專利名稱：生物分子快速結(jié)晶的方法和設備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及促進生物分子從生物分子溶液中快速形成生物分子結(jié)晶的方法及設備，所述生物分子優(yōu)選是蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)溶液在電場中根據(jù)其等電點經(jīng)歷快速濃縮。根據(jù)本發(fā)明所述方法的蛋白質(zhì)的結(jié)晶在幾小時或更短時間內(nèi)發(fā)生。
背景技術：
蛋白質(zhì)結(jié)晶具有3種主要應用(1)結(jié)構(gòu)生物學和藥物設計、(2)生物分離、和(3)純化。在最適宜的條件下，晶體的形成是一個緩慢和冗長的過程，代表性的是基于晶核形成之后制備一種飽和蛋白溶液。蛋白質(zhì)結(jié)晶的最適條件包括在飽和溶液里的最佳的蛋白質(zhì)濃度、pH和溫度等，其中這些條件是由大量的嘗試與誤差試驗確定的。
常規(guī)的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法和確定促進蛋白質(zhì)結(jié)晶的條件的方法公開于美國專利US6,596,077、US6,593,116、US6,579,358、US6,500,933、US6,409,832、US6,268,158、US5,976,325、US5,728,559、US5,271,795、US5,104,478、US4,737,232和US4,330,363等。
本領域中已知的是生物分子尤其是蛋白質(zhì)在諸如硅水凝膠(Silicahydrogel)、瓊脂糖和聚丙烯酰胺的凝膠中的結(jié)晶(例如，CrystalExTM，Hampton Research Corp.)。與從液體溶液中成長(growth)相比，這種方法被認為是有好處的，因為它避免了考慮浮力、對流和沉降。這種方法還通過凝膠的粘度調(diào)節(jié)分子擴散，并因此在許多方面摹擬了在微重力環(huán)境如太空中的晶體成長的有利特性。這種方法的另一個優(yōu)點是，晶體在環(huán)境溫度下保持包被于凝膠中，并且結(jié)晶構(gòu)造甚至能直接用于X-射線衍射。這種方法主要包括在聚合作用之前或在聚合作用之后，把濃度為10-20mg/ml的一種蛋白質(zhì)溶液加到凝膠中，然后在一種控制的溫度下保存在膠中幾天至幾周，直到發(fā)生蛋白質(zhì)結(jié)晶。已經(jīng)有人表示，使用這種方法能夠得到合適的晶體(Sauter等人，ProteinsStructure，F(xiàn)unction and Genetics48146-150，2002)，然而，很少采用這種方法進行蛋白質(zhì)結(jié)晶成長，并且這種方法與本領域中已知的其它方法一樣緩慢。
等電聚焦(IEF)技術廣泛用于蛋白質(zhì)分離和純化，基于它們隨著pH而改變的特有的凈電荷。蛋白質(zhì)置于一個pH梯度中的一種電場下，其中每種蛋白質(zhì)向梯度內(nèi)的一個點移動，在這個點其靜電荷為零，這個點稱為“等電點”或‘pI”。
用于蛋白質(zhì)分離和純化的IEF技術描述于本發(fā)明發(fā)明人的專利WO03/008977、和美國專利US6,537,432、US5,480,562、US5,464,517、US5,451,662、US5,082,548、US4,971,670、US4,495,279、和US4,243,507等。
人們有一種未滿足的需要，為了克服在晶體成長中遇到的障礙，并提能夠發(fā)生結(jié)晶尤其是蛋白質(zhì)結(jié)晶的更快速和消耗較少的方法。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及生物分子快速結(jié)晶的方法和設備，典型地在不超過幾小時以內(nèi)，使用等電聚焦以得到生物分子的濃縮溶液、然后是所述生物分子的快速結(jié)晶。
