專利名稱：編碼核酶的副粘病毒載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼具有催化活性的RNA的副粘病毒載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
有催化活性的低分子量RNAs，例如核酶，已經(jīng)被用于抑制真核細胞基因表達，而且最近它們在人類基因治療中的應(yīng)用引起關(guān)注。錘頭型核酶主要在細胞質(zhì)中激活，因此向細胞質(zhì)的有效轉(zhuǎn)運是成功的關(guān)鍵(Koseki，S.et al.，J Virol 73(3)，1868-77(1999)；Kuwabara，T.et al.，Proc Natl Acad Sci USA96(5)，1886-91(1999))。但是，大多數(shù)現(xiàn)有的載體在細胞核中引起基因表達，因此表達的核酶的出核效率是很大障礙。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供編碼具有催化活性的RNA的副粘病毒載體及其應(yīng)用。
副粘病毒在其轉(zhuǎn)錄和復制過程中沒有DNA階段，并且它們的基因表達發(fā)生在細胞質(zhì)。因此，本發(fā)明者考慮副粘病毒可能是潛在的適合核酶表達的載體。但是，副粘病毒載體在過去沒有被用于表達核酶，并且不清楚有活性的核酶是否可以在細胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄并有功能。因此，為開發(fā)能表達有活性的核酶的副粘病毒載體，本發(fā)明者將編碼核酶的基因插入仙臺病毒(SeV)載體中，將該載體感染細胞，并評價效果。已知K-ras的突變頻率在結(jié)直腸癌中很高，將其選作靶點。Ras蛋白是參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的G蛋白之一，用纈氨酸取代12位的氨基酸導致細胞癌變。以前已經(jīng)報道許多實驗使用核酶靶向含有氨基酸12突變的區(qū)域(Funato，T.et al.，Cancer Gene Ther 7(3)，495-500(2000)；Tsuchida，T.et al.，Cancer Gene Ther 7(3)，373-83(2000)；Tsuchida，T.et al.，Biochem Biophys Res Commun 253(2)，368-73(1998)；Zhang，Y.A.et al.，Gene Ther 7(23)，2041-50(2000))。在本發(fā)明中，除了以前報道的K-ras核酶外，設(shè)計了帶有不同長度K-ras識別位點的核酶并觀察了它們的作用。發(fā)現(xiàn)通過感染編碼核酶的副粘病毒載體，細胞中K-ras的表達可以被明顯抑制。此外，與短的核酶相比，當核酶的長度為50個核苷酸或更長時，可明顯改善從該載體表達的核酶的活性。當核酶的長度為60個核苷酸或更長時，用該載體導入的核酶的活性得到進一步改善，當長度為70個核苷酸或更長時，活性更高。
因此，本發(fā)明首次利用副粘病毒載體成功地表達有活性的核酶，并證明，可以通過調(diào)節(jié)副粘病毒載體攜帶的核酶長度，改善從該載體表達的核酶的活性。副粘病毒感染發(fā)生在廣泛的組織中。因此，使用編碼核酶的副粘病毒載體，使得有可能直接在用傳統(tǒng)載體很難導入基因的那些組織和細胞中進行核酶基因治療。例如，通過使用本發(fā)明編碼核酶的副粘病毒載體抑制癌基因等的表達，可以對各種癌癥進行基因治療。因此，表達核酶的副粘病毒載體可應(yīng)用于各種臨床病例。
本發(fā)明涉及編碼核酶的副粘病毒載體及其應(yīng)用。更詳細地，本發(fā)明涉及權(quán)利要求書中提出的每一發(fā)明。本發(fā)明也涉及權(quán)利要求所述一或多項(或全部)發(fā)明的所需組合，尤其是，本發(fā)明涉及引用相同獨立權(quán)利要求的從屬權(quán)利要求(涉及其它權(quán)利要求所述發(fā)明未能涵蓋的發(fā)明的權(quán)利要求)所述一或多項(或全部)發(fā)明的所需組合。每個獨立權(quán)利要求所述發(fā)明也打算包括從屬權(quán)利要求所述發(fā)明的任何組合。具體地，本發(fā)明包括(1)編碼具有催化活性的RNA的副粘病毒載體；(2)(1)的副粘病毒載體，其中RNA的長度是50個核苷酸或更長；(3)(1)的副粘病毒載體，其中RNA的長度是60個核苷酸或更長；(4)(1)-(3)的副粘病毒載體，其中RNA是錘頭型核酶；(5)(1)-(4)的副粘病毒載體，其中副粘病毒是仙臺病毒。
在本發(fā)明中，重組的病毒意思是經(jīng)重組的多核苷酸產(chǎn)生的病毒。重組的多核苷酸是其結(jié)合已經(jīng)被人工修飾(切割或連接)的多核苷酸。重組的多核苷酸不以天然方式結(jié)合。重組的多核苷酸可以通過本領(lǐng)域已知的基因重組的方法產(chǎn)生，其中基因重組通過聯(lián)合使用多核苷酸合成，核酸酶處理，連接酶處理，等等進行。重組蛋白可以通過表達編碼該蛋白的重組多核苷酸來產(chǎn)生。重組病毒的產(chǎn)生可以是，表達經(jīng)基因操作構(gòu)建的編碼病毒基因組的多核苷酸，然后重新組成病毒?！爸亟M蛋白”包括經(jīng)重組多核苷酸產(chǎn)生的蛋白，和人工合成的蛋白。
本發(fā)明中，“基因”指一種遺傳物質(zhì)，一種編碼轉(zhuǎn)錄單位的核酸。基因可以是RNAs或DNAs。在本發(fā)明中，將編碼蛋白的核酸稱作該蛋白的基因。此外，編碼核酶的核酸稱作核酶的基因?；蚩梢允翘烊划a(chǎn)生的或人工設(shè)計的序列。而且，在本發(fā)明中，“DNA”既包括單鏈的也包括雙鏈的DNAs。此外，“編碼蛋白或核酶”意思是包括核酸或核酶的多核苷酸，其編碼該蛋白的氨基酸序列或者核酶的正義或反義鏈，從而可以在適當條件下表達該蛋白。副粘病毒的基因在病毒基因組中以反義序列編碼。
本發(fā)明的副粘病毒載體實際編碼有催化活性的RNAs(核酶)。具體地，本發(fā)明的副粘病毒載體在其病毒基因組中3’-前導序列和5’-尾隨序列之間攜帶反義核酶RNA序列。
在本發(fā)明中，副粘病毒指屬于副粘病毒科的病毒，或其衍生物。副粘病毒是一組基因組不分節(jié)段的負鏈RNA病毒，它們包括副粘病毒亞科(包括呼吸道病毒屬(也稱作副粘病毒屬)，腮腺炎病毒屬，和麻疹病毒屬)，和肺病毒亞科(包括肺炎病毒和間質(zhì)肺病毒)。應(yīng)用于本發(fā)明的副粘病毒的具體例子是仙臺病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒(RS病毒)，牛瘟病毒，犬瘟病毒，猴副流感病毒(SV5)，和人副流感病毒1，2，和3。
本發(fā)明的病毒優(yōu)選屬于副粘病毒亞科的那些或其衍生物，更優(yōu)選屬于呼吸道病毒的種或其衍生物?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的呼吸道病毒種的病毒例子是人類副流感病毒-1(HPIV-1)，人類副流感病毒-3(HPIV-3)，牛副流感病毒-3(BPIV-3)，仙臺病毒(也稱作鼠副流感病毒-1)，和猴副流感病毒-10(SPIV-10)。本發(fā)明中最優(yōu)選的副粘病毒是仙臺病毒。這些病毒可以源自天然株，野生株，突變株，實驗室傳代株，人工構(gòu)建株，等等。
本發(fā)明中，“載體”是向細胞導入核酸的載體。副粘病毒載體是向細胞內(nèi)導入核酸的源自副粘病毒的載體。副粘病毒例如上面描述的SeV是極好的基因轉(zhuǎn)移載體。由于副粘病毒只在宿主細胞的細胞質(zhì)中完成轉(zhuǎn)錄和復制，并且它們沒有DNA階段，所以不發(fā)生染色體整合。因此，它們不會由于染色體異常(例如癌化或永生化)而引起安全問題。當使用副粘病毒作載體時該病毒的這一特點對其安全性起很大貢獻。當用于外源基因表達時，甚至在連續(xù)多次傳代后，SeV幾乎沒有任何核苷酸突變，表明其基因組的高度穩(wěn)定性和插入的外源基因d長期穩(wěn)定表達(Yu，D.et al.，Genes Cells 2，457-466(1997))。SeV具有進一步的性質(zhì)上的優(yōu)點，例如對插入基因大小和對其包裝的適應(yīng)性，因為它沒有衣殼結(jié)構(gòu)蛋白?？蓮椭频腟eV載體可以導入大小至少4kb的基因，并且通過添加轉(zhuǎn)錄單位可同時表達2或3種基因。因此，可以從同一載體表達兩種或更多的核酶。
已知SeV對嚙齒動物是致病的，引起肺炎，然而，它對人類是不致病的。這有以前的報道支持，其通過向非人類的靈長類鼻腔給予野生型SeV未表現(xiàn)出嚴重的不良效果(Hurwitz，J.L.et al.，Vaccine 15533-540，1997)。以下兩點，“高感染性”和“高表達水平”也應(yīng)被認為是優(yōu)勢。SeV載體通過結(jié)合細胞膜蛋白糖鏈或糖脂中的唾液酸而感染細胞。幾乎所有細胞都表達這種唾液酸，導致廣泛的感染譜，即高感染性。當基于SeV復制子的可復制載體釋放病毒時，這些病毒再感染相鄰的細胞，多核糖核蛋白(RNP)在感染細胞的細胞質(zhì)中復制，并隨細胞分裂將其分配到子代細胞中，因此可以預(yù)期連續(xù)的表達。此外，SeV載體可以被用于非常廣泛的組織。而且，已經(jīng)顯示，它們的轉(zhuǎn)錄和復制只發(fā)生在細胞質(zhì)的特征性表達機制以非常高的水平表達插入基因(Moriya，C.et al.，F(xiàn)EBS Lett.425(1)105-111(1998)；WO00/70070)。而且，已有人成功回收了通過刪除包膜基因而變得不可遺傳的SeV載體(WO00/70070；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。這樣一來，SeV載體被改善，以進一步增強它們的“安全性”，而保持它們的“高感染性”和“高表達水平”。
SeV的這些特征支持包括SeV在內(nèi)的副粘病毒載體用于基因治療和基因轉(zhuǎn)移的有效性，并且可能在體內(nèi)或回體(ex vivo)核酶表達的基因治療中，SeV會成為一種有前途的選擇。通過向副粘病毒載體中插入用于治療(或分析)的編碼核酶的基因，并局部給予該載體，可以在局部高水平表達核酶基因，并可以預(yù)期明確的治療效果，同時減少副作用。這些作用被認為在能誘導插入基因的瞬時強表達的副粘病毒載體包括SeV，中更強。
