專利名稱:內(nèi)胚層干細胞的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及高度純化自中間體(intermediate)干細胞的混合物的內(nèi)胚層干細胞,所述中間體干細胞在體外分化自多能干細胞,本發(fā)明還涉及制備目的干細胞的方法。
背景技術(shù):
在哺乳動物中,在原胚腸形成過程中,伴隨動態(tài)形態(tài)變化,形成了三個胚原基層,即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層。內(nèi)胚層是在將來分化成胃、腸道、肝、脾、大腸的組織。類似于其它組織,內(nèi)胚層是一種重要的組織,因此開發(fā)提供內(nèi)胚層的分離和增殖的系統(tǒng)是開發(fā)藥物和細胞以及臨床應(yīng)用的主要目的,所述細胞產(chǎn)生激素和生物活性物質(zhì),諸如產(chǎn)胰島素細胞。
在小鼠中,已經(jīng)證實了一些內(nèi)胚層組織分化自組織者(organizer)區(qū)域。組織者是在體軸線的形成中具有最主要作用的一群細胞組織的統(tǒng)稱術(shù)語,Spemann和Mangold,等在1924年報道了它的存在。即,將胚胎的胚孔背唇移植到另一胚胎中導(dǎo)致在植入位點的第二體軸的形成。隨后的研究已經(jīng)揭示組織者存在于物種諸如斑馬魚、雞和其它中。已經(jīng)顯示,在小鼠中,具有特異組織形態(tài)并在原條的頂部形成的節(jié)為此作用負責(zé)(Cell,1999,Vol.196,pp.195-209)。節(jié)細胞不僅涉及體軸線的形成,而且與在未來分化成稱為軸中內(nèi)胚層的組織有關(guān),中胚層和內(nèi)胚層組織主要分化和增殖自所述軸中內(nèi)胚層。
小鼠在每個個體中具有小量的組織者特異性細胞,為此原因,處理這些細胞是困難的,并且因此關(guān)于組織者相關(guān)細胞的分化和增殖的分子生物學(xué)機制的許多方面是不清楚的。因此,為了解決僅有有限數(shù)量的這些細胞可以被分離這一問題,本發(fā)明人已經(jīng)進行了研究,該研究涉及應(yīng)用胚胎干細胞純化難以從個體中直接分離的細胞。
胚胎干細胞(ES)是存在于早期胚胎中并具有分化的多潛能性的細胞,其在被注入其它的blastcysts時,分化成為還包括生殖細胞的不同細胞。關(guān)于小鼠胚胎干細胞的研究是最先進的,所述小鼠胚胎干細胞是存在多潛能性和自主復(fù)制能力的細胞,其在發(fā)育的第3.5天建立自胚囊泡的內(nèi)細胞團。僅通過將血清和被稱為白血病抑制因子(LIF)的生長因子添加到普通培養(yǎng)基中,這些細胞能夠維持它們的增殖,而保持它們的未分化狀態(tài)。通過在發(fā)育的第3.5天,被注入胚囊泡中,再將胚囊泡返回母體中,小鼠胚胎干細胞可以在體內(nèi)再分化成所有的組織細胞并用于產(chǎn)生嵌合體和基因敲除小鼠。此外,最近,體外操作胚胎干細胞以使它們分化成為各種成熟的組織細胞(例如,Shinichi NISHIKAWA et al.,Development,1998,No.125,pp.1747-1757;Toru NAKANO et al.,Science,1994,No.265,pp.1098-1101;Takumi ERA et al.,Blood,2000,No.95,pp.870-878)已經(jīng)成為可能。因為胚胎干細胞如上所述的分化的多潛能性和易于操作,預(yù)期將它們作為移植處理應(yīng)用細胞的材料用在未來藥物治療中。
本發(fā)明人和其它小組的研究已經(jīng)證實當(dāng)迫使胚胎干細胞在體外分化時,成熟的細胞出現(xiàn)。目前,盡管期望胚胎干細胞通過在分化的各階段的干細胞(中間體干細胞)徹底成為成熟細胞,它們分化的過程仍舊在許多方面不清楚。
此外,直到現(xiàn)在,沒有關(guān)于直接從這些胚胎干細胞中分離高純度內(nèi)胚層細胞的報道,因此急切需要它的發(fā)展。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人體外應(yīng)用胚胎干細胞的分化系統(tǒng),已經(jīng)進行了胚胎干細胞的鑒定,純化,并分析了內(nèi)胚層細胞的分化能力。不幸的是,直到今天,還未發(fā)現(xiàn)特異于內(nèi)胚層的細胞表面標(biāo)記。為此原因,本發(fā)明人制備了胚胎干細胞,其中作為標(biāo)記基因的綠色熒光蛋白(GFP)基因被敲入goosecoid(Gsc)基因,一種在上述組織者中特異性表達的基因,并嘗試鑒定和純化內(nèi)胚層細胞。結(jié)果,發(fā)現(xiàn)分化自胚胎干細胞的內(nèi)胚層干細胞表達組織者-特異性標(biāo)記和E-鈣粘著蛋白,導(dǎo)致基于這種發(fā)現(xiàn)的本發(fā)明的完成。