本發(fā)明部分地基于意外地發(fā)現(xiàn)，使用任何IEF方法濃縮一種稀的蛋白質(zhì)溶液，產(chǎn)生促進溶液中蛋白質(zhì)快速結(jié)晶的一種蛋白質(zhì)溶液。
根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供一種用于快速結(jié)晶生物分子的方法，包括(a)提供至少一生物分子種類；(b)提供至少一個結(jié)晶反應器，其包括具有一個pH范圍的一種IEF緩沖液，此pH范圍包含至少一類生物分子的pI。
(c)把所述至少一生物分子種類與所述至少一個結(jié)晶反應器接觸；(d)向所述至少一個結(jié)晶反應器引入電場，從而產(chǎn)生所述至少一生物分子種類的一種濃縮溶液；以及(e)在所述至少一個結(jié)晶反應器中得到至少一種晶體。
根據(jù)另一個實施方案，步驟(c)還包括將至少一個結(jié)晶反應器和至少一生物分子種類放置在電泳緩沖液中。優(yōu)選地，步驟(c)還包括攪拌電泳緩沖液。有利地，步驟(e)還包括監(jiān)控生物分子晶體的形成。
根據(jù)又另一個實施方案，結(jié)晶在24小時內(nèi)發(fā)生，優(yōu)選地發(fā)生在少于12小時內(nèi)。
根據(jù)一個可供選擇的實施方案，所述至少一生物分子種類在一種介質(zhì)中，這種介質(zhì)選自由溶液、凝膠和懸浮液組成的組。
根據(jù)另一個可供選擇的實施方案，所述至少一生物分子種類是固定到一種固體基質(zhì)上的。
本文使用的術語“結(jié)晶反應器”或“反應器”是指預設定體積、密度和粘度的任何介質(zhì)，其包括具有一個pH范圍的一種IEF緩沖液。根據(jù)一些實施方案，IEF緩沖液還包括至少一種聚合物，其中所得到的結(jié)晶反應器具有一種預設定的多孔度。設計結(jié)晶反應器的密度、粘度、孔徑大小(當IEF緩沖液包括一種聚合物的情況)和體積，以使期望的生物分子可以進入反應器，并且還可以在其中擴散。結(jié)晶反應器的體積依賴于使用的期望的生物分子的量。在所述結(jié)晶反應器的體積中發(fā)生結(jié)晶。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)晶反應器在電場作用下是功能上穩(wěn)定的。
本文使用的“IEF緩沖液”是以它最寬泛的含義以表示一種含有成分的緩沖液，這些成分在下文中也稱為緩沖劑，其在所給pH值范圍內(nèi)具有緩沖能力?？商鎿Q地，緩沖液可以包括能夠組織以形成pH梯度的成分，所述成分包括但不限于，兩性電解質(zhì)、安福靈(ampholine)、丙烯酰胺衍生物或緩沖劑的組合。根據(jù)本發(fā)明的IEF緩沖液典型地是結(jié)晶反應器的一成分，其形式可為粘液、漿或凝膠。根據(jù)本發(fā)明，一種生物分子能夠穿過IEF緩沖液，除非所述生物分子的pI落在IEF緩沖液的pH范圍內(nèi)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的IEF緩沖液在電場作用下功能是穩(wěn)定的。
根據(jù)又另一個實施方案，至少一生物分子種類選自包括化學個體的蛋白質(zhì)復合物、肽、蛋白質(zhì)、多肽、酶、抗體、蛋白質(zhì)-DNA復合物、多核苷酸、DNA、RNA、抗原、抗原決定部位及其變體、激素、碳水化合物、類脂、磷脂和生物素標記探針所組成的組。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，生物分子是蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，生物分子選自蛋白質(zhì)、肽或多肽。
根據(jù)又另一個實施方案，至少一個結(jié)晶反應器設在毛細管內(nèi)。根據(jù)又另一個實施方案，至少一個結(jié)晶反應器是連接、結(jié)合或基本上鄰接到一種固體基質(zhì)。
