為1.40、或至少1.42、1.44、1.46、1.48、1.50、1.60、或至少1.70。
確定特性ii)為在存在1mM Cu2+時(shí)，相對(duì)于在除了存在Cu2+以外的相同條件下相同酶的活性的酶活性。對(duì)于本發(fā)明的蛋白酶，這個(gè)相對(duì)活性是至少0.66(＝66％)。為了特性ii)的目的)，如上所述測(cè)量酶(蛋白酶)活性。
在本發(fā)明蛋白酶的特定實(shí)施方案中，i)所述的殘余活性是至少0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、或至少0.97。
在可選的實(shí)施方案中，i)所述的殘余活性是至少0.76、0.77、0.78、或0.79。在其它可選的實(shí)施方案中，在孵育116小時(shí)后確定i)所述的殘余活性，而在這種情況下本發(fā)明蛋白酶的殘余活性是至少0.84，具有如上列的相同優(yōu)選范圍(至少0.85或以上)。在更進(jìn)一步的備選實(shí)施方案中，在孵育188.6小時(shí)后確定i)所述的殘余活性，而在這種情況下本發(fā)明蛋白酶的殘余活性是至少0.73，具有如上列的相同優(yōu)選范圍(至少0.76以上，加下列或至少0.74，或至少0.75以上)。
在本發(fā)明蛋白酶的另一組特定的實(shí)施方案中，ii)所述的相對(duì)活性是至少0.67、0.68、0.69、0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、或至少0.82。
在可選的實(shí)施方案中，使用底物Boc-VLGR-pNA代替Suc-AAPF-pNa用于i)和/或ii)所述的活性測(cè)量。
特性i)和ii)所述穩(wěn)定性和抑制的研究結(jié)果分別顯示在實(shí)施例4的表2和1中。從這些表格看出，顯然標(biāo)明為蛋白酶18和Brachysporiella蛋白酶的蛋白酶，是唯一滿足特性i)的測(cè)試蛋白酶，而所有的測(cè)試蛋白酶都滿足特性ii)，除了已知的標(biāo)明為蛋白酶10和綠僵菌蛋白酶的蛋白酶。
對(duì)表1的更近觀察顯示蛋白酶18和蛋白酶08形成在存在銅時(shí)具有明顯更高的相對(duì)活性的極有趣的亞群(兩者的相對(duì)活性都超過(guò)0.80)。然而，Brachysporiella蛋白酶也很好(接近0.70的相對(duì)活性)。這意味著2個(gè)測(cè)試i)和ii)鑒定出這3種蛋白酶是特別有興趣的。
在轉(zhuǎn)而考慮可解釋所觀察到的影響的潛在結(jié)構(gòu)成分前，在此首先考慮計(jì)算多種測(cè)試蛋白酶中氨基酸殘基數(shù)目的一些原則，和如何推斷多種骨架中相應(yīng)氨基酸殘基的指導(dǎo)。
氨基酸殘基編號(hào)在本文中，為了鑒定多種蛋白酶中相應(yīng)氨基酸殘基的目的，必須參考SEQ ID NO2，蛋白酶10從A1開始到T188結(jié)束的成熟部分(第1-188位氨基酸)氨基酸殘基的編號(hào)。圖1顯示在10個(gè)殘基的序列對(duì)比串中，即在序列對(duì)比的上面行中，每個(gè)這種串的最后氨基酸殘基的編號(hào)。例如，編號(hào)″10″是指在這第一串的10個(gè)殘基中，蛋白酶10的最后氨基酸殘基，″T″是成熟蛋白酶10氨基酸序列中編號(hào)10的氨基酸殘基。作為另一個(gè)實(shí)例，編號(hào)″145″是指在圖1序列對(duì)比第三行殘基的這最后串中，蛋白酶10的最后氨基酸殘基，其為″G″，是成熟蛋白酶10氨基酸序列中編號(hào)145的殘基。這個(gè)編號(hào)與SEQ ID NO2的數(shù)目相同，然而不一定與SEQID NOs4、6、8、10、12和14的數(shù)目相同，原因是為了鑒定多種蛋白酶中相應(yīng)氨基酸殘基的目的，根據(jù)蛋白酶10使用統(tǒng)一的編號(hào)。如下進(jìn)一步描述指定統(tǒng)一編號(hào)的方法。
對(duì)于蛋白酶10的每一氨基酸殘基，可在圖1顯示的其它6種蛋白酶的每一個(gè)中鑒定″相應(yīng)″的殘基，因?yàn)椤逑鄳?yīng)″的殘基只不過(guò)是在圖1的序列對(duì)比中置于另一個(gè)上面，或相互可放置在另一個(gè)上(on top of each other)的殘基。例如，蛋白酶10的第10個(gè)氨基酸殘基T(SEQ ID NO2的T10)相應(yīng)于SEQ IDNOs4和12的Y10；相應(yīng)于SEQ ID NOs6、8和10的T10；以及SEQ ID NO14的V8。然而在本文中，除了為了序列表的目的外，全部指定這些殘基為相同的編號(hào)，因?yàn)橄薅ㄋ鼈優(yōu)椤逑鄳?yīng)的殘基″，并且指定的編號(hào)是蛋白酶10中相應(yīng)殘基的編號(hào)，即殘基編號(hào)10。因此，蛋白酶10的T10分別相應(yīng)于綠僵菌蛋白酶、蛋白酶11，蛋白酶35、蛋白酶08、蛋白酶18、和Brachysporiella蛋白酶的Y10、T10、T10、T10、Y10和V10。當(dāng)無(wú)另外說(shuō)明時(shí)，在下文中使用這個(gè)編號(hào)。
圖1的多重序列對(duì)比，在某些行中，在某些位置，包括缺口，其可被認(rèn)為是氨基酸殘基的缺失。在本文中，通過(guò)按字母順序指定每個(gè)缺口為小寫字母來(lái)編號(hào)缺口或缺失的氨基酸殘基，即a、b、c、d-----t、u、v、x、y，z。將需要25個(gè)以上的這種標(biāo)示，編號(hào)將繼續(xù)為aa、bb、cc等。例如，蛋白酶10的G12和G13之間的缺口相應(yīng)于在位置12a和12b的2個(gè)氨基酸殘基的缺失。因此，指定圖1的第二行中顯示的綠僵菌蛋白酶(SEQ ID NO4)中的相應(yīng)殘基為R12a和S12b。以此類推，相應(yīng)于蛋白酶10的第57-60位中FPGN的綠僵菌蛋白酶中的FPGSA連續(xù)氨基酸殘基編號(hào)如下F57、P58、G59、S59a和A60；位置59a相當(dāng)于在蛋白酶10中缺失1個(gè)氨基酸。
圖1的序列對(duì)比中包括的2種蛋白酶，即綠僵菌蛋白酶和Brachysporiella蛋白酶，與蛋白酶10相比包括C-末端延伸。這種延伸的氨基酸通常在本領(lǐng)域中編號(hào)為從號(hào)碼188延伸，即189、190、191等。例如，綠僵菌蛋白酶的最后氨基酸指定為A189。
可向圖1的序列對(duì)比加入的另一個(gè)具有SEQ ID NOX成熟肽部分的氨基酸序列的蛋白酶如下如下所述利用″Align″程序確定SEQ ID NOX與圖1的7種蛋白酶(每一個(gè)SEQ ID NOs2、4、6、8、10、12和14的成熟肽部分)的同一性的百分比。由此產(chǎn)生7個(gè)成對(duì)的序列對(duì)比。選擇與SEQ ID NOX具有最高程度同一性的序列作為模型蛋白酶。如果存在更多候選的模型蛋白酶，選擇在圖1序列對(duì)比中列在第一的蛋白酶。如果，例如，SEQ ID NOX與SEQ ID NOs2、4，6、8、10、12、和14分別具有下列百分比的同一性45％、55％、50％、65％、65％、45％和40％，則應(yīng)選擇SEQ ID NO8作為模型蛋白酶。下一步是利用SEQ ID NOX與SEQ ID NO8的成對(duì)序列對(duì)比，將SEQ ID NOX粘貼(或可簡(jiǎn)單地寫入)到圖1的序列對(duì)比上作為底端行，確保相應(yīng)的氨基酸殘基(在此″相應(yīng)的″是指SEQ ID NOX和SEQ ID NO8的成對(duì)序列對(duì)比)放置在彼此上下。
當(dāng)圖1的序列對(duì)比保持不受加入新序列的這個(gè)步驟的影響時(shí)，與圖1的蛋白酶10相比，所述的方法可能在SEQ ID NOX中產(chǎn)生缺口；在SEQ ID NOX中產(chǎn)生″環(huán)″，和/或產(chǎn)生SEQ ID NOX的N-或C-末端延伸。
關(guān)于這種位置的編號(hào)，為了鑒定SEQ ID NOX中相應(yīng)的氨基酸殘基，如上所述處理缺口和C-末端延伸。如果有N-末端延伸，通常在本領(lǐng)域中編號(hào)為，-1、-2、-3等(″-″意味著″負(fù)的″)。例如，當(dāng)加入圖1的序列對(duì)比時(shí)，如果SEQ ID NOX是從位于蛋白酶10N-末端氨基酸A1之前的ALI序列開始的，這些可分別編號(hào)為A-3、L-2和I-1。如果有環(huán)，這相當(dāng)于SEQ IDNOX具有″多余的″氨基酸殘基，其使得圖1的序列對(duì)比不能留出空間。印刷上地，將這些多余的殘基轉(zhuǎn)移到下一行上，但是當(dāng)然認(rèn)為它們包括在多重序列對(duì)比中，并且以此類推其編號(hào)為如上所述的用于缺口染色的編號(hào)(利用標(biāo)示a、b、c等)。例如，SEQ ID NOX和SEQ ID NO8的成對(duì)序列對(duì)比可包括下列部分(SEQ ID NO8的部分)FAAT-----NAAGQP(SEQ ID NOX的部分)YAVSCRTAKNAACQP，蛋白酶08(SEQ ID NO8)的氨基酸殘基FAATNAAGQP具有序列對(duì)比編號(hào)19至28，而在成對(duì)序列對(duì)比中這些可相應(yīng)地轉(zhuǎn)為SEQ ID NOX的下列氨基酸殘基YAVSCRTAKNAACQP。為此目的，SEQ ID NOX的氨基酸殘基將如下編號(hào)Y19、A20，V21、S22、C22a、R22b、T22c、A22d、K22e、N23A24、A25、C26、Q27、和P28。
在圖1的序列對(duì)比中，這可書寫如下(SEQ ID NO8的部分)FAATNAAGQP(SEQ ID NOX的部分)YAVSNAACQP，CRTAK 22e在特定的備選實(shí)施方案中，利用SEQ ID NOs2、4、6、8、10、12和14的完全CDS部分(包括向成熟肽部分加入任何信號(hào)肽部分，和/或前肽部分)產(chǎn)生相當(dāng)于上述的成對(duì)序列對(duì)比。
下列是在此用于表征蛋白酶的注明的實(shí)施例表示如下″包括氨基酸序列的蛋白酶，當(dāng)根據(jù)圖1排列時(shí)，該氨基酸序列包括V166，其中氨基酸殘基的編號(hào)相應(yīng)于蛋白酶10(SEQ ID NO2的第1-188位氨基酸)的編號(hào)″意味著當(dāng)加入到如上所述的圖1的多重序列對(duì)比時(shí)，該蛋白酶的氨基酸序列在編號(hào)166的位置(是指如上所述推斷的序列對(duì)比編號(hào))具有V。
使用類似″至少一個(gè)的(L114或Y114)；(S121或D121)；(Q130或M130)；(N162或T162或S162)；(S163或R163)；E174；和/或(S177或E177)″的表示，通過(guò)分號(hào)(；)分開，說(shuō)明蛋白酶滿足任何一個(gè)(至少一個(gè))的標(biāo)準(zhǔn)。這個(gè)情況是例如，用于具有Y114、或S121、或M130、或E174的蛋白酶，并且也用于具有L114和D121的蛋白酶。
使用類似″一種蛋白酶，包括下列至少一個(gè)a)(T120+R122+T127+Y129)、(T120+N122+P127+F129)、或(T120+S122+T127+Q129)；和/或b)(T91+T176+1179+N180)、(S91+N176+L179+E180)、或(S91+N176+L179+S180)″的表示，通過(guò)6個(gè)括號(hào)的至少一個(gè)內(nèi)的加號(hào)(+)分開，說(shuō)明滿足所有標(biāo)準(zhǔn)的蛋白酶。這個(gè)情況是例如，用于具有T120、R122、T127和Y129的蛋白酶18((a)中的第一個(gè)括號(hào))。這個(gè)蛋白酶，同時(shí)也包括T91、T176、I179和N180((b)中的第一括號(hào))。
使用類似″(H35+D61+S143)″的表示說(shuō)明包括H35、D61和S143(活性位點(diǎn)氨基酸殘基)的蛋白酶。
關(guān)于Cu的結(jié)構(gòu)性因素本發(fā)明關(guān)于銅對(duì)多種測(cè)試酶的不同影響的驚奇發(fā)現(xiàn)已經(jīng)引起了關(guān)于確定可能解釋所觀察到的差異結(jié)構(gòu)成分的一些研究。鑒定了2個(gè)潛在的銅結(jié)合位點(diǎn)(如下列表格所示的位點(diǎn)號(hào)I和II)，其中預(yù)期位點(diǎn)號(hào)I是最重要的位點(diǎn)
上述表格中，將雙線(＝)放置在那些相對(duì)不受銅影響的蛋白酶，和受到銅的更多負(fù)影響的蛋白酶之間(分別在雙線上下的蛋白酶)。
從這個(gè)表格顯示似乎下列組合的位點(diǎn)號(hào)I的殘基對(duì)于通過(guò)銅達(dá)到的高穩(wěn)定性和/或低抑制是不利的a)(T120+N122+A127+S129)，和b)(S120+S122+T127+T129)。
以此類推，位點(diǎn)號(hào)II的殘基的下列組合也可能是不利的a)(S91+N176+L179+Q180)，和b)(H91+T176+V179+N180)。
另一方面，位點(diǎn)號(hào)I和II的殘基的下列組合似乎是有利的
a)(T120+R122+T127+Y129)、(T120+N122+P127+F129)、或(T120+S122+T127+Q129)；和/或b)(T91+T176+1179+N180)、(S91+N176+L179+E180)、或(S91+N176+L179+S180)。
可能促進(jìn)解釋所觀察到的差異結(jié)構(gòu)性的其它殘基是在第51、54、86、89、99、125、130、131、135、165和166位的殘基。因此，在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶不包括下列殘基的任何組合a)(V51+Q54+A86+A89+S99+E125+N130+M131+T135+R165+T166)，也不包括b)(T51+G54+P86+S89+S99+Q125+S130+L131+S135+S165+R166)。另一方面，在附加的特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶包括下列的至少一個(gè)T51；N54或G54；Q86或P86；T89或F89；A99或G99；Q125或V125；S130或G130；L131；N135或S135；S165或T165；V166或S166。措詞″至少一個(gè)″意味著1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或所有的這11個(gè)殘基的組合。為了本發(fā)明的目的，″至少一個(gè)″的定義一般是以此類推可適用的。
在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明明確地涉及在這個(gè)小節(jié)中所限定的蛋白酶，其沒有如權(quán)利要求1提出的功能性特征i)和ii)，優(yōu)選為肽酶家族S2A或S1E的蛋白酶。
具有蛋白酶活性的多肽具有蛋白酶活性的多肽，或蛋白酶，有時(shí)也指明為肽酶、蛋白酶、肽水解酶、或蛋白水解酶。蛋白酶可能具有起始于其末端的水解肽的外型，或在多肽鏈中內(nèi)部起作用的內(nèi)型(內(nèi)肽酶)。內(nèi)肽酶顯示在N-和C-末端上阻斷與所述的蛋白酶特異性相關(guān)的肽底物的活性。
在此限定術(shù)語(yǔ)″蛋白酶″作為水解肽鍵的酶。它包括屬于EC 3.4酶小組的任何酶(包括其13個(gè)亞類的每一類)。EC號(hào)碼是指來(lái)自NC-IUBMB，Academic Press，San Diego，加利福尼亞的酶命名法1992，包括分別刊登于Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250，1-6；和Eur.J.Biochem.1999，264，610-650的附錄1-5。有規(guī)律地補(bǔ)充和更新該命名法；參見例如萬(wàn)維網(wǎng)(WWW)http//www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html)。
根據(jù)其催化機(jī)理將蛋白酶分為下列小組絲氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金屬蛋白酶(M)、以及未知的或至今未分類的蛋白酶(U)、參見Handbook of Proteolytic Enzymes，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.F.Woessner(編輯)，Academic Press(1998)，特別是綜合導(dǎo)言部分。
本發(fā)明的蛋白酶選自(a)上述手冊(cè)所述的肽酶家族S2A的絲氨酸蛋白酶；和(b)肽酶家族S1E的絲氨酸蛋白酶，其在Biochem.J.290205-218(1993)和2003年3月24日的MEROPS蛋白酶數(shù)據(jù)庫(kù)，版本(release)6.20(www.merops.ac.uk)中有描述。該數(shù)據(jù)庫(kù)在Rawlings，N.D.，O′Brien，E.A.& Barrett，A.J.(2002)MEROPSthe protease database.Nucleic Acids Res.30，343-346中有描述。
肽酶家族S2A代表分類蛋白酶的傳統(tǒng)方式?，F(xiàn)在，經(jīng)常將傳統(tǒng)上分類為S2A蛋白酶的蛋白酶根據(jù)MEROPS分類法在肽酶家族S1E中進(jìn)行分類。
在特定的實(shí)施方案中，蛋白酶屬于肽酶家族S2A。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，蛋白酶屬于肽酶家族S1E。
在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶選自(c)屬于EC 3.4.-.-酶小組的蛋白酶；和(d)屬于上述手冊(cè)S組的絲氨酸蛋白酶；為了確定給出的蛋白酶是否是絲氨酸蛋白酶、S2A蛋白酶家族、和/或S1E蛋白酶家族，參考上述參考文獻(xiàn)和其中表明的原則?？蓪?duì)所有類型的蛋白酶、天然存在或野生型的蛋白酶、或遺傳工程化或合成的蛋白酶進(jìn)行這種確定。
可利用任何分析測(cè)量蛋白酶活性，其中使用底物，包括與所述蛋白酶的特異性相關(guān)的肽鍵。pH-分析和溫度-分析同樣適于所述的蛋白酶。分析-pH-值的實(shí)例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。分析-溫度的實(shí)例是20、25、30、35、37、40、45、50、55、60、65、70或80℃。
蛋白酶底物的實(shí)例是酪蛋白，例如天青精-交聯(lián)(Azurine-crosslinked)的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)。為了本發(fā)明的目的，所謂的pNA分析是優(yōu)選的分析，并且優(yōu)選的底物是Suc-AAPF-pNA。
對(duì)于本發(fā)明的蛋白酶的起源沒有限制。因此，術(shù)語(yǔ)蛋白酶不僅包括獲得自任何種屬微生物的天然或野生型的蛋白酶，并且包括顯示蛋白酶活性的其任何突變體、變體、片段等，以及合成的蛋白酶，例如改組的蛋白酶和共序列(consensus)蛋白酶。可根據(jù)本領(lǐng)域普遍已知的，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變、通過(guò)PCR(利用包含所需突變的PCR片段作為PCR反應(yīng)中的引物)、通過(guò)改組、或通過(guò)隨機(jī)誘變制備這種遺傳工程化的蛋白酶。共有序列蛋白質(zhì)的制劑在例如EP 897985中有描述。如在此使用的與給定來(lái)源有關(guān)的術(shù)語(yǔ)″獲得自″是指由核酸序列編碼的多肽是由來(lái)源或由其中存在來(lái)自該來(lái)源的核酸序列的細(xì)胞產(chǎn)生的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽是細(xì)胞外分泌的。
在特異的實(shí)施方案中，蛋白酶是低-過(guò)敏原的變體，設(shè)計(jì)成當(dāng)暴露于動(dòng)物，包括人時(shí)，能產(chǎn)生減小的免疫反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)免疫反應(yīng)可理解為經(jīng)暴露于蛋白酶的動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的任何反應(yīng)。免疫反應(yīng)的一個(gè)類型是在接觸的動(dòng)物中導(dǎo)致IgE水平增加的變態(tài)反應(yīng)?？衫帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)制備低-過(guò)敏原的變體。例如蛋白酶可與保護(hù)部分的聚合體部分或涉及免疫應(yīng)答的蛋白酶表位結(jié)合。與聚合體的結(jié)合作用可能涉及聚合體與蛋白酶的體外化學(xué)偶聯(lián)，例如在WO 96/17929、WO 98/30682、WO 98/35026和/或WO 99/00489所描述的。此外或備選地，結(jié)合作用可能另外涉及聚合體與蛋白酶的體內(nèi)偶聯(lián)。可通過(guò)編碼蛋白酶的核苷酸序列的遺傳工程，在蛋白酶中插入編碼附加糖基化位點(diǎn)的共有序列，并且在能夠糖基化蛋白酶的宿主中表達(dá)蛋白酶而獲得這種結(jié)合作用，參見例如WO 00/26354。提供低過(guò)敏原變體的另一個(gè)方法是遺傳工程化編碼蛋白酶的核苷酸序列以導(dǎo)致蛋白酶自我寡聚化，影響可能遮蔽其它蛋白酶單體表位的蛋白酶單體，并且由此降低低聚物的抗原性。這種產(chǎn)物及其制劑在例如WO 96/16177中有描述?？赏ㄟ^(guò)多種方法鑒定涉及免疫應(yīng)答的表位，例如在WO 00/26230和WO 01/83559中描述的噬菌體顯示方法，或在EP 561907中描述的隨機(jī)法。一旦已經(jīng)鑒定出表位，可改變其氨基酸序列以通過(guò)已知的基因操作技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變來(lái)產(chǎn)生免疫特性改變的蛋白酶(參見例如WO 00/26230、WO 00/26354和/或WO 00/22103)，和/或可以以足夠的接近度使聚合體與表位進(jìn)行聚合體的結(jié)合作用而保護(hù)表位。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包括具有蛋白酶活性并且與SEQID NO14的第1至186位氨基酸和/或(SEQ ID NOs12、10、8、6、4或2)氨基酸序列的第1-188位氨基酸至少40％同一性程度的氨基酸序列(下文中的″同源的多肽″)。在進(jìn)一步的特定實(shí)施方案中，同一性程度是至少大約42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、63％、64％、66％、68％、70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、或至少大約97％。在另一個(gè)可選的實(shí)施方案中，上述任何同一性程度與SEQ ID NOs14、12、10、8、6、4或2，例如SEQ ID NO2的第-189至186位氨基酸的任何完全的CDS部分相關(guān)。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽i)具有；或ii)由具有如上所述任何同一性程度的氨基酸序列組成。
為了本發(fā)明的目的，通過(guò)Needleman-Wunsch序列對(duì)比的程序″align″(即總的序列對(duì)比)確定2個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度，以及2個(gè)核苷酸序列之間的同一性程度。該程序用于多肽以及核苷酸序列的序列對(duì)比。使用默認(rèn)積分矩陣BLOSUM50用于多肽序列對(duì)比，而默認(rèn)單位矩陣用于核苷酸序列對(duì)比。對(duì)于多肽，缺口的第一個(gè)殘基的罰分是-12，而對(duì)于核苷酸是-16。對(duì)于多肽，缺口的進(jìn)一步殘基的罰分是-2，對(duì)于核苷酸是-4。
″Align″屬于FASTA程序包版本v20u6(參見W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS 852444-2448，和W.R.Pearson (1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparison withFASTP and FASTA，″Methods in Enzymology 18363-98)。FASTA蛋白質(zhì)序列對(duì)比使用Smith-Waterman算法而不限制缺口大小(參見″Smith-Waterman algorithm″，T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147195-197)。
在特定的實(shí)施方案中，將2個(gè)氨基酸序列的成熟肽部分，或預(yù)測(cè)或預(yù)期的成熟肽部分用于序列對(duì)比。
