專利名稱：用低濃度的含碳和含氮營養(yǎng)物來進(jìn)行發(fā)酵的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對目標(biāo)化合物(例如次級代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)和肽)發(fā)酵生產(chǎn)的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
絲狀細(xì)菌中的actinomycetes科對發(fā)酵工業(yè)來說非常重要。該科中的很多成員都已知能生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物或胞外酶，細(xì)菌代謝的這些產(chǎn)物中的若干種都具有工業(yè)應(yīng)用價值。為獲得這些產(chǎn)物，通常在液體培養(yǎng)基(深層培養(yǎng)物，submerged culture)中培養(yǎng)細(xì)菌，使得產(chǎn)物被排進(jìn)液體，從中將其分離。產(chǎn)物的形成可以發(fā)生于生物的初始快速生長期間和/或培養(yǎng)物被保持于緩慢生長或不生長狀態(tài)的第二階段。此過程中每單位時間形成的產(chǎn)物的量(生產(chǎn)率)通常是很多因子的函數(shù)生物的內(nèi)在代謝活性；培養(yǎng)物的主要生理條件(例如pH、溫度和培養(yǎng)基組成)；以及在用于該方法的設(shè)備中存在的生物的量。通常，對發(fā)酵方法的優(yōu)化期間，優(yōu)選獲得盡可能高的細(xì)菌濃度，因為如果假設(shè)每單位生物的內(nèi)在生產(chǎn)率是恒定的，這樣就能獲得最高量的產(chǎn)物。但是，actinomycetes科的細(xì)菌的一個特殊特征卻使得這個目的很難達(dá)到。Actinomycetes在深層培養(yǎng)物中生長時具有絲狀形態(tài)，其通常會導(dǎo)致培養(yǎng)液具有高粘度。培養(yǎng)物的高粘度限制了氧向培養(yǎng)物中的轉(zhuǎn)運。事實上，所有使用到actinomycetes的方法都依賴氧的存在和消耗，因此對氧轉(zhuǎn)運的限制會對整個過程的生產(chǎn)率加以限制。培養(yǎng)液的粘度是由很多因素決定的，例如培養(yǎng)基的組成、微生物排出的產(chǎn)物的存在情況和性質(zhì)、以及(最重要的)微生物的形態(tài)。如果人們可以對微生物的形態(tài)特征施以有利的影響(即降低比粘度)，那么就可以以更高的生產(chǎn)率來實現(xiàn)該方法，或者可以獲得更高濃度的細(xì)菌。對該方法的這兩種改變都能獲得更高的生產(chǎn)率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)目標(biāo)化合物的發(fā)酵方法，所述方法包括在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)絲狀細(xì)菌菌株，其中，發(fā)酵培養(yǎng)基中的含碳營養(yǎng)物和含氮營養(yǎng)物都保持為低濃度。
優(yōu)選地，包含含碳和含氮營養(yǎng)物的養(yǎng)料被提供給培養(yǎng)基，養(yǎng)料中營養(yǎng)物的比例可以使含碳和含氮營養(yǎng)物在培養(yǎng)基中保持低濃度。
絲狀細(xì)菌優(yōu)選是Actinomyces科的，更優(yōu)選是Streptomyces屬的。
發(fā)明詳述我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，某些培養(yǎng)基組成會使得包含絲狀細(xì)菌菌株的發(fā)酵方法中培養(yǎng)物粘度降低，而不會影響到對目標(biāo)化合物的生產(chǎn)。一個重要的因素是培養(yǎng)基中含氮營養(yǎng)物(N)與含碳營養(yǎng)物(C)的比。高N/C比(氮化合物相對過量)導(dǎo)致粘性培養(yǎng)物，而低N/C比使得培養(yǎng)液的粘度相對較低。當(dāng)對培養(yǎng)基中的氮量控制過多時，會使得生物生長極為不良，形成的產(chǎn)物的量也很低。但是，在適中的N/C比下，生物生長良好，產(chǎn)物形成正常，而同時生物的形態(tài)明顯改變，使得培養(yǎng)液的粘度顯著降低。此發(fā)現(xiàn)的結(jié)果就是，通過仔細(xì)控制培養(yǎng)基，或更具體地，通過控制培養(yǎng)基中含碳和含氮營養(yǎng)物的比，可顯著地改進(jìn)包含絲狀細(xì)菌菌株的方法。
