專(zhuān)利名稱：：發(fā)酵方法和組合物的制作方法發(fā)酵方法和組合物發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的酶方法和組合物，包括在發(fā)酵方法中改善酵母性能的方法和組合物。發(fā)明背景可使用發(fā)酵方法生產(chǎn)各種商品，包括醇(例如，乙醇、曱醇、丁醇)；有機(jī)酸(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸(itaconicacid)、乳酸、葡糖酸)；嗣(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；氣體(例如H2和C02),和更加復(fù)雜的化合物，包括，例如，抗生素(例如，青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如，核黃素、B,2、(3-胡蘿卜素)；激素，以及其它很難以合成方式生產(chǎn)的化合物。在消費(fèi)性醇工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳業(yè)(例如，在生長(zhǎng)酸奶和奶酪中)、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)中也同樣通常使用發(fā)酵方法。還有進(jìn)一步改善發(fā)酵方法和改善包括發(fā)酵步驟的方法的需要。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法和組合物。本發(fā)明還提供了使用一種或多種如本發(fā)明中所描述的方法生產(chǎn)乙醇的改進(jìn)方法。根據(jù)本發(fā)明(回收的)回槽(backset)的百分比，如以下所規(guī)定的，在發(fā)酵培養(yǎng)基中可以得到顯著地增加導(dǎo)致減少了往發(fā)酵方法中添加額外的水的需求。而且，發(fā)發(fā)酵產(chǎn)品，例如乙醇，和為發(fā)酵生物提供的碳水化合物營(yíng)養(yǎng)。方法。首先一個(gè)方面本發(fā)明涉及在發(fā)酵培養(yǎng)基中生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，所述方法含有發(fā)酵步驟，包括使至少一種脂肪酸氧化酶與發(fā)酵培養(yǎng)基接觸。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，在發(fā)酵之前或發(fā)酵期間使至少一種脂肪酸氧化酶加入到發(fā)酵培養(yǎng)基。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明包括將發(fā)酵培養(yǎng)基與至少一種脂肪酸氧化酶相接觸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中在回槽回收至發(fā)酵罐/發(fā)酵容器前可用脂肪酸氧化酶預(yù)處理回槽。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中直接在含有或不含有回槽部分的發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行脂肪酸氧化酶處理。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中直接往含回收的回槽的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入脂肪酸氧化酶。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中在發(fā)酵方法之前或期間加入脂肪酸氧化酶。脂肪酸氧化酶可以在加入發(fā)酵生物(例如酵母)之前加入到發(fā)酵培養(yǎng)基，但也可同時(shí)一起加入或在加入發(fā)酵生物之后加入。優(yōu)選的是在發(fā)酵開(kāi)始之前加入脂肪酸氧化酶。然而，在發(fā)酵期間加入脂肪酸氧化酶也在本發(fā)明范圍之內(nèi)，例如在發(fā)酵開(kāi)始后。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用脂肪酸氧化酶預(yù)處理含回槽部分的發(fā)酵培養(yǎng)基?？稍诎l(fā)酵前或發(fā)酵期間加入有效量的脂肪酸氧化酶。可在發(fā)酵之前加入有效量的脂肪酸氧化酶，例如，在發(fā)酵微生物增殖期間或發(fā)酵微生物增殖之后。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中脂肪酸氧化酶是脂氧化酶(lipoxygenase)。在一個(gè)優(yōu)選方案中發(fā)酵微生物是酵母。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的發(fā)酵方法與糖化步驟(SSF)或液化步驟和糖化步驟(LSF)結(jié)合使用。除至少一種脂肪酸氧化酶之外也可加入其它的酶活性。這種酶活性包括酯酶活性，優(yōu)選脂肪酶(lipase)和/或角質(zhì)酶(cutinase)活性、漆酶活性、植酸酶活性、纖維素酶活性、木聚糖酶活性、ot-淀粉酶活性或葡糖淀粉酶活性。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，使用發(fā)酵方法生產(chǎn)醇類(lèi)，優(yōu)選乙醇。至少一種脂肪酸氧化酶的存在可用于提高乙醇的產(chǎn)率。根據(jù)本發(fā)明通過(guò)使用至少一種脂肪酸氧化酶能增加發(fā)酵培養(yǎng)基中(回收的)回槽的百分比?；夭劭蓸?gòu)成發(fā)酵開(kāi)始前發(fā)酵培養(yǎng)基液體部分的高至30%w/w,優(yōu)選高至50%w/w，更優(yōu)選70%wAv，并且甚至高至90。/。w/w。換句話說(shuō)，這意味著例如回收50%w/w的回槽相當(dāng)于含有36%w/w(粉碎的)顆粒物質(zhì)、32%w/w水和32%w/w回槽的發(fā)酵培養(yǎng)基(淤漿)。術(shù)語(yǔ)"回槽"是指在將發(fā)酵副產(chǎn)品(即酒糟(wholestillage))分成(分離)固體部分(例如濕的顆粒)和液體的"回槽，，部分后，從來(lái)自發(fā)酵步驟的副產(chǎn)品(即酒糟)中獲得的液體部分?；夭?回槽"部分有時(shí)稱為"酒糟水"?；夭酆写蠹s10%的固體和通常含有各種抑制發(fā)酵方法的化合物，這可導(dǎo)致降低乙醇產(chǎn)率。因此，通常避免加入回槽。根據(jù)本發(fā)明這問(wèn)題可通過(guò)往發(fā)酵培養(yǎng)基中加入至少一種脂肪酸氧化酶來(lái)克月良。在一個(gè)伊乙選的實(shí)施方案中在一種或多種附加的酶活性存在下進(jìn)《亍發(fā)酵。附加的酶可在脂肪酸氧化酶之前、當(dāng)中/同時(shí)或之后引入。脂肪酸氧化酶可與一種或多種下列酶聯(lián)合使用酯酶，例如脂肪酶和/或角質(zhì)酶、植酸酶、漆酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶和/或葡糖淀粉酶及其混合物。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，發(fā)酵微生物生長(zhǎng)刺激劑與脂肪酸氧化酶和任選附加的本文所述的酶活性結(jié)合加入/存在，以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵方法。優(yōu)選的生長(zhǎng)刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。本發(fā)明的最后一個(gè)方面涉及含有脂肪酸氧化酶和附加的酶和/或刺激劑的纟且合物。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法和組合物，其中在發(fā)酵方法中使用至少一種脂肪酸氧化酶。在發(fā)酵之前或期間用脂肪酸氧化酶處理發(fā)酵培養(yǎng)基提高了發(fā)酵產(chǎn)率。而且，相對(duì)于沒(méi)有加入脂肪酸氧化酶獲得的產(chǎn)率，用脂肪酸氧化酶處理含有回槽部分的發(fā)酵培養(yǎng)基提高了發(fā)酵產(chǎn)率。加入一種或多種附加的酶活性導(dǎo)致了發(fā)酵產(chǎn)率的進(jìn)一步提高。雖然未限定于任何一種工作原理，但在根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵方法中使用脂肪酸氧化酶可以認(rèn)為，是由于造粉體膜從顆粒物質(zhì)中破裂，基于淀粉釋放的增加。并且，脂肪酸氧化酶促進(jìn)了蛋白質(zhì)中s-s橋的形成。這被認(rèn)為是增加了淤漿的穩(wěn)定性。本發(fā)明首先一個(gè)方面涉及了在發(fā)酵培養(yǎng)基中生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，該方法含有發(fā)酵步驟，包括使發(fā)酵培養(yǎng)基與至少一種脂肪酸氧化酶接觸。脂肪酸氧化酶處理可在發(fā)酵方法的任何階段進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，有效量的脂肪酸氧化酶在發(fā)酵期間加入(例如，通過(guò)接觸發(fā)酵培養(yǎng)基)，例如，在發(fā)酵方法開(kāi)始時(shí)。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，有效量的脂肪酸氧化酶在發(fā)酵之前加入，例如，在發(fā)酵生物增殖期間或增殖之后或在糖化或糖化前步驟(pre-saccharification)或液化步驟期間。本發(fā)明的發(fā)酵方案可用于生產(chǎn)醇，例如乙醇，如作為傳統(tǒng)乙醇方法的一個(gè)不可分割的部分。發(fā)酵方法"發(fā)酵"或"發(fā)酵方法"是指任何發(fā)酵方法或包括發(fā)酵步驟的任何方法。本發(fā)明的發(fā)酵方法包括，但不限于，用于生產(chǎn)下列物質(zhì)的發(fā)酵方法醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有機(jī)酸(例如檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；氣體(例如112和C02);抗生素(例如青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如核黃素、B12、p-胡蘿卜素)；和激素。發(fā)酵方法還包括用于消費(fèi)性醇工業(yè)(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工業(yè)(例如發(fā)酵的乳制品)、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)的發(fā)酵方法。優(yōu)選的發(fā)酵方法包括醇發(fā)酵方法，這種方法是為本領(lǐng)域技術(shù)眾所周知的。優(yōu)選的發(fā)酵方法為厭氧發(fā)酵方法，這種方法是為本領(lǐng)域技術(shù)眾所周知的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的發(fā)酵方法與液化方法和/或糖化方法聯(lián)合使用，其中附加的酶活性，例如酯酶，包括脂肪酶和/或角質(zhì)酶；植酸酶；漆酶；纖維素酶；木聚糖酶；a-淀粉酶；葡糖淀粉酶；或其混合物，可用于處理底物，例如淀粉底物。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的發(fā)酵方法用于生產(chǎn)乙醇的方法。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中脂肪酸氧化酶是脂氧化酶。發(fā)酵培養(yǎng)基"發(fā)酵培養(yǎng)基"或"發(fā)酵培養(yǎng)基"是指進(jìn)行發(fā)酵的環(huán)境，其包括發(fā)酵底物，即被發(fā)酵微生物代謝的碳水化合物源?？稍诶绨l(fā)酵方法之前或同時(shí)通過(guò)粉碎、液化和/或糖化或其它所需要的工序來(lái)處理本發(fā)明的發(fā)酵方法中所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基，包括發(fā)酵底物和其它原材料。