可選的，可通過(guò)Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)，利用具有同一性表格及其后的多重序列對(duì)比參數(shù)的LASERGENETTMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)確定2個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度缺口罰分為10，以及缺口長(zhǎng)度罰分為10。成對(duì)序列對(duì)比的參數(shù)是Ktuple＝1，缺口罰分＝3，windows＝5，以及對(duì)角線＝5?？衫萌缟纤龅南嗤惴ê蛙浖_定2個(gè)核苷酸序列之間的同一性程度，其具有下列設(shè)置缺口罰分(gap penalty)為10，以及缺口長(zhǎng)度罰分(gap lengthpenalty)為10。成對(duì)序列對(duì)比的參數(shù)是Ktuple＝1，缺口罰分＝3，和windows＝20。
在特定的實(shí)施方案中，同源性多肽具有10、或9、或8、或7、或6、或5個(gè)氨基酸差異的氨基酸序列。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，同源性多肽與SEQ ID NO14的第1至186位氨基酸，或(SEQ ID NOs12、10、8、6、4或2的)第1-188位氨基酸相差4、或3、或2個(gè)氨基酸、或1個(gè)氨基酸。在可選的實(shí)施方案中，同源性多肽具有與SEQ ID NO14的第1至186位氨基酸、或(SEQ ID NOs12、10、8、6、4或2的)第1-188位氨基酸相差40、35、30、25、20、或15個(gè)氨基酸的氨基酸序列。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO14的第1至186位氨基酸、或(SEQ ID NOs12、10、8、6、4或2的)第1-188位氨基酸的氨基酸序列，或其等位變體；或具有蛋白酶活性的其片段。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQ ID NO14的第1至186位氨基酸、或(SEQ ID NOs12、10、8、6、4或2的)第1-188位氨基酸，或其等位變體；或具有蛋白酶活性的其片段組成。
片段是從這些氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，片段包含至少75個(gè)氨基酸殘基，或至少100個(gè)氨基酸殘基，或至少125個(gè)氨基酸殘基，或至少150個(gè)氨基酸殘基，或至少160個(gè)氨基酸殘基，或至少165個(gè)氨基酸殘基，或至少170個(gè)氨基酸殘基，或至少175個(gè)氨基酸殘基。
等位變體表示占據(jù)相同染色體位點(diǎn)的基因的任何兩個(gè)或多個(gè)備選形式。等位變體通過(guò)突變天然產(chǎn)生，并且可在群體內(nèi)導(dǎo)致多態(tài)性。基因突變可能是沉默的(在編碼多肽中無(wú)變化)或可能編碼改變氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。
本發(fā)明也涉及具有蛋白酶活性的分離多肽，并且其是由在極低、或低、或中等、或中等-高、或高、或極高的嚴(yán)謹(jǐn)條件下與核酸探針雜交的核酸序列編碼的，其中該核酸探針在相同條件下與(a)SEQ ID NO13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO5的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQID NO1的第900-1466位核苷酸；(b)(a)的亞序列，或(c)(a)、或(b)的互補(bǔ)鏈雜交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，紐約)。在特定的實(shí)施方案中，核酸探針選自上述的(a)、(b)、或(c)的核酸序列之中。相應(yīng)于各個(gè)成熟肽部分的SEQ ID NO13的第726-1283位核苷酸、SEQID NO 11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO 5的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQ ID NO 1的第900-1466位核苷酸是優(yōu)選的探針。
亞序列可以是至少100個(gè)核苷酸，或在另一個(gè)實(shí)施方案中是至少200個(gè)核苷酸。此外，亞序列可編碼具有蛋白酶活性的多肽片段。
在上述(a)或(b)下列出的核酸序列，以及相應(yīng)的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計(jì)核酸探針以從不同屬或種的菌株，根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法鑒定和克隆編碼具有蛋白酶活性的多肽的DNA。特別地，這種探針可用于與基因組DNA或令人感興趣的屬或種的cDNA，按照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟雜交，以便鑒定和分離其中的相應(yīng)基因。這種探針比起全部序列來(lái)可以是相當(dāng)短的，但應(yīng)該是至少15，優(yōu)選至少25，以及更優(yōu)選是至少35個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。也可使用更長(zhǎng)的探針?？墒褂肈NA和RNA探針。一般標(biāo)記探針用于檢測(cè)相應(yīng)基因(例如，使用32p、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)。本發(fā)明包括這種探針。
因此，可從這種其它生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)篩選與上述的探針雜交，并且編碼具有蛋白酶活性的多肽的DNA?？赏ㄟ^(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其它分離技術(shù)分離來(lái)自這種其它生物體的基因組或其它的DNA?？蓪?lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移并固定到硝化纖維素或其它合適的載體材料上。為了鑒定同源的克隆或同源的DNA，在Southern印跡中使用載體材料。為了本發(fā)明的目的，雜交表明該核酸序列與相應(yīng)于所選擇核酸序列、其互補(bǔ)鏈、或其亞序列的標(biāo)記核酸探針在極低至極高的嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交?？衫肵光膠片檢測(cè)在這些條件下與核酸探針雜交的分子。
在特定的實(shí)施方案中，核酸探針是SEQ ID NO13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO5的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQ ID NO1的第900-1466位核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸探針是編碼相應(yīng)于任何或上述所列的核酸序列的氨基酸序列。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸探針是包含于質(zhì)粒中的核酸序列，或優(yōu)選其成熟多肽編碼區(qū)，該質(zhì)粒包含于大腸桿菌DSM 15509中，其中核酸序列編碼具有蛋白酶活性的多肽。
對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，定義極低至極高的嚴(yán)謹(jǐn)條件為在42℃，在5×SSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪切和變性的鮭魚精DNA，以及對(duì)于極低和低嚴(yán)謹(jǐn)為25％甲酰胺、對(duì)于中等和中等-高嚴(yán)謹(jǐn)為35％甲酰胺、或?qū)τ诟吆蜆O高嚴(yán)謹(jǐn)為50％甲酰胺中，按照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。
對(duì)于至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的長(zhǎng)探針，最后利用2×SSC，0.2％SDS洗滌載體材料3次，每次15分鐘，優(yōu)選在45℃(極低嚴(yán)謹(jǐn))、更優(yōu)選至少在50℃(低嚴(yán)謹(jǐn))、更優(yōu)選至少在55℃(中等嚴(yán)謹(jǐn))、更優(yōu)選至少在60℃(中等-高嚴(yán)謹(jǐn))、更優(yōu)選至少在65℃(高嚴(yán)謹(jǐn))、以及最優(yōu)選至少在70℃(極高嚴(yán)謹(jǐn))下進(jìn)行洗滌。
對(duì)于大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的短探針，嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為在比利用根據(jù)Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of the NaionalAcademy of Sciences USA 481390)的計(jì)算法計(jì)算的Tm低5℃至10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM一元磷酸鈉，0.1mM ATP，和每ml 0.2mg酵母RNA中，按照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法進(jìn)行預(yù)雜交、雜交、和洗滌后-雜交。
對(duì)于大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的下列短探針，在6×SSC加0.1％SDS中洗滌載體材料15分鐘一次，利用6×SSC在低于計(jì)算的Tm 5℃至10℃下洗滌兩次，每次15分鐘。
本發(fā)明也涉及具有包括SEQ ID NO14的第1至186位氨基酸、和/或(SEQ ID NOs12、10、8、6、4或2)的第1-188位氨基酸的取代、缺失、和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽變體。
變體多肽的氨基酸序列可不同于SEQ ID NO14的第1至186、-170至186、或-189至186位氨基酸的氨基酸序列，或通過(guò)插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基和/或通過(guò)不同的氨基酸殘基取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而不同于SEQ ID NOs12、10、8、6、4或2的任何一項(xiàng)的相應(yīng)部分。優(yōu)選地，氨基酸變化具有次要的特性，也就是說(shuō)保守的氨基酸取代不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；小的缺失，一般為1個(gè)至大約30個(gè)氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸殘基；達(dá)到大約20-25個(gè)殘基的小的接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或另一個(gè)功能，例如聚組氨酸區(qū)、抗原性的表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域而便于純化的小的延伸。
保守取代的實(shí)例是在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天門冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)的組的范圍之內(nèi)。一般不改變特異活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且在例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，The Proteins，Academic Press，紐約中有描述。最通常發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/lle、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly及其相反。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽以及本發(fā)明所述的用途是酸-穩(wěn)定的。為了本目的，術(shù)語(yǔ)酸-穩(wěn)定的是指在pH 3.0和37℃孵育2小時(shí)后的殘余活性，與在pH 9.0和5℃孵育2小時(shí)的相應(yīng)樣品的殘余活性相比是至少20％。在特定的實(shí)施方案中，殘余活性是至少22％、24％、25％或至少26％?？蛇x的，酸穩(wěn)定性定義是指當(dāng)在pH 3.5和37℃測(cè)量時(shí)，與在pH 9.0和5℃孵育2小時(shí)的相應(yīng)樣品的殘余活性相比為至少50％、或60％、或70％的殘余活性。在WO 01/58276的實(shí)施例2C中公開了用于確定耐酸性的合適分析。
在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽和本發(fā)明所述的用途在pH7.0具有至少0.2、0.3、0.4、或至少0.5的相對(duì)活性。WO 01/58276的實(shí)施例2B的pH-圖譜測(cè)試是合適的分析。
本發(fā)明的多肽和根據(jù)本發(fā)明所使用的多肽是細(xì)菌或真菌的多肽。真菌的多肽可能來(lái)源于絲狀真菌或來(lái)自酵母。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是i)真菌的蛋白酶；ii)來(lái)源于子囊菌門(Ascomycota)的蛋白酶；iii)盤菌亞門(Pezizomycotina)；iv)糞科菌綱(Sordariomycetes)；v)糞殼目(Sordariales)；vi)Annulatascaceae科；vii)Ascotaiwania和/或Brachysporiella屬(Brachysporiella是該真菌的無(wú)性型(無(wú)性的)狀態(tài)，而Ascotaiwania是有性型或有性狀態(tài))；和/或viii)來(lái)源于Ascotaiwania和/或Brachysporiella菌株的蛋白酶，例如Ascotaiwaniamitriformis、Ascotaiwania sawada、Brachysporiella gayana、和Brachysporiellasp.，例如Brachysporiella gayana CGMCC 0865，例如具有SEQ ID NO14的第1至186、-170至186、或-189至186位氨基酸的氨基酸序列的多肽。
可以理解對(duì)于上述的種屬，本發(fā)明包括完全的和不完全的狀態(tài)、和其他分類學(xué)的等同物，例如無(wú)性型，而不考慮其已知的種屬名稱。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地識(shí)別適當(dāng)?shù)韧锏耐恍浴?br> 上述分類學(xué)主要是根據(jù)Ranghoo，V.M.，Goh，T.K.& Hyde，K.D.1999.New observations on Monotosporella rhizoidea.Mycosciences 40377-382；和Sivichai，S.，Hywel-Jones，N.& J.E.B.G.1998，Liginicolous freshwaterAscomycota from ThailandI.Ascotaiwania sawada and its anamorph stateMonotosporella.Mycosciense 39307-311。
在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是i)細(xì)菌蛋白酶；ii)來(lái)源于放線菌門(Actinomycetales)的蛋白酶；iii)放線菌綱(the class Actinobacteria)；iv)放線菌目(Actinomycetales)；v)擬諾卡氏菌科(Nocardiopsaceae)；vi)擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)；和/或來(lái)源于vii)擬諾卡氏菌種的蛋白酶，例如Nocardiopsis alba、南極洲擬諾卡氏菌(Nocardiopsis antarctica)、Nocardiopsis prasina、Nocardiopsis composta、Nocardiopsis exhalans、嗜鹽擬諾卡氏菌(Nocardiopsis halophila)、Nocardiopsis halotolerans、Nocardiopsis kunsanensis、李斯特?cái)M諾卡氏菌(Nocardiopsis listeri)、盧森坦類擬諾卡氏菌(Nocardiopsis lucentensis)、Nocardiopsis metallicus、Nocardiopsis synnemataformans、海藻糖擬諾卡氏菌(Nocardiopsis trehalosi)、Nocardiopsis tropica、Nocardiopsis umidischolae、Nocardiopsis xinjiangensis、或達(dá)松維爾擬諾卡氏菌、例如達(dá)松維爾擬諾卡氏菌DSM 43235，例如蛋白酶18，具有SEQ ID NO12的第1至188、或-166至188位氨基酸的氨基酸序列的多肽；Nocardiopsis alba DSM 15647，例如蛋白酶08，具有SEQ ID NO10的第1至188、或-167至188位氨基酸的氨基酸序列的多肽；Nocardiopsis prasina DSM 15649，例如蛋白酶35，具有SEQ ID NO8的第1至188、或-165至188位氨基酸的氨基酸序列的多肽；Nocardiopsis prasina DSM 15648，例如蛋白酶11，具有SEQ ID NO6的第1至188、或-165至188位氨基酸的氨基酸序列的多肽。
這4種蛋白酶，和來(lái)自Brachysporiella gayana CGMCC 0865的蛋白酶，例如具有SEQ ID NO14的第1至186、-170至186、或-189至186位氨基酸的氨基酸序列多肽的Brachysporiella蛋白酶一起形成本發(fā)明的特定實(shí)施方案。由蛋白酶18、蛋白酶08、和Brachysporiella蛋白酶組成的亞組是本發(fā)明的另一個(gè)特定的實(shí)施方案，而由Brachysporiella蛋白酶和蛋白酶18組成的亞組是本發(fā)明的更進(jìn)一步的特定實(shí)施方案。
上述分類學(xué)是根據(jù)G.M.Garrity & J.G.Holt的Bergey′s Manual ofSystematic Bacteriology，2001，第二版，卷號(hào)1，David R.Bone，Richard W.Castenholz中的chapterThe road map to the Manual。這些種屬的菌株是公眾可在許多菌種保藏機(jī)構(gòu)容易地獲得的，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSM)、真菌菌種保藏中心(CBS)、和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(NRRL)。
此外，可鑒定并從其它來(lái)源，包括從自然界分離的微生物(例如，土壤、堆肥、水等)利用上述探針獲得這種多肽。用于從天然生境分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。然后可通過(guò)類似地篩選另一個(gè)微生物的基因組DNA或cDNA文庫(kù)衍生出核酸序列。一旦已經(jīng)用探針檢測(cè)到編碼多肽的核酸序列，可利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)分離或克隆序列(參見例如，Sambrook等人，1989，上文)。
可通過(guò)在適當(dāng)?shù)暮Y選培養(yǎng)基中摻入所需水平的Cu2+和/或Cu+并且選擇最有效的蛋白酶生產(chǎn)者來(lái)進(jìn)行不受銅或相對(duì)不受銅影響的蛋白酶篩選。措詞″有效的″(potent)當(dāng)然是指蛋白酶活性，可利用任何合適的蛋白酶篩選方法，例如根據(jù)包含脫脂乳的固體培養(yǎng)基中澄清帶的大小來(lái)進(jìn)行評(píng)估。所需水平的銅的實(shí)例是達(dá)到200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、或達(dá)到10000ppm的Cu。Cu的含量應(yīng)是至少0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2、3、4、5、6、7、8、9或至少10ppm。措詞ppm是指百萬(wàn)分之(w/w)，例如mg/kg，并且可利用其原子量(近似63.5)轉(zhuǎn)化為Cu的摩爾濃度，如本領(lǐng)域已知的，例如1mM Cu相當(dāng)于63.5ppm Cu。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶是分離和/或純化的。如在此所限定的，″分離″的多肽是基本上沒有其它多肽的多肽，例如通過(guò)SDS-PAGE所確定的，至少大約20％純、優(yōu)選至少大約40％純、更優(yōu)選大約60％純，更優(yōu)選大約80％純、最優(yōu)選大約90％純、以及最優(yōu)選大約95％純。
由本發(fā)明的核酸序列編碼的多肽也包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一個(gè)多肽是在多肽或其片段的N-末端或C-末端融合的。融合多肽是通過(guò)將編碼另一個(gè)多肽的核酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核酸序列(或其部分)融合而產(chǎn)生的。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括連接編碼多肽的編碼序列以使得它們?cè)谧x框內(nèi)，并且融合多肽的表達(dá)是在相同啟動(dòng)子和終止子的調(diào)控之下。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽不包括(即，排除)a)SEQ ID NO4的第-186至188，-167至188、或1-188位氨基酸；b)SEQ ID NO2的第1-188位氨基酸；c)來(lái)自達(dá)松維爾擬諾卡氏菌NRRL 18133的蛋白酶，其在WO 88/03947中有描述，優(yōu)選其具有經(jīng)SDS-PAGE確定為20,500道爾頓的分子量(MW)和pI為9.15和8.2的等電點(diǎn)；d)來(lái)自擬諾卡氏菌種的蛋白酶，其在JP 2255081A中有描述，優(yōu)選其具有經(jīng)SDS電泳確定為21,000Da的MW和10-12的最適pH；和/或e)來(lái)源于由德國(guó)專利號(hào)DD 2,004,328所描述的達(dá)松維爾擬諾卡氏菌種的菌株zIMET 43647的蛋白酶。
核酸序列本發(fā)明也涉及編碼本發(fā)明多肽的分離核酸序列。本發(fā)明的特定核酸序列是SEQ ID NO13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO5的第496-1059位核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)特定核酸序列是包含于質(zhì)粒中的序列，優(yōu)選其成熟多肽的編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含于保藏的微生物大腸桿菌DSM 15509中。本發(fā)明也包括編碼具有SEQID NO14的第1至186位氨基酸，和/或(SEQ ID NOs12、10、8、6、4或2)的第1-188位氨基酸的氨基酸序列多肽的核酸序列，其由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于相應(yīng)的核苷酸序列。本發(fā)明也涉及編碼具有蛋白酶活性的上述氨基酸序列的編碼片段的上述核苷酸序列的亞序列。
在亞序列中已經(jīng)從5′和/或3′末端缺失掉一個(gè)或多個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，亞序列包含至少150、190或至少225個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少300個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少375、450、500、531、600、700、800、900、1000、或1100個(gè)核苷酸。
