專利名稱：采用干細(xì)胞筏式培養(yǎng)制備毒性檢驗(yàn)用全層皮膚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用干細(xì)胞組織工程技術(shù)構(gòu)建全層替代皮膚的方法，可以用于替 代活體動(dòng)物(或人體)皮膚用于毒理學(xué)試驗(yàn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
皮膚是人體最大的器官，是外源化學(xué)因素(化學(xué)品、藥品、化妝品等)或物理機(jī) 械因素(紫外線、微波等)毒性作用的主要器官。利用動(dòng)物或人體皮膚進(jìn)行皮膚毒性 測(cè)試是化妝品、藥品、食品添加劑及原料、農(nóng)藥、生物制品、化學(xué)品健康安全評(píng)價(jià)的 常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。傳統(tǒng)的皮膚安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)不僅要求一定數(shù)量和高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物， 而且試驗(yàn)周期長(zhǎng)，成本高，某些反應(yīng)會(huì)給動(dòng)物造成極大的痛苦。世界各國(guó)非常重視實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物的福利問(wèn)題，如上世紀(jì)歐洲各國(guó)、美國(guó)頒布的動(dòng)物福利法，中國(guó)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 管理?xiàng)l例》等。隨著國(guó)際動(dòng)物保護(hù)和動(dòng)物福利運(yùn)動(dòng)的興起，40多年前國(guó)外最先提出了 以〃減少(reduce) 〃、 〃替代(r印lace) 〃和〃優(yōu)化(refine) 〃為核心內(nèi)容的"3R原 則"，并在此基礎(chǔ)上大力開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法的研究。特別是近20年，不再以動(dòng)物 模式為基礎(chǔ)的毒理學(xué)系統(tǒng)已被科學(xué)家采用，并被許多國(guó)家的政府、歐洲和國(guó)際法規(guī)所 接受。2002年11月7 H歐洲議會(huì)與歐盟理事會(huì)在布魯塞爾達(dá)成協(xié)議，決定"從2009 年3月11 R起在歐盟范圍內(nèi)禁止使用動(dòng)物進(jìn)行化妝品毒性和過(guò)敏實(shí)驗(yàn)"，也"不允許 成員國(guó)從外國(guó)進(jìn)口和銷售進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的化妝品"。歐盟新化學(xué)品法規(guī)REACH (化學(xué)品 的注冊(cè)、評(píng)估、許可和限制)也提出鼓勵(lì)動(dòng)物試驗(yàn)替代方法的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。采用體外 構(gòu)建的組織工程皮膚進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)是動(dòng)物試驗(yàn)替代技術(shù)的關(guān)鍵領(lǐng)域之一。
組織工程化皮膚分為組織型表皮替代物、真皮替代物和器官型全層皮膚替代物幾 類。1975年，Rheinwald和Green采用3T3成纖維細(xì)胞作滋養(yǎng)層，體外培養(yǎng)人自體表
皮細(xì)胞獲得成功(Rheinwald JG， Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinozytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 1975, 6:331-344)。美國(guó)Advanced Tissue Science公司生產(chǎn)的商品名 為Dermagraft的人工真皮以高分子材料PGA、 PGL網(wǎng)為基礎(chǔ)，植入新生兒成纖維細(xì)胞 后培養(yǎng)成人工真皮替代物，結(jié)合自體表皮膜片用于臨床移植(HarisbroughJF， Dore C， Hansbrough WB. Clinical trails of a living dermal tissue replacement placed beneath mesh， split-thickness skin grafts on excised burn wounds. J Burn Care Rehabil， 1992， 13:519-529)。美國(guó)Organogenesis公司生產(chǎn)的Testskin人工皮膚 模型，其表皮層由人角質(zhì)細(xì)胞分化形成，真皮層由人成纖維細(xì)胞種植于I型牛膠原支 架構(gòu)成 (Rodriguez H， 0'Connell C, Barker PE, et al. Measurement of DNA biomarkers for the safety of tissue-engineered medical products, using artificial skin as a model. Tissue Eng，2004， 10 (9—10):1332-1345)。 2001年2 月6閂伍津津等人申請(qǐng)了有關(guān)專利(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1107099. 4)，該發(fā)明包括膠原 凝膠的制備和細(xì)胞的三維培養(yǎng)等。2002年9月2日金巖等人申請(qǐng)了有關(guān)專利(中國(guó)專 利申請(qǐng)?zhí)?2139398. 2)，該發(fā)明包括膠原凝膠的制備和全層皮膚的培養(yǎng)等內(nèi)容。但這 幾種皮膚替代物主要用于燒傷和潰瘍、創(chuàng)傷等皮膚缺損病人的臨床治療，還不能替代 活體動(dòng)物皮膚成熟用于皮膚毒性檢驗(yàn)。作為組織工程皮膚也存在以下缺點(diǎn)人工表皮 由于不含真皮層，還不是真正意義上的人工皮膚；現(xiàn)有的含雙層結(jié)構(gòu)的人工皮膚組織 構(gòu)造上還有待改進(jìn)；培養(yǎng)周期長(zhǎng)，皮膚功能在體外維持時(shí)間短，不適用于慢性毒性試 驗(yàn)。因此，用于毒性檢驗(yàn)的皮膚不僅要求形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)與人體皮膚接近，而且要求 生理功能和活性與活體皮膚相似，構(gòu)建的皮膚重復(fù)性好，批間差異小，便于毒性效應(yīng) 的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題，就是提供一種利用誘導(dǎo)分化的表皮干細(xì)胞或原代分 離的表皮干細(xì)胞，采用筏式培養(yǎng)技術(shù)，制備毒性檢驗(yàn)用全層皮膚的方法，該方法培養(yǎng) 周期短，皮膚含表皮與真皮雙層結(jié)構(gòu)，組織和結(jié)構(gòu)與正常皮膚相似，功能和活性在體 外維持時(shí)間較長(zhǎng)，能滿足毒性檢驗(yàn)領(lǐng)域的需要。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明依次包括以下幾個(gè)步驟 1、高分子真皮支架的制備與修飾