根據(jù)又另一個實施方案，至少一個結(jié)晶反應器包括一種聚合物，這種聚合物包括的一種或多種基質(zhì)選自線型聚合物、支化聚合物、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、水凝膠、纖維素、改性纖維素、交聯(lián)聚乙烯醇、交聯(lián)聚氧化乙烯和乙二醇聚合物組成的組。根據(jù)又另一個實施方案，用在步驟(b)的基質(zhì)包括一種聚合物。
根據(jù)又另一個實施方案，至少一個結(jié)晶反應器還包括一種聚合物，這種聚合物包括至少一種基質(zhì)，此基質(zhì)選自支化聚合物、線型聚合物、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、水凝膠、乙二醇聚合物、纖維素、改性纖維素、交聯(lián)聚乙烯醇、交聯(lián)聚氧化乙烯和乙二醇聚合物組成的組。
根據(jù)又另一個實施方案，IEF緩沖液具有不超過0.2pH單位的狹窄pH范圍，優(yōu)選地不超過0.1pH單位，更優(yōu)選地不超過0.02pH單位。
根據(jù)又另一個實施方案，電泳溶液的溫度保持在0-30℃的范圍內(nèi)。
根據(jù)又另一個實施方案，電泳溶液的溫度保持在0-30℃的范圍內(nèi)，并且電場強度保持在50V/cm至2000V/cm之間。
根據(jù)又另一個實施方案，步驟(d)在能夠提供電場的裝置的存在下進行，電場以DC或AC提供。
根據(jù)某一實施方案，設備包括一陰極電極、一陽極電極和一電壓電源。根據(jù)一個實施方案，電極放在結(jié)晶反應器的相對的面上，以使電場能夠穿過或者進入反應器。根據(jù)另一個實施方案，電極是導線。根據(jù)另一個實施方案，電極是平行放置的導線或者薄板。根據(jù)另一個實施方案，電極是由一種材料制成或涂有一種材料，這種材料選自鉑、鈦、鉻、金、鉭、鈀、氧化鈀、鍺、鎳和銠或包含它們的合金組成的組。優(yōu)選地，電極由鈀、鉑、鈦、碳或包含它們的合金制成或涂覆。
裝置行使功能把生物分子引向結(jié)晶反應器。這樣，根據(jù)又另一個實施方案，電場選自一種交流電場或者一種直流電場。如果結(jié)晶反應器包括在一種閉合系統(tǒng)中(如，電場不能穿過反應器的一側(cè)并穿出反應器的相對側(cè))，那么有利的是，裝置能夠把電場引進并引出包含緩沖液的結(jié)晶反應器(即，一種交流電場)。
根據(jù)另一個實施方案，至少一個結(jié)晶反應器能夠具有任何期望的形狀和幾何形態(tài)。
根據(jù)又另一個實施方案，至少一個結(jié)晶反應器具有圓柱的形狀。根據(jù)一些實施方案，所述至少一個結(jié)晶反應器的直徑是從大約20μm至大約10mm。根據(jù)另一些實施方案，所述至少一個結(jié)晶反應器的長度是從大約0.5mm至大約10mm。
根據(jù)各種實施方案，本發(fā)明所述方法的步驟(a)包括提供多個結(jié)晶反應器，每個結(jié)晶反應器包括一種IEF緩沖液，多個結(jié)晶反應器中的IEF緩沖液是彼此類似或彼此不同的。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，結(jié)晶反應器是互相隔離的。根據(jù)某一實施方案，步驟(e)包括在每個結(jié)晶反應器中得到至少一晶體。根據(jù)一個可供選擇的實施方案，步驟(e)包括在多個結(jié)晶反應器中得到多個(種)晶體。
根據(jù)一個實施方案，每種IEF緩沖液具有不超過0.2pH單位的狹窄pH范圍，優(yōu)選地不超過0.1pH單位，更優(yōu)選地不超過0.02pH單位。根據(jù)另一個實施方案，多個結(jié)晶反應器的pH范圍不重疊?？蛇x擇地，多個結(jié)晶反應器的pH范圍部分地重疊。本文使用的術語“部分地重疊”解釋為它最常規(guī)的含義，并且是指例如多個pH范圍，其中一個pH范圍的上限與至少一個其它pH范圍的下限重疊。可替換地，這個術語可以是指多個pH范圍，其中一個pH范圍比至少一個其它pH范圍寬，這樣較寬的pH范圍完全地包含所述的一個其它pH范圍。