本發(fā)明也涉及編碼在存在銅時(shí)更穩(wěn)定，和/或較少受到銅抑制的蛋白酶的核苷酸序列，其與SEQ ID NO13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO9的第502-1065位核苷酸、SEQ IDNO7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO5的第496-1059位核苷酸、SEQID NO3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQ ID NO1的第900-1466位核苷酸具有至少40％的同一性程度。在特定的實(shí)施方案中，同一性程度是至少42％、45％、47％、50％、52％、55％、57％、60％、62％、64％、65％、67％、70％、72％、75，77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％，或至少97％。
本發(fā)明也涉及在上述任何核苷酸序列中包括至少一個(gè)突變的突變核酸序列，其中突變的核酸序列編碼多肽(i)由任何相應(yīng)的氨基酸序列組成，或(ii)是(i)的任何序列的變體，其中該變體包括取代、缺失、和/或插入一個(gè)或多個(gè)，或(iii)是(i)的任何序列的等位變體，或(iv)是(i)的任何序列的片段。
用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括從基因組DNA分離，從cDNA或其組合制備。從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的核酸序列可能受到，例如利用公知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選以檢測(cè)克隆到的具有共同結(jié)構(gòu)特性的DNA片段的影響。參見例如，Innis等人，1990，PCRA Guide to Methods and Application，AcademicPress，紐約。可使用其它的核酸擴(kuò)增方法，例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化的轉(zhuǎn)錄(LAT)和依賴于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。可從Brachysporiella(Ascotaiwania)的菌株、或擬諾卡氏菌的菌株、或從其它或相關(guān)的生物體克隆核酸序列，因此例如可以是核酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因或種屬變體。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)″分離的核酸序列″是指基本上沒有其它核酸序列的核酸序列，例如通過(guò)瓊脂糖電泳所確定的，至少大約20％純、優(yōu)選至少大約40％純、更優(yōu)選至少大約60％純，更優(yōu)選至少大約80％純、以及最優(yōu)選至少大約90％純。例如，可通過(guò)用于遺傳工程以從其天然位置重新定位核酸序列至其可再生的不同位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法來(lái)獲得分離的核酸序列。該克隆方法可包括切割和分離包括編碼多肽的核酸序列的所需核酸片段，將該片段插入到載體分子中，以及將重組載體整合到宿主細(xì)胞中，其中可復(fù)制該核酸序列的多個(gè)拷貝或克隆。該核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成的、合成的起源、或其任何組合。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的修飾可能是為合成與該多肽基本相似的多肽所必需的。術(shù)語(yǔ)與多肽″基本上相似的″是指該多肽的非天然存在形式。這些多肽可能在從其天然來(lái)源分離多肽的一些工程化方法中有差異，例如在特異活性、熱穩(wěn)定性、最適pH、變應(yīng)原性等中有差異的變體。可根據(jù)作為SEQ ID NO1、3，5、7、9、11或13的多肽編碼部分而提供的核酸序列，例如其亞序列來(lái)構(gòu)建變體序列，和/或通過(guò)導(dǎo)入不產(chǎn)生由該核酸序列編碼的另一個(gè)氨基酸序列多肽、但是其相應(yīng)于宿主生物體的密碼子使用率而用于產(chǎn)生該蛋白酶的核苷酸取代，或通過(guò)導(dǎo)入可能產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代來(lái)構(gòu)建變體序列。對(duì)于核苷酸取代的一般說(shuō)明，參見例如Ford等人，1991，Protein Expression and Purification 295-107。可例如，如上所述制備低-過(guò)敏原的多肽。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的是可在對(duì)分子功能至關(guān)重要的區(qū)域外部進(jìn)行這種取代而仍然產(chǎn)生活性多肽。可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法鑒定對(duì)由本發(fā)明的分離核酸序列編碼的多肽活性必需，因此優(yōu)選不被取代的氨基酸殘基，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸-掃描誘變(參見，例如Cunningham和Wells，1989，Science 2441081-1085)。在后者的技術(shù)中，在分子中的每個(gè)帶正電荷的殘基導(dǎo)入突變，測(cè)試所得到的突變體分子的蛋白酶活性以鑒定對(duì)分子活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。也可通過(guò)由例如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記所確定的三維結(jié)構(gòu)分析來(lái)確定底物-蛋白酶的相互作用位點(diǎn)(參見，例如de Vos等人，1992，Science 255306-312；Smith等人，1992，Journalof Molecular Biology 224899-904；Wlodaver等人，1992，F(xiàn)EBS Letters 30959-64)。
本發(fā)明也涉及編碼本發(fā)明多肽的分離核酸序列，其在極低嚴(yán)謹(jǐn)條件、優(yōu)選低嚴(yán)謹(jǐn)條件、更優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)條件、更優(yōu)選中等-高嚴(yán)謹(jǐn)條件、更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)條件、以及最優(yōu)選極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與核酸探針雜交，其中該核酸探針在相同條件下與在此所限定的SEQ ID NO13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO5的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQ ID NO1的第900-1466位核苷酸；或其互補(bǔ)鏈；或等位變體及其亞序列(Sambrook等人，1989，上文)雜交。
本發(fā)明也涉及由(a)在極低、低、中等、中等-高、高、或極高的嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO5的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQ ID NO1的第900-1466位核苷酸；(ii)(i)的亞序列，或(iii)(i)、或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交的DNA；以及(b)分離核酸序列而產(chǎn)生分離的核酸序列。亞序列優(yōu)選是至少100個(gè)核苷酸的序列，例如編碼具有蛋白酶活性的多肽片段的序列。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸序列不包括(即排除)a)SEQ IDNO 3的第1-1122和/或559-1122位核苷酸；和/或b)SEQ ID NO1的第1-1596和/或900-1466位核苷酸。
用于產(chǎn)生突變核酸序列的方法本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于產(chǎn)生突變核酸序列的方法，包括在SEQ ID NO13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO11的第499-1062位核苷酸、SEQ IDNO9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO7的第496-1059位核苷酸、SEQID NO5的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQ ID NO1的第900-1466位核苷酸，或其亞序列的成熟多肽編碼序列中導(dǎo)入至少一個(gè)突變，其中突變的核酸序列編碼由相應(yīng)的氨基酸序列組成的多肽；或具有蛋白酶活性的其片段。
將突變導(dǎo)入到核酸序列中以使一個(gè)核苷酸變換為另一個(gè)核苷酸可能伴隨有利用本領(lǐng)域中已知的任何方法的定點(diǎn)誘變。特別有用的是利用超螺旋的，具有令人感興趣的插入的雙鏈DNA載體和包含所需要突變的2個(gè)合成引物的方法。各自互補(bǔ)于載體相反鏈的寡核苷酸引物，借助于Pfu DNA聚合酶在溫度循環(huán)期間延伸。在引物的整合上，產(chǎn)生了包含交錯(cuò)缺口的突變質(zhì)粒。溫度循環(huán)后，用特異于甲基化和半甲基化DNA的DpnI處理產(chǎn)物以消化親本DNA模板并且選擇包含突變的合成DNA。也可使用本領(lǐng)域已知的其它方法。
核酸構(gòu)建體本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明核酸序列的核酸構(gòu)建體，其中核酸序列與一個(gè)或多個(gè)指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中在與調(diào)控序列相適合的條件下表達(dá)的調(diào)控序列進(jìn)行可操作地連接?？衫斫獗磉_(dá)包括涉及產(chǎn)生多肽的步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
在此限定″核酸構(gòu)建體″為單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因或已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)而包含以不會(huì)另外存在于自然界的方式組合和毗鄰的(juxtaposed)核酸節(jié)段。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含所有為表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)表達(dá)盒同義。術(shù)語(yǔ)″編碼序列″在此限定為直接指定為其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列的核酸序列。一般通過(guò)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(原核生物)或剛好位于mRNA5′末端開放閱讀框上游的ATG起始密碼子(真核生物)和剛好位于mRNA3′末端開放閱讀框下游的轉(zhuǎn)錄終止子序列確定編碼序列的邊界。編碼序列可包括但不限于，DNA、cDNA和重組的核酸序列。
可以多種方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離核酸序列以保證多肽表達(dá)。在將核酸序列插入到載體中之前，根據(jù)表達(dá)載體其操作可以是合乎需要的或必須的。利用重組DNA方法來(lái)改進(jìn)核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。
術(shù)語(yǔ)″調(diào)控序列″在此限定為包括對(duì)于本發(fā)明多肽的表達(dá)必須或有利的所有成分。各個(gè)調(diào)控序列可以是天然的或與編碼多肽的核酸序列是外源的。這種調(diào)控序列包括但不限于，前導(dǎo)、多聚腺苷酸序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。至少調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號(hào)。對(duì)調(diào)控序列可提供接頭以便導(dǎo)入便于連接調(diào)控序列和編碼多肽的核酸序列編碼區(qū)的特異限制酶切位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)″可操作地連接″在此限定為其中將調(diào)控序列適當(dāng)?shù)刂糜谙鄬?duì)于DNA序列的編碼序列的位置以使得該調(diào)控序列指導(dǎo)多肽表達(dá)的構(gòu)型。
調(diào)控序列可以是適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列，由用于表達(dá)核酸序列的宿主細(xì)胞識(shí)別的核酸序列。啟動(dòng)子序列包含介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在所選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，并且可從編碼胞外或胞內(nèi)多肽的、與宿主細(xì)胞同源或異源的基因獲得。
用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、和尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)基因獲得的啟動(dòng)子，以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的混合啟動(dòng)子)、其突變的、截短的、和混合的啟動(dòng)子。
在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子是從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)、和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因獲得的。其他用于酵母宿主細(xì)胞的的有用啟動(dòng)子在Romanos等人，1992，Yeast 8423-488中有描述。
用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從大腸桿菌乳糖操縱子(lac)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)瓊脂水解酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、和原核的β-內(nèi)酰胺酶(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 753727-3731)基因獲得的啟動(dòng)子，以及tac啟動(dòng)子(DeBoer等人，1983，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 8021-25)。進(jìn)一步的啟動(dòng)子在″Usefulproteins from recombinant bacteria″in Scientific American，1980，24274-94；和Sambrook等人，1989，同上文中有描述。
調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。將終止子序列可操作地與編碼多肽的核酸序列的3′末端連接。任何在所選擇的宿主細(xì)胞中是功能性的終止子都可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因獲得的。
用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因獲得的。其它用于酵母宿主細(xì)胞的有用終止子在Romanos等人，1992，同上文中有描述。
用于細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如芽胞桿菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是來(lái)自地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、或解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)的終止子。
調(diào)控序列也可以是合適的前導(dǎo)序列，mRNA的非翻譯區(qū)，其對(duì)于宿主細(xì)胞的翻譯是很重要的。將前導(dǎo)序列與編碼多肽的核酸序列的5′末端可操作地連接。任何在所選擇的宿主細(xì)胞中有功能的前導(dǎo)序列都可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌的優(yōu)選前導(dǎo)序列是從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因獲得的。
用于酵母宿主細(xì)胞的合適前導(dǎo)序列是從釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子、和釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因獲得的。
調(diào)控序列也可以是多聚腺苷酸序列，是可操作地與核酸序列的3′末端連接的序列，并且當(dāng)其轉(zhuǎn)錄時(shí)，受到宿主細(xì)胞識(shí)別作為向轉(zhuǎn)錄的mRNA加入多聚腺苷殘基的信號(hào)。任何在所選擇的宿主細(xì)胞中有功能的多聚腺苷酸序列都可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選多聚腺苷酸序列是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉氨基苯甲酸合酶、尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶基因獲得的。
用于酵母宿主細(xì)胞的有用多聚腺苷酸序列在Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 155983-5990中有描述。
調(diào)控序列也可以是編碼與多肽氨基末端連接并且指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的氨基酸序列的信號(hào)肽編碼區(qū)。核酸序列的編碼序列的5′末端可固有地包含在翻譯閱讀框中與編碼分泌多肽的編碼區(qū)節(jié)段天然連接的信號(hào)肽編碼區(qū)中。備選地，編碼序列的5′末端可包含與編碼序列外源的信號(hào)肽編碼區(qū)。外源的信號(hào)肽編碼區(qū)可能是當(dāng)編碼序列不天然地包含信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí)所必需的。備選地，外來(lái)的信號(hào)肽編碼區(qū)可簡(jiǎn)單地替代天然的信號(hào)肽編碼區(qū)以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，任何指導(dǎo)表達(dá)多肽進(jìn)入所選擇的宿主細(xì)胞的分泌途徑的信號(hào)肽編碼區(qū)都可用于本發(fā)明。
用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼區(qū)是從芽孢桿菌NCIB 11837生麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽胞桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)基因和枯草芽孢桿菌prsA獲得的信號(hào)肽編碼區(qū)。進(jìn)一步的信號(hào)肽在Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57109-137中有描述。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼區(qū)是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纖維素酶、和Humicola lanuginosa脂肪酶基因獲得的信號(hào)肽區(qū)。
用于酵母宿主細(xì)胞的有用信號(hào)肽是從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶基因獲得的。其它的有用信號(hào)肽編碼區(qū)在Romanos等人，1992，同上文中有描述。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，信號(hào)肽編碼區(qū)選自SEQ ID NO1、3、5、7、9、11或13的信號(hào)肽編碼區(qū)。
調(diào)控序列也可以是編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽編碼區(qū)。所得到的多肽稱為前酶或前多肽(或有時(shí)稱為酶原)。前多肽一般是非活化的并且可通過(guò)前肽的催化或自催化切割而從前多肽轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。前肽編碼區(qū)可從例如枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)基因獲得。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，前肽編碼區(qū)選自SEQ ID NO1、3、5、7、9、11和13的前肽編碼區(qū)。
其中信號(hào)肽和前肽區(qū)存在于多肽的氨基末端，前肽區(qū)緊接位于多肽的氨基末端而信號(hào)肽區(qū)緊接位于前肽區(qū)域的氨基末端。
表達(dá)載體本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明的核酸序列、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載體?？蓪⑷缟纤龅陌ǘ喾N核酸和調(diào)控序列連接在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，其可包括一個(gè)或多個(gè)便利的限制酶切位點(diǎn)以容許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的核酸序列。備選地，可通過(guò)插入核酸序列或包括進(jìn)入適當(dāng)表達(dá)載體的序列的核酸構(gòu)建體表達(dá)本發(fā)明的核酸序列。在表達(dá)載體的產(chǎn)生中，編碼序列位于載體中以便編碼序列與用于表達(dá)的適當(dāng)調(diào)控序列可操作地連接。
重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其可便利地經(jīng)受重組DNA方法并且可實(shí)現(xiàn)核酸序列的表達(dá)。載體的選擇一般取決于載體與其中將導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線性的或封閉的環(huán)狀質(zhì)粒。