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基可以指加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，例如，處于或來(lái)自液化和/或糖化方法的培養(yǎng)基，以及含有發(fā)酵微生物的培養(yǎng)基，例如，在同時(shí)進(jìn)行糖化和發(fā)酵方法(simultaneoussaccharificationandfermentationprocess)(SSF)或同日于進(jìn)4亍液4匕—并唐4匕—發(fā)酵(simultaneousliquefaction-saccharification-fermentation)(LSF)方法中所用的培養(yǎng)基。發(fā)酵生物"發(fā)酵微生物"是指在所需要的發(fā)酵方法中適于使用的任何微生物。根據(jù)本發(fā)明適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵微生物能夠發(fā)酵，即直接或間接地將糖類(lèi)例如葡萄糖和/或麥芽糖轉(zhuǎn)變成所需要的發(fā)酵產(chǎn)品。發(fā)酵微生物的例子包括真菌生物例如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬(&cc/zram_ycw)菌抹，特別是釀酒酵)?？捎玫纳唐坊湍赴?，例如Sto/V丄^"fre五^a"o//ed(購(gòu)自美國(guó)7WStor/Z^q^e)、SUPERSTART(購(gòu)自Alltech)、GERTSTRAND(購(gòu)自瑞典GertStrandAB)和FERMIOL(購(gòu)自DSMSpecialties)發(fā)酵底物任何適當(dāng)?shù)牡孜锘蛟暇捎糜诒景l(fā)明的發(fā)酵方法。如同本領(lǐng)域技術(shù)眾所周知的，通?；谒枰陌l(fā)酵產(chǎn)品和所采用的方法來(lái)選擇底物。適于本發(fā)明方法中使用的底物的例子包括含淀粉物質(zhì)例如塊莖、根、整粒(wholegrains),玉米、玉米穗(cobs)、小麥、大麥、黑麥、高梁或谷類(lèi)；含糖原料例如糖漿、水果材料、糖、甘蔗或甜菜、馬鈴薯和含纖維素物質(zhì)例如木材或植物殘?jiān)?。適當(dāng)?shù)牡孜镞€包括碳水化合物源，尤其是能被發(fā)酵微生物代謝的低分子糖(DP,-3糖)，其可通過(guò)直接加入發(fā)酵培養(yǎng)基中供給。脂肪酸氧化酶術(shù)語(yǔ)"一種"脂肪酸氧化酶是指這種酶中的至少一種。術(shù)語(yǔ)"至少一種"是指這種酶中的一、二、三、四、五、六或甚至更多種。在本發(fā)明范圍內(nèi)，"脂肪酸氧化酶"是一種相比于底物丁香醛連氮(syringaldazine)可更有效地水解底物亞油酸的酶。"更有效，，是指具有更高的反應(yīng)速率。其可使用實(shí)施例2中所描述的方法來(lái)測(cè)試，并計(jì)算(1)每分鐘在底物亞油酸上增加的吸光度(在234nm的吸光度)和(2)每分鐘在丁香醛連氮底物上增加的吸光度(在530nm的吸光度)之間的差值，即計(jì)算反應(yīng)速率的差值(RRD)=(d(A234)/dt-d(A53。)/dt)。如杲RRD大于0,則所考察的酶可看作是本文所定義的脂肪酸氧化酶。如果RRD等于或小于0，則所考察的酶不是脂肪酸氧化酶。在尤其具體的實(shí)施方案中，RRD至少為0.05、0.10、0.15、0.20或至少為0.25吸收單位/分鐘。在尤其具體的實(shí)施例2方法的實(shí)施方案中，酶進(jìn)行了很好的定義。更進(jìn)一步的是，對(duì)于實(shí)施例2的方法調(diào)節(jié)了酶劑量，從而在234nm或在530nm獲得了最大的吸光度增量。在尤其具體的實(shí)施方案中，最大吸光度增量的范圍為0.05-0.50;0.07-0.4;0.08-0.3;0.09-0.2;或0.10-0.25吸收單位/分鐘。酶劑量范圍可以為例如在0.01-20、0.05-15、或0.10-10mg酶蛋白/ml?？晒┻x擇的是，"脂肪酸氧化酶"可定義為相對(duì)于丁香醛連氮能更有效地氧化不飽和脂肪酸的酶。酶活性可在如本申請(qǐng)實(shí)施例1中所描述的在PH6和30。C的在含有丁香醛連氮或亞油酸作為底物的標(biāo)準(zhǔn)血氧計(jì)裝置中進(jìn)行對(duì)比。在尤其具體的實(shí)施方案中，脂肪酸氧化酶定義為分類(lèi)為EC1.11丄3或EC1.13.11.-.EC1.13.11.的酶-意思是指其任何亞類(lèi)，目前為四十九個(gè)EC1.13.11.1-EC1.13.11.49。EC1.11.1.3是指月旨肪酸過(guò)氧物酶，ECU3.11是指通過(guò)結(jié)合兩個(gè)氧原子作用于單一供體的脂氧化酶。在更具體的實(shí)施方案中，EC1.13.11.-酶分類(lèi)為EC1.13.11.12、EC1.13.11.31、EC1.13.11.33、ECU3.11.34、EC1.13.11.40、ECU3.11.44或EC1.13.11.45，分別是指脂氧化酶、花生四烯酸酯12-脂氧化酶、花生四烯酸酯15-脂氧化酶、花生四烯酸酯5-脂氧化酶、花生四烯酸酯8-脂氧化酶、亞油酸二醇合酶和亞油酸11-脂氧化酶。有效量的脂肪酸氧化酶的例子為0.001-400U/gDS(DrySolids)(千燥固體)。優(yōu)選的是，所用的脂肪酸氧化酶的量為0.01-100U/gDS,更優(yōu)選的是0.05-50U/gDS,甚至更優(yōu)選0.1-20U/gDS。脂肪酸氧化酶的進(jìn)一步優(yōu)化此后可通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)獲得。脂氣化酶在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，脂肪酸氧化酶為脂氧化酶(LOX),分類(lèi)為EC1.13.11.12,它是催化聚不飽和脂肪酸特別是順，順-l,4-二烯例如亞油酸和制備氫過(guò)氧化物的酶。并且也可氧化其它的底物，例如單不飽和脂肪酸。微生物脂氧化酶可來(lái)自于例如釀酒酵母(Sacc/2^omycescerevWae)、普通嗜熱放線菌(Ther,ac""ow_ycesvw/gaWs)、FiW(3r/畫(huà)ax^5por畫(huà)、Fwsfln.ww;ra/^/^rafw附、才帛斗犬嗜熱絲孑包菌(772erwomyces/awwg/wosws)、尸j^'cw/w/a。o;zae和地霉屬菌抹(Geo^c/mw)。WO02/20730的實(shí)施例3-4中描述了來(lái)源于禾頂嚢殼(Gaewmcmwomycesgnaw/"/i1)的月旨氧4匕酶的制備。WO02/086114的實(shí)施例2中描述了在米曲霉中表達(dá)來(lái)源于Mag加;ow/7e■sa/v/"http://的脂氧化酶，可使用標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)純化這種酶，例如如WO02/20730的實(shí)施例4所描述的方法。脂氧化酶(LOX)也可從植物種子中萃取，例如大豆、豌豆、鷹嘴豆和菜豆。可供選擇地是，脂氧化酶可從哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞中《曰狄付。脂氧化酶活性可如下面的"材料和方法"中所描述的來(lái)定義。脂氧化酶有效量的例子為0.001-400U/gDS(干燥固體)。優(yōu)選的是，所用脂氧化酶的量為0.01-100U/gDS，更優(yōu)選為0.05-50U/gDS，甚至更優(yōu)選為0.1-20U/gDS。脂氧化酶的進(jìn)一步優(yōu)化值此后可使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)獲得。附加的酶在本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方案中一種或多種附加的酶活性可與本發(fā)明的脂肪酸氧化酶處理聯(lián)合(例如，在此之前、期間或隨后)使用。優(yōu)選附加的酶是酯酶，例如脂肪酶和/或角質(zhì)酶、植酸酶、漆酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶例如a-淀粉酶、麥芽糖a-淀粉酶、(3-淀粉酶或葡萄淀粉酶、或它們的混合物。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，發(fā)酵微生物生長(zhǎng)剌激物可與此處所述的酶活性結(jié)合加入以進(jìn)一步改善發(fā)酵方法。優(yōu)選的生長(zhǎng)刺激物包括維生素和礦物質(zhì)。酯酶在本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，在發(fā)酵之前或期間使有效量的脂肪酸氧化酶與有效量的酯酶結(jié)合使用。酶可以在發(fā)酵之前或發(fā)酵期間加入，包括發(fā)酵微生物增殖期間或之后。也可用酶預(yù)處理發(fā)酵培養(yǎng)基(例如，加入或不加入回槽)。這里所使用的"酯酶"也稱羧酸酯水解酶，是指作用于酯鍵的酶，包括根據(jù)酶命名法分類(lèi)于EC3丄1羧酸酯水解酶類(lèi)的酶(分別可得自http:〃www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme或從EnzymeNomenclature1992,AcademicPress,SanDiego，California,增刊1(1993),增刊2(1994),增刊3(1995)，增刊4(1997)和增刊5，Eur.J.Biochem.1994,223，1-5;Eur.J.Biochem.1995,232，1-6;Eur.J.Biochem.1996,237，1-5;Eur.J.Biochem.1997,250;1-6,和Eur.J.Biochem.1999,264，610-650)。非限制性的酯酶的例子包括芳基酯酶、三?；视王ッ浮⒁阴ｕッ?、乙酰膽石咸酯酶、膽i咸酯酶、托品酯酶(tropinesterase)、果膠酯酶、甾醇酯酶、葉綠素酶、L-阿拉伯糖內(nèi)酯酶、葡萄糖內(nèi)酯酶、糖醛酸內(nèi)酯酶(uronolactonase)、鞣酸酶、棕櫚酸視黃酯酶、羥丁酸二聚體水解酶、?；视王ッ?、3-氧己二酸烯醇-內(nèi)酯酶(3-oxoadipateenol-lactonase)、1，4-內(nèi)酯酶、半乳糖酯酶、4-吡噴醇內(nèi)酯酶、?；舛緄成水解酶、氨酰4RNA水解酶、D-阿拉伯內(nèi)酯酶、6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯酶、磷脂酶A1、6-乙酰葡萄糖脫乙酰基酶、脂蛋白脂肪酶、二氫香豆素酯酶、檸檬苦素-D-環(huán)-內(nèi)酯酶、類(lèi)甾醇內(nèi)酯酶、三乙酸酯內(nèi)酯酶、放線菌素內(nèi)酯酶、苔色酸縮酚酸水解酶、頭孢菌素-C脫乙酰酶、氯原酸水解酶、a-氨基酸酯酶、4-曱基草酰乙酸酯酶、亞曱酸基丁烯醇酶(carboxymethylenebutenolidase)、脫氧檸檬苦素A-環(huán)-內(nèi)酯酶、2-乙?；?1-烷基甘油磷酸膽堿酯酶、鐮孢氨酸-C鳥(niǎo)氨酸酯酶、芥子酸膽堿酯酶、蠟-酯水解酶、佛波醇-二酯水解酶、磷脂酰肌醇脫酰酶、唾液酸-O-乙酰酯酶、乙酸基丁炔并p塞p分脫乙酰基酶(acetoxybutynylbithiophenedeacetylase)、乙酰水楊酸脫乙?；?、曱基傘形乙酸鹽脫乙酰酶(methylumbelliferyl-acetatedeacetylase)、2-吡喃酮-4，6-二羧酸內(nèi)酯酶、N-乙酰半乳糖胺聚糖脫乙酰基酶、保幼激素酯酶、二(2-乙基己基)鄰笨二曱酸酯酯酶、蛋白質(zhì)-谷氨酸酯甲基酯酶、11-順式棕櫚酸視黃基酯水解酶、全反式棕櫚酸視黃基酯水解酶、L-鼠李糖-l,4-內(nèi)酯酶、5-(3，4-雙乙酰氧基丁-1-炔基)-2，2'-聯(lián)逸吩脫乙酰基酶、酯酰乙酯合酶、木糖1,4-內(nèi)酯酶、N-乙酰葡萄糖胺磷脂酰肌醇脫乙酰酶、西曲酸酯千基酯酶(cetraxatebenzylesterase)、乙酰烷基甘油乙酰水解酶和乙酰木糖酯酶。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的酯酶是脂肪分解酶，例如脂肪酶(分類(lèi)為EC3丄1.3、EC3.1.1.23和/或EC3.1.1.26)和磷酸酯酶(分類(lèi)為EC3.1.1.4和/或EC3丄1.32，包括分類(lèi)為EC3丄1.5的溶血磷酸酯酶)。其它的優(yōu)選酯酶為角質(zhì)酶(分類(lèi)為EC3.1.1.74)。當(dāng)與應(yīng)用除脂肪酸氧化酶之外的其它的酶的方法或處理結(jié)合使用時(shí)，例如在液化和/或糖化方法中所使用的例如植酸酶、漆酶、淀4分酶和葡糖淀粉酶，優(yōu)選不抑制其它酶的酯酶組合物。