根據(jù)又另一個實施方案，一種或多種IEF緩沖液之間的pH差不超過0.1pH單位，優(yōu)選地不超過0.02pH單位。術語“pH差”是指具有不同或部分不同pH范圍的兩種不同IEF緩沖液之間pH值的增量差。pH差可以指一個pH范圍的上限與另一個pH范圍的下限之間的差值?？商鎿Q地，pH差可以指一個pH范圍的pH中值與另一個pH范圍的pH中值之間的差值。
根據(jù)又另一個實施方案，多個結(jié)晶反應器是連接、結(jié)合或基本上鄰接到一種基質(zhì)。根據(jù)一個可供選擇的實施方案，結(jié)晶反應器以一種空間上可尋址的方式連接、結(jié)合或基本上鄰接到一種基質(zhì)。根據(jù)又另一個實施方案，基質(zhì)是生物分子不可滲透的。根據(jù)又另一個實施方案，基質(zhì)是離子不可滲透的。
根據(jù)又另一個實施方案，包括多個結(jié)晶反應器的基質(zhì)可以是這樣一種設置，這種設置選自固定化的pH梯度、pH膜和預制凝膠組成的組。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種方法，用于分類一種包括多種生物分子的溶液，并把選自其中的至少一生物分子種類快速結(jié)晶，此方法包括(a)提供包括多種生物分子的介質(zhì)；(b)將多種生物分子在基質(zhì)上分類，從而基質(zhì)上得到包括至少一生物分子種類的至少一個位點；(c)從所述基質(zhì)回收一部分，此部分包括至少一個位點；(d)提供至少一個結(jié)晶反應器，此結(jié)晶反應器包括具有一個pH范圍的一種IEF緩沖液，所述pH范圍包含至少一生物分子種類的pI；(e)把(c)中的所述部分與至少一個結(jié)晶反應器接觸；(f)將一電場引入所述至少一個結(jié)晶反應器，從而在所述至少一個結(jié)晶反應器內(nèi)產(chǎn)生所述至少一生物分子種類的一種濃縮溶液；并且(g)在所述至少一個結(jié)晶反應器中得到至少一生物分子晶體。
根據(jù)一個可供選擇的實施方案，步驟(b)包括將多種生物分子在基質(zhì)上分類，從而在基質(zhì)上得到至少一個位點，該位點包括一生物分子種類。
根據(jù)一個實施方案，步驟(b)中的分類是由集合至少一種生物分子實施的。根據(jù)另一個實施方案，步驟(b)是由選自以下組成的組的一種方法實現(xiàn)的等電聚焦、薄層色譜法(TLC)、包括高效液相色譜(HPLC)技術、和凝膠電泳。優(yōu)選地，這些方法的任何之一都在非變性條件下進行。
根據(jù)又另一個實施方案，其中步驟(e)還包括將所述部分和所述至少一個結(jié)晶反應器放置在電泳緩沖液中。優(yōu)選地，步驟(e)還包括攪拌電泳緩沖液。有利地是，步驟(g)還包括監(jiān)控和/或檢測生物分子晶體的形成。
根據(jù)又另一個實施方案，在24小時內(nèi)得到晶體，優(yōu)選地在12小時內(nèi)。
根據(jù)又另一個實施方案，步驟(d)的IEF緩沖液具有不超過0.2pH單位的一個pH范圍，優(yōu)選地不超過0.1pH單位，更優(yōu)選地不超過0.02pH單位。
根據(jù)又另一個實施方案，電泳溶液的溫度保持在0-30℃的范圍內(nèi)。根據(jù)又另一個實施方案，電泳溶液的溫度保持在0-30℃的范圍內(nèi)，并且電場強度保持在50V/cm至2000V/cm之間。根據(jù)又另一個實施方案，電場以DC或AC提供。
根據(jù)又另一個實施方案，步驟(b)中使用的基質(zhì)是一種凝膠。根據(jù)一個可供選擇的實施方案，步驟(b)中使用的基質(zhì)包括一種聚合物，此聚合物選自聚丙烯酰胺、瓊脂糖、水凝膠、纖維素、硝化纖維素、改性纖維素、交聯(lián)聚乙烯醇、交聯(lián)聚氧化乙烯和乙二醇聚合物組成的組。