載體可以是自我復(fù)制載體，即以染色體外的實(shí)體存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒，染色體外的元件、微型染色體或人工染色體。載體可包含任何用于確保自我復(fù)制的方式。備選地，載體可以是當(dāng)被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，整合到基因組中并與其已經(jīng)整合進(jìn)入的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可使用單個(gè)載體或質(zhì)粒，或一起包含總DNA的兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒以導(dǎo)入宿主細(xì)胞的基因組或者可以使用轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明的載體優(yōu)選包含容許容易的選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)可選擇的標(biāo)記物?？蛇x擇的標(biāo)記物是提供抗微生物性或病毒抗性、重金屬抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等的基因產(chǎn)物。細(xì)菌的可選擇標(biāo)記物的實(shí)例是來(lái)自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因。用于酵母宿主細(xì)胞的合適標(biāo)記物是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的可選擇標(biāo)記物包括但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素轉(zhuǎn)乙酰酶(phosphinothricia acetyltransferase))、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸酯脫羧酶)、sC(硫酸腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)，及其等同物。優(yōu)選用于曲霉細(xì)胞的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本發(fā)明的載體優(yōu)選包含容許載體穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中或容許載體在細(xì)胞中不依賴于基因組而自發(fā)復(fù)制的元件。
對(duì)于整合到宿主細(xì)胞基因組中，載體可能依賴于編碼多肽的核酸序列或通過(guò)同源或非同源重組將載體穩(wěn)定整合到基因組中的其它任何元件。備選地，載體可包含對(duì)于通過(guò)同源重組到宿主細(xì)胞基因組中而指導(dǎo)整合的附加核酸序列。附加的核酸序列能夠使載體在染色體的準(zhǔn)確位置整合到宿主細(xì)胞基因組中。為了增加在準(zhǔn)確位置整合的可能性，整合元件優(yōu)選應(yīng)包含足夠數(shù)目的核酸，例如100至1,500個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選400至1,500個(gè)堿基對(duì)，以及最優(yōu)選800至1,500個(gè)堿基對(duì)，其與相應(yīng)的靶序列是高度同源的以增強(qiáng)同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核酸序列。另一方面，載體可通過(guò)非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
對(duì)于自我復(fù)制，載體可進(jìn)一步包括能夠使載體在所述的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)。細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)的實(shí)例是容許在大腸桿菌中復(fù)制的pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184，以及容許在芽胞桿菌中復(fù)制的pUB110、pE194、pTAl060、和pAMβ1的質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制原點(diǎn)的實(shí)例是2微粒復(fù)制原點(diǎn)(micron origin of replication)、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合、以及ARS4和CEN6的組合。復(fù)制原點(diǎn)可以是具有突變的原點(diǎn)，其在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生功能性溫度靈敏性(參見，例如Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 751433)。
可將本發(fā)明的核酸序列的一個(gè)以上拷貝插入到宿主細(xì)胞中以增加基因產(chǎn)物的生產(chǎn)。可通過(guò)將序列的至少一個(gè)附加拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中，或通過(guò)包括擴(kuò)增伴隨核酸序列的可選擇標(biāo)記基因來(lái)獲得增加拷貝數(shù)的核酸序列，其中細(xì)胞包含擴(kuò)增拷貝的可選擇標(biāo)記基因，由此可通過(guò)在存在適當(dāng)?shù)目蛇x擇試劑時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞而選擇附加拷貝的核酸序列。
用于連接如上所述的元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見，例如Sambrook等人，1989，上文)。
蛋白酶也可以與至少一種令人感興趣的動(dòng)物飼料的其他酶一起共表達(dá)，例如肌醇六磷酸酶(phytase)(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4.-.-)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。
酶可以是從不同的載體、從1個(gè)載體，或利用兩種方法的混合而共表達(dá)的。當(dāng)利用不同的載體時(shí)，載體可能具有不同的可選擇標(biāo)記物和不同的復(fù)制原點(diǎn)。當(dāng)只利用1個(gè)載體時(shí)，可從一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)基因。如果在1個(gè)啟動(dòng)子(二-或多-順反子)的調(diào)控下克隆，其中克隆基因的順序可能影響蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。蛋白酶也可表達(dá)為融合蛋白質(zhì)，即編碼蛋白酶的編碼已經(jīng)與編碼另一個(gè)蛋白質(zhì)的基因在框內(nèi)融合。該蛋白質(zhì)可以是另一個(gè)酶或來(lái)自另一個(gè)酶的功能域。
宿主細(xì)胞本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明核酸序列的重組宿主細(xì)胞，其可有利地用于多肽的重組生產(chǎn)。將包括本發(fā)明核酸序列的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞以使得該載體保持作為染色體的整合部分或如早先所描述的作為染色體外自我復(fù)制的載體。術(shù)語(yǔ)″宿主細(xì)胞″包括由于復(fù)制期間發(fā)生突變而與親本細(xì)胞不相同的任何親本細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來(lái)源。
宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞的微生物，例如原核生物或非單細(xì)胞微生物，例如真核生物。
有用的單細(xì)胞是例如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)菌細(xì)胞，包括但不限于，芽胞桿菌屬細(xì)胞、或鏈霉菌屬細(xì)胞、或乳酸菌屬的細(xì)胞；或革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌和假單胞菌種屬，乳酸菌包括但不限于乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、鏈球菌屬(Streptcoccus)、小球菌屬(Pediococcus)和腸球菌屬(Enterococcus)的種類。
載體進(jìn)入細(xì)菌宿主細(xì)胞的導(dǎo)入可例如受到原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168111-115)、利用感受態(tài)細(xì)胞(參見，Young and Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56209-221)、電穿孔(參見例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6742-751)、或結(jié)合作用(參見例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology1695771-5278)的影響。
宿主細(xì)胞可以是真核生物，例如非人動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、或真菌細(xì)胞。
在特定的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。在此使用的″真菌″包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(正如Hawksworth等人，In，Ainsworth和Bisby′s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，劍橋，UK所限定的)，以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等人，1995，上文，第171頁(yè)所引用的)，和所有的有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，上文)。
在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。如在此使用的″酵母″包括產(chǎn)子囊孢子酵母(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子孢子酵母(basidiosporogenous)、和屬于不完全真菌類(Fungi Imperfecti)的酵母(芽生菌目(Blastomycetes))。因?yàn)閷?lái)酵母的分類法可能有變化，為了本發(fā)明的目的，應(yīng)如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F(xiàn).A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)所描述的限定酵母。
酵母宿主細(xì)胞可以是假絲酵母屬(Candida)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或Yarrowia細(xì)胞。
真菌宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞?！褰z狀真菌″包括真菌門和卵菌門亞門的所有絲狀體(正如Hawksworth等人，1995，上文所定義的)。絲狀真菌的特點(diǎn)在于菌絲體的壁由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、和其他復(fù)合多糖組成。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲的伸長(zhǎng)而碳代謝是專性需氧的。相比之下，例如釀酒酵母的酵母營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)單細(xì)胞原植體(thallus)的出芽而碳代謝可以是發(fā)酵性的。
絲狀真菌宿主細(xì)胞的實(shí)例是下列種屬的細(xì)胞，但不限于枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、腐殖菌屬(Humicola)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、脈孢菌屬(Neurospora)、青霉菌屬(Penicillium)、草根霉屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)或木霉屬(Trichoderma)。
可通過(guò)包括原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和本身已知方式的細(xì)胞壁再生的方法轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化曲霉宿主細(xì)胞的合適方法在EP 238 023和Yelton等人，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 811470-1474中有描述。用于轉(zhuǎn)化鐮刀菌屬種屬的合適方法在Malardier等人，1989，Gene 78147-156和WO 96/00787中有描述。可利用Becker和Guarente，In Abelson，J.N.和Simon，M.I.，編輯，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods in Enzymology，第194卷，第182-187頁(yè)，AcademicPress，Inc.，紐約；Ito等人，1983，Journal of Bacteriology 153163；和Hinnen等人，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 751920描述的方法轉(zhuǎn)化酵母。
生產(chǎn)方法本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法包括(a)培養(yǎng)其野生型能夠產(chǎn)生多肽的菌株；以及(b)回收多肽。優(yōu)選地，菌株屬于Brachysporiella屬，例如Brachysporiella gayana、或?qū)儆跀M諾卡氏菌屬，例如達(dá)松維爾擬諾卡氏菌或Nocardiopsis alba。最優(yōu)選的野生型菌株是達(dá)松維爾擬諾卡氏菌DSM43235、Nocardiopsis alba DSM 15647、Nocardiopsis prasina DSM 15649、Nocardiopsis prasinaDSM 15648、和Brachysporiella gayana CGMCC 0865。本發(fā)明也涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有利于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；以及(b)回收多肽。
本發(fā)明也涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有利于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞包括在SEQ ID NO13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO5的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQID NO1的第900-1466位核苷酸中包括至少一個(gè)突變的突變核酸序列，其中突變的核酸序列編碼相應(yīng)的多肽，其(i)由SEQ ID NO14的第1至186位氨基酸、或(SEQ ID NOs12、10、8、6、4或2)中任何一項(xiàng)的第1-188位氨基酸組成，或(ii)是(i)的任何序列的變體，其中變體包括取代、缺失、和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或(iii)是(i)的任何序列的等位變體，或(iv)是(i)的任何序列的片段。
在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，在適于產(chǎn)生多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中利用本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可通過(guò)搖瓶培養(yǎng)、在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中、在合適的培養(yǎng)基和在容許多肽表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行小規(guī)模的或大規(guī)模的發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、分批飼養(yǎng)、或固態(tài)發(fā)酵)而培養(yǎng)細(xì)胞。在包括碳和氮源和無(wú)機(jī)鹽的合適營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中利用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行培養(yǎng)?？蓮墓?yīng)商獲得合適的培養(yǎng)基或可根據(jù)公開的組合物(例如，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)制備合適的培養(yǎng)基。如果多肽分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，可直接從培養(yǎng)基回收多肽。如果多肽不分泌，可從細(xì)胞裂解物回收多肽。
可利用本領(lǐng)域已知的特異于該多肽的方法檢測(cè)多肽。檢測(cè)方法可包括特異抗體的使用、產(chǎn)物的形成、或底物的消失。例如，可使用蛋白酶分析確定在此所描述的多肽的活性。
可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法回收所得到的多肽。例如，可通過(guò)傳統(tǒng)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基回收多肽，包括但不限于離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。
可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法純化本發(fā)明的多肽，包括但不限于色譜法(例如，離子交換、親合、疏水性的、色譜聚焦、和大小排阻)、電泳方法(例如預(yù)備性的等電聚焦)、差異溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或提取(參見例如Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden，編輯，VCHPublishers，紐約，1989)。
植物本發(fā)明也涉及轉(zhuǎn)基因植物、植物部分、或植物細(xì)胞，其已經(jīng)用編碼具有本發(fā)明的蛋白酶活性的多肽的核酸序列轉(zhuǎn)化以使得表達(dá)和產(chǎn)生可收回?cái)?shù)量的多肽?？蓮闹参锘蛑参锊糠只厥斩嚯摹溥x地，包含重組多肽的植物或植物部分可用作改善食品或飼料的品質(zhì)，例如改善營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、可口性(palatability)、和流變性，或破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。
在特定的實(shí)施方案中，該多肽指向種子中的胚乳貯存液泡。這可通過(guò)合成具有合適信號(hào)肽的前體而獲得，參見Horvath等人in PNAS，2000年2月15日，第97卷，no.4，第1914-1919頁(yè)。
轉(zhuǎn)基因的植物可以是雙子葉(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)或其改造的變體。單子葉植物的實(shí)例是草，例如草地早熟禾(meadow grass)(blue grass，早熟禾屬(Poa))、飼用牧草，例如羊矛屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)、寒地型牧草(temperature grass)，例如剪股穎屬(Agrostis)，以及谷類，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、水稻、高粱和王蜀黍(玉米)。雙子葉植物的實(shí)例是煙草、豆類，例如羽扇豆(lupin)、馬鈴薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆，以及十字花科植物(Cruciferous)(十字花科(Brassicaceae))，例如花椰菜、油菜籽，以及緊密相關(guān)的模式生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。如例如在美國(guó)專利號(hào)5,689,054和美國(guó)專利號(hào)6,111,168中所描述的低-肌醇六磷酸植物是工程化植物的實(shí)例。
植物部分的實(shí)例是莖干、愈傷組織、葉片、根、果實(shí)、種子和球根，以及包括這些部分的個(gè)別組織，例如表皮、葉肉、薄壁組織、維管組織、分生組織。也認(rèn)為特異的植物細(xì)胞隔室，例如葉綠體、非原質(zhì)體、線粒體、液泡、過(guò)氧化物酶體和細(xì)胞質(zhì)是植物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無(wú)論何種組織起源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，也認(rèn)為例如有助于本發(fā)明應(yīng)用的分離的特異組織和細(xì)胞是植物部分，例如胚芽、胚乳、糊粉粒和種皮。
這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的后代也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)將編碼本發(fā)明多肽的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體整合到植物宿主基因組中構(gòu)建植物或植物細(xì)胞，并繁殖所得到的修飾植物或植物細(xì)胞成為轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。
便利地，表達(dá)構(gòu)建體是核酸構(gòu)建體，其包括與在選擇的植物或植物部分中為表達(dá)核酸序列所需要的適當(dāng)調(diào)控序列可操作連接的編碼本發(fā)明多肽的核酸序列。此外，表達(dá)構(gòu)建體可包括用于鑒定其中已經(jīng)整合入表達(dá)構(gòu)建體宿主細(xì)胞和為將構(gòu)建體導(dǎo)入所述植物必需的DNA序列的可選擇標(biāo)記物(后者取決于所使用的DNA導(dǎo)入方法)。
根據(jù)需要多肽在何時(shí)，何處以及如何表達(dá)來(lái)確定調(diào)控序列的選擇，例如啟動(dòng)子和終止子序列以及任選的信號(hào)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因表達(dá)可以是組成性或可誘導(dǎo)的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可定向至例如種子或葉片的特異組織或植物部分。調(diào)控序列是例如Tague等人，1988，Plant Physiology 86506所描述的。
對(duì)于組成性的表達(dá)，可使用下列可使用35S-CaMV啟動(dòng)子(Franck等人，1980，Cell 21285-294)、玉米泛素(Christensen AH，Sharrock RA和Quail 1992.Maize polyubiquitin genesstructure，thermal perturbation ofexpression and transcript splicing，and promoter activity following transfer toprotoplasts by electroporation)、或水稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子(Plant Mo.Biol.18，675-689.；Zhang W，McElroy D.和Wu R 1991，Analysis of rice Actl 5aregion activity in transgenic rice plants.Plant Cell 3，1155-1165)。器官特異性啟動(dòng)子可以是例如，來(lái)自例如種子、馬鈴薯塊莖和果實(shí)的貯存庫(kù)(sink)組織的啟動(dòng)子(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24275-303)、或來(lái)自例如分生組織的代謝貯源組織的啟動(dòng)子(Ito等人，1994，Plant Mol.Biol.24863-878)，種子特異的啟動(dòng)子，例如谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白、或來(lái)自水稻的白蛋白啟動(dòng)子(Wu等人，1998，Plant and Cell Physiology39885-889)、來(lái)自豆球蛋白B4的蠶豆(Vicia faba)啟動(dòng)子和來(lái)自蠶豆的未知種子蛋白質(zhì)基因(Conrad等人，1998，Journal of Plant Physiology 152708-711)、來(lái)自植物油體蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子(Chen等人，1998，Plant and CellPhysiology 39935-941)、來(lái)自蕓苔(Brassica napus)的貯存蛋白質(zhì)napA啟動(dòng)子、或本領(lǐng)域已知的任何其它種子特異的啟動(dòng)子，例如在WO 91/14772中所描述的。此外，啟動(dòng)子可以是葉片特異的啟動(dòng)子，例如來(lái)自水稻或番茄的rbcs啟動(dòng)子(Kyozuka等人，1993，Plant Physiology 102991-1000，小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子(Mitra和Higgins，1994，Plant MolecularBiology 2685-93)、或來(lái)自水稻的aldP基因啟動(dòng)子(Kagaya等人，1995，Molecular and General Genetics 248668-674)、或創(chuàng)傷可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，例如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(Xu等人，1993，Plant Molecular Biology 22573-588)。同樣，啟動(dòng)子可以是通過(guò)非生物的處理，例如溫度、干旱或鹽堿度改變而可誘導(dǎo)的，或通過(guò)外部施用活化啟動(dòng)子的物質(zhì)，例如乙醇、雌激素、植物激素，如乙烯、脫落酸、赤霉酸和/或重金屬而進(jìn)行誘導(dǎo)。
