專利名稱：用于純化和結(jié)晶目的分子的組合物的制作方法
用于純化和結(jié)晶目的分子的組合物 發(fā)明領(lǐng)域和背景
本發(fā)明涉及組合物，該組合物能用于純化和結(jié)晶目的分子。 蛋白質(zhì)和其他大分子越來越多地用于研究、診斷和治療中。蛋白
質(zhì)一般通過占生產(chǎn)過程主要成本的(最高占總成本的60%)大規(guī)模純 化的重組技術(shù)生產(chǎn)。因此，由于與純化有關(guān)的高成本，重組蛋白質(zhì)產(chǎn) 物的大規(guī)模利用受到阻礙。
目前蛋白質(zhì)的純化方法依靠使用不同層析技術(shù)的組合。這些技術(shù) 根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷、疏水性或大小及其他特性而分離蛋白質(zhì)混合物。 一些不同的層析樹脂可用于每種這些技術(shù)中，允許對純化方案進行準 確的修正以得到用于分離的特定靶蛋白質(zhì)。每一種這些分離方法的要 點在于可使蛋白質(zhì)以不同的速率經(jīng)過長柱，當其進一步通過該柱時實 現(xiàn)提高了的物理分離，或者選擇性地粘附至分離介質(zhì)，使得能經(jīng)不同 的溶劑差分洗脫。有時，設(shè)計柱使得雜質(zhì)在那里結(jié)合而在"流過的溶 液(flow-through)"中發(fā)現(xiàn)所需的蛋白質(zhì)。
親和沉淀(AP)是用于蛋白質(zhì)沉淀最有效和最先進的方法 [Mattiasson 1998 ) ; Hilbrig和Freitag (2003 ) J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 790 (1-2 ) : 79-90。目前現(xiàn)有技術(shù)的AP應(yīng) 用配體偶聯(lián)的"智能聚合物(smart polymers)"。"智能聚合物"[或 刺激-響應(yīng)性"智能"聚合物或親和大配體(AML) I為那些以很大的性 質(zhì)改變對小的物理或化學(xué)刺激，例如pH、溫度、放射線等的變化作出 響應(yīng)的聚合物。這些聚合物可以有很多形態(tài)；其可溶于水溶液中，吸 附或接枝在水相-固相的接觸面上，或交聯(lián)以形成水凝膠Hoffman J Controlled Release (1987 ) 6: 297-305; Hoffman Intelligent polymers. In: Park K ， ed. Controlled drug delivery. Washington : ACS Publications, (1997) 485-98 Hoffman Intelligent polymers in medicine and biotechnology. Artif Organs (1995 ) 19: 458-467]。通常，當聚合 物的臨界響應(yīng)受刺激時，溶液中的智能聚合物將呈現(xiàn)突然的渾濁如同 各分相一樣；表面吸附的或接枝的智能聚合物將塌陷，將接觸面從親 水的轉(zhuǎn)化至疏水的；而該智能聚合物(以水凝膠形式交聯(lián)的)將表現(xiàn)出急劇的塌陷并且釋放許多溶脹的溶液。當進行逆向刺激時這些現(xiàn)象 也反轉(zhuǎn)，不過在聚合物必須重溶解或凝膠必須重溶脹在水介質(zhì)中時反 轉(zhuǎn)的速率通常較慢。
"智能"聚合物可以物理混合或化學(xué)偶聯(lián)至生物分子以產(chǎn)生聚合物 -生物分子系統(tǒng)的大家族，其可對生物學(xué)的以及物理的或化學(xué)的刺激作 出響應(yīng)。生物分子可以是聚合物-偶聯(lián)的，包括蛋白質(zhì)和寡肽、糖和多
糖、單-和雙-鏈寡核苷酸和DNA質(zhì)粒、單純的脂類和磷脂以及廣譜的 識別配體和合成的藥物分子。
許多結(jié)構(gòu)參數(shù)控制智能聚合物特異性地沉淀目的蛋白的能力；智 能聚合物應(yīng)當包含配體偶聯(lián)的活性基團；不與雜質(zhì)強烈作用；能使配 體與靶蛋白有效作用；在介質(zhì)性質(zhì)改變時能產(chǎn)生完全的聚合物的分 相；形成致密的沉淀；排除雜質(zhì)在凝膠結(jié)構(gòu)中的截留以及沉淀形成后 很容易溶解。
雖然許多不同的天然及合成的聚合物已用于AP中Mattiasson (1998) J. Mol. Recognit. 11: 211],但是理想的智能聚合物仍是難以 確定的，例如用現(xiàn)有智能聚合物進行的親和沉淀未能滿足上述的一種 或一些條件Hlibrig和Freitag (2003)，上文。
有效的或簡單的蛋白質(zhì)純化技術(shù)的可利用性在蛋白質(zhì)結(jié)晶中也是 有用的，其中蛋白質(zhì)的純度深遠地影響晶體的生長。蛋白質(zhì)的構(gòu)象結(jié) 構(gòu)是了解其生物學(xué)功能以及最終設(shè)計新的藥物療法的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)的 構(gòu)象結(jié)構(gòu)通常通過其晶體的X射線衍射進行測定。不幸的是，在大多 數(shù)情況下生成足夠高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體是非常困難的，并且該困難是 蛋白質(zhì)樣品的科學(xué)測定和結(jié)構(gòu)鑒定的主要限制因素。從過飽和溶液生 成蛋白質(zhì)晶體的現(xiàn)有方法是冗長和費時的，并且才有超過100， 000個 不同蛋白質(zhì)的小于百分之二已經(jīng)被生長成適于X射線衍射研究的晶 體。
膜蛋白是對結(jié)晶產(chǎn)生最大挑戰(zhàn)的蛋白質(zhì)組。雖然膜蛋白的數(shù)量預(yù) 期將構(gòu)成蛋白質(zhì)組的三分之一，可得到的膜蛋白的三維結(jié)構(gòu)的數(shù)量仍 然在20個左右。當希望結(jié)晶膜蛋白時必須克服許多障礙。這些包括， 天然來源中蛋白質(zhì)的低豐度、需要從其天然環(huán)境中(即脂雙分子層) 溶解疏水膜蛋白以及在去污劑溶液中其變性、凝集和/或降解的傾向。 由于一些去污劑可能會妨礙穩(wěn)定的配體與靶蛋白的結(jié)合，對增溶去污劑的選擇就存在另外的問題。
已在膜蛋白的結(jié)晶中嘗試了兩種方法。
直至最近，利用從蛋白質(zhì)_去污劑復(fù)合物的溶液中直接生長成的晶
體測定了大部分的膜蛋白的x射線晶體結(jié)構(gòu)。只有當被結(jié)晶的溶質(zhì)是
蛋白質(zhì)和去污劑的復(fù)合物而不是單獨的蛋白質(zhì)時，蛋白質(zhì)-去污劑復(fù)合 物的晶體生長才可被認為與可溶蛋白質(zhì)的等同。盡管結(jié)晶組裝同時將 去污劑部分帶入閉合的同格中，實際的晶格接觸還是由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì) 相互作用形成的。為了提高有效表面積以使這些蛋白質(zhì)之間接觸，研
究表明添加抗體片段將提高產(chǎn)生晶體的幾率Hunte和Michel ( 2002 ) Curr. Opin. Struct. Biol. 12: 503-508。然而，由于需要單克隆抗體的 產(chǎn)生，其特異于每種膜蛋白，將該技術(shù)應(yīng)用至不同的膜蛋白是困難的。 此外，認為沒有哪一種去污劑膠束可以完全和準確地再生蛋白質(zhì) 的脂雙層環(huán)境。
因此，結(jié)晶膜蛋白的工作必須致力于在脂雙層環(huán)境內(nèi)產(chǎn)生晶體。 利用該方法已經(jīng)進行了許多嘗試以產(chǎn)生膜蛋白的晶體。這些包括在形 成包含連續(xù)雙分子層結(jié)構(gòu)的膠狀物質(zhì)脂質(zhì)立方相(cubic phase)Landau和Rosenbuch (1996 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14532-14535中生長的細菌視紫紅質(zhì)晶體的產(chǎn)生，以及在cubo中結(jié)晶，其在 古生物的七個-跨膜螺旋蛋白質(zhì)的結(jié)晶中被證實是成功的[Gordeliy (2002 ) Nature 419: 484-487; Luecke ( 2001 ) Science 293: 1499-1503; Kolbe ( 2000) Science 288: 1390-1396; Royant ( 2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10131-10136。然而，使用cubo內(nèi)方法的其他膜蛋白的 晶體沒有直接從蛋白質(zhì)-去污劑復(fù)合物溶液生成的晶體的高質(zhì)量Chiu (2000) Acta. Crystallogr. D. 56: 781-784。
