專利名稱：胞外乳糖酶的制備和提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白酶的制備工藝，尤其是一種胞外乳糖酶的制備和提取工藝。

背景技術(shù)：
乳糖酶，又被稱為β-半乳糖苷酶(拉丁文名稱β-Galactosidase)，主要用于乳品工業(yè)，可使低甜度和低溶解度的乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)檩^甜的、溶解度較大的葡萄糖和半乳糖；使冰淇淋、濃縮乳、淡煉乳中乳糖結(jié)晶析出的可能性降低，同時(shí)增加甜度。但由于種種原因，大部分人的體內(nèi)缺少上述乳糖酶，造成很多人患有乳糖不耐癥，即人們在飲用牛奶后常會(huì)引起對牛奶中的主要碳水化合物——乳糖的消化不良，出現(xiàn)腹?jié)q、腸鳴、急性腹痛甚至腹瀉等癥狀，在中國，根據(jù)科研人員的研究結(jié)果，成年人飲用牛奶后乳糖吸收不良的發(fā)生率高達(dá)86.7％，不耐受指數(shù)為0.9。而乳糖不耐癥的會(huì)導(dǎo)致胃腸失調(diào)，造成有價(jià)值的蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)損失，甚至影響到嬰幼兒的智力發(fā)育，故歐洲不少國家常將乳糖酶加入牛奶，供嬰兒飲用。
目前國內(nèi)乳糖酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)還存在著很大的問題，乳糖酶并未得到廣泛應(yīng)用，其主要原因是乳糖酶的單位產(chǎn)量較低，市場銷售的乳糖酶多為胞內(nèi)酶，需破碎細(xì)胞才能得到，其提取純化工藝復(fù)雜，成本高；酶的作用溫度低，耐熱性差，生產(chǎn)過程中很容易染雜菌，適用范圍窄。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用雅致放射毛霉菌株進(jìn)行胞外產(chǎn)酶的胞外乳糖酶的制備和提取工藝。
一種胞外乳糖酶的制備和提取工藝，該工藝包括以下步驟 (1)將活化后的雅致放射毛霉菌接種至固態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)； (2)培養(yǎng)后的粗酶液加入無機(jī)絮凝劑沉淀，然后過濾得到半成品； (3)半成品經(jīng)鹽析和層析純化后得到乳糖酶成品。
步驟(1)中所述的活化后的雅致放射毛霉菌株接種量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的10～15％。
步驟(1)中固態(tài)培養(yǎng)基包括 (1)麩皮、黃豆粉或玉米粉中的一種、兩種或三種； (2)麥芽糖、蔗糖或乳糖中的一種； (3)牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的一種； (4)MnSO4、KH2PO4、NaH2PO4或CaCl2中的一種或兩種； (5)水。
更優(yōu)選的固態(tài)培養(yǎng)基為麩皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4、NaH2PO4和水，其中麩皮與水的重量比為1∶1.0～2.0，乳糖添加量為0.05～0.1g/mL，蛋白胨添加量為0.04～0.08g/mL，KH2PO4添加量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的0.05～0.15％，NaH2PO4添加量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的0.10～0.2％。
上述固態(tài)培養(yǎng)基選用已經(jīng)經(jīng)過2～3次發(fā)酵培養(yǎng)后的固態(tài)培養(yǎng)基時(shí)，胞外產(chǎn)酶的效果更好。
步驟(1)中的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度為30～50℃，培養(yǎng)時(shí)間為60～80h，培養(yǎng)過程中每24～36h翻曲一次。
步驟(2)中的無機(jī)絮凝劑為明礬、硫酸鋁或氯化鎂中的一種。