1) PHBV支架制備:
(a) 將3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸共聚物(poly[3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxyvalericacid],PHBV)溶于氯仿中制成濃度為120-130g/L的溶液，然后每 升溶液加入930-950g的氯化鈉(NaCI)為致孔劑，充分混勻，得到濃漿液；
(b) 將濃漿液倒入孔徑為0.8 1.0cm圓形金屬模具中，待氯仿溶劑揮發(fā)約70-80% 后，從模具中取出成形支架，再置于通風(fēng)櫥內(nèi)室溫48-54小時(shí)晾干，25'C-35i:溫度下， 1000 1300Pa真空范圍內(nèi)千燥2小時(shí) 3小時(shí)除去殘余溶劑；
(c) 將成形支架浸入去離子水中，每隔6-8小時(shí)換水1次，48-52小時(shí)內(nèi)換水6-8 次直至將致孔劑濾除干凈，室溫晾干，25'C-35"C溫度下，1000 1300Pa真空范圍內(nèi)干 燥24-48小時(shí)制成PHBV多孔三維支架；
(d) 將PHBV多孔三維支架以無(wú)水乙醇浸泡l-2h，用波長(zhǎng)254nm、 36W的紫外 線正反面各照射1.5-2h，無(wú)菌PBS漂洗3-4次，每次20-30min，無(wú)菌條件下自然晾干；
2) 制備膠原-甲殼糖-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸修飾液(復(fù)合膠原修飾液) 按質(zhì)量比例為14 16: 2 4: 1: 1制備原料I型膠原、脫乙酰甲殼糖、6-硫酸軟
骨素、透明質(zhì)酸A;在36W紫外燈照射下，用0.1%乙酸攪拌溶解I型膠原然后加入 甲殼糖，待甲殼素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入預(yù)先溶解好的6-透明質(zhì)酸 和硫酸軟骨素A溶液，繼續(xù)攪拌溶解3小時(shí)；使膠原、脫乙酰甲殼糖、6-硫酸軟骨素、
透明質(zhì)酸A最終濃度分別為7-8mg/ml、 l-2mg/ml、 0.5mg/ml和0.5mg/ml;然后在冰 浴條件下加入0.5ml 10XDMEM培養(yǎng)液，用lmol/L的NaOH快速調(diào)pH至7.2-7.3; 3)修飾PHBV支架
將2)歩制備的復(fù)合膠原修飾液均勻涂布于1)步制備的PHBV多孔三維支架表 面，室溫條件下靜置20-30min，以此面為真皮面，在PHBV多孔三維支架的另一面, 用濃度為0. 4。/。的人源IV型膠原蛋白浸泡20-30min，此面為表皮面； 2、制備表皮干細(xì)胞
采用兩種途徑獲得表皮干細(xì)胞(ESC)，即從人胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化制備ESC 和從人皮膚原代分離培養(yǎng)制備ESC。
1) 從胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化制備表皮干細(xì)胞
先制備羊膜片無(wú)菌條件下，取足月妊娠剖腹產(chǎn)的羊膜，鈍性分離除去絨毛膜， 用含100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素的PBS沖洗干凈血污，再轉(zhuǎn)移到DMEM液中； 然后在無(wú)菌環(huán)境下，按6孔培養(yǎng)板或12孔培養(yǎng)板孔徑的大小將人羊膜剪成圓形或半 圓的羊膜片，再將羊膜上皮面向上鋪布于6孔板或12孔板的孔底；最后加入無(wú)白血 病抑制因子(LIF)的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液，收集羊膜分泌液備用。
從商業(yè)途徑購(gòu)買人胚胎干細(xì)胞(hES)，傳代培養(yǎng)48小時(shí)后，以終濃度為0.125% 的胰蛋白酶+O.OP/。EDTA消化液消化后按5 X 104個(gè)細(xì)胞/cm2密度接種于鋪布有羊膜 的6孔或12孔培養(yǎng)板中，用無(wú)人LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；每隔l-2天半量換液； 經(jīng)過(guò)4天誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，收集粘附在羊膜上皮表面的表皮干細(xì)胞(ESC);
2) 從人皮膚原代分離培養(yǎng)制備表皮干細(xì)胞
將外科手術(shù)環(huán)切下的幼兒新鮮包皮用含100 U/mL青霉素、100 ug/mL鏈霉素的 0. 1mol/L的PBS緩沖液徹底清洗2次；然后在無(wú)菌條件下去除皮下脂肪和結(jié)締組織， 將包皮剪切成約2. OmmX3. Omm的皮片；用質(zhì)量濃度0. 25M的裂解酶(Dispases)分離表
皮和真皮，然后用生理鹽水或D-Hanks液清洗3-5次；
表皮部分用質(zhì)量濃度0. 25%胰酶+0. 02%EDTA (按1 : 1比例混合)，4'C消化2±0. 5 小時(shí)，消化成單細(xì)胞懸液，然后接種于鋪布有質(zhì)量濃度為0. 4y。的IV型膠原包被的培養(yǎng) 皿中，置5°/。0)2、 37T:培養(yǎng)箱內(nèi)快速黏附10-15min后，棄去未粘附細(xì)胞。將粘附細(xì) 胞吹打脫離培養(yǎng)壁，按lX10"個(gè)/cm2置于第2步1)制備的鋪布有人羊膜的培養(yǎng)皿 上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為無(wú)LIF的ES完全培養(yǎng)基；或?qū)⒓?xì)胞接種于用5ug/ml絲裂霉 素C處理的小鼠3T3成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層上繼續(xù)培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為全層皮膚專用培養(yǎng) 基。
采用上述兩種方法制備的表皮干細(xì)胞以鼠抗人角蛋白19 (CK19)單克隆抗體和 鼠抗人e 1整合素單克隆抗體為一抗，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定細(xì)胞呈CK19陽(yáng)性和
ei整合素陽(yáng)性。
3、 制備原代人成纖維細(xì)胞取外科環(huán)切手術(shù)獲取的包皮組織，以第2歩2)所述 方法分離皮膚真皮部分，以0. 125%胰酶消化獲取原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，然后 放入含l(W新生牛血清高糖DMEM (H-DMEM)培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24-36小時(shí)半量換液。培 養(yǎng)3 4天，待細(xì)胞融合約80%時(shí)，縣酶消化收集細(xì)胞，制備以KSM培養(yǎng)基重懸的成纖 維細(xì)胞用于全層皮膚制備。
4、 全層皮膚專用培養(yǎng)基制備