因此對沒有上述限制的用于分子純化和結(jié)晶的組合物和其使用方 法有廣泛認同的需求，并且其也是非常有益的。 發(fā)明概述
本發(fā)明的一個方面提供包括至少一種能結(jié)合靶分子或目的細胞的 配體的物質(zhì)組合物，當與配位體離子或分子共-孵育時，所選的附著于 至少一種配位部分的該至少一種配體能指引該物質(zhì)組合物形成非-共價
復(fù)合物o
本發(fā)明的另一方面提供純化靶分子或目的細胞的方法，該方法包括(a)將包含靶分子或目的細胞的樣品和一種組合物接觸，該組合 物包括(i)至少一種能結(jié)合靶分子或目的細胞的配體，該至少一種 配體附著于至少一種配位部分；和(ii)能非-共價結(jié)合該至少一種配 位部分的配位體，當共-孵育時該至少一種配位部分和配位體能形成復(fù) 合物；以及(b)收集包含結(jié)合至靶分子或目的細胞的復(fù)合物的沉淀， 由此純化耙分子或目的細胞。
根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案的更進一步的特征，該方法進一步 包括從沉淀回收目的分子。
本發(fā)明的又一個方面提供檢測患者中與目的分子相關(guān)的疾病的易 感性或存在的方法，該方法包括將獲自受體的生物樣品和組合物接 觸，組合物包括(i)至少一種能結(jié)合靶分子或目的存在的配體，該 至少一種配體附著于至少一種配位部分；和(ii)能非-共價結(jié)合該至 少一種配位部分的配位體，當共-孵育時該至少一種配位部分和配位體 能形成復(fù)合物，其中包含目的分子的復(fù)合物的形成為患者中與目的分 子相關(guān)的疾病的易感性或存在的指示。
本發(fā)明的又一個方面提供用于結(jié)晶目的分子的組合物，該組合物 包括(i)至少一種能結(jié)合靶分子或目的存在的配體，該至少一種配 體附著于至少一種配位部分；和(ii)能非-共價結(jié)合該至少一種配位 部分的配位體，其中當共-孵育時該至少一種配位部分和配位體能形成 復(fù)合物，且因此選擇組合物以使當目的分子結(jié)合至該配位體時能確定 該目的分子的相對空間位置和方向，由此在誘導(dǎo)結(jié)晶的條件下促進其 中晶體的生成。
本發(fā)明的另外一個方面提供結(jié)晶目的分子的方法，該方法包括將 包含目的分子的樣品和一種結(jié)晶組合物接觸，該組合物包括(i)至 少一種能結(jié)合目的分子的配體，該至少一種配體附著于至少一種配位 部分；和(ii)能非-共價結(jié)合該至少一種配位部分的配位體，當共-孵 育時該至少一種配位部分和配位體能形成復(fù)合物，且因此選擇組合物 以使當目的分子結(jié)合至該配位體時能確定該目的分子的相對空間位置 和方向，由此在誘導(dǎo)結(jié)晶的條件下促進其中晶體的形成。
本發(fā)明的仍然另外的一方面提供包含一種分子的物質(zhì)組合物，該 分子具有能結(jié)合目的分子的第一區(qū)域和能結(jié)合配位體離子或分子的第 二區(qū)域，設(shè)計該第二區(qū)域使得該分子暴露于配位體離子或分子時形成聚合物。
本發(fā)明仍是另外一個方面提供除盡來自樣品的靶分子或目的細胞
的方法，該方法包括(a)將包含靶分子或目的細胞的樣品和組合物 接觸，組合物包括(i)至少一種能結(jié)合目的分子的配體，該至少一 種配體附著于至少一種配位部分；和(ii)能非-共價結(jié)合該至少一種 配位部分的配位體，當共-孵育時該至少一種配位部分和配位體能形成 復(fù)合物；以及(b)除去包含結(jié)合至靶分子或目的細胞復(fù)合物的沉淀， 由此除盡來自樣品的靶分子或目的細胞。
本發(fā)明的另外一個方面提供增強靶分子免疫原性的方法，該方法 包括將靶分子和一種組合物接觸，該組合物包括(i)至少一種能結(jié) 合耙分子或目的細胞的配體，該至少一種配體附著于至少一種配位部 分；和(ii)能非-共價結(jié)合該至少一種配位部分的配位體，其中進行 接觸使得該至少一種配位部分和配位體能形成包含目的靶分子的復(fù)合 物，由此增強目的靶分子的免疫原性。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的更進一步的特征，目的分子選自蛋白 質(zhì)、核酸序列、小分子化學(xué)試劑和離子。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的更進一步的特征，該至少一種配體選自 生長因子、激素、核酸序列、抗體、抗原表位標記、親和素、生物素、 酶的底物和酶。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的更進一步的特征，該至少一種配體通過 接頭結(jié)合至至少一種配位部分。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的更進一步的特征，配位部分選自螯合 劑、生物素、核酸序列、抗原表位標記、缺電子的分子和富電子的分 子。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的更進一步的特征，配位體離子或分子選 自金屬離子、親和素、核酸序列、缺電子的分子和富電子的分子。
本發(fā)明通過提供用于分子純化的組合物和方法成功地克服了目前 已知構(gòu)型的不足。
除非另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所述 技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的意思。雖然與此處所述的 類似的或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實踐或測試，但是合適的 方法和材料描述如下。如有沖突，以包含定義的本專利說明書為準。此外，材料、方法和實施例僅是解釋性的而并不試圖作為限制。 附圖簡述
此處參照附圖僅舉例描述本發(fā)明。對于目前對附圖詳細的具體參 考，強調(diào)指出所顯示的詳細說明是舉例而言的，且僅是為了本發(fā)明優(yōu) 選實施方案的解釋性討論的目的，并且是為了提供什么是最有效的以 及很容易地理解本發(fā)明原理的描述和概念方面的原因而存在。關(guān)于這 一點，相比本發(fā)明最基本的理解所需并不試圖更詳細地呈現(xiàn)本發(fā)明的 構(gòu)成細節(jié)，


使得本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知曉本發(fā)明的一些形式 怎樣可以體現(xiàn)在實踐上。
在附圖中
圖la-f用示意圖舉例說明了本發(fā)明組合物的一些構(gòu)型。圖la-c顯 示結(jié)合至兩個配位部分的配體。圖ld-f顯示結(jié)合至多個配位部分的配 體。Z表示配位部分。圖2a-b用示意圖舉例說明了利用本發(fā)明的組合 物對靶分子的沉淀。共價結(jié)合到雙螯合劑的配體與靶分子孵育(圖 2a)。添加金屬(M+、 M2+、 M3+、 M4+)結(jié)合螯合劑并且形成包含與 金屬離子非-共價結(jié)合的靶分子的陣列(圖2b)。
圖3a-e用示意圖舉例說明了靶分子從沉淀中的分級回收。圖3a顯 示添加游離螯合劑竟爭性地參與配體結(jié)合的螯合劑和金屬的結(jié)合。圖 3b顯示配體結(jié)合的靶分子從游離的竟爭性螯合劑和復(fù)合的金屬中基于 比重的分離。圖3d顯示配體結(jié)合的靶分子上樣至固定化的金屬柱以允 許復(fù)合物的結(jié)合。在合適的洗脫條件下靶分子被洗脫而配體配位部分 的分子未洗脫?？闪硗饧尤朊擕}階段用于靶分子的進一步純化。配體 螯合劑分子的再生通過添加竟爭性螯合劑至柱，隨后經(jīng)透析或超濾而 實現(xiàn)(圖3e)。
圖4用示意圖舉例說明了靶分子從沉淀中的直接洗脫，其中螯合
劑-金屬復(fù)合物得到維持，而靶分子和配體間的結(jié)合降低了
圖5用示意圖舉例說明了在靶分子的洗脫之后沉淀單元(即配體-
配位部分)的再生。在這種情況下，通過添加竟爭性的螯合劑和應(yīng)用
合適的分離步驟，例如透析和超濾而實現(xiàn)回收。
圖6a-c用示意圖舉例說明了利用核酸序列作為配位部分沉淀乾分
子。在靶分子存在下孵育含有共價結(jié)合雙核苷酸序列(配位部分)的
配體(圖6a)?；パa序列的添加導(dǎo)致包含配體-配位部分靶分子互補序列(配位體分子，圖6b)的陣列的形成。還顯示了不-對稱的配位 序列(圖6c)。
圖7a-b用示意圖舉例說明了利用生物素作為配位部分來沉淀耙分 子。在靶分子的存在下孵育帶有共價結(jié)合雙-生物素或生物素衍生物例 如DSB-X生物素的配體(圖7a)。親和素(或其衍生物)的引入產(chǎn) 生包括配體-配位部分(生物素)靶分子親和素的網(wǎng)絡(luò)(圖71))。