步驟(3)中的鹽析使用的是硫酸銨分級(jí)沉淀法，層析純化包括Sephadex G-100凝膠層析純化和DEAE-纖維素-52離子交換層析純化。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果在于 本發(fā)明以雅致放射毛霉菌為出發(fā)菌株，在固態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，通過單因素和正交試驗(yàn)確定了最佳的固態(tài)培養(yǎng)基為麩皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4、NaH2PO4和水、培養(yǎng)后得到的粗酶液經(jīng)無機(jī)絮凝劑硫酸鋁處理后，再經(jīng)過硫酸銨鹽析、Sephadex G-100凝膠層析純化和DEAE-纖維素-52離子交換層析純化制得乳糖酶成品，該成品經(jīng)聚丙烯凝膠酰胺電泳檢驗(yàn)后，其最終比活力512.68±0.25U/mg，乳糖酶得率為44.38％，提純倍數(shù)為35.82，乳糖酶的作用pH為4.5～5.5，在30～60℃有較高的耐受性，在4℃冷藏條件下具有良好的穩(wěn)定性，同現(xiàn)有技術(shù)中的胞內(nèi)產(chǎn)酶相比較，其生產(chǎn)工藝簡單、原料成本低、適合規(guī)?；a(chǎn)，制得的乳糖酶耐熱性高、穩(wěn)定性好、安全穩(wěn)定無污染，作用pH更適宜機(jī)體的體內(nèi)生物環(huán)境。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明所使用的雅致放射毛霉購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，該菌種的拉丁文名稱為Actinomucor elegans，保藏編號(hào)為CGMCC3.2178。
一種胞外乳糖酶的制備純化方法包括以下步驟 (1)將活化后的雅致放射毛霉菌株接種至固態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)； 活化的步驟如下 用接種環(huán)直接取凍存的雅致放射毛霉菌株，在LB培養(yǎng)基平板表面劃線，于25～32℃培養(yǎng)36～42小時(shí)。
挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到3～5ml LB培養(yǎng)基中，于25～32℃培養(yǎng)36～42小時(shí)。
將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到100ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)36～42小時(shí)，到OD600＝0.2～0.4。
步驟(1)中的活化后的雅致放射毛霉菌株接種量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的10～15％。
步驟(1)中的固態(tài)培養(yǎng)基包括 ①麩皮、黃豆粉或玉米粉中的任意一種； ②麥芽糖、蔗糖或乳糖中的任意一種； ③牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的任意一種； ④MnSO4、KH2PO4、NaH2PO4或CaCl2中的任意一種或兩種； ⑤水。
經(jīng)過單因素和正交試驗(yàn)確定了更優(yōu)選的固態(tài)培養(yǎng)基為麩皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4、NaH2PO4和水，其中麩皮與水的重量比為1∶1.0～2.0，乳糖添加量為0.05～0.1g/mL，蛋白胨添加量為0.04～0.08g/mL，KH2PO4添加量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的0.05～0.15％，NaH2PO4添加量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的0.10～0.2％。
上述固態(tài)培養(yǎng)基選用已經(jīng)經(jīng)過2～3次發(fā)酵培養(yǎng)后的固態(tài)培養(yǎng)基時(shí)，胞外產(chǎn)酶的效果更好，可提高40～55％的乳糖酶產(chǎn)量。
步驟(1)中的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度為30～50℃，培養(yǎng)時(shí)間為60～80h，培養(yǎng)過程中每24～36h翻曲一次，可提高乳糖酶的產(chǎn)量，通過適當(dāng)翻曲可以使物料接種和溫度保持均勻，有利于原料的利用，同時(shí)翻曲也可以延遲孢子出現(xiàn)的時(shí)間，使菌絲分泌更多的酶類。
(2)培養(yǎng)后的粗酶液加入無機(jī)絮凝劑沉淀，然后過濾得到半成品； 步驟(2)中的無機(jī)絮凝劑為明礬、硫酸鋁或氯化鎂中的一種，其不僅絮凝效果好，而且酶的回收率也高。通過使用絮凝劑，使乳糖酶粗酶液中各種固體小懸浮顆粒和色素絮凝沉降下來，獲得澄清的酶液，達(dá)到初步純化乳糖酶粗酶液的效果，減少對乳糖酶酶活的影響。