取第2歩1)收集的人羊膜分泌液，經(jīng)0.22ym微孔小組膜過(guò)濾后，與角質(zhì)細(xì)胞 無(wú)血清培養(yǎng)基(KSM)與按體積比1. 5~2:8~8.5混合，再添加關(guān)鍵促生長(zhǎng)因子5X 10—1() M 霍亂毒素、10rig/mL人重組表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、 5昭/mL胰島素、0.5嗎/mL氫化可 的松、30 jug/mL慶大霉素、15ng/mL兩性霉素、30嗎/mL牛垂體提取物、5 y g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白、1X10 "o M甲狀腺素T3、 24.3 ug/mL腺嘌呤等活性成分，培養(yǎng)基中鈣終 濃度為0.10 mM;
5、 全層皮膚制備
將第1步所得的PHBV多孔三維支架置于6孔或12孔培養(yǎng)板上，經(jīng)復(fù)合膠原修 飾的真皮面向上，以最小容量100-200 ii 1接種以人KSM培養(yǎng)基懸浮的原代培養(yǎng)人皮 膚成纖維細(xì)胞，細(xì)胞密度為lX105cell/cm2—2X105Cell/Cm2，待4-8小時(shí)細(xì)胞粘附 后，加1.5-2ml足量角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基浸沒(méi)培養(yǎng)，每36-48小時(shí)半量換液，培養(yǎng) 5-7天，完成全層皮膚真皮部分構(gòu)建；
將P朋V支架反轉(zhuǎn)，在表皮面接種第2步)或2)制備的人表皮干細(xì)胞，接種細(xì)胞 密度為lX105Cell/Cm2-2X105cell/Cm2，用第4歩制備的全層皮膚專用培養(yǎng)基代替含 10%新生牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基，浸沒(méi)培養(yǎng)72-96小時(shí)后，采用氣-液界面培養(yǎng)，每 48-60小時(shí)半量換液，10-14天后完成全層皮膚制備；
6、 檢測(cè)
同一批以12孔培養(yǎng)板制備的組織工程皮膚中，取其中一塊皮膚固定于以PBS配 制的4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚5um—6iim，蘇木素-伊 紅(H.E)染色；顯微鏡下觀察人工皮膚的組織結(jié)構(gòu)去除皮膚結(jié)構(gòu)不完整、表皮分層 不明顯或缺少分層、角質(zhì)細(xì)胞含量較少，真皮層成纖維細(xì)胞含量少、膠原排列紊亂者， 即得表皮層含基底層、棘層、顆粒層和角化層等分化結(jié)構(gòu)；真皮層含大量成纖維細(xì)胞， 與WIBV支架融合性好，膠原纖維有序列排列；表皮真皮分界明顯的組織工程皮膚產(chǎn) 品，可用于皮膚毒性檢測(cè)試驗(yàn)。
所述的用質(zhì)量濃度0. 25。/。裂解酶(Dispases)分離表皮和真皮，是將表皮和真皮在 37'C的溫度下經(jīng)質(zhì)量濃度0. 25°/。裂解酶消化3±0. 5小時(shí)；或在4。C的溫度下經(jīng)質(zhì)量濃 度0. 25%裂解酶消化12-18小時(shí)。
所述的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液為一種常規(guī)方法，其采用80。/。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，然 后加入20%胎牛血清，lmML-谷氨酰胺、0.1 mM 3-疏基乙醇，1000U/ml人白血
病抑制因子(LIF)， 100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素。
所述的人胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)為一種來(lái)源于的人胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖嵴的 全能干細(xì)胞，可從商業(yè)途徑購(gòu)買。
所述的小鼠3T3成纖維細(xì)胞為一種來(lái)源于SWISS小鼠的成纖維細(xì)胞株，可從商業(yè) 途徑購(gòu)買。
所述的膠原為商品，主要成份為來(lái)源于牛肌腱或豬皮或鼠尾的I型膠原粉木。 所述的角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基KSM (KeratinocyteSer咖-Free Medium )為商業(yè) 化購(gòu)自國(guó)外公司，如美國(guó)BioWhittaker公司的KBM(Keratinocyte Basal Medium)或 GIBCO公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte Serum Free Medium)。
有益效果本發(fā)明用表皮千細(xì)胞培養(yǎng)組織工程全層皮膚，細(xì)胞分裂增殖能力強(qiáng)， 皮膚的形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)完整、功能和活性體外維持時(shí)間較長(zhǎng)，能滿足亞毒性檢驗(yàn)領(lǐng)域 的需要；人工合成的支架材料標(biāo)準(zhǔn)化程度高、批間差異?。黄つw構(gòu)建過(guò)程中全程采用 無(wú)血清培養(yǎng)基，明確了組織構(gòu)建的影響因素，為以后用于毒性試驗(yàn)減少干擾奠定了基 礎(chǔ)。由此制備的組織工程全層皮膚重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)。通過(guò)本發(fā)明制備的全層皮膚 在解剖和組織結(jié)構(gòu)上更接近于天然皮膚，其應(yīng)用于毒性檢驗(yàn)的方式和檢測(cè)指標(biāo)更符合 皮膚毒性作用的實(shí)際情況，可以代替整體動(dòng)物，直接應(yīng)用于化學(xué)品、化妝品、藥品、 農(nóng)藥等健康相關(guān)產(chǎn)品的皮膚毒性試驗(yàn)。


圖1為筏式培養(yǎng)毒性檢驗(yàn)用組織工程全層皮膚的模式圖2 PHBV與表皮干細(xì)胞構(gòu)建組織工程替代皮膚的組織結(jié)構(gòu)圖。HE染色，生物顯 微鏡觀察，放大倍數(shù)200倍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 依次包括以下幾個(gè)步驟 1、高分子真皮支架的制備與修飾
1) PHBV支架的制備
(a) 將適量的PHBV粉末溶于氯仿中制成濃度為120-130g/L的溶液，然后每升 溶液加入940g的氯化鈉(NaCI)為致孔劑，充分混勻，得到濃漿液；
(b) 將濃漿液倒入孔徑為0.8 1.0cm圓形金屬模具中，待約80%氯仿溶劑揮發(fā) 后，從模具中取出成形支架，再置于通風(fēng)櫥內(nèi)室溫48小時(shí)晾干，室溫下真空干燥除 去殘余溶劑；
(c) 將成形支架浸入去離子水中，每隔6小時(shí)換水1次，48小時(shí)內(nèi)換水8次直 至將致孔劑濾除干凈，室溫晾干后真空干燥24小時(shí)制成PHBV多孔三維支架，制成 的支架的孔隙率>90%，孔徑大小為80-200um;
(d) 將支架以無(wú)水乙醇浸泡l-2h，用波長(zhǎng)254nm、 36W的紫外線正反面各照射 1.5-2h，無(wú)菌PBS漂洗3-4次，每次20-30min，無(wú)菌條件下自然晾千；