因此,本發(fā)明涉及(1)已經(jīng)在體外分化自多能干細胞的內(nèi)胚層干細胞,其中所述細胞是組織者-特異性標(biāo)記陽性和E-鈣粘著蛋白陽性的;優(yōu)選地,內(nèi)胚層干細胞,其中多能干細胞是胚胎干細胞,其中組織者特異性標(biāo)記是goosecoid,其中標(biāo)簽蛋白是綠色熒光蛋白(GFP),和/或其中標(biāo)簽蛋白被融合到組織者特異性標(biāo)記中;(2)一種制備內(nèi)胚層干細胞的方法,其包括如下步驟a)培養(yǎng)多能干細胞,和b)選擇和分離表達組織者特異性標(biāo)記和E-鈣粘著蛋白的細胞;優(yōu)選地,其中將細胞分選儀用在選擇步驟中的方法;進一步優(yōu)選地,其中在包被有膠原蛋白IV的培養(yǎng)平板上的無血清培養(yǎng)基中存在活化素(activin)的情況中培養(yǎng)多能干細胞由此使多能干細胞分化成內(nèi)胚層干細胞的方法;(3)一種使本發(fā)明的內(nèi)胚層干細胞分化從而制備目的內(nèi)胚層細胞的方法;優(yōu)選地,其中在包被有膠原蛋白IV的培養(yǎng)平板上的無血清培養(yǎng)基中存在活化素的情況中培養(yǎng)內(nèi)胚層干細胞由此使內(nèi)胚層干細胞分化成內(nèi)胚層細胞的方法;進一步優(yōu)選地,其中在活化素和bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)存在下,培養(yǎng)內(nèi)胚層干細胞,由此使內(nèi)胚層干細胞分化成為內(nèi)胚層細胞的方法;更優(yōu)選地,其中將活化素A用作活化素的方法;以及通過這種制備方法獲得的內(nèi)胚層細胞;和(4)一種從多能干細胞中制備目的干細胞的方法,其包括如下步驟a)將標(biāo)簽蛋白的基因引入多能干細胞的基因組中從而適合于預(yù)定標(biāo)記基因的表達系統(tǒng),以使所述標(biāo)簽蛋白取代預(yù)定標(biāo)記基因或與其一起表達,和(b)使用所述標(biāo)簽蛋白的標(biāo)記作為指示物來選擇和分離干細胞;優(yōu)選地,其中多能干細胞是胚胎干細胞和標(biāo)簽蛋白是綠色熒光蛋白的方法。
附圖簡述
圖1A是產(chǎn)生具有敲入(knocked-in)goosecoid基因的胚胎干細胞的圖解。
圖1B顯示將GSC基因用作探針,同源重組胚胎干細胞的DNA印跡法的結(jié)果。
圖2表示通過誘導(dǎo)分化顯示GFP-陽性細胞出現(xiàn)的細胞選擇的結(jié)果和顯示goosecoid僅在GFP-陽性細胞中表達的RT-PCR的結(jié)果。
圖3顯示通過細胞選擇獲得的在GFP-陽性細胞中的基因表達的模式。
圖4顯示在補充有活化素A的無血清培養(yǎng)基中誘導(dǎo)Gsc-GFP-陽性細胞分化的結(jié)果。
圖5顯示取決于活化素A的濃度,GFP-陽性細胞的百分比增加的結(jié)果。
圖6顯示BMP-4和bFGF對誘導(dǎo)GFP-陽性細胞的分化的影響。
圖7顯示E-鈣粘著蛋白在GFP-陽性細胞中的表達模式。
圖8A顯示來自GFP-陽性,E-鈣粘著蛋白陽性細胞的上皮樣細胞的分化,以及它們的細胞形態(tài)。
圖8B顯示在來自GFP-陽性,E-鈣粘著蛋白陽性細胞的上皮樣細胞中的細胞系(linage)特異基因的表達。
實施本發(fā)明的最佳模式(1)本發(fā)明提供已經(jīng)在體外分化自多能干細胞的內(nèi)胚層干細胞,其中所述細胞是組織者特異性標(biāo)記陽性和E-鈣粘著蛋白陽性的。
用于本文時,術(shù)語“多能干細胞”意味著能自主復(fù)制并具有分化成選自外胚層、中胚層和內(nèi)胚層干細胞的至少一種細胞的能力的干細胞,并包括胚胎干(ES)細胞、胚胎生殖(EG)細胞,胚胎癌性(EC)細胞,多能成人祖(MAP)細胞,成人多能干(APS)細胞,骨髓干細胞,和其它??梢詰?yīng)用來自包括人、猴、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、豚鼠、牛(caw)、豬、狗、馬、貓、山羊、綿羊;鳥、爬行動物和其它的多種動物諸如哺乳動物的多能干細胞。通常,使用來自哺乳動物的多能干細胞。
用于本文時,術(shù)語“胚胎干細胞”意味著存在于早期胚胎中并具有分化的多潛能性的細胞,當(dāng)其被注入其它blastcysts時,其可以分化成還包括生殖細胞的不同細胞。在本發(fā)明中,可以應(yīng)用新鮮建立自在胚囊泡的內(nèi)細胞團中的胚胎干細胞或已經(jīng)建立的細胞系。