絮凝率的測定方法是 取100mL乳糖酶粗酶液置于500mL燒杯中，室溫和自然pH條件下，加入硫酸鋁，快速混勻1min，2～3min后再慢速混勻1min，靜置60min，空白不添加絮凝劑。取上層液稀釋一定倍數(shù)，在620nm處以蒸餾水為參比測定吸光度OD值。絮凝率(FR)計(jì)算如下
絮凝液過濾速率的測定方法是 過濾5min后記錄體積，換算成單位時(shí)間內(nèi)的體積(mL/min)，作為衡量過濾速率(Fv)的指標(biāo)。
步驟(2)中的過濾方法是發(fā)酵液絮凝處理60min后，用9cm錐形漏斗、12cm濾紙進(jìn)行過濾，濾液直接滴入量筒內(nèi)。
(3)半成品經(jīng)鹽析和層析純化后得到乳糖酶成品。
步驟(3)中的鹽析使用的是硫酸銨分級(jí)沉淀法，層析純化包括Sephadex G-100凝膠層析純化和DEAE-纖維素-52離子交換層析純化。
硫酸銨分級(jí)沉淀法的過程是 將硫酸銨烘干研細(xì)，取200mL上清液，向其中緩慢加入硫酸銨粉末至其濃度達(dá)20％，4℃靜置2h，離心(7000r/min、15min、4℃)，沉淀溶于0.005M、pH6.28的磷酸鹽緩沖液，測酶活。上清液繼續(xù)加入硫酸銨粉末至濃度達(dá)40％，靜置離心，沉淀溶于緩沖液，測酶活。取上清液加入硫酸銨使其濃度分別達(dá)60％、80％和90％，操作同上。
Sephadex G-100凝膠層析純化的過程是 1.Sephadex G-100的預(yù)處理 取2.5g Sephadex G-100，至于燒杯中，加入蒸餾水，輕輕攪拌，棄去懸浮顆粒，如此反復(fù)洗滌幾次后，加入過量0.005M、pH6.28的磷酸鹽緩沖液，室溫下溶脹72h。
2.裝柱 取直徑1.0cm，長50cm的層析柱，垂直固定在鐵架臺(tái)上，將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約5～7cm的0.005M、pH6.28的磷酸鹽緩沖液，然后緩慢加入溶脹好的凝膠，注意使柱中無氣泡，打開出樣閥。凝膠緩緩下沉，繼續(xù)加入，用玻璃棒輕輕攪拌，使柱中無界限。待凝膠柱裝好后，在凝膠表面放一層濾紙，避免上樣時(shí)破壞膠面。用緩沖液平衡層析柱，并打開恒流泵控制流速為1mL/5min。
3.上樣 將柱的上端打開，用吸管將凝膠上面的緩沖液吸出，不要吸凈，留一薄層液面，以免空氣進(jìn)入。沿管壁緩緩加入樣品，注意不要打亂凝膠表面。擰開下端的螺旋夾，使樣品進(jìn)入凝膠中，快要進(jìn)完時(shí)，加1mL～2mL緩沖液沖洗柱壁，隨即用多量的洗脫液洗脫。
4.洗脫、收集 當(dāng)樣品完全進(jìn)入凝膠后，用0.005M、pH 6.28的磷酸鹽緩沖液洗脫樣品，洗脫速度為1mL/5min，并收集。
DEAE-纖維素-52離子交換層析純化的過程是 1.DEAE-纖維素-52膨脹活化 稱取3.0g DEAE-纖維素-52，撒于約45mL0.5mol/L NaOH溶液中，浸泡1h左右，不時(shí)攪拌。抽濾(布氏漏斗加兩層濾紙)，以蒸餾水洗滌，再抽濾，直至濾液近中性為止，再將纖維素浸泡于0.5mol/LHCl中1h，同樣抽濾液至近中性。再將纖維素浸于0.5mol/L NaOH液中，同樣處理，洗至中性。
2.平衡 將DEAE-纖維素-52放入0.02mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液中(即起始緩沖液)，靜止1h，不時(shí)攪拌，待纖維素下沉后，傾去上清液或抽濾除去洗液，如此反復(fù)幾次至傾出液體的pH與加入的磷酸緩沖液的pH相近時(shí)為止。
3.裝柱、上樣 裝柱、上樣過程同Sephadex G-100凝膠裝柱過程。
4.洗脫、收集 用含0.15、0.25、0.35、0.45、0.55mol/LNaCl的0.02mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，并收集。
酶活的檢定方法是 1.ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用已知濃度的ONP(鄰硝基苯酚)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)ONP的濃度c對應(yīng)的OD值，利用最小二乘法建立回歸方程 OD＝51648c+0.0079 OD＝420nm吸光值 cONPG濃度μmol/rnL 相關(guān)系數(shù)R＝0.9908；c的測定范圍為0～0.15μmol/mL 鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)為易溶于水的無色化合物，β-D-半乳糖苷酶催化ONPG水解生成鄰硝基苯酚(ONP)，ONP在堿性溶液中呈黃色，在420nm有最大吸收峰。