副粘病毒載體包括副粘病毒基因組RNAs?；蚪MRNA指一種RNA，其有形成帶有副粘病毒蛋白的RNP的功能，以致基因組中的基因被表達成蛋白，并且核酸被復制以形成子代RNPs。副粘病毒是其基因組為單鏈負鏈RNA的病毒，并且這種RNAs以反義序列編碼基因。一般地，在副粘病毒基因組中，病毒基因在3’-前導區(qū)和5’-尾隨區(qū)之間以反義序列排列。在各自基因的ORFs之間是轉(zhuǎn)錄終止序列(E序列)-間插序列(I序列)-轉(zhuǎn)錄起始序列(S序列)，因此每個基因以單順反子轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的載體中基因組RNAs包含編碼N(核衣殼)-，P(phospho)-，和L(大)-蛋白的反義RNA序列，這些蛋白是RNA所編碼的基因群的表達和RNA自我復制所必需的病毒蛋白。RNAs也可以編碼病毒粒子形成所必需的M(基質(zhì))蛋白。此外，RNAs可以編碼病毒粒子感染所必需的包膜蛋白。副粘病毒包膜蛋白包括引起細胞膜融合的F(融合)蛋白，和病毒粘附于細胞所必需的HN(血凝素-神經(jīng)氨酸酶)蛋白。但是，HN蛋白并不是感染某些類型的細胞必需的(Markwell，M.A.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(4)978-982(1985))，感染只由F蛋白完成。RNAs可以編碼除了F蛋白和/或HN蛋白以外的包膜蛋白。
本發(fā)明的副粘病毒載體可以是，例如，副粘病毒基因組RNAs和病毒蛋白的復合物，即，核糖核蛋白(RNPs)。例如，可以將RNPs與想要的轉(zhuǎn)染試劑一起導入細胞。具體地，該RNPs是包含副粘病毒基因組RNA，N蛋白，P蛋白，和L蛋白的復合物。當一種RNP導入細胞時，編碼病毒蛋白的順反子受病毒蛋白的作用從基因組RNA轉(zhuǎn)錄，而且同時，基因組本身被復制形成子代RNPs?；蚪MRNA的復制可以通過用RT-PCR，Northern印跡雜交等檢測RNA拷貝數(shù)的增加來確認。
進一步，本發(fā)明的副粘病毒載體優(yōu)選是副粘病毒粒子。“病毒粒子”意思是包含受病毒蛋白作用從細胞釋放的核酸的微粒。副粘病毒粒子包含一些結(jié)構(gòu)，其中上面描述的含有基因組RNA和病毒蛋白的RNP被包裹在起源于細胞膜的脂膜中。病毒粒子可以具有感染性。感染性指副粘病毒載體向病毒粒子粘附的細胞導入載體中核酸的能力，因為病毒粒子保留了細胞粘附和膜融合的能力。本發(fā)明的副粘病毒載體可以是可復制的或復制缺陷的載體?！翱蓮椭频摹币馑际钱攲⒉《据d體導入宿主細胞時，病毒可在細胞內(nèi)自我復制以產(chǎn)生有感染力的病毒粒子。
副粘病毒亞科的各種病毒的基因通常表示如下。NP基因通常也描述為“N基因”。
副粘病毒屬(Paramyxovirus)NP P/C/V M F HN -L腮腺炎病毒屬(Rublavirus)NP P/VM F HN (SH) L麻疹(Morbillivirus)屬NP P/C/V M F H -L例如，每種仙臺病毒基因核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫登錄號如下對于N基因為M29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046，和X17218；對于P基因為M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007，和X17008；對于M基因為D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584，和X53056；對于F基因為D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152，和X02131；對于HN基因為D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808，和X56131；和對于L基因為D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587，和X58886。
這些病毒蛋白的ORFs以上面描述的E-I-S順序在基因組RNA中排列為反義序列。離基因組RNAs 3’-端最近的ORF只需要位于3’-前導區(qū)和該ORF之間的S序列，不需要E或I序列。而且，離ORF基因組RNA 5’-端最近的ORF只需要位于5’-尾隨區(qū)和該ORF之間的E序列，不需要I或S序列。而且，這兩個ORFs可以以單順反子轉(zhuǎn)錄，例如通過使用內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)序列進行轉(zhuǎn)錄。在這種情況下，這兩個ORFs之間不需要E-I-S序列。在野生型副粘病毒中，典型的RNA基因組包括3’-前導區(qū)，編碼N，P，M，F(xiàn)，HN，和L蛋白的六個ORF(其以反義方式并按照該順序排列)，和另一末端的5’-尾隨區(qū)。在本發(fā)明的基因組RNAs中，就野生型病毒來說，優(yōu)選在3’-前導區(qū)之后和5’-尾隨區(qū)之前，順次排列編碼N，P，M，F(xiàn)，HN，和L蛋白的ORF；但是基因排列不限于此。某些類型的副粘病毒不包括全部這六種病毒基因，即使在這種情況下，優(yōu)選每種基因按照上面描述的野生型的方式排列。一般地，保留N，P，和L基因的載體能夠在細胞內(nèi)從RNA基因組自主表達基因，復制基因組RNA。而且，通過編碼包膜蛋白的F和HN基因以及M基因的作用，可形成有感染力的病毒粒子并釋放到細胞外。因此，該載體成為可復制的病毒載體?？梢园凑杖缦旅枋鰧⒕幋a核酶的基因插入此基因組3’-前導區(qū)和5’-尾隨區(qū)之間的非蛋白編碼區(qū)。
進一步，本發(fā)明的副粘病毒載體可以缺失任何野生型副粘病毒基因。例如，滅活或缺失M，F(xiàn)，或HN基因或其任何組合的副粘病毒載體，可被優(yōu)選用做本發(fā)明的副粘病毒載體。例如，可通過外部添加缺失基因的產(chǎn)物來重建該病毒載體。如此制備的病毒載體象野生型病毒一樣粘附于宿主細胞引起細胞融合，但是由于導入細胞的載體基因組缺失病毒基因，它們不能形成具有與原始載體相同感染力的子代病毒粒子。因此，該載體作為只能導入一次基因的安全病毒載體是有用的。基因組中可以缺失的基因的例子是F基因，HN基因，M基因，和它們兩者或三者的任意組合。例如，重建病毒載體可以通過用以下物質(zhì)轉(zhuǎn)染宿主細胞完成表達缺失F基因的重組副粘病毒載體基因組的質(zhì)粒，連同F(xiàn)蛋白表達載體和NP，P，和L蛋白的表達載體(WO00/70055，WO00/70070，WO03/025570；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。例如，也可以用在其染色體中組合了F基因的宿主細胞產(chǎn)生病毒。當外部添加這些蛋白時，它們的氨基酸序列不必與病毒序列相同，并且可以將另一種病毒的突變或同源基因用作替代，只要它們與天然類型相比，核酸導入活性相同或更高。
進一步，可以將包含提供載體基因組的病毒的包膜蛋白而非其它蛋白的載體制備為本發(fā)明的病毒載體。例如，當重建病毒時，可以通過表達并非基礎(chǔ)病毒基因組編碼的原始包膜蛋白的另一種包膜蛋白，來產(chǎn)生包含目的包膜蛋白的病毒載體。對這種蛋白無特別限制，包括其它病毒的包膜蛋白，如水皰性口炎病毒(VSV)的G蛋白(VSV-G)。因此，本發(fā)明的病毒載體包括帶有如VSV-G等源自與提供載體基因組的病毒不同的病毒的包膜蛋白的假型病毒載體。通過設(shè)計病毒載體使這些包膜蛋白不由RNA基因組編碼，可以使所述蛋白在病毒粒子感染細胞后不再表達。
而且，本發(fā)明的病毒載體可以是，例如在包膜表面帶有可粘附于特殊細胞的蛋白的載體，這種蛋白例如粘附因子，配體，受體，抗體，或它們的片段；或者包含嵌合蛋白的載體，該嵌合蛋白在胞外區(qū)帶有上述蛋白，在胞內(nèi)區(qū)帶有源自病毒包膜的多肽。因此，也可以產(chǎn)生靶向特殊組織的載體。這種蛋白可以由病毒基因組編碼，或可以是在病毒載體重建時表達除了病毒基因組以外的其它基因(例如，其它表達載體或存在于宿主染色體上的基因)來提供。
進一步，本發(fā)明的載體中，包含在載體中的任何病毒基因可以是從野生型基因修飾而得的，目的是例如減少病毒蛋白引起的免疫原性，或增強RNA轉(zhuǎn)錄或復制的效率。具體地，例如，在副粘病毒載體中，修飾N，P，和L基因中至少一個(它們是復制因子)，被認為可增強轉(zhuǎn)錄或復制的功能。此外，作為包膜蛋白的HN蛋白既包含血凝素活性也包含神經(jīng)氨酸酶活性，但是，例如減弱前一活性可能改善病毒在血液中的穩(wěn)定性，修飾后一活性可以控制感染性。此外，通過修飾F蛋白也可能控制膜融合能力。例如，可以分析可作為細胞表面抗原分子的F蛋白或HN蛋白的表位，并利用這點，可以制備降低了這些蛋白抗原性的病毒載體。
而且，本發(fā)明的載體可以缺失附屬基因。例如，通過敲除SeV附屬基因之一的V基因，SeV對宿主例如小鼠的致病性明顯降低，而不妨礙在培養(yǎng)細胞中的基因表達和復制(Kato，A.et al.，1997，J.Virol.717266-7272；Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587；Curran，J.et al.，WO01/04272，EP1067179)。這種減毒的載體作為體內(nèi)或回體基因轉(zhuǎn)移的非毒性病毒載體是特別有用的。