用于本文時,術(shù)語“內(nèi)胚層干細胞”意味著中間體干細胞,其分化成屬于內(nèi)胚層組織的細胞,但是不分化成屬于中胚層和外胚層組織的細胞。當(dāng)小鼠在母體內(nèi)發(fā)育時,在發(fā)育的第6.5-7.5天的原腸胚形成過程中,已經(jīng)離開形成囊胚的上皮組織的具體區(qū)域的假定的中胚層細胞穿入胚胎的內(nèi)部并在假定的外胚層和內(nèi)胚層之間移動以形成假定的中胚層。組成這些假定的外胚層,內(nèi)胚層和中胚層的細胞分別是外胚層,內(nèi)胚層和中胚層干細胞。
用于本文時,術(shù)語“中間體干細胞”指在多能干細胞分化的晚期階段并且是外胚層,中胚層和內(nèi)胚層干細胞,或其混合物的任何一個的細胞。因此,可以將中間體干細胞表示為具有分化成外胚層細胞,中胚層細胞或內(nèi)胚層細胞任何一個的能力的細胞。
細胞移植處理需要在體外分化胚胎干細胞,帶來了分化成給定胚原基層的中間體干細胞的出現(xiàn),并需要進一步純化它們以制備一種的中間體干細胞。作為用于細胞移植處理的細胞材料,與成熟細胞相比,中間體干細胞在應(yīng)用上具有更大的價值,因為1.大多數(shù)組織的成熟細胞具有低增殖能力,而中間體干細胞具有體外更高的增殖能力。這意味著創(chuàng)造合適的條件可以迫使它們進入體外增殖。
2.一種中間體干細胞分化成為各種成熟細胞,并因此當(dāng)比較治療效果時,更小量的細胞可以獲得更高的結(jié)果。
用于本文時,術(shù)語“組織者特異性標(biāo)記”指在組織者中特異性表達的蛋白,并且就小鼠來說,包括goosecoid(Gsc)、HNF-3β和Lim1。所述goosecoid基因是具有同源異型框結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,并且其已經(jīng)顯示在組織者中表達的基因中,該基因在組織者中特異性地表達(Principles ofDevelopment,Lewis Wolpert,OXFORD Press,2002,pp.105)。本發(fā)明中所用的組織者特異性標(biāo)記的數(shù)量可以是一個,或兩個或更多。
HNF-3β,一種組織者特異性標(biāo)記,描述于Ang,S.-L.和Rossant,J.(1994),Cell,78,561-574;Weinstein,D.C.et al.,(1994),Cell,78,575-588;和其它中;Lim1描述于Shawlot,W. et al.(1995)Nature,374,425-430中。
E-鈣粘著蛋白是負責(zé)細胞之間粘連的跨膜類型的膜蛋白(Annu.Rev.Cell,Dev.Biol.,199713,119-146)并且已知E-Cad缺陷型小鼠是在非常早期的階段胚胎致死的。
在這個方面,優(yōu)選其中標(biāo)簽蛋白已經(jīng)與組織者特異性標(biāo)記融合或標(biāo)記基因已經(jīng)被標(biāo)簽蛋白的基因取代(基因敲除方法)的細胞??梢詫⒕G色熒光蛋白(GFP),或任何可以被用在熒光激活細胞分選儀(FACS’s),例如dsRSD上的任何蛋白用作標(biāo)簽蛋白??梢酝ㄟ^本領(lǐng)域那些技術(shù)人員眾所周知的方法,例如,同源重組和基因引入來進行融合。
用于本文時,給定分子的術(shù)語“陽性(+)”指細胞表達該分子,“陰性(-)”指沒有發(fā)生表達。例如,通過FACS,確定細胞是否表達給定分子是可能的。
用于本文時,術(shù)語“在體外”指反應(yīng)或培養(yǎng)在包括胚胎的活體外進行。當(dāng)在體外培養(yǎng)和/或分化細胞時,可以使用所有適合于細胞生長的培養(yǎng)基,試劑和容器。說明書中的“在體內(nèi)”指在包括胚胎的活體內(nèi)進行反應(yīng)或培養(yǎng),或某種現(xiàn)象在活體內(nèi)發(fā)生。
(2)作為另一方面,本發(fā)明提供一種制備內(nèi)胚層干細胞的方法,其包括如下步驟a)培養(yǎng)多能干細胞,和b)選擇和分離表達組織者特異性標(biāo)記和E-鈣粘著蛋白的細胞。
在上述制備方法中,優(yōu)選標(biāo)簽蛋白與組織者特異性標(biāo)記融合,或標(biāo)記基因被標(biāo)簽蛋白的基因取代(基因敲除方法)。在這種情形中,使用標(biāo)簽蛋白的標(biāo)記作為指示物,用細胞分選儀,優(yōu)選地用熒光激活細胞分選儀(FACS)選擇目的細胞。