圖8a-c用示意圖舉例說明了利用富電子的分子作為配位部分沉淀 靶分子。在靶分子存在下孵育帶有共價結(jié)合的雙富電子體的配體(圖 8a)。傾向于形成復(fù)合物的雙(也可以是三、四)缺電子衍生物的添 加導(dǎo)致產(chǎn)生包括配體-配位部分(缺電子分子)靶分子雙-缺電子部 分的非-共價網(wǎng)絡(luò)(圖8b)。苦味酸和吲哚系統(tǒng)也可用于本發(fā)明(圖8c)。
圖9用示意圖舉例說明了用結(jié)合的A蛋白(ProA)作為配體沉淀 靶抗體。合適的配位體的添加產(chǎn)生A蛋白-配位部分配位體靶分子 的網(wǎng)絡(luò)。
圖10a-b用示意圖舉例說明了用于膜蛋白結(jié)晶的本發(fā)明復(fù)合物的用 途。呈現(xiàn)了結(jié)晶組合物中2D(或3D)結(jié)構(gòu)的一般構(gòu)型，其中配位體自 身相互間并不相連(圖10a)。圖10b中舉例說明了利用以兩個抗原和 導(dǎo)向該特異性抗原的單克隆抗體(mAb)作為配位體修飾的特異性配 體的更具體的實施例。
圖lla-b用示意圖舉例說明了用于膜蛋白晶體形成的金屬復(fù)合物 (圖lla)和核-復(fù)合物(圖lib)的用途。圖llc用示意圖舉例說明了 使用本發(fā)明組合物的三維膜復(fù)合物。蛋白質(zhì)的疏水結(jié)構(gòu)域由去污劑膠 粒環(huán)繞。Z表示多價配位體(即，至少二-價配位體)。
圖12用示意圖舉例說明了由通過合適的螯合劑，結(jié)合至單個金屬 配位體的三個配體組成的非-共價組合物的形成其中該螯合劑通過共價 接頭結(jié)合至配體。
圖13a-b用示意圖舉例說明了對三個目的配體進行修飾以包含異 羥肟酸衍生物(圖13a)，使得三非-共價配體復(fù)合物在鐵離子的存在 下形成(圖13b)。
圖14用示意圖舉例說明了用于產(chǎn)生配體-螯合劑分子的兩步合成 方法。
圖15a-b用示意圖舉例說明了當僅改變存在于介質(zhì)中的陽離子時，通過利用相同的配體-接頭-螯合劑分子來形成雙(圖15a)和三(圖 15b)非-共價配體。
圖16a-c用示意圖舉例說明了通過缺/富電子關(guān)系而配位的本發(fā)明 的組合物。通過用缺電子部分修飾配體(圖16a)并且合成三共價富電 子部分(圖16b)，形成了參見圖16c中結(jié)構(gòu)的復(fù)合物。
圖17用示意圖舉例說明了用于富電子的配體或缺電子的配體衍生
物制備的兩步合成方法。
圖18用示意圖舉例說明了多肽在利用富電子或缺電子部分用于形 成配體復(fù)合物的用途。
圖19用示意圖舉例說明了利用螯合劑-金屬以及富電子和缺電子 的關(guān)系的配體復(fù)合物的形成。
圖20用示意圖舉例說明了用于制備螯合劑-缺電子衍生物的單步 合成方法。
圖21a-b用示意圖舉例說明了通過利用相同的螯合劑-缺電子(兒 茶酚-TNB )衍生物并且僅改變介質(zhì)中的陽離子而形成二和三非共價缺 電子部分。
圖22a-b用示意圖舉例說明了添加包含一個富電子部分的多肽以 形成二聚物和三聚物。
圖23a-b用示意圖舉例說明了通過添加包含結(jié)合至兩個螯合劑的 配體的組合物來形成聚合物復(fù)合物，螯合劑通過電子富/缺關(guān)系配位。
圖24用示意圖舉例說明了限制非共價蛋白質(zhì)二聚物的運動自由度 的一種可能性。通過添加合適的金屬經(jīng)由配體-接頭-螯合劑的形成非共 價二聚物后，加入共價缺電子體(例如，三硝基苯-三硝基苯-TNB-TNB)導(dǎo)致兩個鄰近的蛋白質(zhì)上兩個易接近的富電子殘基(例如，Trp) 的同時結(jié)合,'由此強加了運動限制并且允許晶體結(jié)構(gòu)的形成。
圖25用示意圖舉例說明了分別可用作本發(fā)明組合物中的配位部分 和配位體離子的螯合劑和金屬。
圖26用示意圖舉例說明了可用作本發(fā)明組合物中的配位部分的富 電子和缺電子體。
優(yōu)選實施方案的描述
本發(fā)明為組合物，其可用于純化和結(jié)晶目的分子。
參考附圖和所附的說明，本發(fā)明的原理和操作將得到更好的理解。
在詳細闡明本發(fā)明的至少一種實施方案之前，可以理解的是本發(fā) 明并不限于以下描述中詳細闡述或通過實施例例證的應(yīng)用。本發(fā)明有 其他的實施方案或能以不同的方式操作或進行。另外，可以理解的是 此處所用的詞組和術(shù)語是用于描述而不應(yīng)該被認為是限制。
成本有效的蛋白質(zhì)，例如用于治療的蛋白質(zhì)的商業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)， 主要依賴快速和有效的純化方法的發(fā)展，因為純化步驟通常占據(jù)蛋白 質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)所用成本的大部分。
因此對簡單的、經(jīng)濟合算的方法有需求，該方法可用于純化蛋白 質(zhì)及其他商業(yè)上重要的分子。
在蛋白質(zhì)純化中，現(xiàn)有技術(shù)為親和沉淀(AP)，其基于與結(jié)合目 的蛋白質(zhì)的識別單元偶聯(lián)的"智能"聚合物的利用。這些智能聚合物 在其物理狀態(tài)或特性中產(chǎn)生大的、有時不連續(xù)的變化而響應(yīng)環(huán)境刺激 的微小變化，產(chǎn)生水溶液的分相或者凝膠大小的數(shù)量級的變化以及目 的分子的沉淀。然而，目前由于一些障礙包括，沉淀過程中雜質(zhì)的截 留、雜質(zhì)吸附至聚合物基體、蛋白質(zhì)識別單元的降低的親和性以及可 能導(dǎo)致活性降低的純化蛋白質(zhì)的工作條件，還沒有實現(xiàn)智能聚合物的 前景。
在促使本發(fā)明實踐的過程中，本發(fā)明人設(shè)計了新的組合物，其能
如在下文和隨后的實施例部分舉例說明的那樣，本發(fā)明的組合物 特異性地結(jié)合靶分子以形成非共價復(fù)合物，其可在溫和條件下沉淀和 收集。此外，與現(xiàn)有的純化組合物相反，本發(fā)明的組合物并沒有被固 定化(例如固定到智能聚合物上)，其會降低配體接近靶分子的親和 力、限制所用配體的量、要求使用需要高級維護的復(fù)雜實驗設(shè)備 (HPLC)、導(dǎo)致柱的淤塞和限制對于單一共價結(jié)合配體的柱的利用率。
因此，本發(fā)明的一個方面提供一種物質(zhì)組合物，其適合于靼分子 或目的細胞的純化。
靶分子可以是大分子例如蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖蛋白或核酸序 列(例如，DNA如質(zhì)粒、RNA)或小分子例如化學(xué)試劑。盡管此處提 供的大部分實施例描述了蛋白質(zhì)類的靶分子，可以理解的是本發(fā)明不限于上述靶物質(zhì)。
靶細胞可以是真核細胞、原核細胞或病毒細胞。
本發(fā)明的物質(zhì)組合物包括至少一種能結(jié)合目的分子或細胞的配體 以及所選的當用配位體離子或分子共-孵育時能指引該物質(zhì)組合物形成 非-共價復(fù)合物的至少一種配位部分。
如此處使用的術(shù)語"配體"是指合成的或天然存在的分子，優(yōu)選呈
現(xiàn)高親和力(例如，KD<1(T5)地結(jié)合目的靶分子的以及兩個之間能特 異性地相互作用的分子。當目的靶物質(zhì)為細胞時，選擇能結(jié)合蛋白質(zhì)、 碳水化合物或化學(xué)試劑的配體，其在該細胞表面上表達(例如，細胞 標記物)。優(yōu)選地，配體與目的分子或細胞的結(jié)合為非共價結(jié)合。本 發(fā)明這方面的配體可以是單、雙(抗體、生長因子)或多化合價的配 體并且可以呈現(xiàn)對一種或多種目的分子或細胞的親和力(例如，雙特 異性抗體)?？捎糜诒景l(fā)明的配體的實例包括，但不限于，抗體、模 擬物(例如，Affibodies⑧參見美國專利5， 831， 012、 6， 534， 628 和6， 740， 734)或其片段、抗原表位標記、抗原、生物素和其衍生物、 親和素和其衍生物、金屬離子、受體和其片段(例如，EGF結(jié)合結(jié)構(gòu) 域)、酶(例如，蛋白酶類)和其突變體(例如，催化惰性的)、底 物(例如，肝素)、植物凝集素(例如，刀豆素A)、碳水化合物(例 如，肝素)、核酸序列例如、適體和Spiegelmers [Wlotzka ) (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 8898-02、染料，其常模擬天然底物或 輔因子的結(jié)構(gòu)而與酶的催化部位相互作用且由生色團組成(例如，偶 氮染料、蒽醌或酞菁)，連接至反應(yīng)基團(例如，單或二氯代三吖溱 環(huán)，參見，Denzili (2001 ) J Biochem Biophys Methods. 49 (1-3): 391-416)、小分子化學(xué)試劑、受體配體(例如，生長因子和激素)、 具有相同的結(jié)合功能的不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)的模擬物或其片段(例如，EGF 結(jié)構(gòu)域)、離子配體(例如，鈣調(diào)蛋白)、A蛋白、G蛋白和L蛋白 或其模擬物(例如，PAM，參見Fassina ( (1996 ) J. Mol. Recognit. 9: 564-9、化學(xué)試劑(例如，cibacron藍、其結(jié)合酶和血清白蛋白；氨基 酸例如，賴氨酸和精氨酸、其結(jié)合絲氨酸蛋白酶類)以及磁性分子如 高自旋有機分子和聚合物(參見http : 〃www.chem.unl.edu/rajca/highspiii.html)。