也可使用啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件而在植物中獲得更高表達(dá)的蛋白酶。例如，啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件可以是置于啟動(dòng)子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間的內(nèi)含子。例如，Xu等人，1993，上文公開了利用水稻肌動(dòng)蛋白1基因的第一個(gè)內(nèi)含子以增強(qiáng)表達(dá)。
更進(jìn)一步地，可針對(duì)所述需要改善表達(dá)的植物品種優(yōu)化密碼子使用率(參見Horvath等人參考上文)。
可在本領(lǐng)域中選擇可利用的選擇性標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分。
根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)將核酸構(gòu)建體結(jié)合到植物基因組中，包括土壤桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微注射、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等人，1990，Science 2441293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8535；Shimamoto等人，1989，Nature 338274)。
目前，根瘤土壤桿菌-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是選擇用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的方法(關(guān)于綜述，參見Hooykas和Schilperoort，1992，Plant MolecularBiology 1915-38)，并且它也可用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，盡管對(duì)于這些植物其它的轉(zhuǎn)化方法一般是優(yōu)選的。目前，選擇用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的方法，補(bǔ)充土壤桿菌方法的是粒子轟擊(包被有轉(zhuǎn)化DNA的顯微黃金或鎢顆粒)胚愈傷組織或發(fā)育的胚芽(Christou，1992，Plant Journal 2275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology5158-162；Vasil等人，1992，Bio/Technology 10667-674)。用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的備選方法是基于如Omirulleh等人，1993，Plant Molecular Biology 21415-428所描述的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)化后，選擇其中已經(jīng)整合入表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體，并且根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法使其再生成為完全的植株。
本發(fā)明也涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有利于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包括編碼具有本發(fā)明蛋白酶活性的多肽德核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；以及(b)回收該多肽。
動(dòng)物本發(fā)明也涉及轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物和其產(chǎn)物或元件，其實(shí)例是例如乳汁和血液的體液、器官、肌肉和動(dòng)物細(xì)胞。用于在例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，參見例如手冊(cè)Protein ExpressionA PracticalApproach，Higgins and Hames(編輯)，Oxford University Press(1999)，和其它3本該系列關(guān)于基因轉(zhuǎn)錄、RNA加工和翻譯后過(guò)程的手冊(cè)。一般說(shuō)來(lái)，為了制備轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物，所選擇動(dòng)物的選擇細(xì)胞是用編碼具有本發(fā)明蛋白酶活性的多肽的核酸序列轉(zhuǎn)化以便表達(dá)和產(chǎn)生該多肽?？蓮膭?dòng)物，例如雌性動(dòng)物的乳汁回收多肽，或表達(dá)該多肽可能對(duì)動(dòng)物本身有益，例如有助于該動(dòng)物的消化。下文在標(biāo)題為動(dòng)物飼料的小節(jié)提及動(dòng)物的實(shí)例。
考慮到從動(dòng)物的乳汁回收蛋白酶，為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物，可將編碼蛋白酶的基因插入到所述動(dòng)物的受精卵中，例如使用包括合適的乳蛋白啟動(dòng)子和編碼蛋白酶的基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體。將轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體微注射到受精卵中，并且優(yōu)選永久地整合到染色體中。一旦卵開始生長(zhǎng)和分裂，將潛能胚胎植入到代孕母體中，并且鑒定攜帶轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。因此可通過(guò)傳統(tǒng)的育種繁殖所得到的動(dòng)物?？蓮膭?dòng)物的乳汁純化多肽，參見例如Meade，H.M.等人(1999)Expression of recombinant proteins in the milk of transgenicanimals，Gene expression systemsUsing nature for the art of expression.J.M.Fernandez and J.P.Hoeffler(編輯)，Academic Press。
可選的，為了產(chǎn)生在其體和/或生殖細(xì)胞的基因組中攜帶核酸序列，包括包含編碼蛋白酶的轉(zhuǎn)基因的異種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，可如在WO 2000064247中所公開的，將轉(zhuǎn)基因與用于蛋白酶的唾液腺特異性表達(dá)的第一調(diào)控序列可操作地連接。
組合物在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明多肽的組合物。
可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備多肽組合物并且其可以是液體或干燥組合物的形式。例如，多肽組合物可以是顆?；蛭⒘；男问?。可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法穩(wěn)定被包括在組合物中的多肽。
如下給出優(yōu)選使用本發(fā)明的多肽或多肽組合物的實(shí)例。
動(dòng)物飼料本發(fā)明也涉及在動(dòng)物飼料中利用本發(fā)明蛋白酶的方法，以及包括這些多肽的飼料組合物和飼料添加劑。
術(shù)語(yǔ)動(dòng)物包括所有的動(dòng)物，包括人類。動(dòng)物的實(shí)例是非反芻動(dòng)物、和反芻動(dòng)物，例如綿羊、山羊、馬和牛，例如肉用牛(bef cattle)、奶牛和仔牛犢。在特定的實(shí)施方案中，動(dòng)物是非反芻動(dòng)物動(dòng)物。非反芻動(dòng)物動(dòng)物包括單胃動(dòng)物，例如豬或家豬(swine)(包括但不限于，仔豬、生長(zhǎng)豬和大母豬)；家禽，例如火雞、鴨和雞(包括但不限于肉用小雞(broiler chicks)、產(chǎn)蛋雞(layer))；仔牛犢；和魚(包括但不限于鮭魚、鱒魚、羅非魚、鯰魚和鯉魚)；以及甲殼類(包括但不限于蝦和對(duì)蝦)。
術(shù)語(yǔ)飼料或飼料組合物是指適于或旨在用于動(dòng)物攝取的任何化合物、制劑、混合物、或組合物。
根據(jù)本發(fā)明的用途，可將蛋白酶在日常飲食之前、之后或同時(shí)喂給動(dòng)物。后者是優(yōu)選的。
在特定的實(shí)施方案中，明確限定蛋白酶加入飼料的形式或何時(shí)包括在飼料添加劑中。明確限定是指通過(guò)大小排阻色譜法確定蛋白酶制劑是至少50％純的(參見WO 01/58275的實(shí)施例12)。在其它特定的實(shí)施方案中，通過(guò)這個(gè)方法確定的蛋白酶制劑是至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95％純的。
明確限定的蛋白酶制劑是有利的。例如，對(duì)于飼料使用基本上沒有其它蛋白酶干擾或污染的蛋白酶更容易正確用量。術(shù)語(yǔ)正確用量特別是指為了獲得一致和恒定結(jié)果的目的，以及根據(jù)預(yù)期效果優(yōu)化劑量的能力。
然而關(guān)于動(dòng)物飼料中的使用，蛋白酶不必是很純的；它可例如包括其它的酶，而在這種情況下它可限定為蛋白酶制劑。
蛋白酶制劑可以是(a)直接加入飼料(或在植物蛋白的處理過(guò)程中直接使用)，或(b)可用于一個(gè)或多個(gè)中間組合物，例如飼料添加劑或預(yù)混合料的生產(chǎn)，隨后將其加入飼料(用于處理過(guò)程)。如上所述的純度是指原始蛋白酶制劑的純度，不管是用于上述的(a)或(b)。
利用重組的生產(chǎn)方法可特別地獲得具有這個(gè)數(shù)量級(jí)純度的蛋白酶制劑，然而不是可輕易地獲得它們，并且當(dāng)通過(guò)傳統(tǒng)發(fā)酵方法生產(chǎn)蛋白酶時(shí)，會(huì)有更多的批間差異。
當(dāng)然這種蛋白酶制劑可與其它酶混合。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的蛋白酶能夠溶解植物蛋白。在WO01/58276的實(shí)施例4中公開了用于確定溶解蛋白質(zhì)的合適分析。
如在此所使用的術(shù)語(yǔ)植物蛋白是指包括至少一種衍生自或起源于植物的蛋白質(zhì)，包括修飾的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-衍生物的任何化合物、組合物、制劑或混合物。在特定的實(shí)施方案中，植物蛋白的蛋白質(zhì)含量是至少10、20、30、40、50、或60％(w/w)。
植物蛋白可衍生自植物蛋白來(lái)源，例如豆類和谷類，例如來(lái)自豆科(Leguminosae)、十字花科、藜科(Chenopodiaceae)、和禾本科(Poaceae)植物的材料，例如大豆粗粉、羽扇豆粗粉和油菜籽粉。
在特定的實(shí)施方案中，植物蛋白來(lái)源是來(lái)自一種或多種豆科植物，例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆的材料。
在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，植物蛋白來(lái)源是來(lái)自一種或多種藜科植物，例如甜菜、制糖甜菜(sugar beet)、菠菜或奎藜籽(quinoa)的材料。
植物蛋白來(lái)源的其它實(shí)例是油菜籽和卷心菜。
大豆是優(yōu)選的植物蛋白來(lái)源。
植物蛋白來(lái)源的其它實(shí)例是谷類，例如大麥、小麥、黑麥、燕麥、王蜀黍(玉米)、水稻和高粱。
用本發(fā)明的至少一種蛋白酶處理本發(fā)明所述的植物蛋白導(dǎo)致增加植物蛋白的溶解作用。
術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)的溶解作用主要是指使蛋白質(zhì)成為溶液。這種溶解作用可能是由于蛋白酶介導(dǎo)從通常復(fù)合的天然組合物，例如飼料的其它成分釋放蛋白質(zhì)?？筛鶕?jù)參照沒有蛋白酶處理的空白樣品，可溶蛋白質(zhì)數(shù)量的增加來(lái)測(cè)量溶解作用。
在本發(fā)明(預(yù))處理過(guò)程的的特定實(shí)施方案中，所述的蛋白酶影響(或作用于，或施加其溶解影響于)植物蛋白或蛋白質(zhì)來(lái)源。為了獲得這些，一般將植物蛋白或蛋白質(zhì)來(lái)源懸浮在例如水溶劑的溶劑中，例如水，并且調(diào)節(jié)pH和溫度值，尤其考慮到所述酶的特性。例如，可在實(shí)際蛋白酶的活性至少相同的pH-值下進(jìn)行處理，例如可在實(shí)際蛋白酶的活性至少40％、50％、60％、70％、80％或至少90％的溫度下進(jìn)行處理。上述百分比活性表示相對(duì)的最大活性。繼續(xù)酶促反應(yīng)直到獲得所需要的結(jié)果，其后可以或未必通過(guò)使酶失活，例如通過(guò)熱處理步驟而加以終止。
在本發(fā)明處理過(guò)程的另一個(gè)特定實(shí)施方案中，持續(xù)蛋白酶作用，意味著例如向植物蛋白或蛋白質(zhì)來(lái)源加入蛋白酶，但其溶解影響可能沒有啟動(dòng)直到稍晚，當(dāng)需要時(shí)，一旦建立合適的溶解條件，或一旦任何酶抑制劑失活，或諸如此類的其它方式可用于推遲酶的作用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，處理是動(dòng)物飼料或植物蛋白的預(yù)處理而用于動(dòng)物飼料。
術(shù)語(yǔ)改善動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值是指改善蛋白質(zhì)的可利用性，由此導(dǎo)致增加蛋白質(zhì)的提取、更高的蛋白產(chǎn)率、和/或改善的蛋白質(zhì)利用。因此增加飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善動(dòng)物的生長(zhǎng)速率和/或增重和/或飼料轉(zhuǎn)化(即相對(duì)于體重增加的可攝取飼料的重量)。
可以任何形式向飼料加入蛋白酶，可以是相對(duì)純的蛋白酶，或與旨在加入動(dòng)物飼料的其它成分混合，即以動(dòng)物飼料添加劑的形式，例如所謂用于動(dòng)物飼料的預(yù)混合物。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及用于動(dòng)物飼料的組合物，例如動(dòng)物飼料，和動(dòng)物飼料添加劑，例如預(yù)混合料。
除本發(fā)明的蛋白酶外，本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑包含至少一種脂溶性的維生素，和/或至少一種水溶性的維生素，和/或至少一種微量礦物質(zhì)。飼料添加劑也可包含至少一種大量礦物。
進(jìn)一步任選的，飼料-添加劑是著色劑、芳香族化合物、穩(wěn)定劑、抗菌的肽，包括抗真菌的多肽，和/或至少一種選自下列的其它酶肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4.-.-)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。
在特定的實(shí)施方案中，這些其它酶是明確限定的(如上述用于蛋白酶制劑所限定)。
抗菌肽(AMP′s)的實(shí)例是CAP18、Leucocin A、Tritrpticin、內(nèi)源性抗微生物多肽-1、Thanatin、防衛(wèi)素(Defensin)、乳鐵傳遞蛋白、乳鐵結(jié)合蛋白和Ovispirin，例如Novispirin(Robert Lehrer，2000)、Plectasins、和抑制素，包括在WO 03/044049和WO 03/048148中公開的化合物和多肽，以及上述保持抗菌活性的肽的變體或片段。
抗真菌多肽(AFP′s)的實(shí)例是巨曲霉(Aspergillus giganteus)，和黑曲霉肽，以及保持抗真菌活性的其變體和片段，如在WO 94/01459和WO02/090384中所公開的。多聚不飽和脂肪酸的實(shí)例是C18、C20和C22多聚不飽和脂肪酸，例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亞油酸。產(chǎn)生活性氧種類的實(shí)例是例如過(guò)硼酸鹽、過(guò)硫酸鹽、或過(guò)碳酸鹽的化學(xué)試劑；和例如氧化酶、氧合酶或合成酶。
通常脂溶或水溶性的維生素，以及微量礦物質(zhì)形成將加入飼料的所謂預(yù)混合料的部分，而通常將大量礦物質(zhì)單獨(dú)加入飼料。富集本發(fā)明蛋白酶的預(yù)混合料是本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑的實(shí)例。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑預(yù)期包括(或如必須包括時(shí)規(guī)定)在動(dòng)物的日常飲食中，或以0.01至10.0％；更特別為0.05至5.0％；或0.2至1.0％的水平喂飼(％是指每100g飼料的g添加劑)。這特別地用于預(yù)混合料。
下列是這些成分實(shí)例的非排他性列表脂溶性維生素的實(shí)例是維生素A、維生素D3、維生素E和維生素K，例如維生素K3。
水溶性維生素的實(shí)例是維生素B12、生物素和膽堿、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸和泛酸(panthothenate)、例如Ca-D-泛酸。
微量礦物質(zhì)的實(shí)例是錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。
大量礦物質(zhì)的實(shí)例是鈣、磷和鈉。
這些成分的營(yíng)養(yǎng)需要量(以家禽和仔豬/豬例證)如WO 01/58275的表A所列。營(yíng)養(yǎng)需要量是指在日常飲食中應(yīng)以指明的濃度提供這些成分。
可選的，本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑包括WO01/58275的表A中列舉的至少一種單獨(dú)成分。在本文中，至少一種意味著任何一種、一種或多種、一種或2、或3、或4種等直到所有的13種、或直到所有的15種單獨(dú)成分。更具體地說(shuō)，這個(gè)至少一種單一成分包括在本發(fā)明的添加劑中，其在飼料濃度中呈現(xiàn)的數(shù)量是在表A的第4欄、第5欄、或第6欄指明的范圍內(nèi)。
同時(shí)上述″至少一個(gè)″的定義一般有效的遍及本專利申請(qǐng)--當(dāng)然在以此類推的基礎(chǔ)上，是指該定義的上限，在上述的實(shí)例15種中，當(dāng)然應(yīng)反映為在各個(gè)特定情況中給出選擇的最大數(shù)目。
本發(fā)明也涉及動(dòng)物飼料組合物。動(dòng)物飼料組合物或日常飲食具有相對(duì)高含量的蛋白質(zhì)。可如WO 01/58275的表B中第2-3欄所指明的表征家禽和豬的調(diào)養(yǎng)飼料。可如該表B的第4欄中所指明的表征魚調(diào)養(yǎng)飼料。此外這種魚調(diào)養(yǎng)飼料通常具有200-310g/kg含量的粗脂肪。
本發(fā)明所述的動(dòng)物飼料組合物具有50-800g/kg含量的粗蛋白，此外包括至少一種在此所要求保護(hù)的蛋白酶。
此外，或可選的(關(guān)于如上所述的粗蛋白含量)，本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物具有10-30MJ/kg的可代謝能量含量；和/或0.1-200g/kg的鈣含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸含量。
在特定的實(shí)施方案中，代謝能量、粗蛋白、鈣、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或賴氨酸的含量是在WO 01/58275表B中第2、3、4或5中任何一項(xiàng)的范圍內(nèi)(R.2-5)。
通過(guò)將氮(N)乘以因子6.25來(lái)計(jì)算粗蛋白，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。通過(guò)Kjeldahl定氮法(A.O.A.C.，1984，Official Methods ofAnalysis第14版，Association of Official Analytical Chemists，Washington DC)確定含氮量。
可根據(jù)NRC出版物Nutrient requirements in swine，第9修訂版，1988，subcommittee on swine nutrition，committee on animal nutrition，board ofagriculture，national research council.National Academy Press，華盛頓，D.C.，第2-6頁(yè)，和用于家禽飼料-原料的能量值歐洲表，Spelderholt centre forpoultry research and extension，7361 DA Beekbergen，荷蘭，Grafisch bedrijfPonsen & looijen bv，Wageningen.ISBN 90-71463-12-5來(lái)計(jì)算可代謝能量。
根據(jù)例如Veevoedertabel 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde vanvoedermiddelen，Central Veevoederbureau，Runderweg 6，8219 pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7的飼料表來(lái)計(jì)算完全的動(dòng)物調(diào)養(yǎng)飼料中的飲食性鈣、有效磷和氨基酸含量。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物包含至少一種如上所限定的植物蛋白或蛋白質(zhì)來(lái)源。
在更進(jìn)一步的特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物包含0-80％的玉米；和/或0-80％的高粱；和/或0-70％的小麥；和/或0-70％的大麥；和/或0-30％的燕麥；和/或0-40％的大豆粉；和/或0-10％的魚粉；和/或0-20％的乳清。
可將動(dòng)物調(diào)養(yǎng)飼料制備成例如粉料(非顆粒)或顆粒飼料。一般地，混合碾磨的飼料-原料并且根據(jù)所述種屬的規(guī)格加入足夠數(shù)量的必需維生素和礦物質(zhì)?？杉尤牍腆w的酶或液體酶制劑。例如，一般在混合步驟前或在混合期間加入固體酶制劑；而一般在壓丸(pelleting)步驟后加入液體酶制劑。也可將酶摻入到飼料添加劑或預(yù)混合料中。