通常用流式細胞儀,激光產(chǎn)生裝置,光學(xué),數(shù)據(jù)處理裝置和細胞分選裝置來提供FACS。FACS的功能是自動分離熒光標(biāo)記細胞和對它們的熒光強度進行計算機分析。通過FACS,以接近窄流動通道的激光束來輻射用特異性物質(zhì)熒光標(biāo)記的細胞,然后測量分散的光(前和后分散的光)的信號信息以及在每個個體細胞上的熒光,并顯示其結(jié)果,例如,作為頻率分布,從而可以分選產(chǎn)生特異性信號信息的細胞。FACS設(shè)備可以從Becton-Dickinson和其它商購,并且那些本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按照制造商的說明書來進行操作。
通過使用抗-E-Cad抗體來確定E-鈣粘著蛋白的正性。此外,可以使用熒光激活細胞分選儀(FACS)從而在其分子表達的基礎(chǔ)上選擇細胞。
用在本發(fā)明中的抗體可以是多克隆或單克隆抗體,而當(dāng)用于FACS上時,單克隆抗體是優(yōu)選的。參考實施例中所述的方法,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以產(chǎn)生這些抗體,同時可以使用商購的抗體???E-鈣粘著蛋白單克隆抗體是從Takara Shuzo(商品號M108)商購的,或可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法容易地進行制備。
還可以使用E-鈣粘著蛋白的胞內(nèi)mRNA的存在作為指示物來選擇E-鈣粘著蛋白的正性。
對于培養(yǎng)胚胎干細胞,應(yīng)用具有適合于維持或分化細胞的組成的培養(yǎng)基。通常維持胚胎干細胞的培養(yǎng)基是進行細胞培養(yǎng)的補充有血清、LIF、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇和其它的基本培養(yǎng)基。這些組成的一個實例是85%的KNOCKOUT D-MEM,15%的FBS,10-4M 2-ME,2mM L-谷氨酰胺,0.1mM的NEAA,和1000U/ml LIF。分化胚胎干細胞的培養(yǎng)基通常是進行細胞培養(yǎng)的補充有血清、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇和其它,并且不包含LIF的基本培養(yǎng)基。這些組成的一個實例是90%α-MEM,10%FBS,5×10-5M 2-ME,2mM L-谷氨酰胺??梢詫⒂糜谂囵B(yǎng)的其它物質(zhì),諸如抗生素加入每種培養(yǎng)基中,并可以將具有同等功能的替代物取代相應(yīng)的成分使用。將培養(yǎng)基的各個成分進行滅菌并以它們合適的方式使用。
可以按照隨后的方法和本領(lǐng)域眾所周知的條件來進行按照本發(fā)明培養(yǎng)胚胎干細胞的方法的具體程序。例如,考慮到在Norio NAKATSUJI,ed.Zikken Igaku(Experimental Medicine),Suppl.Vol.,Experimental Course 4 inthe Post-Genome Era,“Stem Cell and Clone Research Protocols”,Yodosha Co.,Ltd.(2001);Hogan,G.et al.,ed.,Mouse Embryo ManipulationsALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NY(1994);Robertson,E.J.ed.,Teratocarcinoma and embryonic Stem Cells,APractical Approach,IRL Press,Oxford,UK(1987)中的描述,可以作出適當(dāng)?shù)臎Q定。
本發(fā)明的某些實施方案包括胚胎干細胞分化成內(nèi)胚層干細胞的步驟。胚胎干細胞可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法進行分化,并且使用在包被有膠原蛋白IV的容器中存在活化素而沒有LIF的無血清培養(yǎng)基來典型地進行培養(yǎng)。本文所用的活化素是大小為24kD的肽細胞生長/分化因子,屬于TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子-β)家族并構(gòu)成二聚體(dimmer),所述二聚體具有兩個通過S-S連接的β-亞單位。(Ling,N.et al.,(1986)Nature,321,779-782;Vale,W.et al.,(1986)Nature,321,776-779).在本發(fā)明中,可以使用活化素A,B,C,和D的任何一種或可以使用來自任何動物,諸如人和小鼠的活化素,并且它們可以從R & D商購。在它們之中,優(yōu)選使用活化素A。優(yōu)選使用來自與所用的多能干細胞所衍生自的物種相同的動物物種的活化素。例如,優(yōu)選當(dāng)將來自人的多能干細胞用作起始材料時,所使用的人活化素A?;罨氐臐舛葍?yōu)選地是10ng/ml或更高,其中10ng/ml是最優(yōu)選的。在低濃度,也可引起誘導(dǎo),但是陽性細胞的百分比很小。