如此處使用的短語"配位部分"是指對配位體離子或分子具有足夠親和力(例如，KD<10—5)的任何分子。當與配位體離子或分子共孵育 時，該配位部分可指引本發(fā)明的物質(zhì)組合物形成非共價復(fù)合物。可用 于本發(fā)明的配位部分的實例包括但不限于，抗原表位(與抗體的抗體 結(jié)合部位結(jié)合的抗原決定簇抗原)、抗體、螯合劑(例如，His-標記， 參見隨后實施例部分的實施例1中的其他實例，圖1、 25和26)、生 物素(參見圖7)、核酸序列(參見圖6)、A或G蛋白(圖9)、缺 電子和富電子分子(參見隨后實施例部分的實施例2和圖8)及其他上 述的分子(參見配體的實例)。
可以理解的是許多配位部分可與上述配體結(jié)合(參見圖la-f)。 進一步可以理解的是，不同的配位部分可以結(jié)合至配體如螯合劑 和富/缺電子分子以形成如圖19中所示的復(fù)合物。這種結(jié)合部分的組合 可以介導(dǎo)如圖23a-b和24中分別舉例說明的包含目的分子的聚合物或 有序的片層(即，網(wǎng)絡(luò))的形成。
題，選擇配位部分以防止配位部分-配體相互作用或配位部分-耙分子相 互作用的可能性。例如，如果配體是對目的免疫球蛋白具有親和力的 抗原，則配位部分優(yōu)選不是能結(jié)合該抗原的抗原表位標記或抗體。
如此處使用的短語"配位體離子或分子"是指可溶性實體(即，分 子或離子)，其對配位部分表現(xiàn)出足夠的親和力(即，KD<1(T5)且同 樣能指引本發(fā)明的物質(zhì)組合物形成非共價復(fù)合物?？捎糜诒景l(fā)明的配 位體分子的實例包括但不限于，親和素及其衍生物、抗體、富電子分 子、缺電子分子等?？捎糜诒景l(fā)明的配位體離子的實例包括但不限于， 單、二或三價金屬。圖25舉例說明了可用作本發(fā)明配位體離子的螯合 劑和金屬的實例。圖26列出了可用于本發(fā)明的富電子分子或缺電子分 子的實例。生成抗體和抗體片段以及單鏈抗體的方法在Harlow和 Lane ， Antibodies: A Laboratory Manual ， Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988，此處引入作為參考；Goldenberg,美 國專利4, O36, 945和4， 331， 647和其中包含的參考文獻；也參見 Porter, R.R.Biochem. J. 73: 119-126 (1959); Whitlow和Filpula， Methods 2: 97-105 (1991 ); Bird等.，Science 242: 423-426 ( 1988); Pack等.，Bio/Technology 11: 1271-77 (1993);以及美國專利4， 946， 778]中描述。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物包括配位體離子或分子。
本發(fā)明的配體可以直接結(jié)合至配位部分，取決于兩個的化學(xué)性 質(zhì)。然而要采取措施以維持配體對目的分子的識別(例如，親和力)。
必要時(例如，空間位阻)，可經(jīng)接頭將配體連接至配位部分。圖14 顯示用于使用常見配體對代表性的螯合劑進行修飾的常規(guī)合成途徑。 Margherita等.(1993 ) J. Biochem. Biophys. Methods 38: 17-28提供了
可用于將配體附著于本發(fā)明的配位部分的合成方法。
當配體和結(jié)合到配體上的配位部分都是蛋白質(zhì)時(例如，分別為
生長因子和抗原表位標記)，融合蛋白質(zhì)的合成可經(jīng)分子生物學(xué)方法
(例如，PCR)或生化方法(固相肽合成)完成。
本發(fā)明的復(fù)合物具有不同的復(fù)雜度水平，例如，單體(參見圖12 和13ab描述了三個配體復(fù)合物)、二聚物、聚合物(參見圖23a-b描 述的聚合物經(jīng)實施例部分實施例3所述的結(jié)合性接頭的形成)、片層
(參見圖24，其中當靶分子的單個表面暴露的Trp殘基與TNB—TNB 體形成富/缺電子關(guān)系時形成片層)以及可形成三維(3D)結(jié)構(gòu)的晶格
(如當超過一個表面暴露的Trp殘基形成富/缺電子關(guān)系時)。得到很 好地證實的是復(fù)合物復(fù)雜度越高，結(jié)構(gòu)越剛性使得能夠用于如下文進 一步描述的結(jié)晶方法中。此外，大的復(fù)合物將更快地發(fā)生分相，不需 要使用另外的離心步驟。
如下文所述，本發(fā)明的組合物可以被組裝在純化試劑盒中，其可 包含另外的緩沖液和添加劑?？梢岳斫獾氖沁@種試劑盒可以包括用于 純化來自單一樣品的許多分子的許多配體。然而，為了簡化沉淀(例 如，使用相同的反應(yīng)緩沖液、溫度條件、pH等)以及進一步的純化步 驟，選擇相同的配位部分和配位體離子或分子。
如上文所提及的，本發(fā)明的組合物可用于純化來自樣品的目的分 子或細胞。
因此，本發(fā)明的另一個方面提供純化目的分子的方法。 如此處使用的術(shù)語"純化"是指至少通過依靠結(jié)合至本發(fā)明的組合
物而改變其溶解度并且沉淀而從樣品分離目的分子(即，分相)。
本發(fā)明的方法通過將包含目的分子的樣品與本發(fā)明的組合物接觸
并且收集包含由本發(fā)明的物質(zhì)組合物和目的分子形成的復(fù)合物的沉
淀，由此純化目的分子。如此處使用的術(shù)語"樣品"是指包含目的分子以及可能一種或多種 污染物(即，不同于所需目的分子的物質(zhì))的溶液。例如當目的分子 為分泌的重組多肽時，樣品可以是條件培養(yǎng)基，其可能包含重組多肽、 血清蛋白以及代謝物以外的分泌自該細胞的其他多肽。當樣品不包含 污染物時，純化是指濃縮。
為了起始純化，首先將本發(fā)明的物質(zhì)組合物與樣品接觸。此優(yōu)選 通過添加結(jié)合于配位部分的配體至樣品而允許目的分子結(jié)合至該配 體，隨后添加配位體離子或分子以允許目的分子的復(fù)合物的形成和沉 淀而完成。為了避免復(fù)合物的快速形成(其可能導(dǎo)致雜質(zhì)的截留)， 優(yōu)選在攪動時將配位體緩慢添加至樣品。還可以通過添加游離的配位 體(即，不與配體結(jié)合的)實現(xiàn)可控制的沉淀速度，其還可引起在各
種應(yīng)用中有益的較小的復(fù)合物的形成，例如下文進一步描述的免疫原 的形成。
一旦形成上述復(fù)合物(數(shù)秒至數(shù)小時)，可通過離心促進復(fù)合物 的沉淀(例如，超離心)，雖然有時(例如，大復(fù)合物的情況)離心 不是必須的。
取決于目的分子所需的用途，沉淀可經(jīng)進一步的純化步驟以從復(fù) 合物回收目的分子。此可通過使用本領(lǐng)域熟知的許多生化方法完成。 其實例包含，但不限于，經(jīng)疏水作用層析的分級分離(例如經(jīng)苯基瓊
脂糖凝膠)、乙醇沉淀法、等電聚焦、反相HPLC、 二氧化硅層析、 肝素瓊脂糖凝膠層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析、層析聚焦、 SDS-PAGE、硫酸銨沉淀、幾基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層 析(例如使用A蛋白、G蛋白、抗體、特異性底物、配體或抗原作為 捕獲試劑)。
可以理解的是可以將純凈的反應(yīng)溶液(例如，緩沖液)簡單添加 至沉淀以洗脫在復(fù)合物形成時被沉淀的低親和力結(jié)合的雜質(zhì)。
進一步可理解的是任何上述純化方法可以對樣品重復(fù)應(yīng)用(即， 沉淀)以提高靶分子的產(chǎn)量和/或純度。
優(yōu)選地，選擇該物質(zhì)組合物和配位體離子或分子以使靶分子從形 成的復(fù)合物快速和筒便的分離。例如，目的分子可直接從復(fù)合物洗脫， 條件是所用的洗脫條件不干擾配位部分結(jié)合至配位體(參見圖4-5)。 例如，當用于復(fù)合物中的配位部分為螯合劑時，可使用高的離子強度來洗脫目的分子，因為已經(jīng)很好地確證其不影響金屬螯合劑的相互作 用。或者，可使用采用離液鹽的洗脫，因為已經(jīng)表明金屬螯合劑的相
互作用對能使靶分子在這種條件洗脫的高鹽條件耐受[Porath (1983 ) Biochemistry 22: 1621-1630。