Actinomycetes科的細(xì)菌菌株已知能生產(chǎn)具有商業(yè)應(yīng)用價值的目標(biāo)化合物，例如次級代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)和肽。其例子是游霉素、nistatine、葡萄糖異構(gòu)酶和棒酸(clavulanic acid)。
例如，actinomycetes菌株Streptomyces natalensis和Streptomycessilvosporens可生產(chǎn)抗真菌化合物游霉素，其作為抗真菌化合物具有多種應(yīng)用。包含此類絲狀細(xì)菌的發(fā)酵方法通常特征在于兩個階段。通常，所述方法起始于微生物開始生長的階段，直到生長條件變得不利，例如，由于支持生長的營養(yǎng)物中的一種從培養(yǎng)基中耗盡。該初始(分批)階段之后可以是微生物被保持于可存活狀態(tài)的階段。通常，大多數(shù)的目標(biāo)產(chǎn)物都形成于該第二階段。在該第二階段，更多的營養(yǎng)物可被提供給培養(yǎng)物，其可以作為單獨或重復(fù)進(jìn)料的新鮮營養(yǎng)物被不連續(xù)地加入，或者可以將含有一種或多種營養(yǎng)物的流體連續(xù)進(jìn)料到發(fā)酵容器中。該種發(fā)酵模式被稱為補料分批發(fā)酵。優(yōu)選地，通過移出部分發(fā)酵混合物可以進(jìn)一步地令發(fā)酵過程延長，例如，當(dāng)由于補充含有營養(yǎng)物的流體導(dǎo)致發(fā)酵容器被完全充滿時移出。該方法被稱為延伸(extended)發(fā)酵或重復(fù)(補料)分批發(fā)酵。
當(dāng)營養(yǎng)物中的一種耗盡時，初始(分批)階段就結(jié)束了。該階段之后可以對氧吸收進(jìn)行測量，在接近初始階段末尾時，氧吸收會降低。通常，初始階段持續(xù)6至48小時。當(dāng)開始補充營養(yǎng)物時，第二階段就開始了。營養(yǎng)物的補充使得發(fā)酵過程較之簡單的分批發(fā)酵過程可持續(xù)更長時間。
通常，對每種生產(chǎn)方法而言，含碳和含氮營養(yǎng)物的最佳比例是由技術(shù)人員確定的，這取決于生物的基本成分、產(chǎn)物、N/C比對生物生理的影響，以及，更具體地，生物的產(chǎn)物形成能力。我們發(fā)現(xiàn)，碳過量和氮過量都無法獲得人們期待的結(jié)果。在最佳狀態(tài)下，在分批過程結(jié)束時和/或延長的補料分批類型的發(fā)酵過程中，可利用的碳和氮都幾乎被耗盡。第二階段中，培養(yǎng)基里含氮營養(yǎng)物的濃度優(yōu)選小于0.5g/l，更優(yōu)選小于0.25g/l，最優(yōu)選小于0.1g/l(表示為每升中氮的克數(shù))。含碳營養(yǎng)物的濃度優(yōu)選小于5g/l，更優(yōu)選小于2.5g/l，最優(yōu)選小于1g/l(表示為每升中碳的克數(shù))。養(yǎng)料(feed)可作為含有所有營養(yǎng)物的一種養(yǎng)料來提供，或者優(yōu)選地，作為多于一種的亞養(yǎng)料(subfeed)來提供，其中每種亞養(yǎng)料中包含含氮營養(yǎng)物、含碳營養(yǎng)物或含氮和含碳營養(yǎng)物的組合。
還可對養(yǎng)料進(jìn)行控制，使得氧的量在20至70％的空氣飽和度之間，優(yōu)選在30至60％的空氣飽和度之間。
氧，典型地，以空氣形式存在的氧，通常在發(fā)酵罐底部或接近底部的地方被引入。裝置有一個或多個噴嘴用于引入空氣或其它含氧氣體，例如(經(jīng)純化的)氧。
可選地，反應(yīng)器中存在攪拌器，以促進(jìn)氧的吸收。此外，攪拌器還防止發(fā)酵罐中形成養(yǎng)料或亞養(yǎng)料的濃度梯度。


圖1氮過量的培養(yǎng)物(●)和氮-碳均受限制的培養(yǎng)物(◆)中粘度的發(fā)展情況。
圖2將溶解氧濃度控制在30％空氣飽和度所需要的攪動力。氮過量的培養(yǎng)物(●)和氮-碳均受限制的培養(yǎng)物(◆)都在類似的條件下被操作。
圖3氮過量的培養(yǎng)物(●)和氮-碳均受限制的培養(yǎng)物(◆)中粘度的發(fā)展情況。
圖4氮過量的培養(yǎng)物(●)和氮-碳均受限制的培養(yǎng)物(◆)中產(chǎn)物積累情況。