本發(fā)明的載體在上面描述的副粘病毒載體基因組中含有編碼核酶的RNAs。這里，“核酶”指一種有催化活性的RNA(T.R.Cech et al.，Cell，27487-496(1981)；Koizumi M.and Otsuka E.，Tanpakushitsu Kakusan Koso(Protein，Nucleic acid，Enzyme)，352191(1990))。催化活性不限于并可包括例如，RNA或DNA鏈的切割和連接，模板依賴的RNA復制，RNA氨?；?，氨基酸從tRNA向5’羥基轉(zhuǎn)移，自身磷酸化，核苷合成，和肽鍵的形成。特別重要的活性是RNA-切割活性。在本發(fā)明中，載體可以攜帶任何核酶，這種核酶包括例如錘頭型核酶，發(fā)夾型核酶，丁型肝炎病毒核酶，核糖核酸酶P的RNA亞基，第一類和第二類內(nèi)含子，和它們的改變的形式。這里，“改變”指在核酸序列中取代，刪除，或添加一個或多個核苷。有傳統(tǒng)的方法用于獲得更高活性的改變的核酶，其中通過體外進化系統(tǒng)將天然核酶改變(Joyce，Selective Amplification Techniques for Optimization of RibozymeFunction.in“Antisense RNA and DNA”，pp.353-372(1992)Wiley-Liss Inc.)。核酶可以以二聚體發(fā)揮功能。
在本發(fā)明中，錘頭型核酶和發(fā)夾型核酶是特別優(yōu)選由載體攜帶的核酶。天然的錘頭型核酶已經(jīng)從類病毒等中分離了(J.M.Buzayan et al.，Nature，323349-353(1986)；G.A.Prody et al.，Science，2311577-1580(1986))。錘頭型核酶具有包括三個環(huán)和三個螺旋的錘頭狀結(jié)構(gòu)，并且最初以順式起作用，但是當有催化活性的RNA部分同靶RNA分離時可以以反式起作用。該核酶可以包括例如，一個環(huán)和一個螺旋，并與靶序列形成假環(huán)(Turner，P.C.，TheBiochemistry of the Hammerhead Ribozyme.InScanlon，KJ.，andKashani-Sabet，M.ed.“Ribozymes in the Gene Tarapy of Cancer(MedicalIntelligence UNIT4)”，R.G.Landes Company，3-14(1998))。錘頭型核酶的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被很好地分析了。煙草環(huán)斑病毒的核酶特異地切割核苷序列NUH的3’末端(N是A，G，C或U；H是A，C或U)(M.Koizumi et al.，F(xiàn)EBS Lett.228225(1988))。因此，可以制備在目的靶RNA序列中特異切割包括UC，UU，或UA的位點的核酶(M.Koizumi et al.，F(xiàn)EBS Lett.239285(1988)；Koizumi M.and Otsuka E.，Tanpakushitsu Kakusan Koso(Protein，Nucleic acid，Enzyme)，352191(1990)；M.Koizumi et al.，Nucleic Acids Res.177059(1989))。
此外，也可用發(fā)夾型核酶來達到本發(fā)明的目的。發(fā)夾型核酶存在例如，煙草環(huán)斑病毒的衛(wèi)星RNA的負鏈中(J.M.Buzayan，Nature 323349(1986))。也可以設(shè)計這種核酶來完成靶特異的RNA切割(Y.Kikuchi and N.Sasaki，Nucleic Acids Res.196751(1992)；Y.Kikuchi，Kagaku To Seibutsu(Chemistryand Biology)30112(1992))。
在本發(fā)明中，載體攜帶的核酶的長度優(yōu)選50個核苷酸或更長，較優(yōu)選55個核苷酸或更長，甚至更優(yōu)選60個核苷酸或更長，還更優(yōu)選65個核苷酸或更長，也更優(yōu)選70個核苷酸或更長，也還更優(yōu)選75個核苷酸或更長?！昂嗣傅拈L度”指從載體轉(zhuǎn)錄的核酶RNA分子的核苷酸數(shù)目。如果核酶太短，優(yōu)選通過增加靶識別序列的大小來增加其長度。例如，本發(fā)明的優(yōu)點之一是即使核酶長度是45個核苷酸或更少，或40個核苷酸或更少，通過調(diào)節(jié)靶識別序列的長度，可以以高活性從副粘病毒載體表達有活性的核酶。
一般地，有RNA切割活性的核酶包含催化活性所必需的序列和靶RNA識別所需的序列。錘頭型核酶催化活性需要的序列包括但不局限于，例如，5′-1C2U3G4A5N6G7A8N9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20G21A22A23A24N-3′(SEQ ID NO38)(其中N代表G，A，U，或C；將5’-8N9N10N11N-3’和5’-16N17N18N19N-3’設(shè)計為相互互補以允許堿基配對)。12N13N14N15N四個核苷酸優(yōu)選形成環(huán)。除了四個核苷酸，核苷酸的數(shù)目可以從大約2個到7個核苷酸(即N2-7)，例如，3到5個核苷酸(即N3-5)，23A24N與靶識別序列重疊。24N是與上面描述的靶位點NUH的N互補的核苷酸。更具體的序列如實施例中所示。將靶識別序列附在兩端。具體地，靶識別序列指包括與靶RNA互補序列的部分。在本發(fā)明中，核酶靶識別位點的長度優(yōu)選20個核苷酸或更長，較優(yōu)選25個核苷酸或更長，甚至更優(yōu)選30個核苷酸或更長，還更優(yōu)選35個核苷酸或更長，還更優(yōu)選40個核苷酸或更長，也還更優(yōu)選45個核苷酸或更長。當靶識別位點被分成不連續(xù)的序列段時，長度相當于各個核苷酸的總數(shù)。例如，錘頭型核酶的靶識別位點一般在核酶RNA的兩端，因此長度相當于在這兩端與靶RNA互補的核苷酸總數(shù)。優(yōu)選在每端加入與靶RNA互補的序列，其包含至少連續(xù)的7個核苷酸，優(yōu)選連續(xù)8個核苷酸或更多，更優(yōu)選連續(xù)9個核苷酸或更多，甚至更優(yōu)選連續(xù)10個核苷酸或更多，也更優(yōu)選連續(xù)12個核苷酸或更多，也還更優(yōu)選連續(xù)15個核苷酸或更多。
例如，可以將編碼核酶的核酸插入基因組中3’-前導區(qū)和5’-尾隨區(qū)之間非蛋白編碼區(qū)的任何想要位置。例如，可以將上面的核酸插入3’-前導區(qū)和與3’-端最近的病毒蛋白ORF之間；每個病毒蛋白ORFs之間；和/或離5’-端最近的病毒蛋白ORF和5’-尾隨區(qū)之間。此外，在缺失F或HN基因等的基因組中，可以將編碼核酶的核酸插入那些缺失區(qū)。當向副粘病毒導入外源基因時，希望插入基因使被插入的基因組多核苷酸鏈的長度是六的倍數(shù)(Journal of Virology，Vol.67，No.8，4822-4830，1993)。應(yīng)該將E-I-S序列排列在插入的外源基因和病毒蛋白ORF之間?？梢詫⒕幋a核酶的兩個或多個核苷酸經(jīng)E-I-S序列串聯(lián)插入?；蛘?，可以將目的基因通過IRES(內(nèi)在的核糖體進入位點)插入。
可以通過在基因上游(負鏈的3’-端)添加轉(zhuǎn)錄起始序列的方式控制載體攜帶的核酶的表達水平(WO01/18223)。表達水平也可以受編碼核酶的外源基因插入到基因組的部位控制插入部位離負鏈的3’-端越近，表達水平越高；離5’-端越近，表達水平越低。因此，為獲得想要的基因表達水平，可以適當控制外源基因的插入部位，因而在外源基因前或后聯(lián)接編碼病毒蛋白的基因是最合適的。一般地，由于認為核酶的高表達水平是有利的，所以優(yōu)選將編碼核酶的基因與高效轉(zhuǎn)錄起始序列連接，并將其插入基因組負鏈的3’-端附近。具體地，將外源基因插入到3’-前導區(qū)和離3’-端最近的病毒蛋白ORF之間?；蛘撸梢詫⑼庠椿虿迦腚x3’-端最近的和第二近的病毒蛋白ORF之間，或離3’-端第二近的和第三近的病毒蛋白基因之間。在一般的副粘病毒中，離基因組的3’-端最近的病毒蛋白基因是N基因，第二近的基因是P基因，第三近的基因是M基因?；蛘?，當不希望導入的基因高水平表達時，可以抑制從病毒載體的基因表達水平以獲得適當?shù)男Ч?，例如，通過將外源基因插入載體中離負鏈的5’-端盡可能近的位點，或通過選擇效率低的轉(zhuǎn)錄起始序列。
在副粘病毒基因組中將編碼核酶的RNA排列并與S序列和E序列側(cè)面相鄰。當核酶從載體轉(zhuǎn)錄時，從S序列起動轉(zhuǎn)錄并在E序列終止。因此核酶轉(zhuǎn)錄物在對核酶活性原始必需的序列的每端含有額外序列。通過向副粘病毒載體插入編碼核酶的核酸而添加的這些額外序列，在這里被稱作“間隔子”。具體地，間隔子是附著在從副粘病毒載體轉(zhuǎn)錄的核酶兩端的序列并且不參與核酶的靶識別和催化活性(然而，這不包括附加在3’端的poly(A)尾)。間隔子包括S序列和E序列部分，和用于向載體中插入核酶的連接序列。如實施例中所描述的，甚至當將間隔子附加在核酶末端時，核酶仍保持它的活性。在核酶末端間隔子的總長度可以是10個核苷酸或更長，當核酶較長時，長度可以是20個核苷酸或更長，當核酶再長時，長度可以是25個核苷酸或更長，當核酶更長時，長度可以是30個核苷酸或更長，當核酶還長時，長度可以是35個核苷酸或更長(poly(A)尾不包括在總長度的計算中)。但是，在核酶兩端間隔子的總長度是100個核苷酸或以下，優(yōu)選80個核苷酸或以下，更優(yōu)選70個核苷酸或以下，還更優(yōu)選60個核苷酸或以下，也更優(yōu)選50個核苷酸或以下。在每端間隔子的長度優(yōu)選每個50個核苷酸或以下。
例如，當編碼核酶的核酸被插入到基因組時，可以將想要的副粘病毒S序列用作附加的S序列。當載體是仙臺病毒載體時，可優(yōu)選使用序列3′-UCCCWVUUWC-5′(W＝A或C；V＝A，C，或G)(SEQ ID NO1)。特別優(yōu)選的序列是3′-UCCCAGUUUC-5′(SEQ ID NO2)，3′-UCCCACUUAC-5′(SEQ ID NO3)，和3′-UCCCACUUUC-5′(SEQ ID NO4)。當表示為編碼正鏈的DNA序列時，這些序列是5′-AGGGTCAAAG-3′(SEQ ID NO5)，5′-AGGGTGAATG-3′(SEQ ID NO6)，和5′-AGGGTGAAAG-3′(SEQ ID NO7)。優(yōu)選的仙臺病毒載體的E序列是，例如，3′-AUUCUUUUU-5′(SEQ ID NO8)(對編碼正鏈的DNA為5′-TAAGAAAAA-3′(SEQ ID NO9))。I序列可以包括例如，任何三個核苷酸，特別是3’-GAA-5’(在正鏈DNA中為5’-CTT-3’)。