可通過與配位體金屬竟爭的游離的(未修飾的)螯合劑(即，配 位部分)的添加而將復(fù)合物重新溶解(圖3)。其后可使用超濾或透析 除去大部分的螯合金屬和竟爭性的螯合劑。溶解的復(fù)合物(即，目的 分子配體-配位部分)隨后可被上樣至固定化的金屬親和柱例如，亞 氨基二乙酸(IDA)和次氮基三乙酸(NTA)?？梢岳斫獾氖钱斒褂?高親和力的螯合劑時(例如，兒茶酚)，采取措施而使用采用相同的 或?qū)潭ɑ慕饘倬哂蓄愃平Y(jié)合親和力的其他螯合劑修飾的固定化的 金屬親和離子柱，以避免配體螯合劑試劑從柱上洗脫下來而不是結(jié) 合在柱上。
合適的洗脫條件的應(yīng)用將導(dǎo)致靶分子的洗脫而保持配體-配位部分 結(jié)合在柱上。最終的脫鹽步驟可用于獲得終產(chǎn)品。
配體-配位部分的再生具有高的經(jīng)濟價值，因為這種融合分子的合 成可能耗費此處所述方法涉及的成本以及工作的大部分。因此，例如， 可通過將竟爭性螯合劑上樣到上述柱或者改變柱的pH，隨后經(jīng)可將游 離的螯合劑和所需的配體-配位部分分離的超濾，而實現(xiàn)配體-配位部分 的回收。
上述純化方法可應(yīng)用于各種重組體和天然物質(zhì)的分離，這些重組 體和天然物質(zhì)具有很高的研究或臨床價值如重組生長因子和血液蛋白 質(zhì)產(chǎn)物(例如，馮.威利布蘭德因子和凝血因子，其分別是在用于馮-威 利布蘭德疾病和甲型血友病的替代治療中有效的治療性蛋白質(zhì))。
如上文所提及的，本發(fā)明的組合物也可用于分離特定的細胞群體。
已確認由于人器官的缺乏，體外器官發(fā)生作為一個最佳替代而出 現(xiàn)。為此，必須分離能分化成任何所需細胞譜系的干細胞。因此，例 如，為了分離造血千/祖細胞，可使用結(jié)合至細胞群獨有的表面標記如 CD34和CD105[參見Pierelli( 2001 )Leuk. Lymphoma 42( 6 ): 1195-206
的許多配體。
另一個實例為利用植物凝集素配體，如刀豆素A[Sharon ( 1972)Science 177: 949; Goldstein (1965 ) Biochemistry4: 876分離紅細胞。
可利用特異于目的病毒細胞的各種配體實現(xiàn)病毒細胞的分離[參見 http: 〃www.bdbiosciences.com/clontech/archive/JAN04UPD/Adeno-X. shtml]。
具體地，可通過設(shè)計成包含肝素配體[Kohleisen ( 1996) J Virol Methods 60 (1 ) : 89-101的本發(fā)明的組合物來分離反轉(zhuǎn)錄病毒。
利用上述方法的細胞分離可經(jīng)之前的樣品分批步驟，實施該步驟 以基于細胞密度或大小分離細胞(例如，離心)以及進一步的選擇性 細胞富集(例如，F(xiàn)ACS)步驟而完成。
除了其純化能力外，本發(fā)明的組合物還可用于除盡樣品中不想要 的分子或細胞。
此通過將包含不想要的靶分子或目的細胞的樣品與本發(fā)明的組合 物接觸使得形成復(fù)合物(上述)并且除去沉淀而完成。該凈化的樣品 為上清液。
該方法具有各種用途，如用于除盡來自骨髓樣品的腫瘤細胞、為 了分離和富集T細胞和CD"細胞或CD"+細胞而除盡來自外周血、脾 臟、胸腺、淋巴或骨髓樣品的B細胞和單核細胞、除盡來自生物樣品 的病原體和不需要的物質(zhì)(例如，朊病毒、毒素)、蛋白質(zhì)的純化(例 如，除盡高分子量的蛋白質(zhì)如BSA)等。
如上文所提及的，為了從給定樣品中除盡大量靶物質(zhì)，例如為了 從生物液體除去高豐度的蛋白質(zhì)(例如，白蛋白、IgG、抗胰蛋白酶、 IgA、轉(zhuǎn)鐵蛋白和親血球蛋白，參見 http : 〃 www.chem.agilent.com/cag/prod/ca/51882709small.pdf)可^吏用多個配 體。
相對現(xiàn)有沉淀組合物(例如，智能聚合物)，本發(fā)明新的組合物 的獨特特性提供了許多優(yōu)點， 一些優(yōu)點概括如下。
U)低成本的純化；該方法不依賴復(fù)雜的實驗設(shè)備如HPLC，因 此規(guī)避了機器維護和運行的成本。
(ii) 易于放大；本方法不受具有擴散限制的親和柱載量的限制。 事實上，對添加的沉淀復(fù)合物的量沒有限制。
(iii) 溫和的沉淀方法；避免了pH、離子強度或溫度很大改變產(chǎn) 生的限制。(iv) 控制整個沉淀過程；沉淀可通過將合適的配位體離子或分子 緩慢添加到沉淀混合物；單和/或多價配位體的使用；對配位部分具有 不同親和力的配位體離子或分子的使用；在非共價聚合物、片層或晶 格形成之前、之中或之后，添加非固定的游離配位部分以避免雜質(zhì)的 非特異性結(jié)合和截留Mattiasson等"(1998) J. Mol. Recognit. 11: 211-216; Hilbrig和Frehag ( 2003 ) J. Chromatogr. B 790: 79-90；以 及通過改變溫度條件而控制。已證實各種分子在溫度降低時呈現(xiàn)較低 的溶解度，因此，控制溫度條件可以調(diào)節(jié)沉淀的速率和程度。不過可 以理解的是，由于快速的沉淀過程，低溫條件可能引起雜質(zhì)的截留， 而高溫條件可能引起靶分子的低產(chǎn)量(例如，變性溫度)。因此在考 慮上述參數(shù)時采取措施以達到最適的溫度條件。
(v) 降低的雜質(zhì)本底；雜質(zhì)不能結(jié)合配位體并且同樣地其不能緊 密結(jié)合至非共價的基質(zhì)，允許在洗脫步驟之前被除去。此外，來自配 體生物本底的雜質(zhì)(與配體共同純化的分子)連同配體本身可能變?yōu)?修飾過的條件是配體和雜質(zhì)具有相同的化學(xué)性質(zhì)(例如，均為蛋白 質(zhì))，并且可能成為沉淀復(fù)合物的一部分。在合適的洗脫條件下，粑 分子將被回收而j務(wù)飾的雜質(zhì)不會被回收。
(vi) 在均勻溶液中的結(jié)合；已證實在均勻溶液中的結(jié)合比在不均 勻的相中更快并且更有效，如在親和層析中AC， Schneider等.，(1981) Aim. NY Acad. Sci. 369， 257-263; Lowe ( 2001) J. Biochem. Biophys. Methods 49， 561-574。例如，已知在許多親和分離策略中，高分子量 聚合物(用于AP)在溶液中形成非常巻曲的和粘滯的結(jié)構(gòu)，其妨礙引 入的大分子如靶分子的進入。
(vii) 沒有上文進一步所述的配體的固定化。
(viii) 簡便的復(fù)合物的重溶；復(fù)合物通過非共價作用而產(chǎn)生。
(ix) 嚴格條件下的消毒；該組合物不與基質(zhì)共價結(jié)合并且因而可 從任何裝置移去，應(yīng)用允許消毒條件以清除裝置(柱)中的非特異性 結(jié)合的雜質(zhì)。
本發(fā)明組合物將目的分子以有序的復(fù)合物如二聚物、三聚物、聚 合物、片層或晶格排列的能力還使得其能用于促進大分子如蛋白質(zhì)， 尤其是膜蛋白的結(jié)晶。如本領(lǐng)域所熟知的，晶體結(jié)構(gòu)代表分子在三維 空間的有序排列。這種有序排列可通過在給定的空間降低游離分子的數(shù)目而產(chǎn)生(參見圖10a-b和lla-c)。
因此，本發(fā)明的又一個方面提供用于結(jié)晶目的分子的組合物。
如此處使用的術(shù)語"結(jié)晶"是指目的分子的固化以致形成其原子的 有規(guī)則地重復(fù)的內(nèi)部排列和常見的外部平的表面。
本發(fā)明的組合物包含至少一種能結(jié)合目的分子的配體，該配體附 著于至少一種配位部分；和能非-共價結(jié)合該至少一種配位部分的配位 體，當共-孵育時該至少一種配位部分和配位體能形成復(fù)合物，并且因 此選擇組合物以使當目的分子結(jié)合至配位體時能確定該目的分子的相 對空間位置和方向，由此在誘導(dǎo)結(jié)晶的條件下促進其中晶體的形成。
可以理解的是共價多配體復(fù)合物的使用之前已在可溶性蛋白質(zhì)的 結(jié)晶中嘗試Dessen( 1995 )Biochemistry 34: 4933-4942; Moothoo( 1998 ) Acta. Cryst. D 54 1023-1025; Bhattacharyya ( 1987) J. Biol. Chem. 262: 1288-1293。然而，每個分子具有超過兩個配體的多配體復(fù)合物的合成 是技術(shù)上困難的和昂貴的；此外，多配體復(fù)合物合成之前靶蛋白的三 維結(jié)構(gòu)應(yīng)該已知，其在配體間具有最佳的距離以結(jié)合足夠的靶分子而 在該多配體復(fù)合物中占據(jù)所有的靶結(jié)合位點，因而，這些配體未曾用 于膜蛋白的結(jié)晶。