例如，優(yōu)選不含或僅含少量鈣結(jié)合化合物的酯酶。同樣地，優(yōu)選不抑制發(fā)酵方法的酯酶。例如，優(yōu)選不含或僅舍少量甘油的酯酶?？杉尤胗行Я康孽ッ笍亩@得所需要的有利于改善發(fā)酵微生物的性能的益處，例如改變發(fā)酵微生物內(nèi)部和/或外部或發(fā)酵微生物細(xì)胞膜內(nèi)脂質(zhì)的組成/濃度，從而導(dǎo)致發(fā)酵期間溶質(zhì)向發(fā)酵微生物內(nèi)和/或向外運(yùn)動(dòng)的改善，和/或提供更易代謝的能源(例如，如通過(guò)轉(zhuǎn)變組分，例如將谷類(lèi)底物中的油類(lèi)轉(zhuǎn)變成對(duì)發(fā)酵微生物有用的組分，例如不飽和脂肪酸和甘油)，從而提高乙醇產(chǎn)量。酯酶有效量的例子為0.01-400LU/gDS(干燥固體)。優(yōu)選的是，所使用的酯酶的量為0.1-100LU/gDS，更優(yōu)選為0.5-50LU/gDS,甚至更優(yōu)選為1-20LU/gDS。酯酶的進(jìn)一步優(yōu)化此后可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)獲得。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中酯酶是脂肪分解酶，更優(yōu)選的是脂肪酶。此處所使用的"脂肪分解酶，，是指脂肪酶和磷酸酯酶(包括溶血磷酯酶)。月旨肪分解酶優(yōu)選來(lái)自于微生物，尤其是來(lái)自于細(xì)菌、真菌或酵母。所用的脂肪分解酶可來(lái)自于任何來(lái)源，包括例如犁頭霉(JfczVfo)菌抹，尤其是^ZmW/aWa/^/ee"(3和傘枝翠頭霉(」^sWacoow&/era);無(wú)色桿菌屬菌抹，尤其是解毒無(wú)色桿菌(^c/romo6a"erz'o;/wgws);氣單胞菌屬菌株；鏈格孢屬菌抹，尤其是甘藍(lán)鏈格孢U/fe朋n'"^m!'c/o/a);曲霉菌屬菌林，尤其是黑曲霉和黃曲霉；無(wú)色桿菌屬菌抹，尤其是解毒無(wú)色桿菌；短梗霉屬菌抹，尤其是出芽短梗霉；芽胞桿菌屬菌林，尤其是短小芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌(5ac/〃ws5^eara^zerwo//n7ws)和枯草芽孢桿菌；白僵菌屬0Beawve〃'a)菌抹；索絲菌屬(Sroc/wAn*)菌抹，尤其是熱殺索絲菌(&oc/zo/zn'x^le削oso/iato);念珠菌屬菌株，尤其是鈹落念珠菌(Ca"d油qy/z>2(iracefl)、Ca"d油para/—/,.ca和Cawd油a齒rc"ca;色桿菌屬菌抹，尤其是粘稠色才干菌(CTzrawoZwcrerv&casww);鬼傘屬(Co;W/ms)菌斗朱，尤其是灰蓋鬼傘(Co戸.wwsc/we"'ws);嫌刀菌屬(7^fln.ww)菌抹，尤其是Fws(ar/ww。w。r廳、癡病鐮刀菌(Fiw"n.wmso/aw/)、S苑豆^S屬鐮孑包菌(FwsaWMmso/a"f;&()和大刀5欠3鬼色嫌孑包菌(Fksan'wwcw/moraw);i也審屬(Geofn'cww)菌才朱,尤其是帚狀地霉(Geofn'c謡/em'"7/(3"An);漢森酵母屬(//<mseww/<3)菌抹，尤其是異常漢遜氏酵母；腐殖菌屬(/ww/co/a)菌才朱，尤其是T/i/m/co/"菌抹；乳桿菌屬菌抹，尤其是彎曲乳桿菌(Z^"o6ac/〃wscwrva&s);Metarhizium菌4朱；毛霉菌屬(A^MCW")菌^朱；擬青霉屬CPaec/Zomyces)菌4朱；青霉屬菌4朱,尤其是圓孓瓜青霉(尸ew.C7'〃/"wcyc/op/ww)、皮落青霉(尸em'c〃/〖wwcn^stoswm)和擴(kuò)展青霉(Pem'c!7/z'wmexpam;wwi);存i單月包菌屬菌斗朱,尤其是銅綠假單胞菌(Psez^fomo加sa/ca"genes)、洋蔥假單胞菌(同義詞為蔥伯克霍爾德氏菌(r^oWen'a))、熒光假單胞菌、莓實(shí)極毛桿菌(尸set^o加o"w/rag0、嗜麥芽假單月包菌(Pseiwfomowos1ma/fop/7//^3)、門(mén)多薩假單胞菌(尸sewcfomowas1me"(iocZ"a)、嗜中溫假單月包菌(i^ewdowowcwwep/2"Zca/(po/;^ca)、產(chǎn)堿假單月包菌(■Rsewcfomowasa/c"Z/gewes)、才直物作i單月包菌(尸sez^omo"osp/awa〃')、類(lèi)產(chǎn)石咸作I單月包菌(尸化W(iowowas1/wei^oa/ca//gewe51)、腐臭，i單月包菌(尸化"(io"wwa、施氏々I單月包菌(/^ewcowowasWw/zen')和PsezWomcwasM^com7力eww'5";絲才亥菌屬(//n'zoctowa)菌才朱，尤其是立沖古絲氺亥菌(W/H'zoctom'aso/am');才艮毛審屬(WA/zowMCor)菌才朱，尤其是米赫才艮毛審(7/7/zomwcormz'e/ze/);才艮霉屬(7/n'zo/w力菌才朱，尤其是日本才艮霉(//2/zo/n^乂a/o"/cw)、小孑包根霉C//n'zo^"sAm'cm/ori^)和結(jié)節(jié)根霉(7/n'zo/7ws"odaswi1);紅冬孑包酵母屬(A/zoc/as^onWMm)菌才朱,尤其是念5朱訝犬纟工冬孑包酵母(W/20flfo5/(3nW/wm"rw/oWM);紅酵母屬(7/zo^)tora/a)菌株，尤其是粘紅酵母(W/zo^tora/ag7w""z^);扭卩孑包酵母屬(iS/o/"oZo/om7c&s)菌才朱,尤其是S/OA"o6o/omyc'e51s/7/6ato"ws;高溫霉屬(77zerwom_yc^y)菌抹尤其是77^rwow;vce51/""喂'"cwws(以前的//"Am.co/a/a"wg/"cwa)，Thiarosporella屬菌才朱尤其是77z/a/"as/o/-e〃a木霉屬(7Hc/2O0mwG)菌林,尤其是7Hc/2ocie削a//zarz/awwm和7Hc/zO(ien77a和/或輪枝霉屬(^f/c/〃/ww)菌抹。在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，脂肪分解酶來(lái)自曲霉屬菌抹、無(wú)色桿菌屬菌抹、芽胞桿菌屬菌抹、念珠菌屬菌抹、色桿菌屬菌抹、鐮孢屬菌抹、腐質(zhì)霉屬菌林、//，/zo矽wa菌株、假單胞菌屬菌林、毛霉屬菌抹、根霉菌屬菌林、或高溫霉屬(TTzerwomyces)菌抹。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪分解酶為脂肪酶。脂肪酶可以因其具有能改變例如得自谷類(lèi)底物中的發(fā)酵培養(yǎng)基(包括發(fā)酵酵母)的甘油三酯油脂和脂肪的結(jié)構(gòu)和組成的能力而在此^^吏用。脂肪酶催化不同類(lèi)型的甘油三酯轉(zhuǎn)化，例如水解、酯化和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。適當(dāng)?shù)闹久赴ㄋ嵝?、中性和堿性脂肪酶，如本領(lǐng)域眾所周知的，雖然在低脂肪酶濃度下酸性脂肪酶(例如，如購(gòu)自Amano的脂肪酶GAMANO50)顯然比中性或堿性脂肪酶更為有效。優(yōu)選用于本發(fā)明的脂肪酶包括Cam^/aa"^"c/^脂肪酶和Cam/,Wa脂肪酶。更優(yōu)選的脂肪酶是純化的脂肪酶，例如Ca^//^2a"torc/to2脂肪酶(脂肪酶A),Candidaantarcitca脂肪酶(脂肪酶B)Cam^foqy//"drace<a月旨肪酶和沙門(mén)氏柏干酷青霉菌(尸emW〃/wwcawew6eW/)月旨肪酶。所述脂肪酶可以是在EP258，068-A中公開(kāi)的任一種脂肪酶或者是脂肪酶變體例如如WO00/60063或WO00/32758中所公開(kāi)的變體，在這里將其引入作為參考。優(yōu)選的商品化脂肪酶包括LECITASE、LIPOLASE和LIPEX(購(gòu)自NovozymesA/S，Denmark)和GAMANO50(購(gòu)自Amano)。優(yōu)選加入脂肪酶的量大約為1-400LU/g，優(yōu)選1-10LU/gDS，更優(yōu)選1-5LU/gDS。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一種酯酶是角質(zhì)酶。角質(zhì)酶是能夠分解角質(zhì)的酶。角質(zhì)酶可從任何來(lái)源獲得。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，角質(zhì)酶來(lái)自曲霉屬菌抹，尤其是米曲霉；鏈格孢屬菌抹，尤其是6ra^/"'o/a;嫌孑包菌屬菌才朱,尤其是腐皮嫌孑包菌(Fz^an'wwso/a"/)、雖宛豆癡屬鐮孑包菌(/^5an'WAWso/am'//s/)牙口大刀3史3鬼色鐮孑包菌(Fwsan'M附nwei/mCM/worwm)或4妾骨木3欠3鬼色嫌孑包(Fwsan.wmraewmsom6wc/ww);長(zhǎng)入孑包屬(//e/w/加/2ospon^w)菌才朱，尤其是"l^頭長(zhǎng)蟲(chóng)需孑包(//e/w/wf/205porwm);腐殖霉屬菌抹(i/wm/co/a),尤其是//wm/co/a/mo/era;假單胞菌屬菌抹，尤其是門(mén)多薩假單胞菌或腐臭假單胞菌(尸化^fomowaspw/Wa);絲核菌屬CR/n'zoctow/a)菌才朱，尤其是癡屬絲核菌(^/n'zo"o"aso/am,);鏈霉菌屬菌株，尤其是齊痂病鏈霉菌(5^eptowycessca6/es);或單格孑包屬(Woc/a&'ww)菌抹，尤其是Woc/aAwrzcoraw"a/e。在一個(gè)最優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，角質(zhì)酶來(lái)自//wm/co/az'rao/e似菌抹，尤其是z>wo/e"5菌抹DSM1800。//"w/co/a/wo/m角質(zhì)酶在WO96/13580中作了描述，在這里將其引入作為參考。角質(zhì)酶可以是變體，例如在WO00/34450和WO01/92502中所公開(kāi)的一種變體，這里將其引入作為參考。優(yōu)選的角質(zhì)酶變體包括WO01/92502的實(shí)施例2中所列的變體，在此將其特別引入作為參考。有效量的角質(zhì)酶在0.01-400LU/gDS，優(yōu)選大約為0.1-100LU/gDS,更優(yōu)選為l-50LU/gDS。此后可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得角質(zhì)酶量的進(jìn)一步優(yōu)化。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一種酯酶是磷脂酶。這里所使用的術(shù)語(yǔ)磷脂酶是一種對(duì)磷脂具有活性的酶。磷脂例如卵磷脂或磷脂酰膽堿，是由與兩個(gè)脂肪酸在外部(sn-l)和中間(sn-2)位置酯化以及與磷酸在第三個(gè)位置酯化的甘油組成；磷酸可依次被酯化成氨基醇。磷脂酶是參與磷脂水解的酶?？设b別出若干種類(lèi)的磷脂酶活性，包括磷脂酶A1和A2，其水解一個(gè)脂?；?分別在sn-l和sn-2位置)形成溶血磷酸酯；溶血磷酸酶(或稱磷脂酶B)可水解溶血磷酸酯中剩余的脂酰基。磷脂酶C和磷脂酶D(磷酸二脂酶)分別釋放二酰基甘油或磷脂酸。術(shù)語(yǔ)磷脂酶包括具有磷脂酶活性的酶，例如磷脂酶A(Al或A2)、磷脂酶B活性、磷脂酶C活性或磷脂酶D活性。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"磷脂酶A，，與本發(fā)明所述的酶相結(jié)合意在將所有具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性的酶包括在內(nèi)。磷脂酶活性可由具有其它活性的酶提供，例如具有磷脂酶活性的脂肪酶。磷脂酶活性可來(lái)自例如具有磷脂酶副活性的脂肪酶。在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，磷脂酶酶活性由基本上僅具有磷脂酶活性的酶提供，其中磷脂酶酶活性不是副活性。磷脂酶可來(lái)自任何來(lái)源，例如動(dòng)物來(lái)源(例如，哺乳動(dòng)物)，例如來(lái)自胰腺(例如?；蜇i胰腺)，或蛇毒或蜂毒。可選擇性地，磷脂酶也可從微生物來(lái)源獲得，例如來(lái)自絲狀真菌、酵母或細(xì)菌，例如曲霉菌屬或種，例如黑曲霉(Am'ger);網(wǎng)柄菌屬(￡)!'c(yoWe//iwi)，例如D.