可以通過將載體轉(zhuǎn)染細胞從本發(fā)明的載體上轉(zhuǎn)錄核酶。例如，當在細胞中表達編碼切割基因轉(zhuǎn)錄物活性的核酶時，載體感染細胞可以抑制靶基因的表達。當它們感染的細胞表達靶基因在MOI＝10，與不編碼核酶的對照載體相比為相同的MOI時，本發(fā)明的載體其編碼有切割靶基因轉(zhuǎn)錄物活性的核酶，具有降低靶基因表達水平的能力優(yōu)選70％或更低，更優(yōu)選75％或更低，也更優(yōu)選60％或更低。
可以將本發(fā)明的載體用作可以體內(nèi)給藥的治療性病毒載體。由于不整合入宿主染色體，因此本發(fā)明的載體是安全的。因為載體一般允許核酶的表達從幾天到幾周或更長，所以它們是適合于各種疾病或異常的治療。為治療目的，本發(fā)明載體的局部給藥可以導致體內(nèi)局部核酶過表達(臨床應(yīng)用)。特別地，核酶是癌癥基因治療的潛在的有用工具(H.Kijima et al.，Pharmac.Ther.，68247-267(1995)；A.Irie et al.，Int.J.Urol.，4329-337(1997))。除了用于癌癥的治療，可以看到核酶的各種應(yīng)用。例如，用編碼核酶的本發(fā)明載體的基因治療可被用于預(yù)防和治療感染性疾病，包括AIDS(Rossi，J.J.，Curr.Opin.Mol.Ther.，1(3)316-22(1999)；Lewin，A.S.andHauswirth，W.W.，Trends Mol.Med.，7(5)221-8(2001)；Gaughan，D.J.et al.，Biochim.Biophys.Acta，1445(1)1-20(1999))。
為制備本發(fā)明的載體，在包含副粘病毒基因組RNA的RNP重建必需的病毒蛋白(即，N，P，和L蛋白)存在情況下，將編碼本發(fā)明副粘病毒基因組RNA的cDNA在哺乳動物細胞中轉(zhuǎn)錄?？梢酝ㄟ^或者負鏈(也稱作負鏈，以相同的反義鏈作為病毒基因組)基因組或者正鏈(也稱作正鏈，正義鏈編碼病毒蛋白)基因組將病毒RNP重建。正鏈的產(chǎn)生對提高載體重建的效率是更好的。RNA末端優(yōu)選表現(xiàn)3’-前導區(qū)和5’-尾隨區(qū)序列的末端盡可能準確，象在天然的病毒基因組中一樣。為準確調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物的5’-末端，例如，可以用T7RNA聚合酶識別序列作為轉(zhuǎn)錄起始位點在細胞內(nèi)表達RNA聚合酶。而且，將轉(zhuǎn)錄物的3’-端經(jīng)自身切割而準確切斷(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820(1997)；Kato，A.et al.，EMBO J.16578-587(1997)；andYu，D.et al.，Genes Cells 2457-466(1997))。
例如，按照文獻中描述Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820(1997)；Kato，A.et al.，EMBO J.16578-587(1997)；Yu，D.et al.，Genes Cells 2457-466(1997)，等等，可以將攜帶核酶的重組仙臺病毒載體如下重建。
首先，合成編碼核酶的cDNA以使在兩端有用于克隆的限制性位點。合成的DNA應(yīng)當含有E-I-S序列，使E-I-S序列位于病毒基因組中插入的核酶和側(cè)翼病毒基因的ORFs之間。如此設(shè)計合成DNA使它在插入載體時大小(核苷酸數(shù)目)為6的倍數(shù)(所謂的“六的規(guī)則”；Kolakofski，D.et al.，J.Virol.72891-899(1998)；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.674822-4830(1993)；Calain，P.and R0ux，L.，J.Virol.674822-4830(1993))。象E-I-S序列，例如，仙臺病毒負鏈的S，I，和E序列，優(yōu)選分別將序列5′-CTTTCACCCT-3′(SEQID NO10)，5′-AAG-3′，和5′-TTTTTCTTACTACGG-3′(SEQ ID NO11)置于寡DNA插入片段的3’端。將此片段插入編碼病毒基因組的cDNA中。例如，將片段插入基因組中編碼病毒蛋白的ORFs和上游S序列之間，以使E-I-S序列一個接一個地放置在核酶每端的病毒蛋白基因的ORFs之間。
例如，可以通過以前報道中描述的方法構(gòu)建重組仙臺病毒基因組的cDNA(Yu，D.et al.，Genes Cells 2457-466(1997)；Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820(1997))。例如，合成雙鏈DNA以具有粘在核酶正義鏈3’端E-I-S序列。將DNA立即插入編碼基因組正義鏈cDNA中目的S序列的3’端。例如，編碼基因組正鏈的cDNA中，首先將限制性位點放在編碼目的病毒蛋白基因和參與基因轉(zhuǎn)錄的S序列之間。然后可以將編碼核酶-E-I-S序列的DNA插入限制性位點(Tokusumi，T.et al.Virus Res 86(1-2)，33-8(2002))。特別地，例如，通過在有P和M基因作側(cè)翼的S序列和M基因的ORF之間插入序列可以達到高效病毒產(chǎn)生。
本發(fā)明載體的構(gòu)建可以通過在細胞內(nèi)存在上述病毒蛋白(L，P和N)的情況下，轉(zhuǎn)錄如此制備的編碼重組副粘病毒基因組RNA的DNA。為產(chǎn)生本發(fā)明的載體，本發(fā)明提供編碼發(fā)明載體病毒基因組RNAs的DNAs。為本發(fā)明載體的產(chǎn)生應(yīng)用，本發(fā)明也涉及編碼載體基因組RNAs的DNAs的應(yīng)用?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已知的方法重建重組的病毒(WO97/16539；WO97/16538；Durbin，A.P.et al.，Virology 235323-332(1997)；Whelan，S.P.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928388-8392(1995)；Schnell.M.J.et al.，EMBO J.134195-4203(1994)；Radecke，F(xiàn).et al.，EMBO J.145773-5784(1995)；Lawson，N.D.et al.，Proe.Natl.Acad.Sci.USA 924477-4481；Garcin，D.et al.，EMBOJ.146087-6094(1995)；Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579(1996)；Baron，M.D.and Barrett，T.，J.Virol.711265-1271(1997)；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9315400-15404(1996))。用這些方法，可以從DNA重建負鏈RNA病毒其包括副流感病毒，皰疹性口腔炎病毒，病毒，麻疹病毒，牛瘟病毒，和仙臺病毒。按照這些方法可以重建本發(fā)明的載體。當病毒載體DNA有F基因，HN基因，和/或M基因缺失時，這些DNAs不形成有感染性的病毒粒子。但是，通過獨立向宿主細胞導入這些缺失的基因，和/或編碼其它病毒包膜蛋白的基因，并然后在那里表達這些基因，可能形成有感染性的病毒粒子。
具體地，制備病毒的步驟如下(a)在表達N，P，和L蛋白的細胞中，轉(zhuǎn)錄編碼副粘病毒基因組RNAs(負鏈RNAs)的cDNAs，或它們的互補鏈(正鏈)；和(b)從這些細胞或從它們的培養(yǎng)上清中收獲包含基因組RNAs的復合物。對于轉(zhuǎn)錄，將編碼基因組RNA的DNA連接在適當啟動子的下游。因此轉(zhuǎn)錄的基因組RNA在存在N，L，和P蛋白的情況下被復制以形成RNP復合物。然后，在存在M，HN，和F蛋白情況下，形成包裹在包膜中的病毒粒子。例如，編碼基因組RNA的DNA可以被連接在T7啟動子的下游，并由T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄成RNA。除了包括T7聚合酶識別序列的那些，可以使用任何想要的啟動子作為啟動子?；蛘?，可以將體外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染細胞。
對從DNA的基因組RNA起始轉(zhuǎn)錄必需的酶，例如T7 RNA聚合酶，可以通過轉(zhuǎn)導表達它們的質(zhì)?；虿《据d體來添加，或例如，通過將它的基因整合入細胞的染色體以能誘導它們的表達，并然后在病毒重建時誘導表達。此外，提供載體重建所必需的基因組RNA和病毒蛋白，例如，通過轉(zhuǎn)導表達它們的質(zhì)粒。在提供這些病毒蛋白時，可以使用輔助病毒例如野生型或某些突變型副粘病毒，但是這可能導致這些病毒的污染，因此不優(yōu)選。
向細胞導入表達基因組RNA的DNAs的方法包括，例如，(i)制備靶細胞可內(nèi)在化的DNA沉淀的方法；(ii)制備包含適合被靶細胞內(nèi)在化的DNAs，和包括低細胞毒陽性電荷特征的復合物的方法；和(iii)用電脈沖在靶細胞膜上瞬時打穿足以讓DNA分子通過的孔的方法。