2) 制備復(fù)合膠原修飾液(膠原為商品，主要成份為來(lái)源于牛肌腱、豬皮或鼠尾 的I型膠原粉末)
在35W紫外燈照射下，用0.1%乙酸攪拌溶解鼠尾膠原然后加入脫乙酰甲殼糖， 待脫乙酰甲殼素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入預(yù)先溶解好的透明質(zhì)酸A 和6-硫酸軟骨素溶液，繼續(xù)攪拌溶解3小時(shí)；鼠尾膠原、脫乙酰甲殼糖、6-硫酸軟骨 素、透明質(zhì)酸A凈重比例為15: 3: 1: 1，四種材料的最終濃度分別為7.5mg/ml、 1.5mg/ml、 0.5mg/ml和0.5mg/ml;然后在冰浴條件下加入0.5ml 10XDMEM培養(yǎng)液， 用lmol/L的NaOH溶液快速調(diào)pH至7.2;
3) 修飾PHBV支架
將2)步制備的復(fù)合膠原修飾液均勻涂布于1)歩制備的支架表面，室溫靜置
20-30min，以此面為真皮面，在支架另一面，用濃度為0. 4。/。的人源IV型膠原蛋白浸泡 20-30min，此面為表皮面。
2、 從人胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化制備表皮干細(xì)胞
1) 制備羊膜片無(wú)菌條件下，取足月妊娠剖腹產(chǎn)的羊膜，鈍性分離除去絨毛膜， 用含100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素的PBS沖洗干凈血污，再轉(zhuǎn)移到DMEM液中； 然后在無(wú)菌環(huán)境下，按6孔培養(yǎng)板孔徑的大小將人羊膜剪成圓形或半圓的羊膜片，再 將羊膜上皮面向上鋪布于6孔板的孔底；最后加入無(wú)白血病抑制因子(LIF)的胚胎 干細(xì)胞培養(yǎng)液，收集羊膜分泌液備用，鋪布好的羊膜片3天內(nèi)可接種細(xì)胞；
其中的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液為一種常規(guī)方法，采用80^/。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，然 后加入20%胎牛血清，lmML-谷氨酰胺、0.1 mM 3-疏基乙醇，1000U/ml人白血 病抑制因子(LIF)， 100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素。人胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)為 一種來(lái)源于胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖嵴的全能干細(xì)胞，從商業(yè)途徑購(gòu)買。
2) 胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化制備表皮干細(xì)胞取傳代培養(yǎng)48小時(shí)的ES細(xì)胞， 以終濃度為0.125。/。胰蛋白酶+0.0in/。EDTA消化液消化后按5 X 10^田胞/ml密度接種于 己鋪布好羊膜的6孔培養(yǎng)板中，用無(wú)LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；每隔1-2天半量換 液；經(jīng)過(guò)4天誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，收集粘附在羊膜上皮表面表皮干細(xì)胞。
將獲得的表皮干細(xì)胞以鼠抗人角蛋白19 (cKi9)單克隆抗體和鼠抗人e 1整合素
單克隆抗體為一抗，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定細(xì)胞呈CK19陽(yáng)性和P 1整合素陽(yáng)性。
3、 制備原代成纖維細(xì)胞將手術(shù)環(huán)切下的幼兒新鮮包皮用含青霉素、鏈霉素的 0. 1mol/L的PBS緩沖液徹底清洗；然后在無(wú)菌條件下去除皮下組織，將包皮剪切成 約1. 0mmX2. Omm的皮片；用質(zhì)量濃度0. 25%裂解酶(Dispases) 37。C下消化3小時(shí)分 離表皮和真皮。真皮部分以O(shè). 125%胰酶消化獲取原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，放入
含10%新生牛血清高糖DMEM (H-DMEM)培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24-36小時(shí)半量換液。培養(yǎng)3~4 天，待細(xì)胞融合約80%時(shí)，縣酶消化收集細(xì)胞，制備以KSM培養(yǎng)基重懸的成纖維細(xì)胞 用于全層皮膚制備。
4、 組織工程全層皮膚專用培養(yǎng)基制備
取第2歩1)收集的人羊膜分泌液，經(jīng)0.22um微孔小組膜過(guò)濾后，與角質(zhì)細(xì)胞 無(wú)血清培養(yǎng)基(KSM)與按體積比1. 5~2:8~8.5混合，再添加關(guān)鍵促生長(zhǎng)因子5 X l(r1Q M 霍亂毒素、10ng/mL人重組表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、 5嗎/mL胰島素、0.5嗎/mL氫化可 的松、30嗎/mL慶大霉素、15 ng/mL兩性霉素、30叱/mL牛垂體提取物、5 y g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白、1X10 —1Q M甲狀腺素T3、 24.3 ug/raL腺嘌呤等活性成分。培養(yǎng)基中鈣終 濃度為0.10 mM。
角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(KSM)為商業(yè)化購(gòu)自GIBCO公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte Serum Free Medium);
5、 組織工程全層皮膚制備
將第1歩所得的PHBV多孔三維支架置于12孔培養(yǎng)板上，經(jīng)復(fù)合膠原修飾的真 皮面向上，以最小容量100-200n 1接種第3步以DMEM培養(yǎng)基懸浮的原代培養(yǎng)人皮膚 成纖維細(xì)胞，細(xì)胞密度為lX105cell/Crn2，待4小時(shí)細(xì)胞粘附后，加2ml足量角質(zhì)細(xì) 胞無(wú)血清培養(yǎng)基浸沒(méi)培養(yǎng)，每36-48小時(shí)半量換液，培養(yǎng)5-7天，完成組織工程皮膚 真皮部分構(gòu)建；
將PHBV支架反轉(zhuǎn)，在表皮面接種第2步制備的來(lái)源于人胚胎干細(xì)胞的人表皮千 細(xì)胞，接種細(xì)胞密度為2X105cell/cm2，用第4步制備的組織工程全層皮膚專用培養(yǎng) 基浸沒(méi)培養(yǎng)96小時(shí)，采用氣-液界面培養(yǎng)，每48-60小時(shí)半量換液，10-14天后完成 組織工程全層皮膚產(chǎn)品制備；
6、 檢測(cè)