<afaco/ofeww;毛霉菌屬(A^wcor)，例々口爪哇毛霉(M:乂m^m'cw)、大毛霉(wwceofo)、纟田月包毛屬(sz^"7/w/mz^);鏈孑包霉屬(A^wros;wra)，例^口4且壽造鏈孑包霉(W.crowo);根毛霉屬(旌zomwcw),例如兄根霉菌屬(//n'z叩M",例如無(wú)沖艮根霉(兄游/n'孺),日本根霉(.7'(3po"/cw)，葡4支才艮審(i.Wo/om)^/")，核盤(pán)霉(Sc/era"m'fl)，例如大豆核盤(pán)菌(&//6eW/a"a);毛褲菌屬(7/c/7o//^to"),例如剛果紅毛褲菌(7>M6rww);『/zetee//m'a，例如Wsc/era"on^w;芽孑包桿菌屬(Sac"/ws),例如巨大芽胞桿菌(RmegafeWwm)、枯草芽胞桿菌(R檸檬酸細(xì)菌屬(C"ratow)，例如氟氏檸檬細(xì)菌(C./腳"必);腸桿菌屬(E"^ra6ac^")，例如產(chǎn)氣腸桿菌(￡.)、陰溝愛(ài)德華氏菌(￡.c/oacae￡<iwara&!W/a)、塔達(dá)氏腸桿菌(￡);歐文氏菌屬(五rvWm'a)，例如草生歐文氏菌(￡./7eW/co/a);埃希氏4干菌屬(Esc/zen'c/z/")，例如大腸桿菌(五.co/0;克雷伯氏桿菌屬，例如肺炎克雷伯氏菌(K);變形桿菌屬(尸ra/ew)，例如普通變形桿菌(Pvw/gan's);普羅成登斯菌屬(iVoW血"c^),例如斯氏普羅威登斯菌(PW^m7)沙門(mén)氏菌屬(Sa〖wo"e〃a),例如鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S.^pWmMr/wm);沙雷氏菌屬(&rm"a),例如乳紅化沙雷氏菌(51./z々we/osc/era)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Xwarcescera);志賀氏菌屬(S/z/ge〃a)，例如氟氏志賀氏菌(5".);鏈霉菌屬(S^pfomyces)，例如紫紅鏈霉菌(S.vi'o/eceorwfeer),耶爾森氏菌屬(1^w'm'a)，例如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Kewmco""ca)。因此，磷脂酶可以是真菌，例如來(lái)自核菌綱(尸jre"ow少ce/es),例如鐮刀菌屬(Fw^n'ww)，例如大刀鐮孢(Fcw/morww)、異孢鐮孢(F&&ros;9orwm)、茄屬鐮孢(Fw/am')菌抹，或尖孢鐮孢(Fojcjworww)菌株。磷脂酶也可來(lái)自曲霉菌屬的絲狀真菌菌抹，例如泡盛曲霉(As/7erg/〃wawawon')菌株、臭曲霉屬菌0^/wg!7/ws/o"!Ww力、日本曲霉屬菌、黑曲霉或米曲霉。優(yōu)選的商品化磷脂酶包括LECITASETM和LECITASEULTRA(可從丹麥的NovozymesA/S購(gòu)買(mǎi))。磷脂酶的有效量在0.01和400LU/gDS之間，優(yōu)選大約為0.1-100LU/gDS，更優(yōu)選1-50LU/gDS?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得磷脂酶量的進(jìn)一步優(yōu)化。植酸酶在優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酸氧化酶與有效量的植酸酶聯(lián)合使用。根據(jù)這個(gè)具體實(shí)施方案，可以利用植酸酶促進(jìn)從存在于培養(yǎng)基中的植酸(myo-inositolhexakisphosphate)或其中的任何鹽類(lèi)(植酸鹽)釋放無(wú)機(jī)磷酸。植酸酶可根據(jù)其在最初水解步驟中的專(zhuān)一性來(lái)分類(lèi)，即根據(jù)最初被水解的磷酸酯基來(lái)分類(lèi)。所使用的植酸酶可具有任一專(zhuān)一性，例如3-植酸酶(E.C.3丄3.8)、6-植酸酶(E.C.3丄3.26)或5-植酸酶(無(wú)E.C.編號(hào))。植酸酶可在發(fā)酵期間加入或在發(fā)酵前加入，例如，在增殖期間或在發(fā)酵前的步驟中，例如液化和/或糖化步驟。如WO01/62947中所描述的，可加入植酸酶，例如以改善酵母必需礦物質(zhì)的生物利用度，這里將其引入作為參考。植酸酶也可用于預(yù)處理發(fā)酵培養(yǎng)基(例如，有或沒(méi)有回槽)。植酸酶可來(lái)自植物或微生物，例如細(xì)菌或真菌，如酵母或絲狀真菌。植物植酸酶可來(lái)自小麥麥麩、玉米、大豆或百合花粉。適當(dāng)?shù)闹参镏菜崦冈谝韵挛墨I(xiàn)中作了描述:Thomlinsonetal，Biochemistry,1(1962)，166-171;Barrientosetal，Plant,Physio.，106(1994),1489-1495;WO98/05785;WO98/20139。細(xì)菌植酸酶可來(lái)自芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)或埃希氏桿菌屬(Escherichia),優(yōu)選枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或大腸桿菌(E.coli)種。適當(dāng)?shù)募?xì)菌植酸酶在以下文獻(xiàn)中作了描述Paver和Jaga腿than，1982,JournalofBacteriology151:1102-110&Cosgrove,1970,AustralianJournalofBiologicalSciences23:1207-1220;Greineretal，Arch.Biochem.Bio-phys.,303,107-113，1993;WO98/06856;WO97/33976;WO97/48812。酵母植酸酶或肌醇單磷酸酶可來(lái)自糖酵母屬(&cc/zarawyces)或許旺氏酵母屬(scMvawm'om^ce51)，優(yōu)選酉良酒酵母(5"acc/zo7"cw^cesrerev/57.ae)或西方許旺氏酵母(5"c/wa"m'omycesocc/cfe"to/^)種。適當(dāng)?shù)慕湍钢菜崦冈谝韵挛墨I(xiàn)中作了描述Nayinietal,1984,LebensmittelWissenschaftundTechnologie17:24-26;Wodzinskietal，Adv.Appl.Microbiol"42,263-303;AU-A-24840/95。絲狀真菌植酸酶可來(lái)自真菌門(mén)子嚢菌(爿^wnj;coto)(子嚢菌綱(asrowjce/^s))或4旦子菌門(mén)(5as/Womycoto),仿H口曲霉菌屬(/^/ergz'〃"s)、高溫霉屬(7Tzwww7^cas)(也稱腐殖霉屬)、毀絲霉屬(MFe//o//z/2ora)、A/a"ascws、青霉屬(尸em,c/〃/ww)、隔孑包革菌屬(Pem-op/wnx)、田頭霉屬(^g,'oqy6e)、樁菇菌屬(尸ax/〃w)或栓菌屬(Tram"e5)，優(yōu)選土曲霉(力5/erg/〃ws)、黑曲霉(J5/erg7'〃wsw/ger)、黑曲霉;包盛曲霉哭種(y4j/erg〃/iwvor.a而mon')、無(wú)花果曲霉(v45/erg7'〃z^_/^扁)、煙曲霉(y^/erg"/w51/ww/gv2Z"s)、米曲霉(/^/ergz7/wso/jzae)、27/awMg/"oyws(也稱/朋wg7力osa)、嗜熱毀絲霉(柳ce/—?jiǎng)?lì)omAe/TnopMa)、尸em.o//zora/_yc"、平田頭茲(Jgrocj^epWaGfes)、M""oscwsa"A:"、_Pox/〃i/wvo/加或織毛檢菌(rrawe&s;MZ^cms)。適當(dāng)?shù)恼婢菜崦冈谙铝形墨I(xiàn)中作了描述:Yamadaetal.，1986,Agric.Biol.Chem.322:1275-1282;Pidding-tonetal.，1993，Gene98/28409;JP7-67635;WO98/44125;WO97/38096;WO98/13480，此處^夸它們并入作為參考。修飾過(guò)的植酸酶或植酸酶變體可采用本領(lǐng)域已知的方法獲得，特別是通過(guò)下列文獻(xiàn)中所公開(kāi)的方法獲得EP897,010;EP897,985;WO99/49022;WO99/48330。可購(gòu)買(mǎi)的商品化植酸酶包括BIO-FEEDPHYTASETM、PHYTASENOVOCT或L(丹麥NovozymesA/S),或NATUPHOSNG5000(DSM)。優(yōu)選可加入的植酸酶在5，000-250，000FYT/gDS范圍，優(yōu)選10，000-100,000FYT/gDS。植酸酶優(yōu)選的合適用量在0.005-25FYT/gDS,更優(yōu)選在0.01-10FYT/g,例如0.1-1FYT/gDS。此處植酸酶活性用FYT單位定義，一個(gè)FYT指在下列條件下每分鐘釋放1毫摩爾無(wú)機(jī)正磷酸鹽PH5.5;溫度37°C;底物濃度為0.0050mole/L的植酸鈉(C6H6024P6Nal2)。蛋白酶在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酸氧化酶處理與至少一種蛋白酶結(jié)合使用。可使用蛋白酶用于例如消化蛋白質(zhì)以產(chǎn)生游離氨基氮(FAN)。這種游離氨基酸可作為酵母的養(yǎng)分，從而增進(jìn)酵母的生長(zhǎng)并就此制備乙醇。在發(fā)酵方法中使用的發(fā)酵微生物可通過(guò)在至少一種蛋白酶的存在下增殖發(fā)酵微生物來(lái)制備。雖然未限定于任一種工作原理，但確信的是，與在未加蛋白酶的相同條件下增殖的發(fā)酵微生物相比，當(dāng)發(fā)酵微生物接著用于發(fā)酵方法中時(shí)，具有至少一種有效量的蛋白酶的發(fā)酵微生物的增殖縮短了發(fā)酵微生物的延遲時(shí)間(lagtime)?？烧J(rèn)為的是，在增殖方法中蛋白酶的作用直接或間接導(dǎo)致了在發(fā)酵期間對(duì)發(fā)酵微生物有害或有益的基因分別抑制或表達(dá)，從而縮短延遲時(shí)間并導(dǎo)致加快發(fā)酵周期。蛋白酶是本領(lǐng)域已知，是指可催化肽鍵裂解的酶。適當(dāng)?shù)牡鞍酌赴ㄕ婢图?xì)菌蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶是酸性蛋白酶，即以在低于PH7的酸性條件下能水解蛋白質(zhì)為特征的蛋白酶。適當(dāng)?shù)乃嵝?acid)真菌蛋白酶包括來(lái)自下列的真菌蛋白酶曲霉屬(y^^rgz'〃w)、毛霉屬(Mwcor)、酒曲菌屬(//n'zo;ws)、念珠菌屬(Ca"AWa)、草蓋菌屬(Cor/o/ws)、疫病霉屬(￡>zc/of/7/a)、￡>z/zomop/^A"a、l巴菌屬(/r/ex)、青霉屬(尸ew/c,〃/ww)、菌才亥(5Wmn'"w)和球擬酵母屬(rora/o;^)。特別傾向的是來(lái)自黑曲霉的蛋白醵(參見(jiàn)，例d^Koazeetal.，(1964),Agr.BioLChem.Japan,28,216)，^Lyperg/〃"ssm'to/(參見(jiàn)，例i口Yoshida，(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan,28,66)，泡盛曲霉(J，rg/腸a而膨W)(Hayashidaetal.，(1977)Agric.Biol.Chem.,42(5),927-933)，棘孢曲霉(如，7/w,/e咖)(WO95/02044)，或米曲霉(Ay/erg7'〃"51和來(lái)自微小毛霉(Mwcor或米赫毛霉(mz'e/2e/)的酸性蛋白酶。不是酸性蛋白酶的細(xì)菌蛋白酶，包括商品化產(chǎn)品ALCALASE和NEUTRASETM(可從NovozymesA/S購(gòu)買(mǎi))。其它的蛋白酶包括GenencorInt,Inc.USA的GC106和丹麥NovozymesA/S的NOVOZYMTM50006。優(yōu)選的是，蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，如同下列文獻(xiàn)中所描敘的HandbookofProteolyticEnzymes,A.,J.Barrett,N.D.RawlingsandJ.F.Woessner編輯，AcademicPress,SanDiego,1998,270章。天冬氨酸蛋白酶適當(dāng)?shù)睦影ɡ缭谙铝形墨I(xiàn)中所公開(kāi)的那些R.M.Berkaetal.Gene，96,313(1990));(R.M.Berkaetal.Gene,125,195-198(1993));和Gomietal.Biosci.Biotech.Biochem.57,1095-1100(1993)，在此將其引入作為參考。