根據(jù)又另一個實施方案，用在步驟(b)的基質(zhì)包括一種聚合物，其中步驟(f)包括引入一電場到所述至少一個結(jié)晶反應器，從而在所述至少一個結(jié)晶反應器內(nèi)產(chǎn)生所述至少一生物分子種類的一濃縮帶；根據(jù)又另一個實施方案，本發(fā)明的方法是自動化的并且適合生物分子的高-產(chǎn)量結(jié)晶，生物分子優(yōu)選是蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的方法優(yōu)于本領域中已知的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法在于，它促進快速蛋白質(zhì)結(jié)晶，典型地在少于1小時之內(nèi)。此外，本發(fā)明的方法能夠得到大的晶體，并因此適于需要足夠大的晶體的應用，例如，收集高質(zhì)量的X-射線衍射數(shù)據(jù)。
根據(jù)本發(fā)明方法的快速結(jié)晶可以使用本領域中已知的許多IEF系統(tǒng)得到，諸如，固定化的pH梯度(IPG)膠條、pH膜和具有期望的pH范圍的兩性電解質(zhì)在凝膠中的任何組合物，附帶條件是這種IEF系統(tǒng)滿足，或被改進以滿足，本發(fā)明的原理。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的一種IEF系統(tǒng)包括多個不同的實體，術語也稱為結(jié)晶反應器，每個結(jié)晶反應器具有一種IEF緩沖液，其有一個pH范圍?？蛇x擇地，結(jié)晶反應器互相隔離，這樣建立起多個隔離pH范圍的一個系統(tǒng)，可選擇地pH范圍是具有狹窄的pH范圍。多個隔離的結(jié)晶反應器覆蓋的pH范圍可以重疊或可以不重疊。
本發(fā)明方法的另一個特殊優(yōu)點是，由于本發(fā)明的方法包括的等電聚焦法是針對從雜質(zhì)分離和溶解蛋白質(zhì)，所以蛋白質(zhì)晶體可以從不是高度純化的蛋白質(zhì)的溶液中得到。
根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供一種適合用于引導生物分子晶體快速形成的設備，生物分子優(yōu)選是蛋白質(zhì)，該設備包括(a)緩沖室，其具有一個上側(cè)面和一個下側(cè)面，下側(cè)面用一個底密封，以使緩沖室圍繞了能夠存儲流體的至少一個緩沖間；(b)至少一個結(jié)晶反應器，此至少一個結(jié)晶反應器包括一種IEF緩沖液，此至少一個結(jié)晶反應器被容納在緩沖室中；(c)一產(chǎn)生電場的裝置；以及可選擇地，(d)用于循環(huán)緩沖間里容納的流體的裝置。
根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明的設備還包括一個具有一個上側(cè)面和一個下側(cè)面的固定器，固定器包括至少一個結(jié)晶反應器，或適合支撐包括至少一個結(jié)晶反應器的基質(zhì)，所述至少一個結(jié)晶反應器包括一種IEF緩沖液，固定器被容納在緩沖室內(nèi)。根據(jù)另一個實施方案，固定器置于至少一個緩沖間內(nèi)。根據(jù)某一實施方案，固定器是包括至少一個結(jié)晶反應器的毛細管。
根據(jù)一個可供選擇的實施方案，本發(fā)明的設備還包括具有兩個末端的兩個鹽橋，每個鹽橋的一端與固定器的一端接觸，每個鹽橋的一端被容納在所述至少一個緩沖室內(nèi)。優(yōu)選地，本發(fā)明的設備包括兩個緩沖室，這樣每個緩沖室圍繞一個鹽橋的一端。
根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的設備還包括一個溫度控制模塊，其能夠控制所述至少一個反應器的溫度。
根據(jù)一個可供選擇的實施方案，固定器包括至少一個腔，此至少一個腔含有包括一種IEF緩沖液的一個結(jié)晶反應器。
根據(jù)又另一個實施方案，固定器具有多個腔，這樣每個腔都適于含有一個結(jié)晶反應器。根據(jù)一些實施方案，一個結(jié)晶反應器的溫度是與另一個結(jié)晶反應器的溫度是不同的。
根據(jù)又另一個實施方案，固定器包括一種材料，該材料的電阻比結(jié)晶反應器所含的聚合物的電阻大。