(1)取1mL粗酶液于EP管中，10000r/min離心10min。取上清液0.5mL，與0.5mL反應(yīng)緩沖液混合。
(2)加入0.2mL ONPG溶液，反應(yīng)10min。
(3)加入0.5mL飽和碳酸鈉溶液終止反應(yīng)。補(bǔ)水至3.5mL。
(4)用紫外可見分光光度計(jì)在420nm處測定OD值。
(5)酶活力定義為在最適反應(yīng)條件下，每分鐘催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位。
E是粗酶液中乳糖酶的酶活力，T是反應(yīng)時(shí)間，V是反應(yīng)體系體積，N是稀釋倍數(shù)。由于是固態(tài)發(fā)酵乳糖酶，最后的酶活力單位要變?yōu)閁/g曲(Y) E是粗酶液中乳糖酶活力，V是粗酶液的總體積，m是麩皮的質(zhì)量 (6)因?yàn)镺D值與酶活成正比，即酶活越高，反應(yīng)的越多，相應(yīng)的OD值也越高，所以可以用OD值來間接反應(yīng)酶活。
實(shí)施例 本實(shí)施例中涉及的儀器設(shè)備包括J-25型高速冷凍離心機(jī)、DL201型恒溫自動(dòng)干燥箱、BS-2F恒溫振蕩培養(yǎng)箱、HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱、磁力攪拌器、JA2003電子天平、DZKW-C型水浴鍋、蒸氣消毒器、Delta 320pH計(jì)。
1.制備孢子懸液 (1)培養(yǎng)好的活化雅致放射毛霉菌株菌種放入無菌室，點(diǎn)燃酒精燈，用75％酒精棉球擦拭雙手和桌面，取3～5mL的無菌水加入到活菌培養(yǎng)皿內(nèi)，在火焰區(qū)域內(nèi)，用滅過菌的涂布器刮下孢子，使之溶于無菌水中。
(2)用移液槍吸取培養(yǎng)皿中的孢子液，移入滅過菌的三角瓶中。取適量無菌水稀釋孢子液。在三角瓶中放入若干滅過菌的小玻璃珠，充分振蕩，使孢子完全散開。
(3)用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)量孢子懸液的孢子數(shù)，利用無菌水稀釋作用使孢子懸液的孢子數(shù)在107的數(shù)量級(jí) 2.固體培養(yǎng)基的制備 (1)將麩皮和蒸餾水1∶1.5混合放入250mL三角瓶中，其中固體物質(zhì)定量為10g，攪拌均勻，作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
(2)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)添加0.06g/mL的乳糖、添加0.06g/mL的蛋白胨、添加固態(tài)培養(yǎng)基總重量的0.1％的KH2PO4，添加固態(tài)培養(yǎng)基總重量的0.15％的NaH2PO4。
(3)將三角瓶用報(bào)紙包好放入高壓滅菌鍋滅菌，滅菌條件121℃，0.1Mpa，17min。
(4)將三角瓶從高壓滅菌鍋中取出、冷卻至常溫。
3.菌種接種 (1)進(jìn)入無菌室，點(diǎn)燃酒精燈，用75％酒精棉球擦拭雙手和桌面。解下捆綁在錐型瓶瓶口的繩子，保留紗布，瓶口在離火焰不遠(yuǎn)處。
(2)用移液槍往三角瓶中接入固體培養(yǎng)基總重量15％的菌懸液，然后用滅過菌的玻璃棒將之?dāng)嚢杈鶆颉?br> 4.培養(yǎng) 將已接種的三角瓶放入45℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)72h左右效果最佳。在培養(yǎng)過程中，每隔24h攪拌1次。
5.粗酶液的制備 用8體積的水浸提發(fā)酵過的麩皮并勻速攪拌30min。經(jīng)四層紗布過濾后即得粗酶液。
6.粗酶液的絮凝 粗酶液中加入硫酸鋁制備乳糖酶半成品，粗酶液添加量為0.002-0.003g/mL。在30℃下，其絮凝效果最佳。在該條件下，過濾速度為1.52mL/min，絮凝率為88.27％，澄清率為91.46％，酶回收率87.9％。
7.乳糖酶半成品的鹽析及純化 (1)乳糖酶半成品經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉淀法鹽析、Sephadex G-100凝膠層析純化和DEAE-纖維素-52離子交換層析純化。
8.酶活的檢定 乳糖酶成品通過聚丙烯凝膠酰胺電泳檢驗(yàn)得到單一條帶，達(dá)到電泳純度，最終其比活力512.68±0.25U/mg，乳糖酶得率為44.38％，提純倍數(shù)為35.82。