通過更快和更便宜地僅合成非共價多配體中的基本單元(具有配 體-配位部分的通用結(jié)構(gòu))，其是更容易實現(xiàn)的，本發(fā)明克服了這些問 題。該基本單元，僅通過多價配位體離子或分子的添加就形成非共價 的三-配體。因此，使用單個合成步驟來形成雙、三、四或更高的可用 于結(jié)晶實驗的多配體。
為了產(chǎn)生目的分子的晶體(優(yōu)選膜蛋白)，使本發(fā)明的組合物與 樣品接觸，樣品包含目的分子，優(yōu)選以預(yù)定的純度和濃度提供。
通常，結(jié)晶樣品為液態(tài)樣品。例如，當目的分子為膜蛋白時，本 發(fā)明的結(jié)晶樣品為膜制備物。生成膜制備物的方法在Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)中描述。
一旦目的分子結(jié)合至本發(fā)明的組合物，使得其相對空間位置和方 向得到很好的確定，樣品就經(jīng)受合適的結(jié)晶條件。本領(lǐng)域已知的一些 結(jié)晶方法可用于樣品以促進目的分子的結(jié)晶。結(jié)晶方法的實例包含， 但不限于，自由界面擴散法Salemme， F.R. ( 1972) Arch. Biochem.Biophys.lSl: 531539、在懸浮或滴入方法中的蒸氣擴散(McPherson， A. (1982 ) Preparation and Analysis of Protein Crystals, John Wiley 和Son, New York, pp82誦127)以及液態(tài)的透析(Bailey， K. (1940) Nature 145: 934-935)。
目前，懸滴法是用于從溶液中生長大分子晶體的最常用的方法； 該方法尤其適于生成蛋白質(zhì)晶體。通常，將包含蛋白質(zhì)溶液的小滴點 樣至蓋玻片上并且懸浮在包含具有較高濃度沉淀劑庫的密封室中。隨 著時間的過去，小滴中的溶液通過來自小滴的水蒸氣的擴散而與該庫 平衡，因此緩慢提高小滴內(nèi)蛋白質(zhì)和沉淀劑的濃度，其進而導(dǎo)致蛋白 質(zhì)的沉淀或結(jié)晶。
利用上述方法獲得的晶體具有優(yōu)選小于3A，更優(yōu)選小于2.5A,更 加優(yōu)選小于2A的分辨率。
本發(fā)明的組合物在檢驗來自復(fù)雜混合物的分析物如血清樣品中具 有顯著的有效性，其具有顯著的診斷優(yōu)點。
因此，本發(fā)明涉及檢測患者中與目的分子相關(guān)的疾病的易感性或 存在的方法。
與目的分子相關(guān)的疾病的實例為前列腺癌，其可通過前列腺特異 性抗原的存在而檢測PSA，例如，>0.4ng/ml， Boccon-Gibod Int J Clin Pract. (2004) 58 ( 4 ) : 382-90。
本發(fā)明的組合物與獲自患者的生物樣品接觸，借此包含目的分子 的復(fù)合物形成的水平指示患者中與目的分子相關(guān)的疾病的易感性或存 在。
如此處使用的短語"生物樣品"是指從患者分離的組織或液體樣 品，包含但不限于，例如血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚、呼吸 的、腸的和泌尿生殖道的外表部分、眼淚、唾液、乳汁、血細胞、腫 瘤、神經(jīng)元組織、器官以及體內(nèi)細胞培養(yǎng)組分的樣品。
為了便于復(fù)合物中目的分子的檢測和定量，優(yōu)選對生物樣品或組 合物進行標記(例如，焚光、放射性標記)。
本發(fā)明的組合物還可用于定性或定量存在于液態(tài)或氣體樣品中的 物質(zhì)，其可能在臨床、環(huán)境、健康和安全、遙感學(xué)、軍事、食物/飲料 和化學(xué)加工應(yīng)用中具有重要的作用。
異常蛋白質(zhì)的相互作用控制許多病原性的病癥的發(fā)展。例如，神經(jīng)系統(tǒng)中突觸蛋白質(zhì)的異常相互作用和錯折疊是各種神經(jīng)系統(tǒng)病癥中 導(dǎo)致神經(jīng)退行性變的重要的發(fā)病事件。這些包括阿爾茨海默氏病
(AD)、帕金森氏癥(PD)和Lewy體癡呆(DLB )。在AD中，錯 折疊的淀粉狀蛋白P多肽1-42(AP )、淀粉狀蛋白前體蛋白代謝作用 的蛋白水解產(chǎn)物在神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞外累積為凝集體(即，血小 板)。本發(fā)明的組合物可用于打亂這種大分子復(fù)合物而因此治療該病 癥。
給藥和藥物組合物產(chǎn)生的方法由例如，F(xiàn)ingl，等.，(1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics" ， Ch.l p.l描述。
本發(fā)明的組合物可被包括在診斷或治療試劑盒內(nèi)。例如，特定疾 病的組合物可和合適的緩沖液和防腐劑一起被包裝在一種或多種容器 中并且用于診斷或用于直接的治療。
因此，配體和配位部分可被置于一個容器中而配位體分子或離子 可被置于第二個容器中。優(yōu)選地，容器包含標簽。合適的容器包含， 例如瓶子、小瓶、注射器和試管。容器可由各種材料如玻璃或塑料制 成。
此外，也可加入其他添加劑如穩(wěn)定劑、緩沖液、封阻劑等。
用于增強抗原的免疫原性潛力的許多方法在本領(lǐng)域中已知。例 如，半抗原載體偶聯(lián)，其涉及利用將抗原性分子(例如，多肽)交聯(lián) 至更大的載體如KLH、 BSA、甲狀腺球蛋白和卵清蛋白來提高該分子 的分子大小， 一個已知控制免疫原性的參數(shù)[參見Harlow和Lane (1998) A laboratory manual Infra]。然而，抗原性分子的共價交聯(lián)導(dǎo) 致其中的結(jié)構(gòu)變化，因此限制了抗原的呈遞。已嘗試將抗原性分子非 共價固定至各種基質(zhì)來繞過該問題[Sheibani Frazier ( 1998 ) Bio Techniques 25: 28。因此，本發(fā)明的組合物可用于介導(dǎo)同樣的作用。
因此，本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的組合物增強目的分子免疫原性 的方法。如此處使用的術(shù)語"免疫原性"是指分子激起生物體內(nèi)免疫應(yīng) 答(例如，抗體反應(yīng))的能力。
該方法通過將目的分子與本發(fā)明的組合物接觸而完成，借此由此 形成的復(fù)合物被用作免疫原?？蓪⑦@種復(fù)合物注射至動物宿主以產(chǎn)生 免疫應(yīng)答。
因此，例如為了產(chǎn)生抗體反應(yīng)，將上述免疫原性組合物經(jīng)皮下注射入動物宿主中(例如，兔或小鼠)。在l-4次注射(即，推進)后， 收集血清(約首先注射的14周)并且例如通過利用上述樣品中分析物 檢測的方法來測定抗體效價，其中配體為比如A蛋白?？蛇x擇的或另 外，進行親和層析或ELISA。
可以理解的是本發(fā)明的組合物具有許多其他的用途，其在此處未 清楚地描述，例如那些屬于親和層析的用途[參見例如，Wen-Chien和 Kelvin (2004) Analytical Biochemistry 324: 1-10。
本發(fā)明另外的目的、優(yōu)點和新的特征對于本領(lǐng)域技術(shù)人員參閱下 列并不試圖限制的實施例后將是顯而易見的。另外，上文所述以及下 列權(quán)利要求部分要求的本發(fā)明的每個不同實施方案和方面將在下列實 施例中找到實驗性的支持。
實施例
參考下列實施例，與上述說明書 一起以非-限制性方式舉例說明本 發(fā)明。
通常，此處所用的術(shù)語和本發(fā)明中所用的實驗方法包括分子的、 生化的、微生物學(xué)的和重組的DNA技術(shù)。所述技術(shù)在文獻中得到充分 說明。參見，例如，"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 等.，(1989 ) ; "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.( 1994 ); Ausubel等.，"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley和Sons, Baltimore, Maryland (l卿)；Perbal， "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988 ) ; Watson等.