此外,在存在bFGF(堿性成纖維細胞生長因子),并具有活化素的情況中培養(yǎng)多能干細胞的時候,多能干細胞更優(yōu)選地分化成為內(nèi)胚層干細胞是可能的。BFGF可以從R & D商購。b-FGF的濃度優(yōu)選地是10ng/ml或更高,其中10ng/ml是最優(yōu)選的。
當(dāng)將胚胎干細胞在這些條件下進行培養(yǎng)時,小鼠胚胎干細胞將到達內(nèi)胚層干細胞的最佳數(shù)量,其適合于通常在第4-6天按照本發(fā)明進行純化。或者,還通過在過去進行的胚狀體體轉(zhuǎn)化方法使胚胎干細胞分化成內(nèi)胚層干細胞是可能的。此外,盡管是以低頻率,白明膠、纖連蛋白或膠原蛋白IV的類似物的替代使胚胎干細胞分化成內(nèi)胚層干細胞(見,例如,Wiles,M.et al.,Development,111,259-267,1991)。
(3)作為另一個方面,本發(fā)明提供分化本發(fā)明的內(nèi)胚層干細胞以制備目的內(nèi)胚層細胞的方法,以及通過這種制備方法獲得的內(nèi)胚層細胞。
可以以與上述相似的方式進行這種分化的方法。
通過分化本發(fā)明的內(nèi)胚層干細胞獲得的內(nèi)胚層細胞是將來分化成胃、十二指腸、腸道、肝、脾和大腸的細胞,可以發(fā)現(xiàn)它們在藥物開發(fā)中的應(yīng)用,并且作為產(chǎn)激素、生物活性物質(zhì)和其它的細胞,諸如產(chǎn)胰島素細胞以及進行臨床應(yīng)用。
(4)作為另一個方面,本發(fā)明提供制備來自多能干細胞的目的中間體干細胞的方法。在這個實施方案中的目的中間體干細胞具有分化成外胚層那個細胞,中胚層細胞或內(nèi)胚層細胞的任何一個的能力。在該方法中,a)將標(biāo)簽蛋白的基因引入多能干細胞的基因組中以適應(yīng)于預(yù)定標(biāo)記基因的表達系統(tǒng),從而使所述標(biāo)簽蛋白取代或與預(yù)定的標(biāo)記基因一起進行表達。作為預(yù)定的標(biāo)記基因,應(yīng)用在外胚層,中胚層和內(nèi)胚層干細胞任何一個中特異性表達的標(biāo)記,例如,在作為外胚層干細胞的細胞情形中的特異性標(biāo)記基因SOX1,在中胚層干細胞情形中的特異性標(biāo)記基因Brachyury或Mesogeninl,以及在作為內(nèi)胚層干細胞的細胞情形中的特異性標(biāo)記基因GATA4或SOX17。對于標(biāo)簽蛋白的基因的引入,通常應(yīng)用同源重組,并且可以使用其中連接啟動子的另外的轉(zhuǎn)基因方法。
隨后,將所述標(biāo)簽蛋白的標(biāo)記用作指示物,來選擇和分離目的中間體干細胞。在這個方面,優(yōu)選多能干細胞是胚胎干細胞并且標(biāo)簽蛋白是綠色熒光蛋白。
在這個方面的方法可以應(yīng)用于制備來自多能干細胞的中間體干細胞(在能分化成外胚層,中胚層或內(nèi)胚層干細胞的任何兩個的階段的細胞)的前體細胞的方法。因此,本發(fā)明還包括一種方法,所述方法的特征在于a)將標(biāo)簽蛋白的基因引入多能干細胞的基因組中以適應(yīng)于預(yù)定標(biāo)記基因的表達系統(tǒng),從而使所述標(biāo)簽蛋白取代或與預(yù)定標(biāo)記基因一起進行表達,以及b)使用所述標(biāo)簽蛋白作為指示物來選擇和分離目的中間體干細胞。
隨后的實施例表示本發(fā)明的實施方案,并且同時證實了通過本發(fā)明的方法制備的內(nèi)胚層干細胞具有分化成成熟細胞的能力。
實施例參考實施例1維持胚胎干細胞a.材料對于維持胚胎干細胞,使用表1中所示的試劑和設(shè)備。
表1
維持胚胎干細胞的培養(yǎng)基的組成為89%G-MEM,1%FBS,10%KSR,10-4M2-ME,2mM L-谷氨酰胺,0.1mM NEAA,和1000U/mlLIF。
將來自小鼠129株(Niwa H.et al.,Genes and Development,1998,122048-2060)的EB5細胞用作胚胎干細胞。
b.方法用白明膠包被6-cm的皿。以2×105EB5胚胎干細胞接種包被的皿。次日,將培養(yǎng)基更換一次。當(dāng)細胞在第二天匯合時,使用胰蛋白酶使細胞從皿上分離下來,并以2×105細胞的濃度再次接種到白明膠包被的皿上。于37℃在5%CO2的培養(yǎng)箱上進行培養(yǎng)。