同一批以12孔培養(yǎng)板制備的組織工程皮膚中，取其中一塊皮膚固定于以PBS配 制的4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚5um—6um，蘇木素-伊 紅(H.E)染色；顯微鏡下觀察人工皮膚的組織結(jié)構(gòu)去除皮膚結(jié)構(gòu)不完整、表皮分層 不明顯或缺少分層、角質(zhì)細(xì)胞含量較少，真皮層成纖維細(xì)胞含量少、膠原排列紊亂者， 即得表皮層含基底層、棘層、顆粒層和角化層等分化結(jié)構(gòu)；真皮層含大量成纖維細(xì)胞， 與PHBV支架融合性好，膠原纖維有序列排列；表皮真皮分界明顯的組織工程皮膚產(chǎn) 品，可用于皮膚毒性檢測(cè)試驗(yàn)。
所得的人工皮膚產(chǎn)品用于皮膚刺激性檢測(cè)將化妝品、化學(xué)品等固體或液體受試 物直接放置于人工皮膚表面，液體用量為10yl，固體用量為(10士2)mg并涂布均勻， 作用(15±1)分鐘后，以無(wú)菌PBS沖洗去除受試物再孵育(42±1)小時(shí)。從12孔 細(xì)胞培養(yǎng)板中取下組織工程替代皮膚，部分組織固定于多聚甲醛，冊(cè)染色觀察組織病 理學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)；部分組織采用MTT法分析細(xì)胞活性，或用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 檢測(cè)比-2等毒性效應(yīng)指標(biāo)。
所述的MTT法為一種檢驗(yàn)細(xì)胞活性的常規(guī)方法，所述的ELISA檢測(cè)法為一種檢測(cè) 細(xì)胞因子的常規(guī)方法。 實(shí)施例2
1、高分子真皮支架的制備與修飾
1) PHBV支架的制備:
(a) 將適量的PHBV粉末溶于氯仿中制成濃度為130g/L的溶液，然后每升溶液 加入930g的氯化鈉(NaCI)為致孔劑，充分混勻，得到濃漿液；
(b) 將濃漿液倒入直徑為1.0cm圓形金屬模具中0.15-0.2ml，待溶劑揮發(fā)后，從 模具中取出成形支架，置于通風(fēng)櫥內(nèi)室溫54小時(shí)晾干，真空干燥除去殘余溶劑；
(c) 將成形支架浸入去離子水中，每隔7小時(shí)換水1次，49小時(shí)內(nèi)換水7次直
至將致孔劑濾除干凈，室溫晾干后真空干燥24小時(shí)制成PHBV多孔三維支架；
(d)將PHBV多孔三維支架以無(wú)水乙醇浸泡2h，用波長(zhǎng)254 nm、 36W的紫外 線正反面各照射2h，無(wú)菌PBS漂洗4次，每次20min，無(wú)菌條件下自然晾干；
2) 制備復(fù)合膠原修飾液
在紫外燈照射下，用0.1%乙酸攪拌溶解鼠尾膠原然后加入脫乙酰甲殼糖，待脫 乙酰甲殼素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入預(yù)先溶解好的透明質(zhì)酸A和6 硫酸軟骨素溶液，繼續(xù)攪拌溶解3小時(shí)；鼠尾膠原、脫乙酰甲殼糖、6-硫酸軟骨素、 透明質(zhì)酸A凈重比例為14: 4: 1: 1，最終濃度分別為7mg/ml、 2mg/ml、 0.5mg/ml 和0.5mg/ml;然后在冰浴條件下加入0.5ml 10XDMEM培養(yǎng)液混勻用lmol/L的NaOH 快速調(diào)pH至7.3;
3) 修飾PHBV支架
將2)歩制備的復(fù)合膠原修飾液均勻涂布于1)歩制備的支架表面，室溫靜置 30min，以此面為真皮面，在支架另一面，用濃度為0.4M的人源IV型膠原蛋白浸泡 30min，此面為表皮面。
2、人皮膚原代分離制備表皮干細(xì)胞
1) 制備羊膜片無(wú)菌條件下，取足月妊娠剖腹產(chǎn)的羊膜，鈍性分離除去絨毛膜， 用含雙抗的PBS沖洗干凈血污，再轉(zhuǎn)移到DMEM液中；然后在無(wú)菌環(huán)境下，按12 孔培養(yǎng)板孔徑的大小將人羊膜剪成圓形或半圓的羊膜片，再將羊膜上皮面向上鋪布于 12孔板的孔底；最后加入角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)，收集羊膜分泌液備用，鋪 布好的羊膜片3天內(nèi)可接種細(xì)胞；
2) 人皮膚原代分離制備表皮干細(xì)胞將手術(shù)環(huán)切下的幼兒新鮮包皮用含青霉素、 鏈霉素的0.1mol/L的PBS緩沖液徹底清洗；然后在無(wú)菌條件下去除皮下組織，將包 皮剪切成約2. 0mraX2. 5咖的皮片；用質(zhì)量濃度0. 25%裂解酶(Dispases) 4。C消化過(guò)夜 (12小時(shí))分離表皮和真皮，生理鹽水清洗3次。表皮部分用質(zhì)量濃度0.25%胰酶 +0.01%EDTA (按l:l比例混合)，4'C消化2小時(shí)，消化成單細(xì)胞懸液，然后接種于 鋪布有質(zhì)量濃度為0.4y。的IV型膠原包被的培養(yǎng)皿中，置5% C02 、 37'C培養(yǎng)箱內(nèi)快速 黏附15min后，棄去未粘附細(xì)胞，將粘附細(xì)胞吹打脫離培養(yǎng)壁，按lXl(^個(gè)/cr/置 于第2歩1)制備的鋪布有人羊膜的培養(yǎng)皿上繼續(xù)培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血 清培養(yǎng)基。將獲得的表皮干細(xì)胞以鼠抗人角蛋白19 (CK19)單克隆抗體和鼠抗人ei 整合素單克隆抗體為一抗，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定細(xì)胞呈CK19陽(yáng)性和P 1整合素 陽(yáng)性。
角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(KSM)為商業(yè)化購(gòu)自GIBCO公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte Serum Free Medium);
3、 制備原代人成纖維細(xì)胞取第2步2)分離的皮膚真皮部分以0.125%胰酶消 化經(jīng)獲取原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，然后放入含10。/。新生牛血清高糖DMEM(H-DMEM) 培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24-36小時(shí)半量換液；培養(yǎng)3 4天，待細(xì)胞融合約80%時(shí)，縣酶消化 收集細(xì)胞，制備以KSM培養(yǎng)基重懸的成纖維細(xì)胞用于全層皮膚制備。
4、 組織工程全層皮膚專用培養(yǎng)基制備
取第2步1)收集的人羊膜分泌液，經(jīng)0.22nm微孔小組膜過(guò)濾后，與角質(zhì)細(xì)胞 無(wú)血清培養(yǎng)基(KSM)與按體積比1. 5~2:8 8.5混合，再添加關(guān)鍵促生長(zhǎng)因子5X 10—1QM 霍亂毒素、10ng/mL人重組表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、 5pg/mL胰島素、0.5嗎/mL氫化可 的松、30嗎/mL慶大霉素、15 ng/mL兩性霉素、30嗎/mL牛垂體提取物、5 w g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白、1X10 —1Q M甲狀腺素T3、 24.3 ug/mL腺嘌呤等活性成分。培養(yǎng)基中鈣終 濃度為0.10 mM。
5、 組織工程全層皮膚制備
將第1歩所得的PHBV多孔三維支架置于12孔培養(yǎng)板上，經(jīng)復(fù)合膠原修飾的真