調(diào)養(yǎng)飼料中的最終酶濃度是在每kg調(diào)養(yǎng)飼料0.01-200mg酶蛋白的范圍內(nèi)，例如在每kg動(dòng)物調(diào)養(yǎng)飼料0.5-25，或5-30的范圍內(nèi)。
當(dāng)然應(yīng)該以有效量施加蛋白酶，即足夠用于改善溶解作用和/或增加飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的數(shù)量。目前預(yù)期施用酶的一種或多種數(shù)量如下(劑量范圍)0.01-200；0.01-100；0.05-100；0.5-100；1-100；5-100；10-100；0.05-50；1-50；或0.10-10，所有這些范圍是每kg飼料的mg蛋白酶的酶蛋白質(zhì)(ppm)。
為了確定每kg飼料的mg酶蛋白，從飼料組合物純化蛋白酶，利用相應(yīng)的分析確定純化蛋白酶的特異活性(見至活性，底物和分析)。利用相同的分析也因而確定飼料組合物的蛋白酶活性，并且根據(jù)這2個(gè)測(cè)定，計(jì)算每kg飼料的mg酶蛋白方式的劑量。
將相同的原則用于確定飼料添加劑中的mg酶蛋白。當(dāng)然，如果可得到用于制備飼料添加劑或飼料的蛋白酶的樣品，由此樣品確定特異活性(不必從飼料組合物或添加劑純化蛋白酶)。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑是預(yù)混合料。通常旨在將預(yù)混合料加入(夾雜至)動(dòng)物飼料中。飼料中預(yù)混合料的一般包含率是0.01-10.0％，更特別為0.05-5.0％，或0.2-1.0％，一般為0.5-1.0％。當(dāng)動(dòng)物飼料中預(yù)混合料的包含率改變時(shí)，在預(yù)定、或指定多種成分的飼料中濃度方面描述這種預(yù)混合料是很有意義的。
本發(fā)明的預(yù)混合料包含本發(fā)明的蛋白酶，此外包含至少一種脂溶性-和/或水溶性維生素，和/或至少一種微量礦物質(zhì)。
在特定的實(shí)施方案中，預(yù)混合料包括、包含或含有微量礦物質(zhì)銅，通常為銅鹽或銅離子的形式，即在其特定的無(wú)機(jī)鹽中分別為Cu2+或Cu+。在本發(fā)明的預(yù)混合料的特定實(shí)施方案中預(yù)混合料包含的銅(Cu)的數(shù)量為，當(dāng)以規(guī)定的包含率包括在飼料中時(shí)，飼料中的濃度(″在飼料中-濃度″)為1-500ppm的銅(ppm意味著例如mg/kg飼料)。
在進(jìn)一步的特定實(shí)施方案中，銅的飼料中濃度低于或等于5、10、20、25、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、300，或低于或等于400ppm。另一方面，Cu的飼料中濃度應(yīng)為至少Cu0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0，或至少5.0ppm。在此具體地包括利用上述指明的上下限中任何組的飼料中濃度的任何范圍。其非限制性的實(shí)例是0.2-100、0.4-100、0.6-200、0.8-100、1-25、1-50、1-100、1-140、1-150、2-100、3-100、4-100、5-100、3-200、4-200、5-200、3-300、4-300和5-300ppm Cu。
因而預(yù)混合料中Cu的濃度當(dāng)然比預(yù)定的飼料中濃度高，一般為飼料中濃度的100-200倍(分別以1％和0.5％的包含率為基礎(chǔ))。因此，預(yù)混合料可能含有、包含或包括濃度達(dá)到100,000ppm(500ppm飼料中濃度的200倍)的Cu，甚至更高。下列是預(yù)混合料中Cu濃度最大量的非限制性實(shí)例1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000ppm Cu。下列是預(yù)混合料中Cu濃度最小量的非限制性實(shí)例100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900，或2000ppm Cu。在此具體地包括利用上述指明的上下限中任何組的預(yù)混合料中濃度的任何范圍。其非限制性的實(shí)例是100-100,000；200-90，000；300-80,000；400-70,000；500-50,000；100-10,000；100-5,000；和100-2000ppmCu。
下列是本發(fā)明的預(yù)混合料組合物的具體實(shí)例，所有的另外包括本發(fā)明的蛋白酶，其飼料中濃度為1-50mg/kg。多種其它預(yù)混合料成分下標(biāo)明的濃度也是是飼料中濃度(每kg的飼料)。
用于仔豬調(diào)養(yǎng)飼料的預(yù)混合料(完全的配合飼料)135ppm Cu、100ppmZn、90ppm Fe、50mg Mn、1.24ppm I、0.3ppm Se、0.10ppm Co、10000IE/kgvit.A、2000IE/kg vit.D3、90mg/kg vit.E、2.25ppm vit.B1、3.75ppm vit.B2、10.50ppm vit.B3、7.5ppm vit.B6、0.03ppm vit.B12、0.75ppm vit.K、0.06ppm vit.H、0.9ppm葉酸、16.5ppm煙酸。
另一種仔豬調(diào)養(yǎng)飼料的預(yù)混合料14400IE vit.A、120000IE vit.D3、1440mg vit.E、2.4mg vit.B1、7.2mg vit.B2、30mg煙酸、4.8mg vit.B6、48μg vit.B12、240μg生物素、21.6mg泛酸、600mg氯化膽堿(Cholinchloride)、120mgZn、90mg Fe、90mg Mn、24mg Cu、1.8mg I、0.84mgCo、0，48mgSe、600mgMg。
第三種仔豬調(diào)養(yǎng)飼料的預(yù)混合料210mg Zn、246mg Fe、84mg Mn、24mg Cu，和4mg I。
用于肉用仔雞調(diào)養(yǎng)飼料的預(yù)混合料視黃醇4.05；膽鈣化醇0.05；生育酚13.5；甲萘醌2.25；硫胺素1；膽堿375；核黃素5.4；泛酸(panthothenicacid)13.5；吡哆醇1.1；氰鈷胺素0.01；煙酸(nicotonic)40；生物素0.15；I 2.1；Co 1.4；Se 0.43；Cu 7.2；Mn 86；Zn 57；Fe 65；Mg 110。
用于其它肉用仔雞調(diào)養(yǎng)飼料的預(yù)混合料包含8或10mg Cu/kg調(diào)養(yǎng)飼料。
清潔劑組合物本發(fā)明的蛋白酶可加入清潔劑組合物并且因此成為清潔劑組合物的組分。
可將本發(fā)明的清潔劑組合物例如配制成為手洗或機(jī)洗清潔劑組合物，其包括適于預(yù)處理染色織物和漂洗加入的織物軟化劑組合物的洗滌添加劑組合物，或配制成為供普通家庭的硬表面清洗操作之用的清潔劑組合物，配制用于手工或機(jī)械洗滌的操作。
在特定的方面，本發(fā)明提供包括本發(fā)明蛋白酶的去污添加劑。去垢添加劑以及清潔劑組合物可包括一種或多種其它的酶，例如脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或過(guò)氧化物酶。
總的來(lái)說(shuō)，所選擇的酶的特性應(yīng)與所選擇的清潔劑相適合，(即最適pH，與其它酶促或非酶促成分的相容性等)，并且該酶應(yīng)以有效量存在。
合適的脂肪酶包括細(xì)菌或真菌起源的脂肪酶。包括化學(xué)上改進(jìn)或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用脂肪酶的實(shí)例包括來(lái)自腐殖菌屬(同義語(yǔ)Thermomyces)的脂肪酶，例如來(lái)自如EP 258068和EP 305216中所描述的H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶，或來(lái)自如WO 96/13580中所描述的H.insolens的脂肪酶，假單胞菌(pseudomonas)脂肪酶，例如來(lái)自產(chǎn)堿桿菌假單胞菌(P.alcaligenes)或類產(chǎn)堿桿菌假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、施氏假單胞菌(P.Stutzeri)(GB 1,372,034)、熒光假單胞菌(P.Fluorescens)、假單胞菌種菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶，芽胞桿菌脂肪酶，例如來(lái)自枯草芽胞桿菌(Dartois等人(1993)，Biochemica et biophysica Acta，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽胞桿菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。其它的實(shí)例是，例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260105、WO 95/35381、WO96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO97/04079和WO 97/07202中所描述的脂肪酶變體。優(yōu)選的可商業(yè)購(gòu)買的脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novozymes A/S)。
合適的淀粉酶(α-和/或β-)包括細(xì)菌或真菌起源的淀粉酶。包括化學(xué)上改進(jìn)或蛋白質(zhì)工程化的突變體。淀粉酶包括例如，從芽胞桿菌，例如地衣芽孢桿菌的特殊菌株獲得的α-淀粉酶，其在GB 1,296,839中有詳細(xì)描述。有用淀粉酶的實(shí)例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、和WO97/43424中描述的變體，特別是在下列一個(gè)或多個(gè)位置中有取代15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444?？缮虡I(yè)購(gòu)買的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(Novozymes A/S)、RapidaseTM和PurastarTM(來(lái)自Genencor International Inc.)。
合適的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌起源的纖維素酶。包括化學(xué)上改進(jìn)或蛋白質(zhì)工程化的突變體。合適的纖維素酶包括來(lái)自芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、腐殖菌屬、鐮刀菌屬、草根霉屬、枝頂孢屬的纖維素酶，例如由US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178，US 5,776,757和WO89/09259中公開的Humicola insolens、嗜熱毀絲霉和尖孢鐮孢產(chǎn)生的真菌纖維素酶。特別合適的纖維素酶是具有注意顏色好處(color care benefit)的堿性或中性的纖維素酶。這種纖維素酶的實(shí)例是在EP 0495257、EP 531372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纖維素酶。其它的實(shí)例是例如在WO94/07998、EP 0531315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和WO 99/01544中描述的纖維素酶變體?？缮虡I(yè)購(gòu)買的纖維素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(Novozymes A/S)、ClazinaseTM、和Puradax HATM(Genencor International Inc.)、和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
合適的過(guò)氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌起源的酶。包括化學(xué)上改進(jìn)或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用的過(guò)氧化物酶的實(shí)例包括來(lái)自鬼傘菌(Coprinus)，例如灰蓋鬼傘(C.cinereus)的過(guò)氧化物酶，以及在WO93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中描述的其變體?？缮虡I(yè)購(gòu)買的過(guò)氧化物酶包括GuardzymeTM(Novozymes)。
可通過(guò)加入包含一種或多種酶的單獨(dú)添加劑，或通過(guò)加入包括所有這些酶的組合添加劑使清潔劑酶包括在清潔劑組合物中?？梢灶w粒、液體、勻漿等的形式配制本發(fā)明的去垢添加劑，即單獨(dú)的添加劑或組合添加劑。優(yōu)選的去垢添加劑制劑是顆粒，特別是無(wú)粉塵的顆粒、液體，特別是穩(wěn)定的液體、或勻漿。
可如在US 4,106,991和4,661,452中公開的生產(chǎn)無(wú)粉塵的顆粒，并且可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法任選進(jìn)行涂層。蠟狀涂層材料的實(shí)例是平均摩爾量為1000至20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50個(gè)環(huán)氧乙烷單元的乙氧基壬基酚；其中包含12至20個(gè)碳原子并且存在15至80個(gè)環(huán)氧乙烷單位的乙氧基脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的單和雙和三酸甘油酯。在GB 1483591中給出了適于通過(guò)流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜涂層材料的實(shí)例?？筛鶕?jù)已建立的方法，通過(guò)加入多元醇，例如丙二醇，糖或糖醇、乳酸或硼酸穩(wěn)定液體酶制劑。可根據(jù)EP 238216中公開的方法制備保護(hù)酶。
本發(fā)明的清潔劑組合物可以是任何便利的形式，例如棒狀、片劑、粉劑、顆粒、糊劑或液體。液體洗滌劑可以是含水的，一般包含達(dá)到70％的水和0-30％的有機(jī)溶劑，或是無(wú)水的。
清潔劑組合物包括一種或多種表面活性劑，其可以是非離子的，包括半極性的和/或陰離子和/或陽(yáng)離子和/或兩性離子的。表面活性劑一般以按重量計(jì)0.1％至60％的水平存在。
當(dāng)包括在其中時(shí)，清潔劑通常包含大約1％至大約40％的陰離子表面活性劑，例如直鏈烷基苯磺酸鹽、α-烯烴磺酸鹽、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸酯、仲烷基磺酸鹽、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基丁二酸或肥皂。
當(dāng)包括在其中時(shí)，清潔劑通常包含大約0.2％至大約40％的非離子型表面活性劑，例如脂肪醇乙氧基化合物、羥乙基壬基酚酯、烷基聚糖苷、烷基二甲基胺氧化物、羥乙基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、聚羥基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(″葡糖酰胺″)。
清潔劑可能包含0-65％的清潔劑增效助劑或絡(luò)合劑，例如沸石、二磷酸、三磷酸、膦酸酯、碳酸酯、檸檬酸酯、次氮基三乙酸(氨三乙酸)、乙二胺四乙酸、二乙撐三胺五乙酸、烷基或烯基丁二酸、可溶性硅酸鹽或分層的硅酸鹽(例如來(lái)自Hoechst的SKS-6)。
清潔劑可包括一種或多種聚合物。實(shí)例是羧甲基纖維素、聚(乙烯替吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡淀-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯，例如聚丙烯酸酯、馬來(lái)酸/丙烯酸酯共聚合物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸酯共聚合物。
清潔劑可能包含包括H2O2來(lái)源的漂白系統(tǒng)，例如可與過(guò)酸形式的漂白活化劑，例如四乙?；叶坊蛉甚；椒踊撬猁}結(jié)合的過(guò)硼酸鹽或過(guò)碳酸鹽。備選地，漂白系統(tǒng)可包括例如酰胺、二酰亞胺、或砜類型的過(guò)氧酸。
可利用傳統(tǒng)的穩(wěn)定劑，例如多元醇，例如丙二醇或甘油，糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物，例如芳族的硼酸酯、或苯基硼酸衍生物，例如4-甲?；交鹚醽?lái)穩(wěn)定本發(fā)明的清潔劑組合物的酶，并且可如例如WO92/19709和WO 92/19708中所述的配制組合物。
清潔劑也可包含其它的傳統(tǒng)清潔劑成分，例如織物調(diào)節(jié)劑，包括粘土、發(fā)泡劑、抑泡劑、防腐劑、污垢懸浮劑、抗污垢再沉積試劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑、水溶增溶劑、晦暗抑制劑或芳香劑。
目前預(yù)期在清潔劑組合物中，可加入相當(dāng)于每升洗滌溶液0.01-100mg酶蛋白的數(shù)量的任何酶，特別是本發(fā)明的酶，優(yōu)選每升洗滌溶液0.05-5mg的酶蛋白，特別是每升洗滌溶液0.1-1mg的酶蛋白。
可將本發(fā)明的酶另外摻入在WO 97/07202中公開的清潔劑制劑。
生物材料的保藏下列生物材料已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約的條款分別保藏在NRRL(農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心)、DSM(德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，MascheroderWeg 1b，38124Braunschweig，德國(guó))，和CGMCC(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，北京100080，中國(guó))，并給出下列保藏號(hào)
菌株達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種DSM 43235可從DSM公開獲得。這個(gè)菌株也保藏在其它的下列保藏機(jī)構(gòu)ATCC 23219、IMRU 1250、NCTC 10489。菌株擬諾卡氏菌NRRL 18262與另一個(gè)專利申請(qǐng)的提交相關(guān)而進(jìn)行了保藏。
在37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122下，在專利與商標(biāo)官員確定本專利申請(qǐng)懸而未決至授權(quán)期間，將可獲得已經(jīng)在保證獲得培養(yǎng)物的條件下保藏的菌株。保藏物表示保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交相關(guān)主題申請(qǐng)的副本或其后續(xù)申請(qǐng)的國(guó)家中，根據(jù)國(guó)外專利法律的要求，該保藏物是可利用的。然而，應(yīng)該理解保藏物的可利用性不構(gòu)成在通過(guò)政府作用所授予專利權(quán)的損抑中實(shí)施相關(guān)主題發(fā)明的許可。
Brachysporiella菌株CGMCC 0865是在中國(guó)于1998年10月從未鑒定植物的死亡分支(branches)中分離的。菌株Nocardiopsis prasina DSM 15648、Nocardiopsis prasinaDSM 15649和Nocardiopsis alba DSM 15647是在丹麥于2001年從土壤樣品中分離的。
在此所描述和要求保護(hù)的本發(fā)明不限于在此所公開的特定實(shí)施方案所限制的范圍，因?yàn)檫@些實(shí)施方案旨在例證說(shuō)明本發(fā)明的幾個(gè)方面。任何等同的實(shí)施方案都是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的。實(shí)際上，除在此所顯示和描述的實(shí)施方案外，從上述說(shuō)明書看來(lái)，本發(fā)明的各種改變對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。這種改變也是屬于所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)的。就分岐來(lái)說(shuō)，包括定義的本公開的內(nèi)容將進(jìn)行控制。
在此引用多種參考文獻(xiàn)，其公開的內(nèi)容全部引入作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1蛋白酶利用常規(guī)方法從各個(gè)野生型菌株或重組宿主細(xì)胞的發(fā)酵物純化下列蛋白酶蛋白酶10(SEQ ID NO2的第1-188位氨基酸)、蛋白酶18(SEQ ID NO12的第1-188位氨基酸)、Brachysporiella蛋白酶(SEQ ID NO14的第1-186位氨基酸)、綠僵菌(Metarhizium)蛋白酶(SEQ ID NO4的第1-188位氨基酸)、蛋白酶08(SEQ ID NO10的第1-188位氨基酸)、蛋白酶11(SEQID NO6的第1-188位氨基酸、和蛋白酶35(SEQ ID NO8的第1-188位氨基酸)。
經(jīng)SDS-PAGE確定的蛋白酶制劑的純度(參見實(shí)施例2)在95％以上，并且吸光率純度(A280/A260比率；參見實(shí)施例3)在1.40以上。
實(shí)施例2通過(guò)SDS-PAGE確定純度實(shí)施例1中提及的蛋白酶純度是通過(guò)SDS-PAGE利用下列步驟確定的將40μl(微升)蛋白酶溶液(A280濃度＝0.025)與40μl 0.1M的PMSF在置于冰上的Eppendorf試管中混合并靜置半小時(shí)。然后向Eppendorf管加入20μl 50％(w/v)的TCA(三氯乙酸)。在冰上又放置半小時(shí)后，離心試管(5分鐘，0℃，14.000×g)并小心地除去上清液。向沉淀加入20μl SDS-PAGE樣品緩沖液(200μl Tris-甘氨酸SDS樣品緩沖液(2×)(125mM Tris/HCl，pH6.8，4％(w/v)SDS，50ppm溴酚藍(lán)，20％(v/v)甘油，LC2676，來(lái)自InvitrogenTM)+160μl蒸鎦水+20μl β-巰基乙醇+20μl 3M未緩沖的Tris Base(Sigma T-1503)并煮沸試管3分鐘。短暫離心試管并且將10μl樣品加入來(lái)自InvitrogenTM的4-20％梯度的Tris-甘氨酸預(yù)澆制的凝膠(基于Laemmli的化學(xué)，但在凝膠中沒有SDS(Laemmli，英國(guó)，(1970)Nature，vol.227，pp.680-685)，EC60255)的聚丙烯酰胺梯度凝膠)。用Tris-甘氨酸電泳緩沖液(2.9gTris Base，14.4g甘氨酸，1.0g SDS，加蒸餾水至1L)在緩沖槽(reservoirs)中以150V的恒定電壓進(jìn)行電泳，直到溴酚藍(lán)示蹤染料到達(dá)凝膠的底部。電泳后，用100ml蒸餾水通過(guò)輕柔的晃動(dòng)漂洗凝膠3次，每次5分鐘。然后用Gelcode藍(lán)染試劑(來(lái)自PIERCE的膠體考馬斯G-250產(chǎn)品，PIERCE目錄號(hào)24592)輕柔晃動(dòng)凝膠1小時(shí)，并通過(guò)用蒸餾水輕柔晃動(dòng)洗滌8至16小時(shí)，其中幾次更換蒸餾水。最后，在兩片玻璃紙之間干燥凝膠。用來(lái)自AGFA的裝備有Fotolook 95v2.08軟件的Arcus II掃描儀掃描，并且通過(guò)File/Acquire命令輸入Windows的圖像評(píng)估軟件CREAMTM(目錄號(hào)990001和990005，Kem-En-Tec，丹麥)，其設(shè)置如下(Fotolook 95 v2.08的)起始＝反射，模式＝彩色RGB，掃描分別率＝240ppi，輸出分辨率＝1201pi，比例系數(shù)＝100％，范圍＝整體選擇的直方圖，以及Min＝0和Max＝215，彈性曲線＝無(wú)，尖銳度＝無(wú)，Descreen＝無(wú)和Flavor＝無(wú)，由此產(chǎn)生SDS-PAGE凝膠的*.img圖片文件，其可用于在CREAMTM中進(jìn)行評(píng)估。用菜單命令分析/1-D評(píng)估該*.img圖片文件。用泳道放置工具在*.img圖片文件上放置兩條掃描線樣品掃描線和背景掃描線。從上樣點(diǎn)剛好以下至溴酚藍(lán)示蹤染料剛好以上的位置將樣品掃描線放在樣品(具有待檢測(cè)的蛋白酶)泳道的中間。將背景掃描線與樣品掃描線平行放置，但是其放置在成像的SDS-PAGE凝膠中沒有加入樣品的位置，背景掃描線的起點(diǎn)和終點(diǎn)垂直于樣品掃描線的起點(diǎn)和終點(diǎn)。背景掃描線代表凝膠的真實(shí)背景。沒有調(diào)整掃描線的寬度和形狀?，F(xiàn)在用中敏感度的1-D/掃描菜單命令記錄沿著掃描線的強(qiáng)度。利用1-D/編輯菜單命令，從樣品掃描減去背景掃描。然后選擇1-D/結(jié)果菜單命令，并通過(guò)CREAMTM軟件計(jì)算蛋白酶峰的面積％，使用其作為蛋白酶的SDS-PAGE純度。