，"Recombinant DNA"， Scientific American Books, New York; Birren等，(eds ) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4， Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);美國專利4, 666， 828; 4, 683， 202; 4， 801， 531; 5， 192， 659和5， 272, 057中闡述的方法;"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-HI Cellis， J.E., ed. (1994 ); "Current Protocols in Immunology" Volumes l陽lll ColiganJ.E., ed. (1994) ; Stites等. (eds ) ， "Basic and Clinical Immunology"(第8版)，Appleton & Lange， Norwalk， CT( 1994 ); Mishell和Shiigi( eds ), "Selected Methods in Cellular Immunology", H.Freeman和Co., New York (1980 ); 可 用的免疫測定法在專利和科學(xué)文獻中被廣泛地描述，參見，例如，美國專利3， 791， 932; 3， 839， 153; 3， 850， 752; 3， 850， 578; 3， 853， 987; 3， 867， 517; 3， 879， 262; 3， 901， 654; 3， 935， 074; 3， 984， 533; 3， 996， 345; 4， 034， 074j 4， 098， 876. ， 4， 879， 219. ， 5， 011， 771和5， 281， 521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait， M.J" ed.( 1984 ); "Nucleic Acid Hybridization" Hames， B.D.，和HigginsS.J., eds. (1985) ; "Transcription and Translation" Hames， B.D.，以及 HigginsS.J" Eds. (1984) ; "Animal Cell Culture" Freshney， R.I.， ed. (1986) ; "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal， B., ( 1984 )和 "Methods in Enzymology"Vol.l-317 , Academic Press ; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications" ， Academic Press, SanDiego， CA( 1990 ); Marshak等.,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996);此處所有這些引入作為參考就如完全闡述一樣。其他的一 般參考文獻貫穿該說明書而提供。為了方便閱讀而提供其中被認為是 本領(lǐng)域熟知的方法。其中包含的全部信息此處引入作為參考。
^^脊合唐-金虞復(fù)合^合^ 癡傳茇合參 螯合劑以不同特異性和親和力結(jié)合金屬的能力在文獻中得到很好 的描述。為了產(chǎn)生本發(fā)明的非共價多配體復(fù)合物，修飾接頭(具有所 需長度)結(jié)合特定的配體和螯合劑以產(chǎn)生下列配體--接頭--螯合劑的 通用結(jié)構(gòu)。
隨后，通過添加合適的金屬，將形成非共價多配體復(fù)合物。(圖 12)。
例如，合成異鞋肟酸(其為已知的鐵螯合劑)衍生物(圖13a )以 使在FeS+離子存在時形成非共價多配體復(fù)合物(圖13b)。圖14顯示 用于使用常見配體修飾典型的螯合劑的常規(guī)合成途徑。上述合成可與 上文Margherita等.，1999所述的類似。
螯合劑的用于制備非共價多配體復(fù)合物的用途可具有一個另外的 優(yōu)點，該優(yōu)點來自 一 些螯合劑以不同的化學(xué)計量結(jié)合不同金屬的能 力，如在1， 10-菲咯啉2-Cu2+或[1， 10-菲咯啉l3-Ru3+[Onfelt等"(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 5708-5713的情況下。該現(xiàn)象可用于利用相同的配體一接頭--螯合劑衍生物來形成雙 (圖lh)和三(圖15b)非共價多配體復(fù)合物。
冉^ ,鬯f-凝鬯f《合參合4舉^斧,應(yīng)謬^合參 電子受體很容易和"兀過度的"雜環(huán)吲哚環(huán)體系形成分子復(fù)合物。 p引哚苦味酸是約130年前描述的該類型的第一個復(fù)合物[Baeyer，和 Caro, ( 1877) Ber.l0: 1262并且數(shù)年后使用相同的電子受體從茉莉 花油分離出了吲哚?？辔端岽撕蟪３１挥糜诜蛛x和鑒定來自反應(yīng)混合 物的吲哚復(fù)合物。后來，引入1， 3， 5-三硝基苯作為絡(luò)合劑并且常用 于相同的目的[Merchant和Salagar， ( 1963 ) Current Sci. 32: 18。 已經(jīng)用電子受體例如收斂酸[Marion， L"和Oldfield， C.W" (1947) Cdn. J. Res. 25B 1、間三硝苯基卣化物[Triebs， W" (1961 )Chem. Ber. 94: 2142、2， 4， 5， 7-四硝基誦9-藥酮Hutzinger， O.，和Jamieson， W.D.， Anal. Biochem. (1970) 35， 351-358,以及用l陽氟代畫2， 4-二硝 基苯和l-氯代-2,4-二硝基苯Elguero等"(1967 )Anals Real Soc. Espan. Fis. Quim.( Madrid )ser. B 63， 905( 1%7 ); Wilshire， J.F.K" Australian J.Chem. 19， 1935 (1966)制備了吲哚的其他固體復(fù)合物。
圖16a，舉例說明了配體——接頭——缺電子(缺E.)衍生物的一個 實例，而圖16b，呈現(xiàn)了可使用的富電子共價三聚物的一個實例?？深A(yù) 料的是，通過將三硝基苯(圖16a)和吲哚(圖16b)衍生物混合將形 成多配體復(fù)合物(圖16c )?？梢岳斫獾氖且部梢院铣煞聪驈?fù)合物，即，
含有富電子部分的配體衍生物和缺電子的共價三聚物。
圖17顯示了用于上述配體衍生物制備的可能的合成途徑。 包含Trp殘基(或任何其他富電子或缺電子部分)的合成肽(或 任何多肽)也可用于非共價多配體復(fù)合物的制備。圖18顯示了可形成 具有四個Trp殘基(四個富電子部分)合成肽的一個實例， 一個具有 用缺電子體(三硝基苯)修飾的配體衍生物的四-非共價配體。
可組合上述實施例1和2中所述的兩種復(fù)合能力以形成非共價多 配體復(fù)合物。這種非共價多配體復(fù)合物的通用結(jié)構(gòu)的一個實例在圖19中顯示。
為此，需要與缺電子部分共價結(jié)合的螯合劑。用于生成這種組合
的合成途徑在圖20中呈現(xiàn)。
例如，能結(jié)合1V^+和M"金屬的螯合劑(例如，兒茶酚)在M2+ 和M"金屬存在時能形成非共價-二配體(圖21a)或者非共價-三配體 (圖21b)。
具有Trp殘基(或任何其他富電子殘基)的肽(或多肽)的存在 可能會引起圖22a-b中所示結(jié)構(gòu)的形成。
上述兩種結(jié)合關(guān)系的組合(螯合劑-金屬和富電子-缺電子)可以帶 來另外的優(yōu)點。例如，形成非共價多配體聚合復(fù)合物的能力。這可通 過將兩個螯合劑和一個處于其間的富電子部分合成而實現(xiàn)(圖23a)。 在配體--缺電子衍生物存在時預(yù)期將形成圖23b中所繪的復(fù)合物，其 代表一種配體的非共價聚合物。
一旦形成二聚物、三聚物、四聚物等(通過例如配體--螯合劑衍 生物)，將會希望限制上述運動的自由度以便實現(xiàn)高度的有序排列。 如果目的蛋白質(zhì)具有富電子部分(例如Trp)，該富電子部分能接近共 價的二-缺電子部分(如例如二-三硝基苯、TNB—TNB)，則可在兩個 非共價二聚物之間形成復(fù)合物(圖24)。這將導(dǎo)致蛋白質(zhì)和多配體的 有序片層的形成。
可以理解的是也可將本發(fā)明的為了解釋而在上下文的各個實施方 案中描述的某些特征組合用于單個實施方案中。反之，本發(fā)明的為了 簡便起見而在上下文的單個實施方案中所述的不同特征也可單獨或以 任何合適的亞組合形式提供。
雖然聯(lián)系本發(fā)明的具體的實施方案對本發(fā)明進行了描述，但顯然 許多替換、改進和改變對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，其 目的是包括所有這樣的替換、改進和改變，其落入附加的權(quán)利要求的 精神和較寬的范圍內(nèi)。說明書提及的所有出版物、專利和專利申請此 處整體引入說明書作為參考，就如每個單獨的出版物、專利或?qū)＠?請此處具體和單獨地引入作為參考一樣。此外，該申請中任何參考文
明的現(xiàn)有技術(shù).