對于(ii)，可以使用各種轉(zhuǎn)染試劑。例如，DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche#1811169)，并且可使用這些。對于(i)，例如，可以使用磷酸鈣的轉(zhuǎn)染方法，而且盡管用此方法轉(zhuǎn)入細胞中的DNAs被吞噬體內(nèi)在化，但已知有足夠量的DNA進入細胞核(Graham，F(xiàn).L.and Van Der Eb，J.，Virology 52456(1973)；Wigler，M.andSilverstein，S.，Cell 11223(1977))。Chen和Okayama研究轉(zhuǎn)染技術(shù)的最優(yōu)化，報道(1)細胞和共沉淀的保溫條件為2～4％CO2，35℃，和15～24h，(2)環(huán)狀DNA的活性高于線性DNA，和(3)當在沉淀混合物中DNA的濃度為20～30μg/ml時獲得最佳沉淀(Chen，C.and Okayama，H.，Mol.Cell.Biol.72745(1987))。(ii)的方法適合于瞬時轉(zhuǎn)染。通過制備DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885M.W.5×105)混合物與目的DNA的濃度比例進行轉(zhuǎn)染的方法已經(jīng)清楚。因為大多數(shù)復合物在內(nèi)體中被分解，所以也可以添加氯喹以增強效果(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015(1983))。(iii)的方法被稱作電穿孔方法，因為不是細胞選擇性的，所以比方法(i)和(ii)應(yīng)用更普遍。在最理想的條件下設(shè)想這些方法的效率好電流脈沖的持續(xù)時間，脈沖的波形，電場強度(電極間距離，電壓)，緩沖液的傳導率，DNA濃度，和細胞密度。
上述三條，(ii)的方法簡單易于操作并能用大量細胞檢測許多樣品，因此轉(zhuǎn)染試劑適合于載體重建的DNA導入細胞。優(yōu)選地，使用SuperfectTransfection Reagent(QIAGEN，Cat No.301305)，或DOSPER LiposomalTransfection Reagent(Roche，Cat No.1811169)，但是轉(zhuǎn)染試劑不限于這些。
具體地，從cDNA進行重建可按如下進行在24孔或6孔塑料板或100-mm petri平板中的極限必需培養(yǎng)基(MEM)中培養(yǎng)猴腎細胞系LLC-MK2至100％鋪滿，所述培養(yǎng)基含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100單位/ml青霉素G和100μg/ml鏈霉素)。用在有1μg/ml補骨脂素存在的條件下，于UV中暴露20分鐘進行滅活后的表達T7RNA聚合酶的重組痘苗病毒vTF7-3以2pfu/細胞的量感染上述細胞(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838122-8126(1986)；Kato，A.et al.，GenesCells 1569-579(1996))。可以適當調(diào)整補骨脂素的量和紫外線照射的時間。對細胞進行轉(zhuǎn)染，其方法例如是，用Superfect(QIAGEN)、將2-60μg(最好是3-20μg)編碼上述重組仙臺病毒基因組RNA的DNA、以及表達病毒RNP生成所需的、起反式作用的病毒蛋白的質(zhì)粒(0.5-24μg pGEM-N，0.25-12μgpGEM-P，和0.5-24μg pGEM-L)(Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579(1996))進行脂轉(zhuǎn)染。編碼N、P和L蛋白的表達載體的量，優(yōu)選是2∶1∶2的比例，而質(zhì)粒的量經(jīng)過適當調(diào)整后，可以是例如，1-4μg pGEM-N，0.5-2μg pGEM-P，和1-4μg pGEM-L。
有時可能需要將轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)在含有100μg/ml利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC)的無血清MEM中，更優(yōu)選僅40μg/ml的阿糖胞苷(AraC)(Sigma)。為使痘苗病毒的細胞毒活性最小而回收的病毒最多，可將藥物濃度調(diào)整至最佳(Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579(1996))。轉(zhuǎn)染后將細胞培養(yǎng)48-72小時，然后收集并通過三輪凍融而裂解。將含有RNP的裂解物再感染LLC-MK2細胞，并將細胞培養(yǎng)。或者，收集培養(yǎng)上清，加入LLC-MK2細胞的培養(yǎng)液中以感染細胞，然后培養(yǎng)。例如可以通過與脂轉(zhuǎn)染胺，聚陽離子脂質(zhì)體等形成復合物，并將復合物轉(zhuǎn)導入細胞進行轉(zhuǎn)染。具體地，可以使用各種轉(zhuǎn)染試劑。例如，可以使用DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE和DOSPER(Roche#1811169)。為防止在內(nèi)體中分解，也可以加入氯喹(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015(1983))。在轉(zhuǎn)導了RNP的細胞中，病毒基因從RNP表達，RNP復制，載體擴增。通過將如此獲得的病毒溶液(培養(yǎng)上清)適當稀釋，然后重復擴增，可以將痘苗病毒vTF7-3完全消除。擴增可以重復，例如，三次或更多?？梢詫⒁虼双@得的載體貯存在-80℃。為重建因缺失編碼包膜蛋白的基因而沒有復制能力的病毒載體，可以用表達包膜蛋白的LLC-MK2細胞轉(zhuǎn)染，或可以共轉(zhuǎn)染表達包膜蛋白的質(zhì)粒?；蛘撸せ蛉笔筒《据d體的擴增可以通過培養(yǎng)用表達包膜蛋白的LLC-MK2細胞覆蓋的轉(zhuǎn)染的細胞進行(參見WO00/70055和WO00/70070)。
例如，可以通過測定CIU(細胞感染單位)或血細胞凝集活性(HA)來判斷獲得的病毒滴度(WO00/70070；Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579(1996)；Yonemitsu，Y.& Kaneda，Y.，Hemaggulutinating Virus ofJapan-liposome-mediated gene deliVery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular MedicineHumana Presspp.295-306(1999))。攜帶GFP(綠色熒光蛋白)等標志基因的載體滴度的定量可以通過使用標志作為指標(例如GFP-CIU)直接計數(shù)感染的細胞?？梢詫⑷绱双@得的滴度用與CIU同樣方式處理(WO00/70070)。
只要能夠重建病毒載體，重建中使用的宿主細胞沒有特別限制。例如，仙臺病毒載體等的重建中，培養(yǎng)的細胞可以使用例如LLC-MK2細胞，源于猴腎的CV-1細胞，和源于倉鼠腎的BHK細胞，和源于人的細胞。通過在這些細胞中表達適當?shù)陌さ鞍祝部梢垣@得有包膜的感染性病毒粒子。此外，為獲得大量仙臺病毒載體，可以將從上述宿主獲得的病毒載體感染受孕的雞卵以擴增載體。已經(jīng)建立了使用雞卵產(chǎn)生病毒載體的方法(Nakanishi，et al.，ed.，“State-of-the-Art Technology Protocol in NeuroscienceResearch III，Molecular Neuron Physiology”，Koseisha，Osaka，pp.153-172(1993))。例如，具體是將受精卵在37-38℃孵化器中培養(yǎng)9-12天(例如3天)以形成胚。將病毒載體接種尿囊腔，然后將該受精卵接著培養(yǎng)數(shù)日以便繁殖病毒載體。可根據(jù)所用的重組仙臺病毒類型的不同而改變諸如培養(yǎng)時間等條件。然后，收獲含有載體的尿囊液。用常規(guī)方法從尿囊液樣品中分離和純化仙臺病毒載體(Tashiro，M.，“Virus Experiment Protocol”，Nagai，Ishihama，ed.，Medical View Co.，Ltd.，pp.68-73(1995))。
例如，可以按如下描述進行缺失F蛋白的仙臺病毒載體的重構(gòu)和制備(見WO00/70055和WO00/70070)<1>重建F缺失的仙臺病毒的基因組cDNA，和表達F基因的質(zhì)粒將仙臺病毒(SeV)全長基因組cDNA，pSeV18+b的cDNA(+)(Hasan，M.K.et al.，J.General Virology 782813-2820(1997))(“pSeV18+b(+)”也被稱作“pSeV18+”)用SphI/KpnI消化以收獲片段(14673bp)，其被克隆到pUC18以制備質(zhì)粒pUC18/KS。在此pUC18/KS上進行F缺失位點的構(gòu)建。通過聯(lián)合使用PCR-連接方法制造F基因缺失，結(jié)果F基因ORF(ATG-TGA＝1698bp)被刪除。然后，例如，將atgcatgccggcagatga(SEQ ID NO12)連接以構(gòu)建F缺失型SeV基因組cDNA(pSeV18+/ΔF)。使用引物對[正向5’-gttgagtactgcaagagc/SEQ ID NO13，反向5’-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SEQ ID NO14]的PCR所形成的PCR產(chǎn)物連接到EcoT22I中F的上游，用引物對[正向5’-atgcatgccggcagatga/SEQ ID NO15，反向5’-tgggtgaatgagagaatcagc/SEQ ID NO16]形成的PCR產(chǎn)物連接到F基因的下游。將因此獲得的質(zhì)粒用SacI和SalI消化以獲得包含F(xiàn)缺失位點的4931 bp片段部分，其被克隆到pUC18以形成pUC18/dFSS。將此pUC18/dFSS用DraIII消化，將片段回收，用pSeV18+包含F(xiàn)基因區(qū)域替換，并連接以獲得質(zhì)粒pSeV18+/ΔF。例如，將外源基因插入pUC18/dFSS的F缺失位點中NsiI和NgoMIV限制酶位點。
<2>誘導SeV-F蛋白表達的輔助細胞的制備為構(gòu)建表達仙臺病毒F基因(SeV-F)的Cre/loxP誘導型表達質(zhì)粒，將SeV-F基因用PCR擴增，并插入質(zhì)粒pCALNdlw的唯一的SwaI位點(Arai，T.et al.，J.Virology 72，p1115-1121(1998))，其中該質(zhì)粒經(jīng)過設(shè)計，使得有可能通過Cre DNA重組酶進行基因產(chǎn)物的誘導型表達，并因此構(gòu)建質(zhì)粒pCALNdLw/F。