漆酶在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酸氧化酶處理與漆酶結(jié)合使用?？稍诎l(fā)酵期間加入有效量的漆酶，和/或在發(fā)酵之前或發(fā)酵期間例如，在發(fā)酵微生物增殖期間施用有效量的漆酶。雖然未限定于任一種工作原理，但可認(rèn)為的是在發(fā)酵方法中使用至少一種漆酶促進(jìn)了抑制劑的氧化和缺氧，從而促進(jìn)更適于發(fā)酵微生物的缺氧環(huán)境的形成。在本發(fā)明范圍內(nèi)，漆酶和涉及漆酶的酶包括酶分類(lèi)(EC1.10.3.2)所包含的任何漆酶、酶分類(lèi)(EC1.10.3.1)所包括的任何兒茶酚氧化酶、酶分類(lèi)(EC1.3.3.5)所包括的任何膽紅素氧化酶或酶分類(lèi)(EC1.14.18.1)所包括的4壬何單酚單加氧酶。上述酶可來(lái)自植物、細(xì)菌或真菌(包括絲狀真菌和酵母)，適當(dāng)?shù)睦影▉?lái)自下列菌屬的抹的漆酶曲菌屬(^yp^g///^);鏈孢霉屬(A^ewrawora),例如粗糙鏈孢霉(iV.);束柄霉屬(戶。(ios/ora);葡萄孑包屬(5"o^;y);金錢(qián)菌屬(C0〃76/a);層孔菌屬();香菇屬(丄e""騰);北風(fēng)菌屬(尸/e騰to);栓菌屬(r讀由),例如！Tv/〃謹(jǐn)和7:ver57'co/or;絲核菌屬(/^Zzo"o"/a),例^口癡屬絲核菌(兄so/awz');鬼傘屬(Co/n'"^)，仿H口C.c/werew5sC.cowans,C./n'es//牙口C.pZ/caZ//"';尸s"^yre〃a,侈'H口f！co"(ie〃e(2"(3;尸a"aeo/iw,例i口尸/apz7/ow(acew;f殳絲霉屬(A^ce//o;/7Aora!),例4口P耆熱^:絲零(A/.Aermo//7z7a);Sc/7yto/W/Mm，例:i口5"./Ae/Twop/n'/ww;多孑L菌屬(尸o/y/on^)，例i口尸p/m7w;密孑L菌屬(尸yc"c^omy),例如朱紅密孑L菌(尸c/"w^<an>ms);射脈菌屬(尸A/e6/a),例如輻射射脈菌(尸ra麵)(WO92/01046),或草蓋菌屬(Cor油s),例如C.(JP2-238885)。優(yōu)選來(lái)自下列菌屬的漆酶鬼傘屬(Co;n'"w)、毀絲霉屬(Afyce//op/^/zora)、多孑L菌屬(尸o(y;onw)、密孑L菌屬(尸少c"opoms)、柱霉屬(Sc少to/Wwm)或絲核菌屬(//H'zocom'a),特別是來(lái)自灰鬼傘屬(Co/r/"w".were^s)、嗜熱毀絲霉(Afyce/Zop緣on3Ae/vwop/n'/o)、尸o/y/orws//ra""5、朱纟工密孑L菌(尸j;cwopo^s">wa6an'wws)、■Scyfa/i.^'wrnf/jermo//n7w;77或jS屬絲核菌(A/n'zocom'aso/aw/)的S泰酵。淀粉酶在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酸氧化酶處理與淀粉酶結(jié)合使用。優(yōu)選來(lái)自真菌或細(xì)菌的a-淀粉酶。a-淀粉酶更優(yōu)選是芽孢桿菌屬a-淀粉酶，例如來(lái)源于地衣芽孢桿菌(及//c/^m/orw/s)、解淀粉芽孢桿菌(Ram_y/o/,々we/ac/era)、嗜熱脂肪芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌(及wMto)的菌抹。其它a-淀粉酶包括來(lái)自芽孢桿菌屬(B鎖7/zww.)NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513或DSM9375的菌株的a-淀粉酶，所有的這些在WO95/26397中進(jìn)行了詳細(xì)描述和Tsukamotoetal.，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,151(1988)，pp.25-31中描述的a-淀粉酶。其它a-淀粉酶變體和雜交體在W096/23874、W097/41213和W099/19467中作了描述。其它的a-淀粉酶包括來(lái)源于曲菌屬菌抹的a-淀粉酶，例如米曲霉和黑曲霉a-淀粉酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，a-淀粉酶是酸性a-淀粉酶。在更優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，酸性a-淀粉酶是酸性真菌a-淀粉酶或酸性細(xì)菌a-淀粉酶。更優(yōu)選的是，酸性a-淀粉酶是來(lái)源于曲霉菌屬的酸性真菌a-淀粉酶?？少?gòu)買(mǎi)的商業(yè)化酸性真菌淀粉酶為SP288(購(gòu)自丹麥的NovozymesA/S)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，a-淀4分酶是酸性a-淀4分酶。術(shù)語(yǔ)"酸性a-淀粉酶，，是指加入的有效量的a-淀粉酶(E,C.3.2丄1)在PH3.0-7.0的范圍內(nèi)、優(yōu)選3.5-6.0或更優(yōu)選4.0-5.0范圍內(nèi)具有活性。優(yōu)選的酸性真菌a-淀粉酶為芬加密爾(Fungamyl)樣的a-淀粉酶。在本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)"芬加密爾樣a-淀粉酶，，是指顯示出高同源性的a-淀粉酶，即對(duì)在W096/23874中所示的SEQIDNO.10氨基酸序列超過(guò)50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或甚至90%的同源性。當(dāng)用作產(chǎn)生麥芽糖的酶時(shí)，可加入真菌a-淀粉酶的有效量為0.001-1.0AFAU/gDS,優(yōu)選為0.002-0.5AFAU/gDS，優(yōu)選0.02-0.1AFAU/gDS。優(yōu)選a-淀粉酶為酸性a-淀粉酶，優(yōu)選來(lái)源于曲霉屬，優(yōu)選黑曲霉或米曲霉種。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中酸性真菌a-淀粉酶是如在Swiss-prot/TeEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)以最初登記號(hào)為P56271的"AMYA—ASPNG，，中披露的黑曲霉(A.niger)中的酸性真菌a-淀粉酶。此外考慮所述的酸性真菌淀粉酶變體，其具有與其最少70%的同源性(一致性)，例如至少80%的同源性或甚至至少90%的同源性。優(yōu)選含有a-淀粉酶的商品化組合物包括DSM的MYCOLASETM(GistBrochades)、BAN、TERMAMYLSC、FUNGAMYL、LIQUOZYMEX和SANSUPER,和SANEXTRAL(novozymesA/S)和CLARASETML-40,000、DEX-LOTM、SPEYMEFRED、SPEYMEAA和SPEZYMEDELTAAA(GenencorInt)，以及以商品名SP288銷(xiāo)售的酸性真菌a-淀粉酶(購(gòu)自丹麥的NovozymesA/S)。淀粉酶也可是產(chǎn)麥芽糖(maltogenic)a-淀粉酶。"產(chǎn)麥芽糖a-淀粉酶"(葡聚糖1,4-a-麥芽糖水解酶，E.C.3.2丄133)能將直鏈淀粉和支鏈淀粉水解成a構(gòu)型的麥芽糖。來(lái)源于嗜熱脂肪芽孢桿菌(5.WeflraAermopMw)菌抹NCIB11837的產(chǎn)麥芽糖a-淀粉酶可從NovozymesA/S公司以商品名NOVAMYL購(gòu)買(mǎi)到。產(chǎn)麥芽糖a-淀粉酶在下列文獻(xiàn)中作了描述美國(guó)專(zhuān)利號(hào)US4，598,048;4,604，355,和6,162,628,在此將其引入作為參考。優(yōu)選的是，例如如同在WO95/10627中所描述的將產(chǎn)麥芽糖a-淀粉酶在粗淀粉水解方法中使用，此處將其引入作為參考。a-淀粉酶可以本領(lǐng)域眾所周知的量加入。當(dāng)以AAU單位計(jì)量時(shí)，優(yōu)選酸性a-淀粉酶活性的存在量為5-50,0000AAU/kgDS、量為500-50,000AAU/kgDS或更優(yōu)選為100-10,000AAU/kgDS，例如500-1，000AUU/kgDS。優(yōu)選加入真菌酸性a-淀粉酶的量為10-10,000AFAU/kgDS、量為500-2,500AFAU/kgDS或更優(yōu)選量為100-1,000AFAU/kgDS,例如大約為500AFAU/kgDS。根據(jù)本發(fā)明方法的實(shí)施方案中所用的葡糖淀粉酶可來(lái)源于任何合適來(lái)源，例如來(lái)源于微生物或植物。優(yōu)選的葡萄糖淀粉酶來(lái)自真菌或細(xì)菌，選自由曲霉屬葡萄糖淀粉酶組成的組，具體為黑曲霉Gl或G2葡萄糖淀粉酶(Bodetal.(1984),EMBOJ.3(5)，p.1097-1102)，或其變體，例如公開(kāi)于WO92/00381和WO00/04136;泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(WO84/02921)，米曲霉(A,oryzae)(Agric.Biol.Chem.(1991),55(4)，p.941-949)，或其變體或片段。其它曲霉屬葡糖淀粉酶變體包括增強(qiáng)其熱穩(wěn)定性的變體G137A和G139A(Chenetal.(1996)，Prot.Engng.9,499-505);D257E和D293E/Q(Chenetal.(1995),ProtEngng.8,575-582);N182(Chenetal.(1994)，Biochem.J.301，275-281);二硫鍵，A246C(Fierobeetal.(1996)，Biochemistry,35，8698-8704;以及在A435和S436位置引入殘基(Lietal.(1997),ProteinEngng.10，1199-1204)。其它葡糖淀粉酶包括踝節(jié)菌屬(ra/aram_yces)葡糖淀粉酶，特別是來(lái)自ra/araw_ycesemersow'/(WO99/28448)、ra/aramyc^/eyce,towws(美國(guó)專(zhuān)利號(hào).Re.32,153)、7h/orcw^ces<iwpo/^'、ra/arawyes//7enwp/n7^(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)US4,587,215)。所考慮的細(xì)菌葡糖淀粉酶包括來(lái)自梭狀芽胞桿菌屬(C7oWrWwn)，特別是C.f/^moamy/o/,'CMm(EP135,138)和C.Aermo/z>^msw//wWcMW(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。含葡糖淀粉酶的商品化組合物包括AMG200L;AMG300L;SANTMSUPER,SANEXTRAL，SPIRIZYMEPLUS,SPIRIZYMEFUEL和AMGE(購(gòu)自NovozymesA/S);OPTIDEX300(購(gòu)自GenencorInt.);AMIGASE和AMIGASEPLUS(購(gòu)自DSM);G-ZYMEG900,G-ZYMETM和G990ZR(購(gòu)自GenencorInt.)?？杉尤肫咸堑矸勖傅挠行Я繛?.02-20AGU/gDS，優(yōu)選0.1-10AGU/gDS,例如2AGU/gDS。木聚糖酶在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酸氧化酶處理與木聚糖酶結(jié)合使用。木聚糖酶(EC.3.2.1.8)活性可源于任何適合的來(lái)源，包括真菌和細(xì)菌生物體，例如曲霉屬、ZXs;orafn'c/mw、青霉屬、脈孢菌、鐮刀菌屬和木霉屬。含有木聚糖酶的優(yōu)選商品化制品包括SHEARZYME、BIOFEEDWHEAT、CELLUCLAST、ULTRAFLO、VISCOZYME(NovozymesA/S)和SPEZYMECP(GenencorInt.)。纖維素酶在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酸氧化酶處理與纖維素酶結(jié)合使用。根據(jù)發(fā)明所使用的纖維素酶活性源于任何適合的來(lái)源；優(yōu)選纖維素酶是源于微生物，例如源于絲狀真菌菌抹(例如曲霉屬、木霉屬、腐殖菌屬、鐮刀菌屬)?？