參考實施例2誘導(dǎo)胚胎干細胞在無血清培養(yǎng)基中的分化a.材料對于誘導(dǎo)胚胎干細胞的分化,使用表2中所示的材料。
表2
b.分化胚胎干細胞的培養(yǎng)基將1升蒸餾水加入SF-03粉末并加入伴隨的NaHCO3(2.2g),并攪拌所述混合物。然后,將二氧化碳氣體加入培養(yǎng)基中直到培養(yǎng)基的顏色成為橙色。將BSA加至0.1%的濃度,2-ME加到10-4M的濃度,并將所述混合物攪拌超過30分鐘。最終將所述溶液過濾滅菌。
c.分化誘導(dǎo)的方法以1×105EB5胚胎干細胞接種用BIOCOAT膠原蛋白IV-包被的10-cm皿。在第3-6天,使用細胞分離緩沖液(Invitrogen)分離所述細胞并用于隨后的實驗中。
參考實施例3通過FacsVantage選擇GFP-陽性細胞或GFP-陽性,E-鈣粘著蛋白-陽性細胞a.試劑的制備使用表3中所示的試劑。
表3
將100ml的10xHank’s緩沖液和10g的BSA(終濃度為1%)加入900ml的去離子水中,并將所述混合物充分?jǐn)嚢琛SA溶解后,用0.2μm的濾器對溶液進行滅菌。其后,將得到的溶液稱作BSA-Hank’s緩沖液。
b.方法使用細胞分離緩沖液在分化的第3-6天對分化-誘導(dǎo)的胚胎干細胞進行解聚,然后用1%BSA-Hank’s緩沖液洗滌一次。然后,將細胞以106細胞溶解在1ml的1%BSA-Hank’s緩沖液,并通過細胞選擇收集GFP-陽性細胞。當(dāng)進行E-鈣粘著蛋白的抗體染色時,加入10μl的106細胞的小鼠血清,并在冰上溫育20分鐘以進行封閉。加入針對E-鈣粘著蛋白的生物素-標(biāo)記的抗體,并在冰上溫育20分鐘。20分鐘后,用1%BSA-Hank’s緩沖液洗滌細胞一次。將細胞重新溶解于500μl的含鏈霉抗生物素蛋白-allopycocyanine(APC)的1%BSA-Hank’s緩沖液中,并在冰上溫育20分鐘。最終,將細胞用1%BSA-Hank’s緩沖液洗滌兩次,重新溶解于106細胞的1ml 1%BSA-Hank’s緩沖液中,并用于細胞分離。在標(biāo)記染料是PE(藻紅蛋白)的情形中,獲得了相似的結(jié)果。
按照隨附的手冊應(yīng)用FacsVantage(Becton-Dickinson)。Nozzle變化的頻率在26000的等級上,水平在3V,降落滯后(drop delay)是約12-14。
參考實施例4維持和分化Goosecoid-陽性細胞對于維持和分化goosecoid(Gsc)-陽性細胞,使用表4所示的試劑和設(shè)備。
表4
b.方法將細胞分離的GFP-陽性細胞接種在BIOCOAT膠原蛋白IV-包被的10cm皿上。
c.維持和分化Gsc-陽性細胞的培養(yǎng)基維持和分化培養(yǎng)基的組成是90%α-MEM,10%FBS,5×10-5M2-ME,和2mM L-谷氨酰胺。
實施例1建立Goosecoid-GFP基因敲入胚胎干細胞構(gòu)建了構(gòu)建物(construct),并將其引入胚胎干細胞以獲得同源重組克隆(圖1A),其中在所述構(gòu)建物中,按照常規(guī)方法(例如,Gu H,Zou YR,Rajewsky K.,Cell,1993,73,1155-1164)綠色熒光蛋白(GFP)被引向小鼠goosecoid基因的起始密碼子ATG的框架中。
使用GSC(goosecoid)基因作為探針,通過DNA印跡法分析選擇目的克隆。其中沒有發(fā)生同源重組的正常細胞通過HindIII消化給出6.5-kb長的片段,而同源重組克隆提供具有6.5和5.5kb的兩個片段(圖1B)。另外,用NEO探針進行DNA印跡法以鑒定NEO基因是否被完全去除,并觀察到信號的消失(圖1B,右)。
如上所述,將處理的胚胎干細胞加入具有不含LIF并補充有血清的分化培養(yǎng)基的膠原蛋白IV-包被的培養(yǎng)平板上,并于37℃在5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在第四天,觀察到約3%的GFP-陽性細胞。這些細胞經(jīng)過細胞分離,應(yīng)用FacsVantage,并通過RT-PCR方法測試goosecoid基因的表達。該結(jié)果顯示,goosecoid的表達僅在GFP-陽性細胞中顯示(圖2)。這證明了GFP的表達對應(yīng)于goosecoid的表達。
接下來,以類似方式使用RT-PCR檢查這些GFP-陽性細胞是否表達特異于節(jié)細胞的其它基因(圖3)。有趣的是,這些細胞不僅特異性地表達節(jié)細胞特異性基因,還特異性地表達內(nèi)胚層特異性的標(biāo)記基因(GATA4,Soc17)。所述基因表達的模式類似于節(jié)細胞和它們的子代細胞的基因表達模式。從這些發(fā)現(xiàn)可見這些細胞的群體包含所謂的內(nèi)中胚層細胞。