圖5對Streptomyces natalensis的完整規(guī)模的發(fā)酵，來生產(chǎn)游霉素。最初的方法(●)中使用了大豆油限制性養(yǎng)料，而NH3的濃度則保持在不受限制的水平。在改進(jìn)方法(◆)中，通過以與補充油的速度成比例的速度來連續(xù)補充NH3溶液，將NH3濃度保持在較低的值上。培養(yǎng)物粘度降低使得對油的補充更快。產(chǎn)物形成的增加與補充油的速度的增加幾乎成比例。
實施例實施例1在含有500mL生長培養(yǎng)基的2000ml錐形搖瓶中培養(yǎng)Steptomycesnatalensis菌株ATCC27448，培養(yǎng)基成分如下g/L葡萄糖·1H2O 30酪蛋白水解物 15酵母提取物(干)10消泡劑Basildon0.4通過加NaOH/H2SO4將pH調(diào)為7.0，通過高壓滅菌對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌(120℃，20分鐘)。將生長完全的搖瓶中的內(nèi)容物用于接種含有6L培養(yǎng)基的發(fā)酵容器，所述培養(yǎng)基成分如下
g/L大豆花25大豆油8玉米浸出物(干)1KH2PO40.45微量元素溶液 17消泡劑Basildon0.4微量元素溶液的組成如下所示g/L檸檬酸·1H2O 175FeSO4·7H2O 5.5MgSO4·7H2O 100H3BO30.06CuSO4·5H2O 0.13ZnSO4·7H2O 1.3CoSO4·7H2O 0.14培養(yǎng)基的溫度和pH被分別控制為25℃和7.0。通過在必要的時候增加氣流和/或攪拌器速度，將溶解氧濃度保持在大于30％空氣飽和度上。在分批培養(yǎng)物中進(jìn)行大約24小時的初始生長之后，培養(yǎng)物進(jìn)入發(fā)酵的第二階段。在第二階段，通過補充純的大豆油來使生長和產(chǎn)物形成都得以持續(xù)。第二進(jìn)料線被用于補充氨。大豆油的平均補充速度為3g/h。以與大豆油補充速度成比例的速度來提供氨。進(jìn)行一系列的發(fā)酵，其中應(yīng)用不同的速度來補充氨，而補充大豆油的速度保持恒定。就該菌株而言，當(dāng)NH3與油的比例在30-40mg NH3/g油的范圍內(nèi)時，碳源和氮源全部被消耗掉。C-N均受限制的條件使得培養(yǎng)物具有最低的比粘度。氮過量(NH3/油的比例＞40mg/g)導(dǎo)致培養(yǎng)物的粘度大幅增加。碳過量(NH3/油的比例＜30mg/g)具有類似效果。此外，油的積聚對培養(yǎng)物的存活能力具有負(fù)面效應(yīng)。含氮營養(yǎng)物與含碳營養(yǎng)物之比的范圍取決于菌株以及氮源和碳源的性質(zhì)。因此對每種新方法而言，可以通過本發(fā)明的方法來確定最佳的范圍。
根據(jù)上述方法進(jìn)行了兩項實驗。其中一項用于達(dá)到氮過量的條件(即，然后通過大豆油補充速度來對培養(yǎng)物進(jìn)行單一控制)。在另一項實驗中，氨補充速度相對大豆油補充被降低，以達(dá)成發(fā)酵容器中兩種營養(yǎng)物(大豆油和氨)的濃度都非常低的條件。對于試驗生物(Strepromycesnatalensisi)而言，在選擇的條件下，氨補充速度相對大豆油補充速度的比例應(yīng)當(dāng)在每g油35mg NH3左右。氨過剩的實驗被開展于每g油45mgNH3的比例之下。
圖1中清楚地展示了碳-氮均受限制的效果。在氮過量的條件下，粘度達(dá)到通常的高值。在同時對碳和氮進(jìn)行限制的條件下，粘度降低至低很多的值，使得通氣條件更好。對好的生產(chǎn)而言，優(yōu)選將溶解氧濃度保持在大于30％空氣飽和度的水平上。圖2顯示，當(dāng)培養(yǎng)物在碳-氮均受限制的條件下時，為保持該溶解氧濃度需要的攪動力(能量)要小很多。
實施例2用Streptomyces natalensis的菌株，按照與實施例1中相同的手段來進(jìn)行另一項發(fā)酵實驗。該菌株是抗真菌化合物游霉素的生產(chǎn)者。在該實驗中，進(jìn)行兩項發(fā)酵。其中一項是在碳受限但氮過量的情況下(補充油的階段，NH3水平保持在150-200mg/L)進(jìn)行的。第二項進(jìn)行的條件是補充油的階段，氮-碳均受限制，其中使用的NH3/油的比為32mg/g。圖3和4中顯示了一些結(jié)果。明顯能觀察到兩種發(fā)酵模式中粘度有非常顯著的差異。低粘度對于有效的過程操作來說是非常有好處的。但是，低粘度和不利的產(chǎn)物形成趨勢的組合則是不好的。在本實驗中，產(chǎn)物的形成則完全不受導(dǎo)致低粘度的條件的影響(圖3)。在氮-碳均受限制的實驗中，在發(fā)酵的第二部分，產(chǎn)物形成的速率更快，只是除了在起始時稍慢之外。