為從F缺失的基因組回收有感染力的病毒粒子，建立表達SeV-F蛋白的輔助細胞系。例如可以使用通常被用于SeV增殖的猴腎源的LLC-MK2細胞系作為細胞。將LLC-MK2細胞在添加了10％熱滅活的胎牛血清(FBS)，青霉素G鈉(50單位/ml)，和鏈霉素(50μg/ml)的MEM中，于37℃，5％CO2培養(yǎng)。由于SeV-F基因產(chǎn)物是細胞毒的，按照本領(lǐng)域熟知的方法，使用磷酸鈣法用上述質(zhì)粒pCALNdLw/F轉(zhuǎn)染LLC-MK2細胞，進行基因轉(zhuǎn)導，其中質(zhì)粒經(jīng)過設(shè)計，使得有可能通過Cre DNA重組酶進行基因產(chǎn)物的誘導性表達。
將質(zhì)粒pCALNdLw/F(10μg)轉(zhuǎn)導入已經(jīng)在10cm平皿中生長至40％匯合的LLC-MK2細胞，然后將細胞在含10％FBS的MEM(10ml)中，在5％CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)24小時。24小時后，將細胞分散并在培養(yǎng)基(10ml)中重懸。然后將懸液接種在5個10-cm平皿中，一個平皿5ml，兩個平皿2ml，兩個平皿0.2ml，并培養(yǎng)在含有G418(GIBCO-BRL)(1200μg/ml)和10％FBS的MEM中。將細胞培養(yǎng)14天，每兩天更換一次培養(yǎng)基，以選擇基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)導的細胞系。用克隆環(huán)將從上述培養(yǎng)基中生長的表現(xiàn)出對G418抵抗的細胞回收。如此回收的每個克隆的培養(yǎng)繼續(xù)在10-cm平皿中直至匯合。
細胞在6-cm平皿中生長至匯合后，按照Saito等的方法(Saito et al.，Nucl.Acids Res.233816-3821(1995)；Arai，T.et al.，J.Virol 72，1115-1121(1998))，例如用腺病毒AxCANCre在MOI＝3時感染細胞來誘導F蛋白表達。
<3>F缺失的仙臺病毒(SeV)的重建和擴增將其中已經(jīng)插入外源基因的上述質(zhì)粒pSeV18+/ΔF按照如下轉(zhuǎn)染LLC-MK2細胞。將LLC-MK2細胞以5×106細胞/平皿接種于100-mm平皿中。當基因組RNA轉(zhuǎn)錄用T7RNA聚合酶完成時，將細胞培養(yǎng)24小時，然后在MOI約為2時，用表達T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒于室溫感染1小時，其中痘苗病毒已經(jīng)用補骨脂素和長波紫外線(365nm)處理20分鐘(PLWUV-VacT7Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))。對于痘苗病毒的紫外線照射，例如，可以使用裝有五個15瓦燈泡的UV Stratalinker 2400(目錄號400676(100V)，Stratagene，La Jolla，CA，USA)。將細胞用無血清MEM洗滌，然后使用適當?shù)闹D(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染用表達基因組RNA的質(zhì)粒，和分別表達副粘病毒N，P，L，F(xiàn)，和HN蛋白的表達質(zhì)粒。盡管沒有額外限制，按照該順序，這些質(zhì)粒的量的比例可以優(yōu)選設(shè)為6∶2∶1∶2∶2∶2。例如，轉(zhuǎn)染基因組RNA表達質(zhì)粒以及表達N，P，L，F(xiàn)，和HN蛋白的表達質(zhì)粒(pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L，和pGEM/F-HN；WO00/70070，Kato，A.et al.，Genes Cells 1，569-579(1996))的量的比例分別為每平皿12μg，4μg，2μg，4μg，和4μg。培養(yǎng)幾小時后，將細胞用無血清MEM洗滌兩次，培養(yǎng)在含有40μg/ml的呋喃阿糖胞苷(AraCSigma，St.Louis，MO)和7.5μg/ml胰酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中?；厥者@些細胞，并將沉淀重懸在Opti-MEM中(107細胞/ml)。將懸液凍融三次，與脂轉(zhuǎn)染試劑DOSPER(Boehringer Mannheim)混合(106細胞/25μl DOSPER)，室溫放置15分鐘，轉(zhuǎn)染上述克隆的表達F的輔助細胞(12孔板，106細胞/孔)，并培養(yǎng)在無血清MEM(含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰酶)中以回收上清。也可通過與此相同的方法制備缺失除了F以外的其它基因，例如HN基因或M基因的病毒。
在制備缺失型病毒載體時，如將在其載體基因組中缺失了不同包膜基因的兩種不同病毒載體轉(zhuǎn)染至相同細胞中，每種缺失的包膜蛋白可以通過另一載體的表達來提供。因此，這些載體合起來彌補了蛋白缺失，且可以形成有感染力的病毒粒子。結(jié)果是，復制周期可擴增病毒載體。換言之，可以將本發(fā)明的兩種或更多種病毒載體同時混合接種，使它們相互補充，從而以較低的成本生產(chǎn)出各種包膜缺陷型病毒載體的大量混合物。當與不缺失病毒基因的載體對比時，由于這些包膜基因缺陷的病毒具有較小的基因組，它們允許插入較長的外源基因。此外，這些由于缺失病毒基因而喪失增殖能力的病毒最終減毒，很難維持共感染狀態(tài)，因此它們不會產(chǎn)生后代，對環(huán)境的損害也較小。
當向個體或細胞給予可復制的副粘病毒載體后，由于治療完成必須限制病毒載體的增殖，因此也可能通過給予RNA依賴的RNA聚合酶抑制劑，特別地只限制病毒載體的增殖，對宿主無損傷。
按照本發(fā)明的方法，可以將本發(fā)明的病毒載體釋放到產(chǎn)生病毒的細胞的培養(yǎng)基中，例如，以1×105CIU/ml或更高的滴度，優(yōu)選1×106CIU/ml或更高，更優(yōu)選5×106CIU/ml或更高，更優(yōu)選1×107CIU/ml或更高，更優(yōu)選5×107CIU/ml或更高，更優(yōu)選1×108CIU/ml或更高，更優(yōu)選5×108CIU/ml或更高。可以按照這里和其它描述的方法(Kiyotani，K.et al.，Virology 177(1)，65-74(1990)；WO00/70070)測定病毒滴度。
收集的副粘病毒可以通過精制純化使其基本純。純化可以用已知的純化/分離方法進行，如過濾、離心分離和柱純化，或它們的組合。術(shù)語“基本純”是指在病毒載體以一種成分存在的樣品中病毒載體占主要部分。一般地，真正純的病毒載體可以通過確認來自病毒載體的蛋白比例而鑒定，例如，在樣品中占全部蛋白的10％或以上，優(yōu)選20％或以上，優(yōu)選50％或以上，優(yōu)選70％或以上，更優(yōu)選80％或以上，更優(yōu)選90％或以上(但是，除了被當作載體、穩(wěn)定劑等而加入的蛋白外)。特異于副粘病毒的純化方法有，利用硫酸纖維素或交聯(lián)的多糖硫酸酯進行的方法(特公昭62-30752號公報、特公昭62-33879號公報和特公昭62-30753號公報)，以及包括允許含巖藻糖硫酸的多糖和/或其降解產(chǎn)物吸附病毒的方法(WO97/32010)。
在制備含有載體的組合物時，可以按需要將載體與所需藥用載體或賦形劑混合?！八幱幂d體或賦形劑”意思是可以與載體一起給藥、但不明顯抑制載體的基因轉(zhuǎn)導的物質(zhì)。例如，可以將載體用生理鹽水或磷酸鹽緩沖液(PBS)適當稀釋以形成組合物。當載體在雞卵等中生長時，“藥用載體或賦形劑”可以包括尿囊液。此外，含有載體的組合物可以包括載體或賦形劑例如去離子水和5％葡萄糖水溶液。而且，除上面的，組合物可以包括植物油，懸浮劑，表面活性劑，穩(wěn)定劑，殺生物劑等等。組合物也可包含防腐劑或其它添加物。含有本發(fā)明載體的組合物可以用作試劑或藥物。
載體劑量可以依據(jù)下列因素而變化疾病，體重，年齡，性別，和患者的癥狀，以及給藥目的，給藥的組合物的形式，給藥方法，轉(zhuǎn)導的基因，等等；但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以適當判斷劑量?？梢赃m當選擇給藥途徑，盡管給藥可以通過如下進行例如，經(jīng)皮，鼻內(nèi)，經(jīng)支氣管，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，脊柱內(nèi)，或皮下，但是不局限于這些途徑。也可以局部或全身給藥。在可藥用的載體中給藥的載體劑量優(yōu)選約105CIU/ml至約1011CIU/ml，更優(yōu)選約107CIU/ml至約109CIU/ml，最優(yōu)選約1×108CIU/ml至約5×108CIU/ml。在人類，單次劑量優(yōu)選在2×105CIU至2×1010CIU范圍，并且可以給藥一次或多次，只要副作用在臨床可接受的范圍。對每天給藥的次數(shù)也有相同考慮。對除人類外的動物，例如可以將上述劑量基于目的動物和人類之間的體重比或給藥靶點的體積比(例如平均值)進行轉(zhuǎn)換，將轉(zhuǎn)換后的劑量向動物給藥。給予含本發(fā)明載體的組合物的受試者包括所有動物，例如人類，猴，小鼠，大鼠，兔，綿羊，牛，和狗。
附圖簡述

圖1是表示特異切割K-ras的核酶的結(jié)構(gòu)(A)和活性(B)的圖和照片。靶點的核苷酸序列和它編碼的氨基酸序列分別顯示在SEQ ID NOs31和32中。核酶的核苷酸序列顯示在SEQ ID NO33中。
圖2是表示編碼特異切割K-ras的核酶的仙臺病毒載體結(jié)構(gòu)的示意圖。在載體中附在核酶每端的核苷酸序列顯示在SEQ ID NOs35和36中。EIS序列顯示在SEQ ID NO34中。pSeV(+)PM克隆位點附近的核苷酸序列顯示在SEQ ID NO37中。
圖3是顯示編碼特異切割K-ras的核酶的仙臺病毒載體活性的照片和圖。
完成本發(fā)明的最佳方式在下文中，將參考實施例更詳細解釋本發(fā)明，但是不意味著本發(fā)明局限與此。所有這里引入的參考文獻被引入作為本說明的一部分。