所有蛋白酶樣品的SDS-PAGE純度為95％以上。
實(shí)施例3吸光度純度的確定純化的蛋白酶樣品的A280/A260比率確定如下。
A260是指蛋白酶樣品相對(duì)于空白緩沖液在1cm路徑長(zhǎng)度的比色杯中在260nm處的吸光度。A280是指相同蛋白酶樣品相對(duì)于空白緩沖液在1cm路徑長(zhǎng)度的比色杯中在280nm處的吸光度。
將來(lái)自實(shí)施例1的純化的蛋白酶樣品在緩沖液中稀釋直到分光光度計(jì)的A280讀數(shù)在其反應(yīng)曲線的線性部分內(nèi)。從讀數(shù)確定A280/A260比率。獲得下列結(jié)果蛋白酶10∶1.94、蛋白酶18∶1.96、Brachysporiella蛋白酶∶1.48、綠僵菌蛋白酶∶1.95、蛋白酶08∶1.86、蛋白酶11∶1.95、蛋白酶35∶1.94。
實(shí)施例4蛋白酶測(cè)定-和多種抑制劑對(duì)所選擇蛋白酶的穩(wěn)定性和活性的影響如下所述測(cè)試多種潛在抑制劑對(duì)實(shí)施例1的蛋白酶的活性和穩(wěn)定性的影響。
分析緩沖液100mM丁二酸(Merck 1.00682)、100mM HEPES(Sigma H-3375)、100mM CHES(Sigma C-2885)、100mM CABS(Sigma C-5580)、1mMCaCl2、150mM KCl、0.01％ Triton X-100(Sigma T-9284)，用NaOH調(diào)節(jié)至pH 7.0。
抑制劑Fe(II)SO4·7H2O，Sigma F-7002
Cu(II)SO4·5H2O，Merck 2790Zn(II)Ac2·2H2O，Merck 8802Mg(II)Cl2·6H2O，Merck 105832Mn(II)Cl2·H2O，Merck 5934氯化膽堿，Aldrich C7，970-0pNA分析pNA底物Suc-AAPF-pNA(Bachem L-1400)或Boc-VLGR-pNA(Bachem L-1205)。
溫度25℃。
將20μl(微升)蛋白酶(在0.01％Triton X-100中稀釋)置于微滴定平板的孔中。通過(guò)加入200μl pNA底物(將50mg溶解在1.0ml DMSO并進(jìn)一步用分析緩沖液稀釋100×)開始分析。監(jiān)測(cè)OD405的增加而測(cè)量蛋白酶的活性。
利用有和沒有各種抑制劑的多種蛋白酶的pNA分析確定劑量/反應(yīng)關(guān)系(OD405/min對(duì)(mg酶)/l))。劑量反應(yīng)曲線在足夠廣泛的酶濃度范圍內(nèi)是線性的。觀察到不同程度的抑制為了比較的目的而包括的一些蛋白酶，即豬胰蛋白酶和SAVINASETM蛋白酶(來(lái)源于幽閉芽孢桿菌(Bacillus clausii)的枯草桿菌蛋白酶，可從Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880Bagsvaerd，丹麥商業(yè)購(gòu)買)未受到抑制，而其它的蛋白酶受到抑制。加入抑制劑而已經(jīng)發(fā)展為黃色的p-硝基苯胺顏色證明沒有影響。因此推斷pNA分析實(shí)際上適于抑制測(cè)量。
穩(wěn)定性分析將蛋白酶在具有0.1％(w/v)K-山梨酸(山梨酸的鉀鹽)和1mM抑制劑的分析緩沖液中稀釋到近似為1mg/ml(見下文)。使混合物在25℃孵育)。每隔一段時(shí)間，從孵育物(充分混合后)取出樣品并冷凍。在分析緩沖液中稀釋后，利用pNA分析測(cè)量殘余活性。為了加入1mM抑制劑，在具有5mM EDTA的分析緩沖液中稀釋孵育物以便看到單純的穩(wěn)定性影響。
從理論的摩爾消光系數(shù)評(píng)估蛋白酶濃度，E280(1M)，其可利用公式從氨基酸組成計(jì)算出來(lái)E280(1M)＝5690*NTrp+1280*NTyr+120Ncys，其中NTrp、NTyr和Ncys是蛋白酶中Trp、Tyr和Cys氨基酸殘基的數(shù)目(Gill，S.C.，vonHippel，P.H.，Analytical Biochemistry 182，319-326，(1989))，并從氨基酸序列計(jì)算蛋白酶的分子量Mw。從純的(實(shí)施例2所述的95％純度以上)蛋白酶樣品的A280測(cè)量值計(jì)算蛋白酶濃度濃度(mg/ml)＝(A280*Mw)/E280(1M))。
抑制結(jié)果劑量/反應(yīng)曲線(OD405/min對(duì)(mg酶)/l)顯示任何蛋白酶都沒有受到Fe2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+或氯化膽堿(加入分析緩沖液的濃度為1mM)的抑制。然而Cu2+，抑制所有測(cè)試的蛋白酶(至不同的程度，如下列表1所顯示)。
首先，用1mg/l的酶劑量測(cè)試多種Cu2+濃度的影響。至少在0至1mM Cu2+的范圍內(nèi)，似乎在抑制和Cu2+的濃度之間有線性關(guān)系，抑制顯示隨著Cu2+濃度增加其本身使酶活性降低(從劑量/反應(yīng)曲線的線性部分測(cè)量酶活性為平均的OD405增加/時(shí)間)。
表1顯示測(cè)試的多種蛋白酶相對(duì)于對(duì)照實(shí)驗(yàn)的活性(酶濃度為1mg/l，利用1mM濃度的Cu2+，并且利用Suc-AAPF-pNA作為底物，在pH7和25℃)，對(duì)照實(shí)驗(yàn)除沒有加入Cu2+外是完全相同的。
表1
穩(wěn)定性結(jié)果在存在濃度為1mM的多種抑制劑時(shí)，如上所述測(cè)試多種蛋白酶的穩(wěn)定性。對(duì)一些蛋白酶的穩(wěn)定性有影響的唯一抑制劑是Cu2+。然而，這個(gè)抑制劑對(duì)所有蛋白酶的影響是不相同的參見下列表2中的結(jié)果，顯示在存在1mMCu2+時(shí)，蛋白酶18和Brachysporiella蛋白酶實(shí)際上是穩(wěn)定的，而其他的蛋白酶不是。
表2
序列表<110>諾維信公司(Novozymes A/S)Oestergaard，Peter RahbekDe Maria，Leonardo<120>蛋白酶<130>10604.504-WO<160>14<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1596<212>DNA<213>擬諾卡氏菌屬NRRL 18262(Nocardiopsis sp.NRRL 18262)<220>
<221>CDS<222>(900)..(1466)<400>1acgtttggta cgggtaccgg tgtccgcatg tggccagaat gcccccttgc gacagggaac 60ggattcggtc ggtagcgcat cgactccgac aaccgcgagg tggccgttcg cgtcgccacg120ttctgcgacc gtcatgcgac ccatcatcgg gtgaccccac cgagctctga atggtccacc180gttctgacgg tctttccctc accaaaacgt gcacctatgg ttaggacgtt gtttaccgaa240tgtctcggtg aacgacaggg gccggacggt attcggcccc gatcccccgt tgatcccccc300aggagagtag ggaccccatg cgaccctccc ccgttgtctc cgccatcggt acgggagcgc360tggccttcgg tctggcgctg tccggtaccc cgggtgccct cgcggccacc ggagcgctcc420cccagtcacc caccccggag gccgacgcgg tctccatgca ggaggcgctc cagcgcgacc480tcgacctgac ctccgccgag gccgaggagc tgctggccgc ccaggacacc gccttcgagg540tcgacgaggc cgcggccgag gccgccgggg acgcctacgg cggctccgtc ttcgacaccg600agagcctgga actgaccgtc ctggtcaccg atgccgccgc ggtcgaggcc gtggaggcca660ccggcgccgg gaccgagctg gtctcctacg gcatcgacgg tctcgacgag atcgtccagg720agctcaacgc cgccgacgcc gttcccggtg tggtcggctg gtacccggac gtggcgggtg780acaccgtcgt cctggaggtc ctggagggtt ccggagccga cgtcagcggc ctgctcgcgg840acgccggcgt ggacgcctcg gccgtcgagg tgaccacgag cgaccagccc gagctctac 899gcc gac atc atc ggt ggt ctg gcc tac acc atg ggc ggc cgc tgt tcg 947Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser1 5 10 15gtc ggc ttc gcg gcc acc aac gcc gcc ggt cag ccc ggg ttc gtc acc 995Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr20 25 30gcc ggt cac tgc ggc cgc gtg ggc acc cag gtg acc atc ggc aac ggc 1043Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly35 40 45agg ggc gtc ttc gag cag tcc gtc ttc ccc ggc aac gac gcg gcc ttc 1091
Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe50 55 60gtc cgc ggt acg tcc aac ttc acg ctg acc aac ctg gtc agc cgc tac 1139Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr65 70 75 80aac acc ggc ggg tac gcc acg gtc gcc ggt cac aac cag gcc ccc atc 1187Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile85 90 95ggc tcc tcc gtc tgc cgc tcc ggc tcc acc acc ggt tgg cac tgc ggc 1235Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly100 105 110acc atc cag gcc cgc ggc cag tcg gtg agc tac ccc gag ggc acc gtc 1283Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val115 120 125acc aac atg acc cgg acc acc gtg tgc gcc gag ccc ggc gac tcc ggc 1331Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly130 135 140ggc tcc tac atc tcc ggc acc cag gcc cag ggc gtg acc tcc ggc ggc 1379Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly145 150 155 160tcc ggc aac tgc cgc acc ggc ggg acc acc ttc tac cag gag gtc acc 1427Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr165 170 175ccc atg gtg aac tcc tgg ggc gtc cgt ctc cgg acc tga tccccgcggt 1476Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr180 185tccaggcgga ccgacggtcg tgacctgagt accaggcgtc cccgccgctt ccagcggcgt1536ccgcaccggg gtgggaccgg gcgtggccac ggccccaccc gtgaccggac cgcccggcta1596<210>2<211>188<212>PRT<213>擬諾卡氏菌屬NRRL 18262(Nocardiopsis sp.NRRL 18262)<400>2Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser1 5 10 15Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr20 25 30Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly35 40 45Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe50 55 60Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr65 70 75 80Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile85 90 95
Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly100 105 110Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val115 120 125Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly130 135 140Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly145 150 155 160Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr165 170 175Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr180 185<210>3<211>1125<212>DNA<213>金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1122)<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(54)<220>
<221>mat_peptide<222>(559)..(1122)<400>3atg gag ctt acc aaa ttt ctt gcc tta ctg gca gtt atc ctg ccc 45Met Glu Leu Thr Lys Phe Leu Ala Leu Leu Ala Val Ile Leu Pro-185-180-175gtc gcc tac ggt gca cca acg cag gcg gca agc ctg cac ccc cag 90Val Ala Tyr Gly Ala Pro Thr Gln Ala Ala Ser Leu His Pro Gln-170-165-160att ttg gag gcc atg aag cgc gac ttg ggg ctg aac gcc gag cag135Ile Leu Glu Ala Met Lys Arg Asp Leu Gly Leu Asn Ala Glu Gln-155-150-145gcc act gtt cgt gtg gcg cgg gag atc cat gcc acc gat gtt att 180Ala Thr Val Arg Val Ala Arg Glu Ile His Ala Thr Asp Val Ile-140-135-130gag cag ctg cgc agc tca gta gcg ttc gct ggt gct tgg att gac 225Glu Gln Leu Arg Ser Ser Val Ala Phe Ala Gly Ala Trp Ile Asp-125-120-115gcg gac gtg cta tac atc ggc att act gac caa gcc ttg gcc gat 270Ala Asp Val Leu Tyr Ile Gly Ile Thr Asp Gln Ala Leu Ala Asp-110-105-100
gag gtc act gct gcc ggc gcc acg ccg att gtc atg acc aac agc ctg 318Glu Val Thr Ala Ala Gly Ala Thr Pro Ile Val Met Thr Asn Ser Leu-95 -90 -85tcc aag ctg gaa aag gcc aag gag gat ctc gat aag ata ttc atc ggc 366Ser Lys Leu Glu Lys Ala Lys Glu Asp Leu Asp Lys Ile Phe Ile Gly-80 -75 -70 -65cga gcc aac acc ctg gaa aca tct tcg gac act agc tct ggc att gca 414Arg Ala Asn Thr Leu Glu Thr Ser Ser Asp Thr Ser Ser Gly Ile Ala-60 -55 -50tcg tat ttc gtt gat gtc gcc gcc aac aag ctc gtt ata gag gct ctc 462Ser Tyr Phe Val Asp Val Ala Ala Asn Lys Leu Val Ile Glu Ala Leu-45 -40 -35gcc gac agt cac ggc cat gct gag caa cta gcc gcg cag gtt ggg ctt 510Ala Asp Ser His Gly His Ala Glu Gln Leu Ala Ala Gln Val Gly Leu-30 -25 -20aca tcc gaa ttc gag gtg cgg act gtt gag acg atg ccg act acc atg 558Thr Ser Glu Phe Glu Val Arg Thr Val Glu Thr Met Pro Thr Thr Met-15 -10 -5 -1gcc acg gtt cag ggt ggt gat gtc tat tat att aat aga agc tcc cgc 606Ala Thr Val Gln Gly Gly Asp Val Tyr Tyr Ile Asn Arg Ser Ser Arg1 5 10 15tgc tct atc ggt ttc gca gta acc aca ggt ttc gtg tcc gct gga cac 654Cys Ser Ile Gly Phe Ala Val Thr Thr Gly Phe Val Ser Ala Gly His20 25 30tgt gga gga tca gga gct tca gct aca aca agt agt ggt gag gcc cta 702Cys Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Thr Ser Ser Gly Glu Ala Leu35 40 45gga acc ttt tcg ggc tcc gtc ttc cct ggc agt gcc gac atg gcc tac 750Gly Thr Phe Ser Gly Ser Val Phe Pro Gly Ser Ala Asp Met Ala Tyr50 55 60gtc cgc act gta agt gga aca gtc ctt aga ggc tac atc aac ggc tac 798Val Arg Thr Val Ser Gly Thr Val Leu Arg Gly Tyr Ile Asn Gly Tyr65 70 75 80ggc caa ggg agc ttt ccc gtc tca gga agc tcc gag gct gcc gtt gga 846Gly Gln Gly Ser Phe Pro Val Ser Gly Ser Ser Glu Ala Ala Val Gly85 90 95gct agc atc tgc cgc tcc ggc tca acc act caa gtc cac tgc ggc acg 894Ala Ser Ile Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gln Val His Cys Gly Thr100 105 110att ggt gcc aag ggc gcc acg gtt aac tac cct caa gga gct gtt tcg 942Ile Gly Ala Lys Gly Ala Thr Val Asn Tyr Pro Gln Gly Ala Val Ser115 120 125ggc ctc act cgg act agc gtc tgc gcc gag ccc ggc gac tca ggc ggt 990Gly Leu Thr Arg Thr Ser Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly130 135 140tct ttc tac tcc ggc tcc cag gcg cag ggt gtc acc tcg gga ggc agc 1038Ser Phe Tyr Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser145 150 155 160ggc gac tgc agc cgt gga ggc acg acc tat ttc cag cct gtt aat agg 1086Gly Asp Cys Ser Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Pro Val Asn Arg165 170 175atc ctc cag aca tat ggc ctt acc ttg gtc acg gcg tag 1125
Ile Leu Gln Thr Tyr Gly Leu Thr Leu Val Thr Ala180 185<210>4<211>374<212>PRT<213>金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)<400>4Met Glu Leu Thr Lys Phe Leu Ala Leu Leu Ala Val Ile Leu Pro-185-180-175Val Ala Tyr Gly Ala Pro Thr Gln Ala Ala Ser Leu His Pro Gln-170-165-160Ile Leu Glu Ala Met Lys Arg Asp Leu Gly Leu Asn Ala Glu Gln-155-150-145Ala Thr Val Arg Val Ala Arg Glu Ile His Ala Thr Asp Val Ile-140-135-130Glu Gln Leu Arg Ser Ser Val Ala Phe Ala Gly Ala Trp Ile Asp-125-120-115Ala Asp Val Leu Tyr Ile Gly Ile Thr Asp Gln Ala Leu Ala Asp-110-105-100Glu Val Thr Ala Ala Gly Ala Thr Pro Ile Val Met Thr Asn Ser Leu-95 -90 -85Ser Lys Leu Glu Lys Ala Lys Glu Asp Leu Asp Lys Ile Phe Ile Gly-80 -75 -70 -65Arg Ala Asn Thr Leu Glu Thr Ser Ser Asp Thr Ser Ser Gly Ile Ala-60 -55 -50Ser Tyr Phe Val Asp Val Ala Ala Asn Lys Leu Val Ile Glu Ala Leu-45 -40 -35Ala Asp Ser His Gly His Ala Glu Gln Leu Ala Ala Gln Val Gly Leu-30 -25 -20Thr Ser Glu Phe Glu Val Arg Thr Val Glu Thr Met Pro Thr Thr Met-15 -10 -5 -1Ala Thr Val Gln Gly Gly Asp Val Tyr Tyr Ile Asn Arg Ser Ser Arg1 5 10 15Cys Ser Ile Gly Phe Ala Val Thr Thr Gly Phe Val Ser Ala Gly His20 25 30Cys Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Thr Ser Ser Gly Glu Ala Leu35 40 45
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<221>CDS<222>(1)..(1059)<220>