皮面向上，以最小容量100-200 u 1接種第3培養(yǎng)基懸浮的原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì) 胞，細(xì)胞密度為lX105cell/cm2，待4小時(shí)細(xì)胞粘附后，加2ml足量角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清 培養(yǎng)基浸沒(méi)培養(yǎng)，每48小時(shí)半量換液，培養(yǎng)5天，完成組織工程皮膚真皮部分構(gòu)建;
將PHBV支架反轉(zhuǎn)，在表皮面接種第2步制備的來(lái)源于人皮膚組織和原代人表皮 干細(xì)胞，接種細(xì)胞密度為2X10^ell/cm2，用第4步制備的組織工程全層皮膚專用培 養(yǎng)基浸沒(méi)培養(yǎng)80小時(shí)，然后采用氣-液界面培養(yǎng)，每48小時(shí)半量換液，12天后完成 人組織工程皮膚產(chǎn)品制備；
6、檢測(cè)
同實(shí)施例1。
實(shí)施例3
1、高分子真皮支架的制備與修飾
1) PHBV支架的制備
(a) 將適量的PHBV粉末溶于氯仿中制成濃度為130g/L的溶液，然后每升溶液 加入940g的氯化鈉(NaCI)為致孔劑，充分混勻，得到濃漿液；
(b) 將濃漿液倒入直徑為1.0^11圓形金屬模具中0.15-0.21111,待溶劑揮發(fā)后，從 模具中取出成形支架，置于通風(fēng)櫥內(nèi)室溫54小時(shí)晾干，真空干燥除去殘余溶劑；
(c) 將成形支架浸入去離子水中，每隔8小時(shí)換水1次，56小時(shí)內(nèi)換水7次直 至將致孔劑濾除干凈，室溫晾干后真空干燥24小時(shí)制成PHBV多孔三維支架；
(d) 將PHBV多孔三維支架以無(wú)水乙醇浸泡2h，用波長(zhǎng)254 nm、 36W的紫外 線正反面各照射2h，無(wú)菌PBS漂洗4次，每次20min，無(wú)菌條件下自然晾干；
2) 制備復(fù)合膠原修飾液
在紫外燈照射下，用0.1%乙酸攪拌溶解鼠尾膠原然后加入脫乙酰甲殼糖，待脫 乙酰甲殼素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入預(yù)先溶解好的透明質(zhì)酸A和6
硫酸軟骨素溶液，繼續(xù)攪拌溶解3小時(shí)；鼠尾膠原、脫乙酰甲殼糖、6-硫酸軟骨素、 透明質(zhì)酸A凈重比例為16: 2: 1: 1，最終濃度分別為8mg/ml、 lmg/ml、 0.5mg/ml 和0.5mg/ml;然后在冰浴條件下加入0.5ml 10XDMEM培養(yǎng)液，用lmoil/L的NaOH 快速調(diào)pH至7.3;
3)修飾PHBV支架
將2)步制備的復(fù)合膠原修飾液均勻涂布于1)步制備的支架表面，室溫靜置 30min，以此面為真皮面，在支架另一面，用濃度為0.4y。的人源IV型膠原蛋白浸泡 30min,此面為表皮面。
2、人皮膚原代分離制備表皮干細(xì)胞
1) 制備羊膜片無(wú)菌條件下，取足月妊娠剖腹產(chǎn)的羊膜，鈍性分離除去絨毛膜， 用含雙抗的PBS沖洗干凈血污，再轉(zhuǎn)移到DMEM液中；然后在無(wú)菌環(huán)境下，按12 孔培養(yǎng)板孔徑的大小將人羊膜剪成圓形或半圓的羊膜片，再將羊膜上皮面向上鋪布于 12孔板的孔底；最后加入角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)，收集羊膜分泌液備用，鋪 布好的羊膜片3天內(nèi)可接種細(xì)胞；
2) 人皮膚原代分離制備表皮干細(xì)胞將手術(shù)環(huán)切下的幼兒新鮮包皮用含青霉素、
鏈霉素的O. 1mol/L的PBS緩沖液徹底清洗；然后在無(wú)菌條件下去除皮下組織，將包 皮剪切成約1. 5mmX2. 5mm的皮片；用質(zhì)量濃度0. 25%裂解酶(Dispases) 4。C消化過(guò)夜 (12小時(shí))分離表皮和真皮，生理鹽水清洗3次。表皮部分用質(zhì)量濃度0.25%胰酶 +0.01%EDTA (按l:l比例混合)，4'C消化2小時(shí)，消化成單細(xì)胞懸液，然后接種于 包被IV膠原的培養(yǎng)皿中，置5%0)2 、 37'C培養(yǎng)箱內(nèi)快速黏附15min后，棄去未粘附 細(xì)胞，將粘附細(xì)胞吹打脫離培養(yǎng)壁，接種于用5iig/inl絲裂霉素C處理的小鼠3T3成 細(xì)胞滋養(yǎng)層上。所用培養(yǎng)基為角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基。將獲得的表皮干細(xì)胞以鼠抗人 角蛋白19(CK19)單克隆抗體和鼠抗人fU整合素單克隆抗體為一抗，采用免疫細(xì)胞
化學(xué)方法鑒定細(xì)胞呈CK19陽(yáng)性和0 1整合素陽(yáng)性。
角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(KSM)為商業(yè)化購(gòu)自美國(guó)BioWhittaker公司的 KBM(Keratinocyte Basal Medium)。
3、 制備原代人成纖維細(xì)胞取第2步2)分離的皮膚真皮部分以0. 125%胰酶消 化經(jīng)獲取原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，然后放入含10%新生牛血清高糖DMEM(H-DMEM) 培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24-36小時(shí)半量換液；培養(yǎng)3 4天，待細(xì)胞融合約80%時(shí)，縣酶消化 收集細(xì)胞，制備以KSM培養(yǎng)基重懸的成纖維細(xì)胞用于全層皮膚制備。
4、 組織工程全層皮膚專用培養(yǎng)基制備
取第2歩1)收集的人羊膜分泌液，經(jīng)0.22um微孔小組膜過(guò)濾后，與角質(zhì)細(xì)胞 無(wú)血清培養(yǎng)基(KSM)與按體積比1. 5~2:8~8.5混合，再添加關(guān)鍵促生長(zhǎng)因子5X 10_1Q M 霍亂毒素、10ng/mL人重組表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、 5嗎/mL胰島素、0.5嗎/mL氫化可 的松、30嗎/mL慶大霉素、15ng/mL兩性霉素、30嗎/mL牛垂體提取物、5 y g/ml轉(zhuǎn) 鐵蛋白、1X10^M甲狀腺素T3、 24.3ug/mL腺嘌呤等活性成分。培養(yǎng)基中鈣終濃度 為0.10 mM。
5、 組織工程全層皮膚制備
將第1歩所得的PHBV多孔三維支架置于12孔培養(yǎng)板上，經(jīng)復(fù)合膠原修飾的真 皮面向上，以最小容量100-200y 1接種第3培養(yǎng)基懸浮的原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì) 胞，細(xì)胞密度為lX105cell/Cm2，待4小時(shí)細(xì)胞粘附后，加2ml角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng) 基浸沒(méi)培養(yǎng)，每48小時(shí)半量換液，培養(yǎng)5天，完成組織工程皮膚真皮部分構(gòu)建；