質(zhì)粒構(gòu)建表1顯示合成的編碼核酶的寡核苷酸。選擇的靶是在突變體V12K-ras中位置12的突變的纈氨酸。已經(jīng)有核酶靶向此位點的報道。在本發(fā)明中，表1的KRZa和KRZb(圖1A，上圖)的制備分別參考Tokunaga等和Zhang等的設(shè)計(Tokunaga，T.et al.Br J Cancer 83(6)，833-9(2000)；Zhang，Y.A.et al.Gene Ther 7(23)，2041-50(2000))，和Funato等(Funato，T.et al.Cancer GeneTher 7(3)，495-500(2000))。在本發(fā)明中設(shè)計了KRZc和KRZd，其識別位點與上面那些的大小不同。它們各自的序列是KRZa(正義5′-CTAGCTACGCCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCTGGTAC-3′/SEQ ID NO17，反義5′-CAGCTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGGCGTAG-3′/SEQ ID NO18)；KRZb
(正義5′-TGCCTACGCCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCICCAACTAGG-3′/SEQ ID NO19，反義5′-CTAGTTGGAGCTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGGCGTAGGCAGG-3′/SEQ ID NO20)；KRZc(正義5′-CTAGCCCACTCTTGCCTACGCCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCTCCAACTACCACAAGGTAC-3′/SEQ ID NQ21，反義5′-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGGCGTAGGCAAGAGTGGG-3′/SEQ ID NO22)；KRZd(正義5′-CTAGCCTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCTCCAACTACCACAAGTTTATGGTAC-3′/SEQ IDNO23，反義5′-CATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGAGG-3′/SEQ ID NO24)。
在上述每個序列的一端添加NheI位點，另一端添加KpnI位點。將正義鏈和反義鏈以1∶1的比例混合并使之退火。將每個序列亞克隆到pcDNA3.1-hygro(+)、含有仙臺病毒最小基因組的pAG270、和pSeV(+)PM(Tokusumi，T.et al.Virus Res 86(1-2)，33-8(2002))(圖1A，中圖)。含有核酶的pAG270如下構(gòu)建使下列兩種序列退火5′-GGCCGCGCTAGCTTGCTCGAGCAAGGCGCGCCTCCGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCATCGC-3′(SEQ ID NO25)和5′-GGCCGCGATG AACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACGGAGGCGCGCCTTGCTCGAGCAAGCTAGCGC-3′(SEQ ID NO26)，將得到的雙鏈連接到pSeV 18+(Hasan，M.K.et al.，J.General Virology 782813-2820(1997))的NotI位點，用NheI和KpnI消化質(zhì)粒以去除病毒基因組中大多數(shù)中間部分，并將編碼核酶的合成DNA連接到該位點。體外測試核酶活性的底物如下制備用PCR擴增K-ras cDNA的核苷酸1-171的區(qū)域，用TA克隆方法將其插入pCRII(Invitrogen)(圖1A下圖)。使用的引物為5′-ATGAGGGACCAGTACATGAGGA-3′(SEQ ID NO27)和5′-GTCGAGAATATCCAAGAGACAGGTTTCTCC-3′(SEQ ID NO28)。


(按照從上向下的順序，此表中核苷酸序列為SEQ ID NOs17至24)[實施例2]體外切割實驗測試核酶活性以判斷它是否受副粘病毒，例如仙臺病毒特異的轉(zhuǎn)錄終止序列，間插序列和轉(zhuǎn)錄起始序列的影響。將pCRII/K-ras171線性化，在存在[α-32P]UTP的情況下，用SP6RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，以制備32P-標記的RNA底物。用含8M尿素的6％聚丙烯酰胺凝膠通過電泳將底物純化。其間，用T7RNA聚合酶從線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄核酶。將10μg核酶與大約5000cpm32P-標記的RNA混合在裂解緩沖液(40mM Tris-HCl(pH7.5)，20mM MgCl2，2mM亞精胺，10mM DTT)中，37℃保溫過夜。將此混合物在含8M尿素的6％聚丙烯酰胺凝膠中電泳，凝膠用BAS2000分析。圖1B顯示所得的結(jié)果。此核酶的活性僅稍稍低于不含副粘病毒特異序列的核酶的活性，因此認為這些序列對活性幾乎沒影響。而且，無論副粘病毒特異序列存在與否，KRZa的活性低。因此確定這些序列并非由SeV載體攜帶。
重組SeV載體的制備基本按文獻方法(Tokusumi，T.et al.Virus Res 86(1-2)，33-8(2002))制備SeV載體。修飾pAC116的多克隆位點以引進NheI-KpnI位點。5’-克隆位點含有72-mer片段，其側(cè)翼有NotI位點(5′-GGCCGCACTCGAGTTCGCTAGCTTGGCGCGCCGGTACCTCCGTAAGAAAAACTTAGGGTCAAAGTTCATCGC-3′/SEQ ID NO29)并含有NheI位點、KpnI位點和EIS序列。將編碼核酶的DNA亞克隆到NheI/KpnI位點。將DNA用NotI酶切并亞克隆到pSeV(+)PM的NotI位點(T0kusumi，T.et al.Virus Res 86(1-2)，33-8(2002))(圖2)。pSeV(+)PM的NotI位點附近的序列是5′-AGGGTGAAAGAAATTTCACCTAAGCGGCCGCAATG-3′(SEQ ID NO30；從左側(cè)開始，下劃線部分相應(yīng)于S序列、NotI位點和起始密碼子)。用該構(gòu)建體在LLC-MK2被表達T7RNA聚合酶的痘苗病毒VacT7感染的情況下轉(zhuǎn)染LLC-MK2。三天后，收獲細胞，凍融三次使細胞裂解以制備裂解物。將所得的裂解物接種于10日齡受精卵以擴增病毒。
Western印跡用MOI為10的重組SeV感染人結(jié)直腸癌細胞系SW480。兩天后，收獲細胞。將細胞在SDS-PAGE樣品緩沖液中裂解并在100℃加熱。然后，將樣品用10-20％凝膠通過SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)。將膜用人K-ras抗體(Oncogene)和抗-GAPDH抗體(TREVIGEN)通過Western印跡分析。用ECL Plus(Amersham)進行檢測。用圖像分析儀LAS1000進行信號分析和定量(圖3)。通過圖像分析儀判斷條帶的強度，并用抗-GAPDH抗體判定的強度標準化。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)編碼核酶的每種仙臺病毒都抑制內(nèi)源K-ras的表達。因此，SeV允許有活性的核酶的表達。最短的核酶僅表現(xiàn)出低活性，但是，當使用含有較長核酶的載體時，活性較高?；钚宰罡叩氖前哂凶铋L識別位點的KRZc的SeV。
工業(yè)適用性本發(fā)明提供允許核酶表達的副粘病毒載體。本發(fā)明的載體可以抑制細胞內(nèi)目的靶基因的表達?？梢詫⒏闭巢《据d體用于向廣泛多種類型的細胞中導入基因，并因此適于作為體內(nèi)導入或回體導入機體的基因治療載體。特別是，抑制引起疾病的基因的表達的核酶編碼載體可以用于這些疾病的基因治療。
序列表<110>株式會社載體研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)<120>編碼核酶的副粘病毒載體及其應(yīng)用<130>D3-A0207P<140>
<141>
<150>JP 2003-023313<151>2003-01-31<160>38<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>10<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例(w＝a或c；v＝a或c或g)<400>1cwuuvwcccu 10<210>2<211>10<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例<400>2cuuugacccu 10<210>3
<211>10<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例<400>3cauucacccu 10<210>4<211>10<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例<400>4cuuucacccu 10<210>5<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例<400>5agggtcaaag 10<210>6<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例