權(quán)利要求
1. 一種包括至少一種能結(jié)合靶分子或目的細胞的配體的物質(zhì)組合物，當與配位體離子或分子共-孵育時，所選的附著于至少一種配位部分的所述至少一種配體能指引該物質(zhì)組合物形成非-共價復(fù)合物。
2. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述的復(fù)合物是聚合復(fù)合物。
3. 權(quán)利要求l的組合物，進一步包括所述的配位體離子或分子。
4. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述的目的靶分子選自蛋白質(zhì)、核 酸序列、小分子化學(xué)試劑和離子。
5. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述的目的靶細胞選自真核細胞、 原核細胞和病毒細胞。
6. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述的至少一種配體選自生長因子、 激素、核酸序列、抗體、抗原表位標記、親和素、生物素、酶的底物 和酵。
7. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述的至少一種配體經(jīng)接頭附著于 所述的至少一種配位部分。
8. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述的配位部分選自螯合劑、生物 素、核酸序列、抗原表位標記、缺電子分子和富電子分子。
9. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述的配位體離子或分子選自金屬 離子、親和素、核酸序列、缺電子分子和富電子分子。
10. —種純化乾分子或目的細胞的方法，該方法包括(a) 將包含靶分子或目的細胞的樣品和一種組合物接觸，該組 合物包括(i) 至少一種能結(jié)合靶分子或目的細胞的配體，所述至少一種 配體附著于至少一種配位部分，和(ii) 能非-共價結(jié)合所述的至少一種配位部分的配位體，當共-孵育時所述至少一種配位部分和所述配位體能形成復(fù)合物；和(b) 收集包含結(jié)合至靶分子或目的細胞的所述復(fù)合物的沉淀，由 此純化靶分子或目的細胞。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中目的分子選自蛋白質(zhì)、核酸序列、 小分子化學(xué)試劑和離子。
12. 權(quán)利要求10的方法，其中目的靶細胞選自真核細胞、原核細 胞和病毒細胞。
13. 權(quán)利要求10的方法，其中所述的至少一種配體選自生長因子、 激素、核酸序列、抗體、抗原表位標記、親和素、生物素、酶的底物 和酵。
14. 權(quán)利要求10的方法，其中所述的至少一種配體經(jīng)接頭附著于 所述的至少一種配位部分。
15. 權(quán)利要求10的方法，其中所述的配位部分選自螯合劑、生物 素、核酸序列、抗原表位標記、缺電子分子和富電子分子。
16. 權(quán)利要求10的方法，其中所述的配位體離子或分子選自金屬離子、親和素、核酸序列、缺電子分子和富電子分子。
17. 權(quán)利要求10的方法，進一步包括從所述沉淀回收目的分子。
18. —種檢測受試者中與目的分子相關(guān)的疾病的易感性或存在的 方法，該方法包括將獲自受試者的生物樣品和一種組合物接觸，該組 合物包括(i) 至少一種能結(jié)合目的分子的配體，所述的至少一種配體附 著于至少一種配位部分；和(ii) 能非-共價結(jié)合所述的至少一種配位部分的配位體，當共-孵 育時所述的至少一種配位部分和所述的配位體能形成復(fù)合物，其中包 含目的分子的復(fù)合物的形成指示患者中與目的分子相關(guān)的疾病的易感 性或存在。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中目的分子選自蛋白質(zhì)、核酸序列、 小分子化學(xué)試劑和離子。
20. 權(quán)利要求18的方法，其中所述的至少一種配體選自生長因子、 激素、核酸序列、抗體、抗原表位標記、親和素、生物素、酶的底物 和酵。
21. 權(quán)利要求18的方法，其中所述的至少一種配體經(jīng)接頭附著于 所述的至少一種配位部分。
22. 權(quán)利要求18的方法，其中所述的配位部分選自螯合劑、生物 素、核酸序列、抗原表位標記、缺電子分子和富電子分子。
23. 權(quán)利要求18的方法，其中所述的配位體離子或分子選自金屬 離子、親和素、核酸序列、缺電子分子和富電子分子。
24. —種用于結(jié)晶目的分子的組合物，該組合物包括(i) 至少一種能結(jié)合目的分子的配體，所述至少一種配體附著于至少一種配位部分；和(ii)能非-共價結(jié)合所述的至少一種配位部分的配位體，其中當 共-孵育時所述至少一種配位部分和配位體能形成復(fù)合物，因此選擇組 合物以使當目的分子結(jié)合至該配位體時能確定所述目的分子的相對空 間位置和方向，由此在誘導(dǎo)結(jié)晶的條件下促進其中晶體的生成。
25. 權(quán)利要求24的組合物，其中目的分子選自蛋白質(zhì)、核酸序列、 小分子化學(xué)試劑和離子。
26. 權(quán)利要求24的組合物，其中所述的至少一種配體選自生長因 子、激素、核酸序列、抗體、抗原表位標記、親和素、生物素、酶的 底物和酶。
27. 權(quán)利要求24的組合物，其中所述的至少一種配體經(jīng)接頭附著 于所述的至少 一種配位體。
28. 權(quán)利要求24的組合物，其中所述的配位部分選自螯合劑、生 物素、核酸序列、抗原表位標記、缺電子分子和富電子分子。
29. 權(quán)利要求24的組合物，其中所述的配位體離子或分子選自金 屬離子、親和素、核酸序列、缺電子分子和富電子分子。
30. —種使目的分子結(jié)晶的方法，該方法包括將包含目的分子的 樣品和結(jié)晶組合物接觸，該結(jié)晶組合物包括(i) 至少一種能結(jié)合目的分子的配體，所述至少一種配體附著 于至少一種配位部分；和(ii) 能非-共價結(jié)合所述至少一種配位部分的配位體，當共-孵育 時所述至少一種配位部分和配位體能形成復(fù)合物，因此選擇結(jié)晶組合 物以使當目的分子結(jié)合至該配位體時能確定所述目的分子的相對空間 位置和方向，由此在誘導(dǎo)結(jié)晶的條件下促進其中晶體的生成。
31. 權(quán)利要求30的方法，其中目的分子選自蛋白質(zhì)、核酸序列、 小分子化學(xué)試劑。
32. 權(quán)利要求30的方法，其中所述的至少一種配體選自生長因子、 激素、核酸序列、抗體、抗原表位標記、親和素、生物素、酶的底物 和酵。
33. 權(quán)利要求30的方法，其中所述的至少一種配體經(jīng)接頭附著于 所述的至少一種配位部分。
34. 權(quán)利要求30的方法，其中所述的配位部分選自螯合劑、生物素、核酸序列、抗原表位標記、缺電子分子和富電子分子。
35. 權(quán)利要求30的方法，其中所述的配位體離子或分子選自金屬、 親和素、核酸序列、缺電子分子和富電子分子。
36. —種包含一種分子的物質(zhì)組合物，所述分子具有能結(jié)合目的 分子的第一區(qū)域和能結(jié)合配位體離子或分子的第二區(qū)域，所述的第二 區(qū)域被設(shè)計成使得當該分子暴露于所述配位體離子或分子時形成聚合 物。
37. 權(quán)利要求36的組合物，其中所述的第二區(qū)域能結(jié)合超過兩個 配位體離子或分子。
38. 權(quán)利要求36的組合物，其中所述的配位體離子或分子的結(jié)合是非共價的結(jié)合。
39. —種除盡來自樣品的靶分子或目的細胞的方法，該方法包括(a) 將包含靶分子或目的細胞的樣品和一種組合物接觸，該組 合物包括(i) 至少一種能結(jié)合目的分子的配體，所述至少一種配體附著 于至少一種配位部分；和(ii) 能非-共價結(jié)合所述至少一種配位部分的配位體，當共-孵 育時所述至少一種配位部分和配位體能形成復(fù)合物；和(b) 除去包含結(jié)合至靶分子或目的細胞的復(fù)合物的沉淀，由此除 盡來自樣品的靶分子或目的細胞。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中目的分子選自蛋白質(zhì)、核酸序列、 小分子化學(xué)試劑和離子。
41. 權(quán)利要求39的方法，其中目的靶細胞選自真核細胞、原核細 胞和病毒細胞。
42. 權(quán)利要求39的方法，其中所述的至少一種配體選自生長因子、 激素、核酸序列、抗體、抗原表位標記、親和素、生物素、酶的底物 和酵。
43. 權(quán)利要求39的方法，其中所述的至少一種配體經(jīng)接頭附著于 所述的至少一種配位部分。
44. 權(quán)利要求39的方法，其中所述的配位部分選自螯合劑、生物 素、核酸序列、抗原表位標記、缺電子分子和富電子分子。
45. 權(quán)利要求39的方法，其中所述的配位體離子或分子選自金屬、 親和素、核酸序列、缺電子分子和富電子分子。
46. —種增強目的靶分子的免疫原性的方法，該方法包括將目的 靶分子和一種組合物接觸，該組合物包括(i) 至少一種能結(jié)合靶分子或目的細胞的配體，所述的至少一 種配體附著于至少一種配位部分；和(ii) 能非-共價結(jié)合所述至少一種配位部分的配位體， 其中進行接觸使得所述至少一種配位部分和配位體能形成包含目的靶分子的復(fù)合物，由此增強目的靶分子的免疫原性。
47. 權(quán)利要求46的方法，其中目的分子選自蛋白質(zhì)、核酸序列、 小分子化學(xué)試劑和離子。
48. 權(quán)利要求46的方法，其中所述的至少一種配體選自生長因子、 激素、核酸序列、抗體、抗原表位標記、親和素、生物素、酶的底物 和酶。
49. 權(quán)利要求46的方法，其中所述的至少一種配體經(jīng)接頭附著于 所述的至少一種配位部分。
50. 權(quán)利要求46的方法，其中所述的配位部分選自螯合劑、生物 素、核酸序列、抗原表位標記、缺電子分子和富電子分子。
51. 權(quán)利要求46的方法，其中所述的配位體離子或分子選自金屬 離子、親和素、核酸序列、缺電子分子和富電子分子。
全文摘要
提供一種物質(zhì)組合物。該組合物包括至少一種能結(jié)合靶分子或目的細胞的配體，當與配位體離子或分子共-孵育時，所選的附著于至少一種配位部分的該至少一種配體能指引該物質(zhì)組合物形成非-共價復(fù)合物。還提供了使用該組合物進行靶物質(zhì)純化、結(jié)晶和免疫的方法。
文檔編號C12NGK101415721SQ200480026353
公開日2009年4月22日 申請日期2004年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月24日
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