墒褂玫暮欣w維素酶的商品化制品包括CELLUCLAST、CELLUZYME、CEREFLO和ULTRAFLO(NovozymesA/S)、LAMINEX和SPEZYMECP(GenencorInt.)，以及ROHAMENT7069W(購(gòu)自R6hmGmbH)。酶的制備脂肪酸氧化酶和此處所引用的其它酶可來(lái)源于或獲得于任何合適的來(lái)源，包括細(xì)菌、真菌、酵母或哺乳動(dòng)物源。術(shù)語(yǔ)"來(lái)源"在本文中的意思是所述酶可以從其天然存在的生物體中分離出，即該酶的氨基酸序列與天然酶一致。術(shù)語(yǔ)"來(lái)源，，也指該酶可以由宿主生物體重組產(chǎn)生，重組生成的酶具有與天然酶一致的特性或具有修飾的氨基酸序列，例如具有一個(gè)或多個(gè)缺失、插入和/或替換的氨基酸，即重組生成的酶為天然氨基酸序列的突變體和/或片段，或通過(guò)本領(lǐng)域已知的核酸改組的方法產(chǎn)生的酶。在天然酶意義內(nèi)包括天然的變體。此外，術(shù)語(yǔ)"來(lái)源"包括合成產(chǎn)生的酶，例如肽合成。術(shù)語(yǔ)"來(lái)源"還包括不論是在體內(nèi)或體外經(jīng)過(guò)修飾例如通過(guò)糖化、磷酸化或其它的化學(xué)修飾的酶。術(shù)語(yǔ)"獲得"在本文中的意思是指具有與天然酶一致的氨基酸序列的酶。該術(shù)語(yǔ)包括已從天然存在的生物體中分離的酶，或在同種或不同種類(lèi)的生物體中已重組表達(dá)的酶，或通過(guò)合成例如肽合成產(chǎn)生的酶。就重組產(chǎn)生的酶而言，術(shù)語(yǔ)"獲得"和"來(lái)源"是指酶的特性，而非其在其中重組產(chǎn)生的宿主生物體的特性。酶也可以被純化。這里所使用的術(shù)語(yǔ)"純化的"包括不含其所來(lái)源的生物體的其它組分的酶。術(shù)語(yǔ)"純化的"還包括不含其所從其獲得的天然生物體中組分的酶。酶可以純化至僅有少量的其它蛋白存在。措詞"其它蛋白質(zhì)"特別是指其它的酶。這里所使用的術(shù)語(yǔ)"純化的"也指除去其它組分，特別是其它的蛋白質(zhì)，更具體指存在于本發(fā)明酶的來(lái)源的細(xì)胞中的其它酶。酶可以是"基本上，，純的，即不含其從中產(chǎn)生的生物體的其它組分，即例如重組產(chǎn)生酶的宿主生物體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶至少為75%(W/W)純，更優(yōu)選至少為80%、至少為85%、至少為卯％、至少為95%、至少為96%、至少為97%、至少為98%或至少為99%純。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶為100%純。根據(jù)本發(fā)明所使用的酶可以以任何適合的形式用于此處所描述方法中使用，例如，如以干粉或顆粒、無(wú)塵顆粒、液體、穩(wěn)定液體或受保護(hù)酶的形式。例如可如在美國(guó)專(zhuān)利US4，106，991和US4,661,452中所公開(kāi)的方法制備顆粒，并且可任選采用本領(lǐng)域已知的方法包被?？筛鶕?jù)既定方法例如通過(guò)加入穩(wěn)定劑如糖、糖醇或其它多元醇、乳酸或其它有機(jī)酸來(lái)穩(wěn)定液體酶制劑。受保護(hù)的酶可根據(jù)EP238，216中所公開(kāi)的方法制備。發(fā)酵刺激劑根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案，發(fā)酵刺激劑可與此處所描述的任何的酶方法結(jié)合使用以進(jìn)一步改善發(fā)酵方法，特別是，改善發(fā)酵微生物的性能，例如，提高速度和乙醇產(chǎn)率。"發(fā)酵刺激劑"是指發(fā)酵微生物生長(zhǎng)刺激劑，發(fā)酵微生物特別是酵母。優(yōu)選的發(fā)酵生長(zhǎng)刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的例子包括多種維生素、生物素、泛酸、煙酸、內(nèi)消旋肌醇、石克胺、吡哆醇、對(duì)氨基苯酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D和E，例如參見(jiàn)Alfenoreetal.,"ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiabyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess",Springer-Verlag(2002)，其在此弓1入作為參考。礦物質(zhì)的例子包括那些能提供含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu營(yíng)養(yǎng)素的礦物質(zhì)和礦物質(zhì)。液化或糖化任何液化或糖化均可與本發(fā)明的發(fā)酵方法結(jié)合使用。根據(jù)本發(fā)明糖化和液化可與發(fā)酵方法同時(shí)或分開(kāi)進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，液化、糖化和發(fā)酵方法同時(shí)進(jìn)行(LSF)。"液化"是其中磨碎的(完整的)谷類(lèi)原料被分解(水解)成麥芽糖糊精(糊精)的方法。液化通常以三步熱淤漿方法進(jìn)4亍。在60-95。C、優(yōu)選80-85。C加熱淤漿，和加入酶以引發(fā)液化(稀釋)。然后在95-140。C、優(yōu)選在105-125。C下噴烤(jet-cooked)淤漿以使淤漿徹底糊化(gelanitization)。接著使淤漿冷卻至60-95。C并加入更多的酶以結(jié)束水解(二級(jí)液化)。液化方法通常在PH4.5-6.5進(jìn)行，特別是在PH5-6。磨碎并液化的全粒稱為糊狀物(mash)。通常使用上述"淀粉酶"部分中所列的任何a-淀粉酶進(jìn)行液化方法。"糖化"是使麥芽糖糊精(例如由液化方法產(chǎn)生)變成可被發(fā)酵微生物例如酵母代謝的低分子量糖DPw(即碳水化合物源)的方法。糖化方法是為本領(lǐng)域眾所周知的，通常由葡糖淀粉酶酶催化進(jìn)行?？蛇x擇地或附加地，可使用a-葡糖苷酶或酸性a-淀粉酶。整個(gè)糖化方法可持續(xù)大約24-72小時(shí)，通常大約在30-65。C的溫度、和在PH4-5、通常大約在PH4.5的條件下進(jìn)行。然而，通常更優(yōu)選進(jìn)行預(yù)糖化步驟，該步驟持續(xù)大約40-90分鐘、在30-65。C的溫度、典型地大約在6(TC下進(jìn)行，隨后在發(fā)酵期間在同時(shí)發(fā)生的糖化和發(fā)酵方法(SSF)中完全糖化。在乙醇生產(chǎn)中使用的最普遍的方法是同時(shí)進(jìn)行糖化和發(fā)酵(SSF)方法，其中不經(jīng)過(guò)糖化保持階段，這意味著共同加入發(fā)酵生物(例如酵母)和酶。在SSF方法中，通常恰恰在發(fā)酵前，在5(TC以上的溫度引入預(yù)糖化步驟。更優(yōu)選的是，液化、糖化或發(fā)酵方法是同時(shí)進(jìn)行液化-糖化-發(fā)酵(LSF)方法或單一酶方法，其中液化、糖化和發(fā)酵方法全部在一個(gè)方法中進(jìn)行，即所有用于液化、糖化和發(fā)酵的酶(或可替換的或另外的非酶試劑)在同一個(gè)方法中加入，更優(yōu)選在同一方法內(nèi)同時(shí)加入。優(yōu)選的LSF方法的工藝條件包括溫度約26-40°C、優(yōu)選大約32。C,大約PH4至大約8、優(yōu)選大約PH5，和方法步驟時(shí)間大約48-72小時(shí)，優(yōu)選大約72小時(shí)。優(yōu)選LSF方法或單一酶催化方法為粗淀粉水解(RSH)方法，更優(yōu)選用于生產(chǎn)醇例如乙醇。"粗淀粉水解，，方法(RSH)不同于常規(guī)的淀粉處理方法在于粗的未煮過(guò)的淀粉(也稱顆粒淀粉)用于乙醇發(fā)酵方法。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"顆粒淀粉"是指粗的未煮過(guò)的淀粉，即以天然形式存在于谷物、塊莖或谷類(lèi)中的淀粉。淀粉在植物細(xì)胞內(nèi)形成不溶于水的細(xì)小顆粒。當(dāng)置于冷水中時(shí)，淀4分顆?？晌丈倭恳后w并膨脹。在高至50-75。C的溫度時(shí)膨月長(zhǎng)是可逆的。然而，在更高的溫度下開(kāi)始不可逆膨脹，叫做糊化。術(shù)語(yǔ)"初始糊化溫度，，是指淀粉開(kāi)始糊化的最低溫度。在水中加熱的淀粉于50-75。C之間開(kāi)始糊化；確切的糊化溫度取決子具體的淀粉，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地確定該溫度。因此，初始糊化溫度可根據(jù)植物品種.植物品種的具體變種以及生長(zhǎng)條件而不同，在本發(fā)明范圍內(nèi)，給定淀粉的最初糊化溫度為在通過(guò)使用Gorinstein.S.和Lii.C.,Starch/Starke，Vol.44(12)pp.461-466(1992)中所描述的方法雙折射損失5%淀粉顆粒的溫度。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選脂肪酸氧化酶與酯酶、植酸酶、漆酶、蛋白酶、淀粉酶和/或葡糖淀粉酶結(jié)合使用，以提高粗淀粉水解方法中的乙醇產(chǎn)率。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用脂肪酸氧化酶和選自下列組中的一種或多種酶活性在低于顆粒淀粉的最初糊化溫度下處理顆粒淀粉淤漿，其中所述組為植酸酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、葡糖淀粉酶和/或(產(chǎn)麥芽糖)a-淀粉酶、酵母。優(yōu)選酵母是乙醇紅(red"/zam/)酵母。優(yōu)選淀粉酶是酸性a-淀粉酶，更優(yōu)選是酸性真菌a-淀粉酶。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，粗淀粉水解方法需要用葡糖淀粉酶和/或a-淀粉酶在低于顆粒淀粉最初糊化溫度的0-20。C下處理顆粒淀粉淤漿，隨后在10-35。C溫度下用葡糖淀粉酶和/或a淀粉酶、酵母和至少一種脂肪酸氧化酶以及任選的酯酶、蛋白酶、植酸酶、漆酶、淀粉酶和/或葡糖淀粉酶處理淤漿。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法需要下列連續(xù)步驟(a)在低于顆粒淀粉最初糊化溫度的0-2(TC下用酸性a-淀粉酶和葡糖淀粉酶處理顆粒淀粉淤漿，優(yōu)選時(shí)間為5分鐘-12小時(shí)，(b)在10-35i:在酸性a-淀粉酶、葡糖淀粉酶、酵母和至少一種脂肪酸氧化酶以及任選的植酸酶、蛋白酶、漆酶、酯酶存在下處理淤漿，優(yōu)選時(shí)間為20-250小時(shí)，以生成乙醇。在RSH步驟中，可將其它酶和發(fā)酵刺激劑與脂肪酸氧化酶處理結(jié)合使用。優(yōu)選其它的酶選自酯酶例如脂肪酶、或角質(zhì)酶、植酸酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶或a-淀粉酶例如產(chǎn)麥芽糖a-淀粉酶、葡糖淀粉酶或它們的組合。在RSH步驟中存在大量的植酸。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如前面所述，4直酸酶可用于促進(jìn)乂人才直酸(myoinositolhexakisphosphate)或其任何鹽(植酸鹽)中釋放無(wú)機(jī)磷酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在RSH方法中將產(chǎn)麥芽糖a-淀粉酶與脂肪酸氧化酶結(jié)合使用。本發(fā)明所述的發(fā)酵方法和組合物優(yōu)選應(yīng)用于醇的生產(chǎn)方法中(例如，用作燃料或燃料添加劑的乙醇)，更優(yōu)選使用粗淀粉水解方法。使用如本發(fā)明所述的方法，例如可提高乙醇生產(chǎn)的速度和/或產(chǎn)率。加入至少一種有效量的脂肪酸氧化酶可用于改善發(fā)酵產(chǎn)品的乙醇產(chǎn)率。乙醇生產(chǎn)方法通常包括磨碎、液化、糖化、發(fā)酵和蒸餾步驟。在生產(chǎn)乙醇和其它的基于淀粉的產(chǎn)品中，需要粉碎原料例如全粒，優(yōu)選玉米，以便破壞結(jié)構(gòu)然后進(jìn)行下一步加工。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選使用兩種方法濕法磨碎和干法磨碎。