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Val Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly Thr Gly Thr Phe Gln Asn40 45 50Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn55 60 65 70Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly Tyr Gln75 80 85Ser Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg90 95 100Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn105 110 115Gln Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Tyr Ser Leu Thr Arg Thr120 125 130Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly135 140 145 150Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Val155 160 165Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Ile Asn Ser Trp170 175 180Gly Val Arg Ile Arg Thr185<210>13<211>1400<212>DNA<213>Brachysporiella gayana<220>
<221>CDS<222>(159)..(1283)<220>
<221>mat_peptide<222>(726)..(1283)<400>13gtaggagctg tagaatcagc acatgaggca agtataaaag aaccagcatg ggatgatcaa 60agtctgccaa ttcaaaggag caccatcaag ccgtcttgtc tagaactcct tgaacaccct120gtctactcca gtactcttgt cacagaacac atctagat atg gag ctc aca agc173Met Glu Leu Thr Ser-185ctc atc gcc gca ctc gca gtt att ctg cct att gcc tac ggt gtt 218Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Pro Ile Ala Tyr Gly Val-180-175-170ccc atg gat gcc acc acc aac ctt tct ccc aag gtc ctg gcc gct 263
Pro Met Asp Ala Thr Thr Asn Leu Ser Pro Lys Val Leu Ala Ala-165-160-155atg aag cgc gac ctg gga ctt gac gcc agg gag gcc act gcc cgt 308Met Lys Arg Asp Leu Gly Leu Asp Ala Arg Glu Ala Thr Ala Arg-150-145-140gtc acc ttc gaa cgt cgt gct ggc gat gtc atc gag gag ctg cgc 353Val Thr Phe Glu Arg Arg Ala Gly Asp Val Ile Glu Glu Leu Arg-135-130-125agc tcc ctg gga gat tcg ttc gcc ggt gct tgg gtt acg gat ggc 398Ser Ser Leu Gly Asp Ser Phe Ala Gly Ala Trp Val Thr Asp Gly-120-115-110aag gtc atc aac att ggt gtc act gat caa gct ttg gtc tcc aag gtt 446Lys Val Ile Asn Ile Gly Val Thr Asp Gln Ala Leu Val Ser Lys Val-105-100-95aag gaa gct ggc gct gaa ccg atg gtt atg aag aac agc ctc ggg aag 494Lys Glu Ala Gly Ala Glu Pro Met Val Met Lys Asn Ser Leu Gly Lys-90 -85 -80ctt caa gag gca aag aag aag ctt gat cag atc atc aag gag aag ccg 542Leu Gln Glu Ala Lys Lys Lys Leu Asp Gln Ile Ile Lys Glu Lys Pro-75 -70 -65aag acc ctc agc acc tca ggc aag ccc ggc att gca aca tac tac gtt 590Lys Thr Leu Ser Thr Ser Gly Lys Pro Gly Ile Ala Thr Tyr Tyr Val-60 -55 -50gac att gag acc aac aag ctc atc atc acg gca ctc tcc acc agt atc 638Asp Ile Glu Thr Asn Lys Leu Ile Ile Thr Ala Leu Ser Thr Ser Ile-45 -40 -35 -30act caa gct gaa gat ctg gct aag gag gtt ggc ctt tct gag tct gag 686Thr Gln Ala Glu Asp Leu Ala Lys Glu Val Gly Leu Ser Glu Ser Glu-25 -20 -15ttc gag gtg cgc aag act gag aag atg cca tcc cct ttc atc ctc ggc 734Phe Glu Val Arg Lys Thr Glu Lys Met Pro Ser Pro Phe Ile Leu Gly-10 -5 -1 1gga gac ccc ttt gtc atc aac aac agt gcc gtg tgc tct gtc ggc ttc 782Gly Asp Pro Phe Val Ile Asn Asn Ser Ala Val Cys Ser Val Gly Phe5 10 15gcc gtc tct ggc ggg ttt gtc tca gct ggc cac tgt ggc ggt caa ggc 830Ala Val Ser Gly Gly Phe Val Ser Ala Gly His Cys Gly Gly Gln Gly20 25 30 35agc cct gtc acc tat atc gac ggt ggc gca ctt gga acg atc gaa gga 878Ser Pro Val Thr Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Leu Gly Thr Ile Glu Gly40 45 50tct gtc ttc ccc ggt gat gca gat atg tcc ttc atc cgt gcc gtt gac 926Ser Val Phe Pro Gly Asp Ala Asp Met Ser Phe Ile Arg Ala Val Asp55 60 65ggc act gac ctc cct ggc atc gtt ggt acc tat ggc aac ggt gat cag 974Gly Thr Asp Leu Pro Gly Ile Val Gly Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Gln70 75 80ccc atc ttt ggc agc aat gtc gca ccc atc ggc tct ggt gtc tgc cgc 1022Pro Ile Phe Gly Ser Asn Val Ala Pro Ile Gly Ser Gly Val Cys Arg85 90 95tca gga aca act acc ggc tat cac tgc ggc cag ctt gat gcc tac gac 1070Ser Gly Thr Thr Thr Gly Tyr His Cys Gly Gln Leu Asp Ala Tyr Asp
100 105 110 115gtc act gtc aac tac gac gtg gga cct gtg ttc ggt ctt acc atg acc 1118Val Thr Val Asn Tyr Asp Val Gly Pro Val Phe Gly Leu Thr Met Thr120 125 130tct gct tgc gct gag cct gga gac tct ggc ggc tcc ttc ttt gcc ggt 1166Ser Ala Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Phe Ala Gly135 140 145gac cag gct cag ggc gtc acc tcg gga ggt tct ggt gat tgc acc agc 1214Asp Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asp Cys Thr Ser150 155 160ggt ggt cag acc ttc ttc cag ccc gtg aac gag att ctg gag acc tat 1262Gly Gly Gln Thr Phe Phe Gln Pro Val Asn Glu Ile Leu Glu Thr Tyr165 170 175ggt ctc tcg ctc acc acg gcc taattggatg aggctttgga cagccaagag1313Gly Leu Ser Leu Thr Thr Ala180 185cctcaacttt tcatctgtat atagcaatta ttttcgtatc tcaagtactt agatcgtcac 1373gatcaataca tatggacttc gcttggc 1400<210>14<211>375<212>PRT<213>Brachysporiella gayana<400>14Met Glu Leu Thr Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Pro-185-180-175Ile Ala Tyr Gly Val Pro Met Asp Ala Thr Thr Asn Leu Ser Pro-170-165-160Lys Val Leu Ala Ala Met Lys Arg Asp Leu Gly Leu Asp Ala Arg-155-150-145Glu Ala Thr Ala Arg Val Thr Phe Glu Arg Arg Ala Gly Asp Val-140-135-130Ile Glu Glu Leu Arg Ser Ser Leu Gly Asp Ser Phe Ala Gly Ala-125-120-115Trp Val Thr Asp Gly Lys Val Ile Asn Ile Gly Val Thr Asp Gln-110-105-100Ala Leu Val Ser Lys Val Lys Glu Ala Gly Ala Glu Pro Met Val Met-95 -90 -85Lys Asn Ser Leu Gly Lys Leu Gln Glu Ala Lys Lys Lys Leu Asp Gln-80 -75 -70Ile Ile Lys Glu Lys Pro Lys Thr Leu Ser Thr Ser Gly Lys Pro Gly-65 -60 -55
Ile Ala Thr Tyr Tyr Val Asp Ile Glu Thr Asn Lys Leu Ile Ile Thr-50 -45 -40Ala Leu Ser Thr Ser Ile Thr Gln Ala Glu Asp Leu Ala Lys Glu Val-35 -30 -25 -20Gly Leu Ser Glu Ser Glu Phe Glu Val Arg Lys Thr Glu Lys Met Pro-15 -10 -5Ser Pro Phe Ile Leu Gly Gly Asp Pro Phe Val Ile Asn Asn Ser Ala-1 1 5 10Val Cys Ser Val Gly Phe Ala Val Ser Gly Gly Phe Val Ser Ala Gly15 20 25His Cys Gly Gly Gln Gly Ser Pro Val Thr Tyr Ile Asp Gly Gly Ala30 35 40 45Leu Gly Thr Ile Glu Gly Ser Val Phe Pro Gly Asp Ala Asp Met Ser50 55 60Phe Ile Arg Ala Val Asp Gly Thr Asp Leu Pro Gly Ile Val Gly Thr65 70 75Tyr Gly Asn Gly Asp Gln Pro Ile Phe Gly Ser Asn Val Ala Pro Ile80 85 90Gly Ser Gly Val Cys Arg Ser Gly Thr Thr Thr Gly Tyr His Cys Gly95 100 105Gln Leu Asp Ala Tyr Asp Val Thr Val Asn Tyr Asp Val Gly Pro Val110 115 120 125Phe Gly Leu Thr Met Thr Ser Ala Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly130 135 140Gly Ser Phe Phe Ala Gly Asp Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly145 150 155Ser Gly Asp Cys Thr Ser Gly Gly Gln Thr Phe Phe Gln Pro Val Asn160 165 170Glu Ile Leu Glu Thr Tyr Gly Leu Ser Leu Thr Thr Ala175 180 18權(quán)利要求
1.一種肽酶家族S2A和/或肽酶家族S1E的蛋白酶，其i)在pH7和25℃下，在補(bǔ)充有0.1％K-Sorbate的分析緩沖液中，并且在存在1mM的Cu2+時(shí)培養(yǎng)164小時(shí)后，測(cè)量的殘余活性相對(duì)于培養(yǎng)0小時(shí)后的活性，具有至少0.80的殘余活性；和/或ii)相對(duì)于沒有Cu2+的對(duì)照，在存在1mM的Cu2+時(shí)，具有至少0.66的相對(duì)活性；其中i)和ii)的活性測(cè)量是在pH7.0和25℃，在分析緩沖液中，在底物Suc-AAPF-pNA上測(cè)量的；并且其中對(duì)于i)的測(cè)量值，蛋白酶具有經(jīng)SDS-PAGE確定的至少90％的純度。
2.權(quán)利要求1的蛋白酶，包括氨基酸序列，當(dāng)根據(jù)圖1排列時(shí)，該氨基酸序列不包括下列任何序列a)(T120+N122+A127+S129)，并且不包括b)(S120+S122+T127+T129)；其中每個(gè)氨基酸殘基的編號(hào)相應(yīng)于蛋白酶10(SEQ ID NO2的第1-188位氨基酸)的編號(hào)。
3.包括氨基酸序列的上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的蛋白酶，當(dāng)根據(jù)圖1排列時(shí)，該氨基酸序列不包括下列任何序列a)(S91+N176+L179+Q180)，并且不包括b)(H91+T176+V179+N180)；其中每個(gè)氨基酸殘基的編號(hào)相應(yīng)于蛋白酶10(SEQ ID NO2的第1-188位氨基酸)的編號(hào)。
4.包括氨基酸序列的上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的蛋白酶，當(dāng)根據(jù)圖1排列時(shí)，該氨基酸序列包括下列至少一個(gè)序列a)(T120+R122+T127+Y129)、(T120+N122+P127+F129)、或(T120+S122+T127+Q129)；和/或b)(T91+T176+I179+N180)、(S91+N176+L179+E180)、或(S91+N176+L179+S180)，其中每個(gè)氨基酸殘基的編號(hào)相應(yīng)于蛋白酶10(SEQ ID NO2的第1-188位氨基酸)的編號(hào)。
5.包括氨基酸序列的上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的蛋白酶，當(dāng)根據(jù)圖1排列時(shí)，該氨基酸序列不包括下列任何序列a)(V51+Q54+A86+A89+H91+S99+S120+S122+E125+T127+T129+N130+M131+T135+R165+T166+T176+V179+N180)，并且不包括b)(T51+G54+P86+S89+S91+S99+T120+N122+Q125+A127+S129+S130+L131+S135+S165+R166+N176+L179+Q180)；其中每個(gè)氨基酸殘基的編號(hào)相應(yīng)于蛋白酶10(SEQ ID NO2的第1-188位氨基酸)的編號(hào)。
6.包括氨基酸序列的上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的蛋白酶，當(dāng)根據(jù)圖1排列時(shí)，該氨基酸序列包括下列至少一個(gè)序列T51、N54或G54、Q86或P86、T89或F89、T91或S91、A99或G99、T120、R122或N122、Q125或V125、T127或P127、Y129或F129、S130或G130、L131、N135或S135、S165或T165、V166或S166、T176或N176、I179或L179、N180或E180，其中每個(gè)氨基酸殘基的編號(hào)相應(yīng)于蛋白酶10(SEQ ID NO2的第1-188位氨基酸)的編號(hào)。
7.包括氨基酸序列的上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的蛋白酶，當(dāng)根據(jù)圖1排列時(shí)，該氨基酸序列包括a)(T51+N54+Q86+T89+T91+A99+T120+R122+Q125+T127+Y129+S130+L131+N135+S165+V166+T176+I179+N180)，或b)(T51+G54+P86+F89+S91+G99+T120+N122+V125+P127+F129+G130+L131+S135+T165+S166+N176+L179+E180)；其中每個(gè)氨基酸殘基的編號(hào)相應(yīng)于蛋白酶10(SEQ ID NO2的第1-188位氨基酸)的編號(hào)。
8.包括氨基酸序列的上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的蛋白酶，當(dāng)根據(jù)圖1排列時(shí)，該氨基酸序列包括(H35+D61+S143)，其中每個(gè)氨基酸殘基的編號(hào)相應(yīng)于蛋白酶10(SEQ ID NO2的第1-188位氨基酸)的編號(hào)。
9.包括氨基酸序列的上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的蛋白酶，當(dāng)根據(jù)圖1排列時(shí)，該氨基酸序列包括(A33+G34+H35+C36+G37)、D61、和(C137+A138+E139+P140+G141+D142+S143+G144+G145)，其中每個(gè)氨基酸殘基的編號(hào)相應(yīng)于蛋白酶10(SEQ ID NO2的第1-188位氨基酸)的編號(hào)。
10.上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的蛋白酶選自(a)具有與SEQ ID NO14的第1至186位氨基酸，和/或(SEQ ID NOs12、10、8、6、4或2)的第1-188位氨基酸至少40％同一性程度的氨基酸序列的多肽；(b)由在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)大腸桿菌(Escherichia coli)DSM 15509中含有質(zhì)粒的成熟蛋白酶編碼部分，(ii)SEQ ID NO13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO5的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQ ID NO1的第900-1466位核苷酸，(iii)(i)或(ii)的至少100個(gè)核苷酸的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列編碼的多肽；(c)具有包括取代、缺失、和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的、SEQ IDNO14的第1至186位氨基酸、和/或(SEQ ID NOs12、10、8、6、4或2)的第1-188位氨基酸的氨基酸序列的多肽的變體；(d)(a)或(b)的等位變體；以及(e)(a)、(b)、或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
11.分離的核酸序列，包括編碼權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)多肽的核酸序列。
12.核酸構(gòu)建體，包括與一個(gè)或多個(gè)在合適的表達(dá)宿主中指導(dǎo)多肽生產(chǎn)的調(diào)控序列可操作連接的權(quán)利要求11的核酸序列。
13.包括權(quán)利要求12的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
14.包括權(quán)利要求12的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求13的載體的重組宿主細(xì)胞。
15.用于生產(chǎn)權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)多肽的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)權(quán)利要求14的重組宿主細(xì)胞以產(chǎn)生包括該多肽的上清液；以及(b)回收該多肽。
16.轉(zhuǎn)基因的植物、或植物部分，其能夠表達(dá)權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)的多肽。
17.轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物、或產(chǎn)品、或其成分，其能夠表達(dá)權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)的多肽。
18.權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)的至少一個(gè)多肽(i)在動(dòng)物飼料中；(ii)在用于動(dòng)物飼料的組合物制備中；(iii)用于改善動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；(iv)用于增加動(dòng)物飲食中可消化和/或可溶解的蛋白質(zhì)；(v)用于增加動(dòng)物飲食中蛋白質(zhì)的水解度；和/或(vi)用于處理植物蛋白的用途。
19.動(dòng)物飼料添加劑，包括權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)的至少一個(gè)蛋白酶；以及(a)至少一種脂溶性維生素，和/或(b)至少一種水溶性維生素，和/或(c)至少一種微量礦物質(zhì)。
20.權(quán)利要求19的動(dòng)物飼料添加劑，其包含Cu，優(yōu)選其數(shù)量為提供1-500ppm的飼料中濃度的Cu。
21.權(quán)利要求19-20中任何一項(xiàng)的動(dòng)物飼料添加劑，其包含濃度達(dá)到100,000ppm的Cu。
22.動(dòng)物飼料組合物，其具有含量為50至800g/kg的粗蛋白，并且包括權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)的至少一種蛋白酶，或權(quán)利要求19-21中任何一項(xiàng)的至少一種飼料添加劑。
23.權(quán)利要求22的動(dòng)物飼料組合物，其包含Cu，優(yōu)選濃度為1-500ppm。
24.清潔劑組合物，其包括權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)的至少一種蛋白酶和至少一種表面活性劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及肽酶家族S2A或S1E的絲氨酸蛋白酶新種類，其在存在銅(Cu
文檔編號(hào)A23J3/34GK1774504SQ200480009201
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2004年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月7日
發(fā)明者彼得·R·奧斯特加德, 倫納多·德瑪麗亞 申請(qǐng)人:諾維信公司