根據(jù)又另一個實施方案，固定器包括一種非導體材料。這種非導體材料可以選自聚-N-甲基甲基丙烯酰胺、丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、陶瓷、玻璃和聚-甲基丙烯酸甲酯組成的組。
根據(jù)又另一個實施方案，固定器包括一種對生物分子不可滲透的材料，以避免蛋白質(zhì)從一個腔中的結(jié)晶反應器擴散到另一個腔中的結(jié)晶反應器。
根據(jù)又另一個實施方案，所述至少一個結(jié)晶反應器還包括一種聚合物，這種聚合物包括至少一種基質(zhì)，此基質(zhì)選自線型聚合物、支化聚合物、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、水凝膠、乙二醇聚合物、纖維素、改性纖維素、交聯(lián)聚乙烯醇、交聯(lián)聚氧化乙烯和乙二醇聚合物組成的組。
根據(jù)又另一個實施方案，緩沖室包括一種非導體的材料。
根據(jù)又另一個實施方案，本發(fā)明的設備適于在顯微鏡下監(jiān)控在至少一個結(jié)晶反應器中晶體的形成。
根據(jù)另一個實施方案，緩沖間適于存儲包括電泳緩沖液和至少一種溶解在電泳緩沖液里的生物分子的溶液。
根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明提供用于高產(chǎn)量快速大分子結(jié)晶的小型化和自動化的設備和方法。本發(fā)明的設備可以構(gòu)造為具有自動化的互相作用組件，例如，用于填充腔的滴定器，所述腔具有包括IEF緩沖液(固定化電解質(zhì)、兩性電解質(zhì)等)的預-聚合的結(jié)晶反應器，用于從腔或結(jié)晶反應器回收蛋白晶體的提取器，及用于監(jiān)控和記錄結(jié)晶反應器中蛋白晶體形成的裝置。
本發(fā)明的以上所述和其它目標、特征和優(yōu)點將從以下詳細描述和附帶的權(quán)利要求中更清楚地看到。


圖1是各種(A-C)結(jié)晶系統(tǒng)的示意圖，此結(jié)晶系統(tǒng)包括圍繞在緩沖室(2)中的一個緩沖間(1)、一個固定器(3)、電極(6)、一個鹽橋(10)和一個固體支撐(7)、包括一個或多個結(jié)晶反應器(5)的一個毛細管(8)或一個帶(14)以及可選的一個裝載點(9)。
圖2是一種結(jié)晶設備的示意圖，此結(jié)晶設備包括圍繞在緩沖室(2)中的一個緩沖間(1)、一個固定器(3)、包括結(jié)晶反應器(5)的多個腔(4)和電極(6)。
圖3(A)是表示蛋白質(zhì)從包含在固定器(3)的結(jié)晶反應器(5)內(nèi)的蛋白帶(12)移動的圖示，(B)是表示包括3個結(jié)晶反應器的固定器(3)的俯視橫截面圖(左圖)和側(cè)視橫截面圖。
圖4表示用IEF在pH范圍為3至10的市售IPG條(AmershamBiosciences)分離3個蛋白質(zhì)樣品。
圖5表示使用本發(fā)明的所述方法，用狹窄pH范圍為9.5至9.75的IEF緩沖液，分離和快速結(jié)晶從圖1的IPG條得到的一種蛋白質(zhì)。
圖6表示用本發(fā)明的方法得到的一種p53晶體(A)和其衍射圖形(B)。
圖7表示從一個結(jié)晶反應器得到的大約100μm長的單個肌紅蛋白晶體的圖像(300μm*150μm)(A)，和凝膠中血紅蛋白晶體的圖像(B)。中心的狹長物體是400μm長的血紅蛋白晶體。
圖8表示膠里藻青蛋白晶體的圖像(A)和醇脫氫酶晶體的圖像(B)。
圖9表示從一個腔中的凝膠中提取的谷氨酸脫氫酶(GDH)晶體的圖像(A)和凝膠里水通道蛋白(Aquaporin)3晶體的圖像(B)。
圖10表示由聚合的IEF緩沖液組成的結(jié)晶反應器內(nèi)碳酸酐酶晶體的圖像(A)和從結(jié)晶反應器萃取的晶體的圖像(B)。
圖11表示胃蛋白酶-4晶體(B)的衍射圖形(A)。
圖12表示肌酸激酶1晶體的圖像(A)、β-人生長因子晶體的圖像(B)和抗生物素蛋白晶體的圖像(C)。
圖13表示赫賽汀(herceptin)蛋白晶體(A)和Ly1溶菌酶蛋白晶體(B)。