優(yōu)選使用干法磨碎生產(chǎn)乙醇，其中將整個(gè)籽粒磨碎然后在后面的步驟中使用。也可使用濕法磨碎并且可很好的分離微生物和粗粉(淀粉顆粒和蛋白質(zhì))，除少數(shù)情況外濕法磨碎在平行生產(chǎn)糖漿時(shí)使用。濕法和干法磨碎方法是本領(lǐng)域所公知的。在乙醇生產(chǎn)中，發(fā)酵生物優(yōu)選酵母，將其應(yīng)用于麥芽漿。酵母優(yōu)選來(lái)源于酵母菌屬(Sacc/2aramyc"&ss//.),更^f尤選來(lái)于酉良酒酵母(Sacc/zGramyc'escerev&ae)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將酵母加入麥芽漿，然后發(fā)酵進(jìn)行24-96小時(shí)，例如典型的為35-60小時(shí)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，溫度通常為26-34。C，特別是大約為32。C，PH值通常為PH3-6，優(yōu)選大約為PH4-5。施用的酵母細(xì)胞的量?jī)?yōu)選為105-1012，優(yōu)選為107-101Q,特別是為每毫升發(fā)酵肉湯中活酵母計(jì)數(shù)為5xl07。在乙醇產(chǎn)生階段酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)優(yōu)選在107-101()范圍內(nèi)，特別是大約為2xl08。關(guān)于使用酵母用于發(fā)酵的更多指導(dǎo)可參見(jiàn)，例如，"ThealcoholTextbook"(EditorsK.Jacques,T.P.LyonsandD.R.Kelsall,NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999)，在此將其引入作為參考。發(fā)酵后，可蒸餾麥芽漿以提取醇產(chǎn)品(乙醇)。在根椐本發(fā)明方法獲得的最終產(chǎn)品是乙醇的情況，其可用作例如燃料乙醇；飲用乙醇，即飲用酒精；或工業(yè)乙醇。另一方面本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括U)磨碎全粒；(b)液化步驟(a)的產(chǎn)品；(c)糖化液化的物質(zhì)；(d)使用微生物來(lái)發(fā)酵糖化的物質(zhì)，其中發(fā)酵方法還包括使發(fā)酵培養(yǎng)基與至少一種脂肪酸氧化酶相接觸。脂肪酸氧化酶和附加的酶以及刺激劑可以是上面提到的任一種。脂肪酸氧化酶優(yōu)選是脂氧化酶。最后本發(fā)明涉及一種組合物，所述組合物舍有脂肪酸氧化酶和一種或多種選自由酯酶、植酸酶、漆酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶例如a-淀粉酶或葡糖淀粉酶或它們的混合物組成的酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中脂肪酸氧化酶是脂氧化酶(LOX)，優(yōu)選上面所提到的任一種。在一個(gè)實(shí)施方案中組合物還含有脂肪酶和任選的a-淀粉酶，組合物還可含有脂肪酶和任選的a-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶。材料和方法脂肪酸氧化酶脂氧化酶來(lái)源于Maga/oW/zew/v/m7,其公開(kāi)于WO02/086114(可購(gòu)自丹麥的NovozymesA/S)。脂肪酶LIPOLASE100L(購(gòu)自丹麥的NovozymesA/S)葡糖淀粉酶SPIRIZYMEFUEL(購(gòu)自NovozymesA/S)蛋白酶NOVOZYM50006(購(gòu)自丹麥NovozymesA/S)酵母乙醇紅，購(gòu)自美國(guó)RedStar/Lesaffre方法回槽的制備從發(fā)酵醪(beer)解吸塔(stripper)柱中離心發(fā)酵的粗淀粉后的離心分離液。脂氧化酶活性脂氧化酶活性可在25。C下通過(guò)監(jiān)測(cè)氫過(guò)氧化物的形成采用分光光度來(lái)測(cè)定。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)分析方法，將10微升酶加入到含980微升25mM的磷酸鈉緩沖液(PH7.0)和10微升底物溶液(10mM分散有0.2%(v/v)Tween20的亞油酸(不應(yīng)保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)))的lml石英池中。通常將酶足夠稀釋以確保在第一時(shí)間內(nèi)最大使加入的底物轉(zhuǎn)換10%。吸收在234nm進(jìn)行，其吸收率可通過(guò)曲線的直線部分來(lái)估計(jì)。假定順式-反式-共軛的羥基(過(guò)氧)脂肪酸具有的分子消光系數(shù)為23,000M-'cm—'。a-淀粉酶活性(KNU)可采用馬鈴薯淀粉作為底物來(lái)測(cè)定淀粉分解活性。該方法以由酶破壞修飾的馬鈴薯淀粉為基礎(chǔ)，隨后通過(guò)使淀粉/酶溶波樣品和碘溶液混和進(jìn)行反應(yīng)。最初形成微黑-藍(lán)色，但分解淀粉期間藍(lán)色變?nèi)?，然后逐漸變成紅褐色，將其與有色玻璃標(biāo)準(zhǔn)比較。1KiloNovoa-淀粉酶單位(KNU)的定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下(即在37°C+/-0.05;0.0003MCa2+;和PH5.6)糊精化5260mg可溶性MerckAmylum淀粉干燥物所需要酶的量。這種分析方法在文件EB-SM-0009.02/01中作了更詳細(xì)地描述,其可從丹麥的NovozymesA/S索取得到，在此將其引入作為參考。植酸酶活性植酸酶活性以FYT單位來(lái)計(jì)量，在下列條件下PH5.5;溫度37。C;底物濃度為0.0050mol/L的植酸鈉(C6H6024P6Na12)，1FYT是指每分鐘釋放1毫摩爾無(wú)機(jī)正磷酸鹽所需要酶的量。FAU活性測(cè)定1真菌a-淀粉酶單位(FAU)是指基于下列標(biāo)準(zhǔn)條件下每小時(shí)分解5.26g淀粉(MerckAmylum的可溶性Erg.B.6，批號(hào)9947275)所需要的酶的量底物..........可溶性淀粉溫度.........37°CpH............4.7反應(yīng)時(shí)間.........7-20分鐘酸性a-淀粉酶活性(AFAU)測(cè)試酸性a-淀粉酶活性以AFAU(酸性真菌a-淀粉酶單位)來(lái)計(jì)量，其相對(duì)于酶的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定。使用的標(biāo)準(zhǔn)是AMG300L(丹麥NovozymesA/S，野生型黑曲霉屬Gl葡糖淀粉酶，還公開(kāi)于Boeletal.(1984)，EMBOJ.3(5),p.1097-1102)和WO92/00381)。在這一AMG的中性a-淀粉酶經(jīng)在室溫下存儲(chǔ)3星期后從大約1FAU/mL降至^氐于0.05FAU/mL。在這一AMG標(biāo)準(zhǔn)中的酸性a-淀粉酶活性根據(jù)下列說(shuō)明來(lái)確定。在該方法中，1AFAU是指在標(biāo)準(zhǔn)條件下每小時(shí)分解5.260mg淀粉干物質(zhì)所需的酶的量。碘與淀粉而不是與其降解物形成藍(lán)色絡(luò)合物。顏色的強(qiáng)度與淀粉的濃度成正比。使用反向比色法如在所規(guī)定的分析條件下通過(guò)淀粉濃度的降低來(lái)測(cè)定淀粉酶活性。a-淀粉酶淀粉+碘-糊精+低聚糖4(TC,pH2.5藍(lán)/紫t-23秒褪色標(biāo)準(zhǔn)條件/反應(yīng)條件(每分鐘)底物淀粉，大約0.17g/L緩沖液檸檬酸鹽，大約0.03M碘(12):0.03g/LCaCl2:1.85mMpH:2.50±0.05孵育溫度40°C反應(yīng)時(shí)間23秒波長(zhǎng)？i=590nm酶濃度0.025AFAU/mL酶工作范圍0.01-0.04AFAU/mL如需更詳細(xì)的細(xì)節(jié)，可在EB-SM-0259.02/01中找到，其可從丹麥的NovozymesA/S得到，在此并入本發(fā)明作為參考。酸性a-淀粉酶單位(AAU)酸性a-淀粉酶活性可以AAU(酸性a-淀粉酶單位)來(lái)計(jì)量，其是一個(gè)絕對(duì)的方法。一個(gè)酸性淀粉酶單位(AAU)是在標(biāo)準(zhǔn)條件下與強(qiáng)度已知等同于某一顏色基準(zhǔn)的碘溶液反應(yīng)后，將lg淀粉(100%干料)轉(zhuǎn)變成在620nm能傳輸(transmission)的產(chǎn)品每小時(shí)所需的酶的量。標(biāo)準(zhǔn)條件/反應(yīng)條件底物濃度大約為20gDS/L的可溶性淀粉緩沖液檸檬酸鹽，大約0.13M,pH=4.2石爽溶液4t).176g硤化鉀+0.088g碘/L的自來(lái)水15°-20°dH(德國(guó)度硬度)PH:4.2孵育溫度30。C反應(yīng)時(shí)間11分鐘波長(zhǎng)620nm酶濃度0.13-0.19AAU/mL酶工作范圍0.13-0.19AAU/mL淀粉應(yīng)該是Lintner淀粉，它是一種用于實(shí)驗(yàn)室的作為比色指示的低稠性(thin-boiling)淀粉。Lintner淀粉是通過(guò)稀鹽酸處理天然淀粉而獲得的從而使其保持遇碘變藍(lán)色的性能。在EP0140410B2中作了更詳細(xì)的描述,在此將其并入作為參考。測(cè)定葡糖淀粉酶活性(AGI)葡糖淀粉酶(相當(dāng)于淀粉葡萄糖苦酶)使淀粉轉(zhuǎn)變成葡萄糖。在此通過(guò)葡萄糖氧化酶方法測(cè)定活性來(lái)測(cè)定葡萄糖的量。所述方法在下列文獻(xiàn)中作了描述參見(jiàn)"ApprovedmethodsoftheAmericanAssociationofCerealChemists"的76-11章節(jié)Starch-GlucoamylaseMethodwithSubsequentMeasurementofGlucosewithGlucoseOxidase.Vol.1-2AACC,AmericanAssociationofCerealChemists,(2000);ISBN:1-891127-12-8。1葡糖淀粉酶單位(AGI)是指在方法的標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘形成1微摩爾葡萄糖所需要的酶的量。標(biāo)準(zhǔn)條件/反應(yīng)條件底物可溶性淀粉，濃度大約為16g干燥物質(zhì)/L.緩沖液檸檬酸鹽，大約0.04M，pH=4.3pH:4.3孵育溫度60°C反應(yīng)時(shí)間15分鐘中止反應(yīng)加入NaOH至濃度大約為0.2g/L(PH~9)酶濃度0.15-0.55AAU/mL淀粉應(yīng)該是Lintner淀粉，它是一種用于實(shí)驗(yàn)室的作為比色指示的低稠碘變藍(lán)色的性能。葡糖淀粉酶活性(AGU)所述Novo葡糖淀粉酶單位(AGU)定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件37。C和PH4.3底物麥芽糖23.2mM，緩沖液乙酸鹽0.1M,反應(yīng)時(shí)間5分鐘下水解1微摩爾麥芽糖每分鐘所需的酶的量?？墒褂米詣?dòng)分析儀系統(tǒng)。往葡萄糖脫氬酶試劑中加入變旋酶以使存在的任一a-D-葡萄糖轉(zhuǎn)變成P-D-葡萄糖。葡糖脫氫酶專(zhuān)一地與上述反應(yīng)中的卩-D-葡萄糖反應(yīng)，形成NADH，其如同測(cè)量最初的葡萄糖濃度那樣通過(guò)使用光度計(jì)在340nm測(cè)定。AMG孵育<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>更詳細(xì)地描述這種分析方法的文件EB-SM-0131.02/01可從丹麥的NovozymesA/S索取得到，在此將其引入作為參考。測(cè)定角質(zhì)酶活性(LU)如同測(cè)定脂解活性，可采用三丁酸甘油酯(tributyrine)作為底物來(lái)測(cè)定角質(zhì)酶活性。所述方法基于酶水解三丁酸甘油酯，然后作為時(shí)間的函數(shù)來(lái)記錄堿的消耗量。1脂肪酶單位(LU)定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下(即30°C;PH7.0;阿拉伯樹(shù)膠(GumArabic)作為乳化劑和三丁酸甘油酯作為底物)釋放1微摩爾可滴定的丁酸每分鐘所需的酶的量。