乳糖酶成品以鄰硝基苯酚為底物的酶學(xué)性質(zhì)為最適作用pH為4.5～5.5。當(dāng)pH超過6.0時(shí)酶活顯著降低；其反應(yīng)的最適溫度為45～60℃。在30～60℃有較高的耐受性，純酶液在4℃冷藏條件下具有良好的穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1.一種胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于包括以下步驟
(1)將活化后的雅致放射毛霉菌接種至固態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；
(2)培養(yǎng)后的粗酶液加入無機(jī)絮凝劑沉淀，然后過濾得到半成品；
(3)半成品經(jīng)鹽析和層析純化后得到乳糖酶成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于步驟(1)中所述的活化后的雅致放射毛霉菌株接種量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的10～15％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于所述固態(tài)培養(yǎng)基包括
(1)麩皮、黃豆粉或玉米粉中的一種、兩種或三種；
(2)麥芽糖、蔗糖或乳糖中的一種；
(3)牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的一種；
(4)MnSO4、KH2PO4、NaH2PO4或CaCl2中的一種或兩種；
(5)水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于步驟(1)中所述固態(tài)培養(yǎng)基為麩皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4、NaH2PO4和水，其中麩皮與水的重量比為1∶1.0～2.0，乳糖添加量為0.05～0.1g/mL，蛋白胨添加量為0.04～0.08g/mL，KH2PO4添加量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的0.05～0.15％，NaH2PO4添加量為固態(tài)培養(yǎng)基總重量的0.10～0.2％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于所述固態(tài)培養(yǎng)基為經(jīng)過2～3次發(fā)酵培養(yǎng)后的固態(tài)培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于步驟(1)中所述培養(yǎng)的條件是培養(yǎng)溫度為30～50℃，培養(yǎng)時(shí)間為60～80h，培養(yǎng)過程中每24～36h翻曲一次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于步驟(2)中所述的無機(jī)絮凝劑為明礬、硫酸鋁或氯化鎂中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于步驟(3)中所述的鹽析使用的是硫酸銨分級(jí)沉淀法，層析純化包括Sephadex G-100凝膠層析純化和DEAE-纖維素-52離子交換層析純化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胞外乳糖酶的制備和提取工藝，該工藝包括以下步驟(1)將活化后的雅致放射毛霉菌接種至固態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)后的粗酶液加入無機(jī)絮凝劑沉淀，然后過濾得到半成品；(3)半成品經(jīng)鹽析和層析純化后得到乳糖酶成品。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)中的胞內(nèi)產(chǎn)酶相比較，其生產(chǎn)工藝簡單、適合規(guī)?；a(chǎn)，耐熱性高、穩(wěn)定性好、安全穩(wěn)定無污染，作用pH更適宜機(jī)體的體內(nèi)生物環(huán)境。
文檔編號(hào)C12N9/38GK101812435SQ201010187278
公開日2010年8月25日 申請日期2010年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
發(fā)明者劉鼎闊, 王立紅, 董惠峰, 張勇, 張鳳洪, 張俊霞 申請人:鼎正動(dòng)物藥業(yè)(天津)有限公司