將RiBV支架反轉(zhuǎn)，在表皮面接種第2步制備的來(lái)源于人皮膚組織和原代人表皮 干細(xì)胞，接種細(xì)胞密度為2X10Scell/cffl2，用第4步制備的組織工程全層皮膚專用培 養(yǎng)基浸沒(méi)培養(yǎng)96小時(shí)，采用氣-液界面培養(yǎng)，每48小時(shí)半量換液，12天后完成人組 織工程皮膚產(chǎn)品制備；6、檢測(cè) 同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1、一種采用干細(xì)胞筏式培養(yǎng)制備毒性檢驗(yàn)用全層皮膚的方法，依次包括以下的步驟I、高分子真皮支架的制備與修飾1)PHBV支架制備(a)將3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸共聚物PHBV溶于氯仿中制成濃度為120-130g/L的溶液，然后每升溶液加入930-950g的氯化鈉為致孔劑，充分混勻，得到濃漿液；(b)將濃漿液倒入孔徑為0.8～1.0cm圓形金屬模具中，待氯仿溶劑揮發(fā)約70-80％后，從模具中取出成形支架，再置于通風(fēng)櫥內(nèi)室溫48-54小時(shí)晾干，25℃-35℃溫度下，1000～1300Pa真空范圍內(nèi)干燥2小時(shí)～3小時(shí)除去殘余溶劑；(c)將成形支架浸入去離子水中，每隔6-8小時(shí)換水1次，48-52小時(shí)內(nèi)換水6-8次直至將致孔劑濾除干凈，室溫晾干，25℃-35℃溫度下，1000～1300Pa真空范圍內(nèi)干燥24-48小時(shí)制成PHBV多孔三維支架；(d)將PHBV多孔三維支架以無(wú)水乙醇浸泡1-2h，用波長(zhǎng)254nm、36W的紫外線正反面各照射1.5-2h，無(wú)菌PBS漂洗3-4次，每次20-30min，無(wú)菌條件下自然晾干；2)制備膠原-甲殼糖-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸修飾液按質(zhì)量比例為14～16∶2～4∶1∶1制備原料I型膠原、脫乙酰甲殼糖、6-硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸A；在36W紫外燈照射下，用0.1％乙酸攪拌溶解I型膠原然后加入甲殼糖，待甲殼素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入預(yù)先溶解好的6-透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素A溶液，繼續(xù)攪拌溶解3小時(shí)；使膠原、脫乙酰甲殼糖、6-硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸A最終濃度分別為7-8mg/ml、1-2mg/ml、0.5mg/ml和0.5mg/ml；然后在冰浴條件下加入0.5ml 10×DMEM培養(yǎng)液，用1mol/L的NaOH快速調(diào)pH至7.2-7.3；3)修飾PHBV支架將2)步制備的復(fù)合膠原修飾液均勻涂布于1)步制備的PHBV多孔三維支架表面，室溫條件下靜置20-30min，以此面為真皮面，在PHBV多孔三維支架的另一面，用濃度為0.4％的人源IV型膠原蛋白浸泡20-30min，此面為表皮面；II、制備表皮干細(xì)胞采用兩種途徑獲得表皮干細(xì)胞(ESC)1)從胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化制備表皮干細(xì)胞先制備羊膜片無(wú)菌條件下，取足月妊娠剖腹產(chǎn)的羊膜，鈍性分離除去絨毛膜，用含100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素的PBS沖洗干凈血污，再轉(zhuǎn)移到DMEM液中；然后在無(wú)菌環(huán)境下，按6孔培養(yǎng)板或12孔培養(yǎng)板孔徑的大小將人羊膜剪成圓形或半圓的羊膜片，再將羊膜上皮面向上鋪布于6孔板或12孔板的孔底；最后加入無(wú)白血病抑制因子LIF的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液，收集羊膜分泌液備用；從商業(yè)途徑購(gòu)買人胚胎干細(xì)胞hES，傳代培養(yǎng)48小時(shí)后，以終濃度為0.125％的胰蛋白酶+0.01％EDTA消化液消化后按5×104個(gè)細(xì)胞/cm2密度接種于鋪布有羊膜的6孔或12孔培養(yǎng)板中，用無(wú)人LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；每隔1-2天半量換液；經(jīng)過(guò)4天誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，收集粘附在羊膜上皮表面的表皮干細(xì)胞ESC；2)從人皮膚原代分離培養(yǎng)制備表皮干細(xì)胞將外科手術(shù)環(huán)切下的幼兒新鮮包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL鏈霉素的0.1mol/L的PBS緩沖液徹底清洗2次；然后在無(wú)菌條件下去除皮下脂肪和結(jié)締組織，將包皮剪切成約2.0mm×3.0mm的皮片；用質(zhì)量濃度0.25％的裂解酶Dispases分離表皮和真皮，然后用生理鹽水或D-Hanks液清洗3-5次；表皮部分用質(zhì)量濃度0.25％胰酶+0.02％EDTA按1∶1比例混合，4℃消化2±0.5小時(shí)，消化成單細(xì)胞懸液，然后接種于鋪布有質(zhì)量濃度為0.4％的IV型膠原包被的培養(yǎng)皿中，置5％CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)快速黏附10-15min后，棄去未粘附細(xì)胞；將粘附細(xì)胞吹打脫離培養(yǎng)壁，按1×104個(gè)/cm2置于第2步1)制備的鋪布有人羊膜的培養(yǎng)皿上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為無(wú)LIF的ES完全培養(yǎng)基；或?qū)⒓?xì)胞接種于用5μg/ml絲裂霉素C處理的小鼠3T3成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層上繼續(xù)培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為全層皮膚專用培養(yǎng)基；將上述兩種方法之一制備的表皮干細(xì)胞以鼠抗人角蛋白19 