實施例2確定純化GSC-陽性細胞的條件如實施例1所示,GFP-陽性細胞以2%-3%的水平出現(xiàn)在補充血清的培養(yǎng)基中,并且它們的百分比很小。首先通過比較來檢查關(guān)于在血清存在的情況條件下添加活化素A,BMP-4(骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4),BMP-2,LiCl和其它是否能導(dǎo)致任何變化。僅觀察到了關(guān)于活化素A的較小的效果,并且沒有檢測到任何明顯的效果。然后使用無血清培養(yǎng)基,進行關(guān)于使GSC-GFP-陽性細胞出現(xiàn)的培養(yǎng)條件的研究,并以相似的方式在活化素A,BMP-4,BMP-2,LiCl,和其它之間進行比較。具體地,在BIOCOAT膠原蛋白IV-包被的皿上,在缺乏血清情況中,使用不含LIF的誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基,使goosecoid基因敲入胚胎干細胞經(jīng)歷對它們分化的誘導(dǎo)。在這種情形下,在第0天,以10ng/ml的濃度添加活化素A。使用Facs在第2-6天分析GFP的表達。結(jié)果顯示,當(dāng)加入活化素A時,GFP的表達在第六天在97%的細胞中被誘導(dǎo)(圖4)。另一方面,對于BMP-4,BMP-2,和LiCl,GFP的表達沒有被誘導(dǎo)。而且,以相似的方式進行了其中在第0天以0,0.3,1和10ng/ml的濃度誘導(dǎo)活化素的實驗,并使用Facs分析了在第四天GFP的表達。從這些結(jié)果說明以取決于活化素A的濃度的方法,GFP-陽性細胞的百分比增加(圖5)。因此獲得的細胞的基因表達與在GFP-陽性細胞中的基因表達是相同的,當(dāng)加入血清特異于節(jié)細胞的基因的HNF-3β,Liml,和特異于內(nèi)胚層的基因的,GATA-4和Sox17被表達而獲得所述GFP-陽性細胞。
接下來,研究了BMP-4和bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)對誘導(dǎo)GFP-陽性細胞分化的影響。
在BIOCOAT膠原蛋白IV-包被的皿上,在缺乏血清的情況中,使用不含LIF的誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基,使goosecoid基因敲入胚胎干細胞經(jīng)過對它們的分化的誘導(dǎo)。在該情形下,以3ng/ml的固定濃度加入活化素A,以10ng/ml的濃度加入BMP-4和bFGF。相對于只添加活化素A,BMP-4的加入導(dǎo)致Gsc-GFP-陽性細胞百分比的減少,并給出抑制效應(yīng),而bFGF的添加相反地導(dǎo)致增加的百分比(圖6)。從這些發(fā)現(xiàn)了解的是,GFP-陽性細胞的分化沒有被所有的生長因子所誘導(dǎo)并且活化素A和bFGF具有所述的能力(盡管bFGF是輔助的)。
實施例3從GFP-陽性細胞中分離內(nèi)胚層細胞以及它們的增殖為了分析GFP-陽性細胞的分化能力,進行了關(guān)于在E-鈣粘著蛋白的表達的模式中有什么變化的分析,所述E-鈣粘著蛋白在由胚胎干細胞的分化所導(dǎo)致的內(nèi)胚層和外胚層中表達。在BIOCOAT膠原蛋白IV-包被的皿上,在缺乏血清的情況中,使用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基使goosecoid基因敲入胚胎干細胞經(jīng)歷對它們分化的誘導(dǎo)。在該情形下,以10ng/ml的濃度從第0天添加活化素A。使用Facs,分析了在第4,5和6天的GFP和E-鈣粘著蛋白的表達。在第4天,大多數(shù)GFP-陽性細胞是E-鈣粘著蛋白陽性的。當(dāng)分化進展時,GFP-陽性,E-鈣粘著蛋白陰性細胞出現(xiàn),并且它們的百分比增加(圖7)。根據(jù)goosecoid在內(nèi)中胚層中的表達,這些結(jié)果將顯示GFP-陽性,E-鈣粘著蛋白-陽性細胞是內(nèi)胚層細胞。
接下來,嘗試將在GFP-陽性細胞中的E-鈣粘著蛋白陽性和E-鈣粘著蛋白-陰性細胞分化成上皮樣細胞。