<400>6agggtgaatg 10<210>7<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例<400>7agggtgaaag 10<210>8<211>9<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述仙臺病毒E序列的示例<400>8uuuuucuua9<210>9<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述仙臺病毒E序列的示例<400>9taagaaaaa9<210>10<211>10<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例<400>10ctttcaccct 10<210>11<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述仙臺病毒E序列的示例<400>11tttttcttac tacgg 15<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的接頭序列<400>12atgcatgccg gcagatga 18<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的PCR引物
<400>13gttgagtact gcaagagc 18<210>14<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的PCR引物<400>14tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc 42<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的PCR引物<400>15atgcatgccg gcagatga 18<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的PCR引物<400>16tgggtgaatg agagaatcag c 21<210>17<211>44<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述用于構(gòu)建核酶的寡核苷酸<400>17ctagctacgc cctgatgagt ccgtgaggac gaaacagctg gtac 44<210>18<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于構(gòu)建核酶的寡核苷酸<400>18cagctgtttc gtcctcacgg actcatcagg gcgtag 36<210>19<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于構(gòu)建核酶的寡核苷酸<400>19tgcctacgcc ctgatgagtc cgtgaggacg aaacagctcc aactagg 47<210>20<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于構(gòu)建核酶的寡核苷酸<400>20ctagttggag ctgtttcgtc ctcacggact catcagggcg taggcagg 48
<210>21<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于構(gòu)建核酶的寡核苷酸<400>21ctagcccact cttgcctacg ccctgatgag tccgtgagga cgaaacagct ccaactacca 60caaggtac 68<210>22<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于構(gòu)建核酶的寡核苷酸<400>22cttgtggtag ttggagctgt ttcgtcctca cggactcatc agggcgtagg caagagtggg 60<210>23<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于構(gòu)建核酶的寡核苷酸<400>23ctagcctcaa ggcactcttg cctacgccct gatgagtccg tgaggacgaa acagctccaa 60ctaccacaag tttatggtac 80<210>24<211>72<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述用于構(gòu)建核酶的寡核苷酸<400>24cataaacttg tggtagttgg agctgtttcg tcctcacgga ctcatcaggg cgtaggcaag 60agtgcct tga gg 72<210>25<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于構(gòu)建pAG270的寡核苷酸<400>25ggccgcgcta gcttgctcga gcaaggcgcg cctccgtaag aaaaacttag ggtgaaagtt 60catcgc 66<210>26<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于構(gòu)建pAG270的寡核苷酸<400>26ggccgcgatg aactttcacc ctaagttttt cttacggagg cgcgccttgc tcgagcaagc 60tagcgc 66<210>27<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的PCR引物<400>27atgagggacc agtacatgag ga 22
<210>28<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的PCR引物<400>28gtcgagaata tccaagagac aggtttctcc 30<210>29<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述含有多克隆位點和仙臺病毒EIS序列的人工合成序列<400>29ggccgcactc gagttcgcta gcttggcgcg ccggtacctc cgtaagaaaa acttagggtg 60aaagttcatc gc 72<210>30<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pSeV(+)PM的Not I位點周圍的序列<400>30agggtgaaag aaatttcacc taagcggccg caatg 35<210>31<211>60<212>RNA<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS<222>(1)..(60)<400>31aug acu gaa uau aaa cuu gug gua guu gga gcu guu ggc gua ggc aag 48Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys1 5 10 15agu gcc uug acg 60Ser Ala Leu Thr20<210>32<211>20<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>32Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys1 5 10 15Ser Ala Leu Thr20<210>33<211>46<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述切割K-ras mRNA的核酶KRZb<400>33ugccuacgcc cugaugaguc cgugaggacg aaacagcucc aacuac 46<210>34<211>22<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述仙臺病毒的EIS序列<400>34taagaaaaac ttagggtcaa ag 22<210>35<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述載體中編碼的核酶的側(cè)翼序列<400>35gcggccgcac tcgagttcgc tagc 24<210>36<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述載體中編碼的核酶的側(cè)翼序列<400>36ggtacctccg taagaaaaac ttagggtcaa agt tcatcgc ggccgc 46<210>37<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pSeV(+)PM的Not I位點周圍的序列<400>37agggtgaaag aaatttcacc taagcggccg caatg 35
<210>38<211>24<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述錘頭型核酶的序列(n＝g或a或u或c)<400>38cugangannn nnnnnnnnng aaan 2權(quán)利要求
1.副粘病毒載體，其編碼具有催化活性的RNA。
2.權(quán)利要求1的副粘病毒載體，其中RNA的長度是50個核苷酸或更長。
3.權(quán)利要求1的副粘病毒載體，其中RNA的長度是60個核苷酸或更長。
4.權(quán)利要求1的副粘病毒載體，其中RNA是錘頭型核酶。
5.權(quán)利要求1的副粘病毒載體，其中所述副粘病毒是仙臺病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供編碼有活性核酶的副粘病毒載體。本發(fā)明的載體適于作為在廣泛多種組織中進行目的核酶的體內(nèi)或回體表達的基因治療載體。可以將本發(fā)明的載體用于癌癥和其它疾病的基因治療。
文檔編號C12N15/86GK1768145SQ20048000910
公開日2006年5月3日 申請日期2004年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月31日
發(fā)明者德炭剛, 伴浩志, 飯?zhí)镎虏? 長谷川護 申請人:株式會社載體研究所