CK19單克隆抗體和鼠抗人β1整合素單克隆抗體為一抗，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定細(xì)胞呈CK19陽(yáng)性和β1整合素陽(yáng)性；III、制備原代人成纖維細(xì)胞取外科環(huán)切手術(shù)獲取的包皮組織，以第2步2)所述方法分離皮膚真皮部分，以0.125％胰酶消化獲取原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，然后放入含10％新生牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24-36小時(shí)半量換液，培養(yǎng)3～4天，待細(xì)胞融合約80％時(shí)，縣酶消化收集細(xì)胞，制備以KSM培養(yǎng)基重懸的成纖維細(xì)胞用于全層皮膚制備；IV、全層皮膚專用培養(yǎng)基制備取第2步1)收集的人羊膜分泌液，經(jīng)0.22μm微孔小組膜過(guò)濾后，與角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基KSM與按體積比1.5～2∶8～8.5混合，再添加關(guān)鍵促生長(zhǎng)因子5×10-10M霍亂毒素、10ng/mL人重組表皮生長(zhǎng)因子EGF、5μg/mL胰島素、0.5μg/mL氫化可的松、30μg/mL慶大霉素、15ng/mL兩性霉素、30μg/mL牛垂體提取物、5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、1×10-10M甲狀腺素T3、24.3ug/mL腺嘌呤等活性成分，培養(yǎng)基中鈣終濃度為0.10mM；V、全層皮膚制備將第1步所得的PHBV多孔三維支架置于6孔或12孔培養(yǎng)板上，經(jīng)復(fù)合膠原修飾的真皮面向上，以最小容量100-200μl接種以人KSM培養(yǎng)基懸浮的原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，細(xì)胞密度為1×105cell/cm2-2×105cell/cm2，待4-8小時(shí)細(xì)胞粘附后，加1.5-2ml足量角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基浸沒(méi)培養(yǎng)，每36-48小時(shí)半量換液，培養(yǎng)5-7天，完成全層皮膚真皮部分構(gòu)建；將PHBV支架反轉(zhuǎn)，在表皮面接種第2步1)或2)制備的人表皮干細(xì)胞，接種細(xì)胞密度為1×105cell/cm2-2×105cell/cm2，用第4步制備的全層皮膚專用培養(yǎng)基代替含10％新生牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基，浸沒(méi)培養(yǎng)72-96小時(shí)后，采用氣-液界面培養(yǎng)，每48-60小時(shí)半量換液，10-14天后完成全層皮膚制備；VI、檢測(cè)同一批以12孔培養(yǎng)板制備的組織工程皮肷中，取其中一塊皮膚固定于以PBS配制的4％多聚甲醛溶液中，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚5μm-6μm，蘇木素-伊紅H.E染色；顯微鏡下觀察人工皮膚的組織結(jié)構(gòu)去除皮膚結(jié)構(gòu)不完整、表皮分層不明顯或缺少分層、角質(zhì)細(xì)胞含量較少，真皮層成纖維細(xì)胞含量少、膠原排列紊亂者，即得表皮層含基底層、棘層、顆粒層和角化層等分化結(jié)構(gòu)；真皮層含大量成纖維細(xì)胞，與PHBV支架融合性好，膠原纖維有序列排列；表皮真皮分界明顯的組織工程皮膚產(chǎn)品，可用于皮膚毒性檢測(cè)試驗(yàn)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用干細(xì)胞筏式培養(yǎng)制備毒性檢驗(yàn)用全層皮膚的方法，其特 征在于所述的用質(zhì)量濃度0. 25%裂解酶Dispases分離表皮和真皮，是將表皮和真皮在37 。C的溫度下經(jīng)質(zhì)量濃度0. 25%裂解酶消化3±0. 5小時(shí)；或是將表皮和真皮在4'C的溫度下經(jīng) 質(zhì)量濃度0. 25%裂解酶消化12-18小時(shí)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的采用干細(xì)胞筏式培養(yǎng)制備毒性檢驗(yàn)用全層皮膚的方法，其特 征在于所述的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液為采用80% DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，然后加入20%胎牛 血清、lmML-谷氨酰胺、0.1 mM e-疏基乙醇、1000U/ml白血病抑制因子LIF 100U/ml青 霉素及100ug/ml鏈霉素。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的采用干細(xì)胞筏式培養(yǎng)制備毒性檢驗(yàn)用全層皮膚的方法，其特 征在于所述的胚胎干細(xì)胞ES為一種來(lái)源于的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖嵴的全能干細(xì)胞。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的采用干細(xì)胞筏式培養(yǎng)制備毒性檢驗(yàn)用全層皮膚的方法，其特 征在于所述的小鼠3T3成纖維細(xì)胞為一種來(lái)源于SWISS小鼠的成纖維細(xì)胞株，可從商業(yè)途 徑購(gòu)買。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的采用干細(xì)胞筏式培養(yǎng)制備毒性檢驗(yàn)用全層皮膚的方法，其特征在于所述的膠原為商品，主要成份為來(lái)源于牛肌腱或豬皮或鼠尾的I型膠原粉末。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的采用干細(xì)胞筏式培養(yǎng)制備毒性檢驗(yàn)用全層皮膚的方法，其特 征在于所述的角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基SFM-KC可采用KBM或DK-SFM。
全文摘要
一種采用干細(xì)胞筏式培養(yǎng)制備毒性檢驗(yàn)用全層皮膚的方法1.高分子真皮支架制備與修飾，2.從胚胎干細(xì)胞和皮膚組織制備表皮干細(xì)胞，3.制備原代人成纖維細(xì)胞，4.制備全層皮膚專用培養(yǎng)基，5.構(gòu)建全層皮膚。本全層皮膚利用表皮干細(xì)胞分化增殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)，構(gòu)建的皮膚形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)和功能活性能滿足亞慢性毒性檢驗(yàn)的需要；人工合成的支架材料標(biāo)準(zhǔn)化程度高、批間差異小；皮膚構(gòu)建全程采用無(wú)血清培養(yǎng)基，減少了影響組織構(gòu)建的因素，為以后用于毒性試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)本發(fā)明制備的全層皮膚更接近于天然皮膚，其應(yīng)用于毒性檢驗(yàn)的方式和檢測(cè)指標(biāo)更符合實(shí)際情況，可以代替整體動(dòng)物，直接應(yīng)用于化學(xué)品、化妝品、藥品等健康相關(guān)產(chǎn)品的皮膚毒性試驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101352586SQ20081003038
公開(kāi)日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2008年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月26日
發(fā)明者紅 焦, 瑤 秦, 程樹(shù)軍, 黃亞?wèn)| 申請(qǐng)人:程樹(shù)軍;廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心