在BIOCOAT膠原蛋白IV-包被的皿上,在缺乏血清的情況中,使用不含LIF的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基,使goosecoid基因敲入胚胎干細胞經(jīng)過對它們分化的誘導(dǎo)。在該情形下,以10ng/ml的濃度在第0天加入活化素A。在第6天,用針對E-鈣粘著蛋白的抗體對作為GFP-陽性/E-鈣粘著蛋白-陽性和GFP-陽性/E-鈣粘著蛋白-陰性的各個細胞進行染色,并使用FacsVantage通過細胞選擇進行純化。當(dāng)將這些細胞培養(yǎng)在包含血清的分化培養(yǎng)基中時,E-鈣粘著蛋白-陽性部分有效導(dǎo)致了僅有上皮樣細胞的出現(xiàn),而E-鈣粘著蛋白陰性部分導(dǎo)致了不可觀察的如這些細胞的上皮樣細胞的出現(xiàn)(圖8A)。這意味著上皮樣細胞優(yōu)先從GFP-陽性細胞E-鈣粘著蛋白-陽性細胞出現(xiàn)。
接下來,為了研究這些上皮樣細胞的細胞系,通過RT-PCR方法分析了特異于該細胞系的基因的表達。該結(jié)果顯示盡管表達了HNF3b,Sox17和GATA4,所述HNF3b是內(nèi)胚層-特異性標(biāo)記,沒有檢測到分子在肝細胞和脾細胞中的表達(圖8B)。細胞形態(tài)學(xué)(圖8A)和這種基因表達模式已經(jīng)顯示在第6天分化自GFP-陽性,E-鈣粘著蛋白-陽性細胞的上皮樣細胞是內(nèi)胚層細胞。
工業(yè)應(yīng)用性按照本發(fā)明的內(nèi)胚層干細胞分化成為內(nèi)胚層細胞,得到的內(nèi)胚層細胞是將來分化成為胃、十二指腸、腸道、肝、脾和大腸的細胞??梢詫⑦@些內(nèi)胚層細胞用于開發(fā)藥物,或者作為產(chǎn)激素、生物活性物質(zhì)和其它的細胞,諸如產(chǎn)胰島素細胞,或進行臨床應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種已經(jīng)在體外從多能干細胞分化的內(nèi)胚層干細胞,其中所述細胞是組織者特異性標(biāo)記陽性的和E-鈣粘著蛋白陽性的。
2.按照權(quán)利要求1的細胞,其中多能干細胞是胚胎干細胞。
3.按照權(quán)利要求1或2的細胞,其中組織者特異性標(biāo)記是goosecoid。
4.按照權(quán)利要求3的細胞,其中標(biāo)簽蛋白被融合到組織者特異性標(biāo)記中。
5.按照權(quán)利要求4的細胞,其中標(biāo)簽蛋白是綠色熒光蛋白(GFP)。
6.一種制備內(nèi)胚層干細胞的方法,其包括如下步驟a)培養(yǎng)多能干細胞,和b)選擇和分離表達組織者特異性標(biāo)記和E-鈣粘著蛋白的細胞。
7.按照權(quán)利要求6的方法,其中將所述細胞分選儀用在選擇步驟中。
8.按照權(quán)利要求6或7的方法,其中所述多能干細胞在存在活化素的情況中,在包被有膠原蛋白IV的培養(yǎng)平板上的無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),由此使多能干細胞分化為內(nèi)胚層干細胞。
9.一種分化權(quán)利要求1-5中任一項的內(nèi)胚層干細胞以制備目的內(nèi)胚層細胞的方法。
10.按照權(quán)利要求9的方法,其中在活化素存在的情況中,在包被有膠原蛋白IV的培養(yǎng)平板上的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)內(nèi)胚層干細胞,由此將內(nèi)胚層干細胞分化成內(nèi)胚層細胞。
11.一種通過按照權(quán)利要求9或10的制備方法獲得的內(nèi)胚層細胞。
12.一種由多能干細胞制備目的中間體干細胞的方法,其包括如下步驟a)將標(biāo)簽蛋白基因引入多能干細胞的基因組中以適應(yīng)于預(yù)定標(biāo)記基因的表達系統(tǒng),從而使所述標(biāo)簽蛋白取代預(yù)定標(biāo)記基因表達或與其一起進行表達,和b)使用所述標(biāo)簽蛋白的標(biāo)簽作為指示物,選擇和分離目的中間體干細胞。
13.按照權(quán)利要求11的方法,其中多能干細胞是胚胎干細胞并且標(biāo)簽蛋白是綠色熒光蛋白。
14.按照權(quán)利要求12或13的方法,其中所述中間體干細胞是內(nèi)胚層干細胞。
全文摘要
本發(fā)明意欲通過從多能干細胞分化和隨后分離來制備內(nèi)胚層干細胞。將特異性細胞表面標(biāo)記、組織者特異性標(biāo)記和E-鈣粘著蛋白的表達方式用作指示,這個目的可以通過分離已經(jīng)從多能干細胞中分化的各種內(nèi)胚層干細胞來實現(xiàn)。
文檔編號C12N15/09GK1791668SQ20048001370
公開日2006年6月21日 申請日期2004年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月20日
發(fā)明者西川伸一, 江良択實 申請人:獨立行政法人理化學(xué)研究所