實施例3實施例1和2所述的實驗中獲得的信息被用于改進(jìn)對游霉素進(jìn)行的工業(yè)規(guī)模(100m3規(guī)模)的實際生產(chǎn)方法。降低的粘度下，通過主營養(yǎng)物大豆油更快的補充，使得該方法被強化。NH3的補充速度與對油的補充成比例，如實施例1和2中所示，這使得補充階段(開始于對發(fā)酵容器的接種之后24小時)中碳-氮均受限制。工藝條件和培養(yǎng)基的成分都與實施例1和2所述的小規(guī)模實驗相似。補充油的速度最初小量增加，然后一輪一輪地逐步增加，直到達(dá)到可被保持在最小溶解氧壓力下的過程強度。圖5顯示，更高的油補充速度導(dǎo)致的產(chǎn)物產(chǎn)量增加相當(dāng)顯著。
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)目標(biāo)化合物的發(fā)酵方法，所述方法包括在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)絲狀細(xì)菌菌株，其中，發(fā)酵培養(yǎng)基中的含碳營養(yǎng)物和含氮營養(yǎng)物都保持為低濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其中，所述培養(yǎng)基中含氮營養(yǎng)物的濃度小于0.5g/l(表示為每升中氮的克數(shù))。
3.如權(quán)利要求1或2所述的發(fā)酵方法，其中，所述培養(yǎng)基中含碳營養(yǎng)物的濃度小于5g/l(表示為每升中碳的克數(shù))。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的發(fā)酵方法，其中，包含含碳營養(yǎng)物和含氮營養(yǎng)物的養(yǎng)料被提供給培養(yǎng)基，并且，其中，養(yǎng)料中所述營養(yǎng)物的比例使得含碳和含氮營養(yǎng)物在培養(yǎng)物中都保持為低濃度。
5.如權(quán)利要求1-4中任意一項所述的發(fā)酵方法，其中，所述養(yǎng)料通過多于一種的亞養(yǎng)料被提供給培養(yǎng)基，并且，其中，每種亞養(yǎng)料包含含氮營養(yǎng)物、含碳營養(yǎng)物或含氮和含碳營養(yǎng)物的組合。
6.如權(quán)利要求1-4中任意一項所述的發(fā)酵方法，其中培養(yǎng)基中氧的量在20-70％空氣飽和度之間。
7.如權(quán)利要求6所述的發(fā)酵方法，其中培養(yǎng)基中氧的量在30-60％空氣飽和度之間。
8.如權(quán)利要求1-7中任意一項所述的方法，其中所述細(xì)菌是Actinomycetes科的。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)菌是Streptomyces屬的。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述細(xì)菌是Streptomyces natalensis或Streptomyces gilvosporeus，并且，其中，目標(biāo)化合物是游霉素。
11.如權(quán)利要求1-10中任意一項所述的發(fā)酵方法，其中所述含碳營養(yǎng)物中大豆油超過50％的(計算為碳的克數(shù))，所述含氮營養(yǎng)物中氨超過50％(計算為氮的克數(shù))。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種用于生產(chǎn)目標(biāo)化合物(例如游霉素)的方法，所述方法包括在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)絲狀細(xì)菌菌株，其中，發(fā)酵培養(yǎng)基中的含碳營養(yǎng)物和含氮營養(yǎng)物都保持為低濃度。本發(fā)明的方法降低了培養(yǎng)基的粘度，因此增加了目標(biāo)化合物的產(chǎn)量。
文檔編號C12R1/01GK1768146SQ200480009211
公開日2006年5月3日 申請日期2004年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月4日
發(fā)明者約翰內(nèi)斯·阿布里翰·霍蘭德爾德, 富瑞迪·羅納德·誒斯韋爾德爾, 鮑路斯·皮特斯·瑪麗亞·贊德萬德爾 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司