更詳細(xì)地描述這種分析的方法在文件AF95/5可從丹麥的NovozymesA/S索取得到，在此將其引入作為參考。木聚糖分解(Xylanolvtic)活性(FXU)可用FXU單位表示木聚糖分解活性，其用remazol-木聚糖(用RemazolBrilliantBlueR染色的4-0-曱基-D-glucurono-D-木聚糖，F(xiàn)luka)作為底物在PH6.0下來(lái)測(cè)定。用remazol-木聚糖底物孵育木聚糖酶樣品。通過(guò)乙醇沉淀不降解的染色底物的底色。在上層清液中保留的藍(lán)色(在585nm分光光度測(cè)定)與木聚糖酶活性成正比，然后相對(duì)于酶的標(biāo)準(zhǔn)在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件即在50.0°C、PH6.0和30分鐘的反應(yīng)時(shí)間下測(cè)定木聚糖酶單位。更詳細(xì)地描述這種分析方法的文件EB-SM-352.02/01可從丹麥的NovozymesA/S索取得到，在此將其引入作為參考。測(cè)定產(chǎn)麥芽糖淀粉酶(MaltogenicAmylase)活性(MANU)1MANU(產(chǎn)麥芽糖淀粉酶Novo單位)可定義為在每毫升0.1M檸檬酸鹽緩沖液PH5.0濃度為每毫升10mg麥芽三糖(SigmaM8378)底物下37r和30分鐘的反應(yīng)時(shí)間，釋放1微摩爾麥芽糖每分鐘所需要的酶的量。纖維素分解(CeHulvtic)活性(EGU)纖維素分解(cellulytic)活性可以內(nèi)-葡聚糖酶單位來(lái)計(jì)算，其用羧甲基纖維素(CMC)作為底物在PH6.0來(lái)測(cè)定。制備底物溶液，其在PH6.0下在0.1M磷酸鹽緩沖液中含有34.0g/LCMC(Hercules7LFD)的底物溶液。將要分析的酶樣品在同一緩沖液中溶解。將5ml底物溶液和0.15ml酶溶液混和，然后轉(zhuǎn)移至振動(dòng)粘度計(jì)(例如法國(guó)Sofraser的MIVI3000),在40。C恒溫30分鐘。1EGU定義為在這些條件下使粘度減至一半所需要酶的量。反應(yīng)混合物中酶樣品的量應(yīng)調(diào)至0.01-0.02EGU/mL。將主要標(biāo)準(zhǔn)(archstandard)定義為880EGU/g。更詳細(xì)地描述這種分析方法的文件EB-SM-0275.02/01可從丹麥的NovozymesA/S索取得到，在此將其引入作為參考。實(shí)施例實(shí)施例1測(cè)定基于亞油酸的脂肪酸氧化酶活性使用具有TriOxmatic300氧電極和4ml的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)容量的"Oxi3000Oximeter"(WTW,Weilheim，德國(guó))。將10mg亞油酸(10ml60%亞油酸)溶于lml乙醇，然后加入2微升Tween20。將50微升這一底物原液加入含有3.85ml緩沖溶液(Britton-Robinson:100mM磷-、醋-和硼酸；用NaOH調(diào)節(jié)PH)的反應(yīng)燒杯中，該反應(yīng)燒杯還裝備有使溶液很好混和的小攪動(dòng)棒，將氧電極插入反應(yīng)燒杯。加入100微升純化的酶溶液，即，(a)來(lái)源于Mag"a;oW/zesa/v/""的月旨氧4b酶濃度大約為0.4mg/ml;或(b)來(lái)源于Gaewma""ow少cesgram//7^的脂氧化酶濃度大約為0.76mg/ml(其意味著在最終的反應(yīng)中大約為0.02mg/ml)。這些脂氧化酶的制備如前面所述。溫度為25°C。測(cè)量溶解的氧的濃度(mg/1)并以時(shí)間(分鐘)作為函數(shù)繪圖。加入酶之后，計(jì)算曲線線性部分的斜率作為酶活性(mg/l/min)。當(dāng)相關(guān)時(shí)用減法矯正基線，意思指在加入脂肪酸氧化酶(即對(duì)照物)之前，如果以時(shí)間作為函數(shù)顯示氧濃度的曲線具有大于大約0.05mg氧/ml/分鐘的斜率，則將該值從樣品的斜率值中減去。下面的表l列出了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>實(shí)施例2脂肪酸氧化酶如下面所描述來(lái)對(duì)四種酶進(jìn)行檢測(cè)，即兩種漆酶和兩種脂氧化酶。來(lái)源于尸o(y;owsp/m/仏s的漆酶具有65kDaSDSMW65kDa、3.5、和在PH5.5下60。C的最佳溫度。來(lái)源于灰鬼傘屬(Coprinuscinereus)的漆酶具有SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳MW67-68kDa、用IEF的pI3.5-3.8和在PH7.5下65。C的最佳溫度。酶的制備和純化如在WO96/00290和美國(guó)專(zhuān)利US6,008,029中所描述的方法進(jìn)行。這兩種脂氧化酶來(lái)源于Magm^0W/7esa/v/m7和Gaewwa""ow;;cesgram/"^，它們的制備方法如前面所描述的。調(diào)節(jié)酶的劑量以確保在234nm/530nm每分鐘增加的吸光度最大，即每分鐘在0.1-0.25吸光度單位的范圍。底物溶液將11.65mg亞油酸(60%)和溶于乙醇的12.5ml0.56mM丁香醛連氮(Sigma)與去離子水相混和以達(dá)到25ml的總體積。將要測(cè)試的50微升酶制劑轉(zhuǎn)移至含有900微升磷酸鹽緩沖液(50mM,pH7.0)和50孩i升底物溶液的石英池中。所述石英池置于分光光度計(jì)(spectrofotometer)中，恒溫于23°C,在234nm和530nm測(cè)量作為時(shí)間的函數(shù)的吸光度。吸光度在530nm指示為丁香趁連氮的降解，而吸光度在234nm指示為亞油酸的降解。以時(shí)間為函數(shù)的吸光度增量可基子2-4分鐘的反應(yīng)時(shí)間來(lái)計(jì)算，即d(A234)/dt，以及d(A53o)/dt。結(jié)果如下列表2中所示。四種酶中僅有兩種脂氧化酶符合如本文中所定義的脂肪酸氧化酶。這是因?yàn)閮H有這兩種酶的RRD-反應(yīng)速率差-(dA234/dt-dA530/dt)〉0。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>*是指等同于0活性(分析誤差)實(shí)施例3含50。/。w/w回槽的LSF粗淀4分水解(RSH)以下列方式進(jìn)行乙醇紅酵母(EthanolRedyeast)于500rpm和32.2。C下在0.02%DSNOVOZYM50006存在下有氧增殖8小時(shí)。通過(guò)混和粉碎的玉米(2-mm篩)、自來(lái)水和回槽來(lái)制備玉米淤漿，然后用磷酸調(diào)節(jié)PH至5?；夭鄣暮繛橐合嗟?0%w/w,SP288,0.8AFAU/gDS、SPIRIZYMETMFUEL、2AGU/gDS。在填充配置有空氣塞的25ml發(fā)酵罐之前，將酵母繁殖立即導(dǎo)入淤漿中。空氣塞具有0.2屮m針筒式濾器以防止油的回流和微生物污染。發(fā)酵在32.2。C進(jìn)行64小時(shí)。當(dāng)發(fā)酵完成時(shí)，發(fā)酵罐在3，000rpm,2(TC離心15分鐘。迫使上層清液通過(guò)0.45卞m過(guò)濾器并通過(guò)HPLC分析。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>RSH中回槽濃度對(duì)64小時(shí)乙醇產(chǎn)率的影響。數(shù)據(jù)是在不同時(shí)間進(jìn)行的7次發(fā)酵的平均。表1表明往發(fā)酵培養(yǎng)基中加入回槽降低了乙醇的產(chǎn)率。實(shí)施例4用^^加卯^/^^/^"http://脂氧化酶預(yù)處理發(fā)酵培養(yǎng)基和50°/?；夭鄣腖SF重復(fù)如實(shí)施例3中所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中使用發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基用脂氧化酶和發(fā)酵培養(yǎng)基中摻有脂肪酶的脂氧化酶預(yù)處理。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表2表明1)脂氧化酶和2)脂氧化酶和脂肪酶預(yù)處理發(fā)酵培養(yǎng)基增加了乙醇的產(chǎn)率。權(quán)利要求1.一種在發(fā)酵培養(yǎng)基中生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，所述方法含有發(fā)酵步驟，包括將發(fā)酵培養(yǎng)基暴露于至少一種脂肪酸氧化酶。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪酸氧化酶是脂氧化酶，優(yōu)選來(lái)源于釀酒酵母、普通嗜熱放線菌、Fwsan'wm棉狀嗜熱絲孢菌、/>"/cw/an'aoo^e、地霉屬菌抹、禾頂囊殼或Magm^0W/2e3.權(quán)利要求1的方法，其中發(fā)酵微生物是酵母。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)品是乙醇。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵步驟是同時(shí)糖化和發(fā)酵方法(SSF)或液化、糖化和發(fā)酵方法(LSF)中的一部分。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵在一種或多種酶的存在下進(jìn)行，所述酶選自酯酶、植酸酶、纖維素、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶、a-淀粉酶或葡糖淀粉酶。7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵是干法磨碎方法或濕法磨碎方法中的一部分。8.權(quán)利要求7的方法，其中用于磨碎方法的原料是含淀粉的原料，例如玉米、小麥、大麥或買(mǎi)羅高梁。9.一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括(a)磨碎全粒；(b)液化步驟(a)的產(chǎn)品；(c)糖化液化的物質(zhì)；(d)使用微生物發(fā)酵糖化的物質(zhì)，其中發(fā)酵方法還包括使發(fā)酵培養(yǎng)基與至少一種脂肪酸氧化酶相接觸。10.權(quán)利要求9的方法，進(jìn)一步還包括蒸餾發(fā)酵的物質(zhì)。11.權(quán)利要求9或10的方法，其中所述方法是同時(shí)液化和糖化方法(SSF)或同時(shí)液化、糖化和發(fā)酵方法(LSF)。12.權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括加入一種或多種酶，所述酶選自酯酶例如脂肪酶或角質(zhì)酶、植酸酶、纖維素酶、木聚糖酶、a-淀粉酶、葡糖淀粉酶或其混合物。13.權(quán)利要求9的方法，其中所述脂肪酸氧化酶是脂氧化酶。14.權(quán)利要求9的方法，其中所述微生物是酵母。15.—種組合物，其含有脂肪酸氧化酶和一種或多種酶，所述酶選自酯酶、植酸酶、纖維素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶、a-淀粉酶、葡糖淀粉酶或其混合物。16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述脂肪酸氧化酶是脂氧化酶。17.權(quán)利要求15或16的組合物，進(jìn)一步還含有脂肪酶。全文摘要本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的包括在生產(chǎn)乙醇方法中使用的發(fā)酵方法。所述改進(jìn)的發(fā)酵方法包括在發(fā)酵方法中應(yīng)用最少一種脂肪酸氧化酶(特別是脂氧化酶)。所述改進(jìn)的發(fā)酵方法還包括加入各種附加的酶和發(fā)酵微生物生長(zhǎng)刺激物，包括維生素和礦物質(zhì)。文檔編號(hào)C12P7/10GK101146912SQ200480022900公開(kāi)日2008年3月19日申請(qǐng)日期2004年6月9日優(yōu)先權(quán)日2003年6月10日發(fā)明者瓦瓦拉·格里奇科申請(qǐng)人:諾維信北美公司