圖14表示溶菌酶晶體的衍射圖形(A)和核糖核酸酶-1晶體的衍射圖形(B)。
圖15表示前列腺素晶體的衍射圖形(A)和由沒有蛋白質(zhì)晶體的聚合IEF緩沖液組成的結(jié)晶反應器的衍射圖形(B)。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明提供了誘導從蛋白質(zhì)溶液快速形成蛋白質(zhì)晶體的方法和設備。本發(fā)明的方法包括等電聚焦并因此形成濃縮的蛋白質(zhì)溶液或蛋白質(zhì)帶，其促進快速的蛋白質(zhì)結(jié)晶，典型地在不超過15小時的時間段內(nèi)。
目前所有用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)晶體的方法都依賴于冗長的對導致晶體形成的最適條件的“嘗試與誤差”試驗和研究。對影響蛋白質(zhì)結(jié)晶的各種因素的評論出版于McPHerson，Methods Enzymol.，114，pp.112-20(1985)。McPHerson and Gilliland，J.Crystal Growth，90，pp.51-59(1988)匯編了已經(jīng)結(jié)晶的蛋白質(zhì)和核酸的列表，以及它們結(jié)晶的條件。晶體的概述和結(jié)晶配方，以及溶解的蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)的坐標系庫，由Brookhaven NationalLaboratory的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)保存[http//www.pdb.bnl.gov；Bernstein et al.，J.Mol.Biol.，112，pp.535-42(1977)]。這些參考能夠用于確定蛋白質(zhì)結(jié)晶的必要條件，作為形成合適蛋白質(zhì)晶體的前奏并指引其它蛋白質(zhì)結(jié)晶的策略?？商鎿Q地，在大多數(shù)情況下，一種明智的嘗試與誤差試驗研究策略可以產(chǎn)生適合于許多蛋白質(zhì)的結(jié)晶的條件，假定這些蛋白質(zhì)可以達到一種可接受程度的純度[見于，例如，C.W.Carter，Jr.and C.W.Carter，J.Biol.Chem.，254，pp.12219-23(1979)]。
總之，通過把將要結(jié)晶的蛋白質(zhì)與一種合適的含水溶劑或含有合適的結(jié)晶劑的含水溶劑結(jié)合而產(chǎn)生晶體，合適的結(jié)晶劑諸如鹽類或有機溶劑。溶劑與蛋白質(zhì)結(jié)合并可以在一定溫度下攪動，這種溫度是實驗確定的適合誘導結(jié)晶的并對保持蛋白質(zhì)活性和穩(wěn)定性是可以接受的。溶劑可選擇性地包括諸如二價陽離子等的共溶質(zhì)(co-solutes)、輔助因子或離液劑(chaotropes)、以及用于控制pH的緩沖液種類。對共溶質(zhì)的需要和它們的濃度由實驗確定以促進結(jié)晶。
在工業(yè)-規(guī)模的生產(chǎn)中，導致結(jié)晶的受控沉淀最好可以由蛋白質(zhì)、沉淀劑、共溶質(zhì)以及可選擇的緩沖液的簡單組合分批實現(xiàn)。對另一種選擇，可以由使用蛋白質(zhì)沉淀物作為起始材料來結(jié)晶蛋白質(zhì)。在這種情況下，向結(jié)晶溶液加入蛋白質(zhì)沉淀物，并培養(yǎng)直到形成晶體。也可以采用其他的實驗室結(jié)晶方法，諸如透析或蒸汽擴散(vapor diffusion)。McPHerson，ibidand Gilliland，ibid，在他們對結(jié)晶文獻的評論中包括適合條件的綜合列表。
根據(jù)本發(fā)明的教導，具有一個明確的等電點的任何蛋白質(zhì)都可以用于制備蛋白質(zhì)晶體。然而需要注意的是，結(jié)晶的條件，諸如IEF緩沖液的含量、密度、粘度、和其它特征，以及結(jié)晶反應器的溫度及其它設置參數(shù)，可以被優(yōu)化以產(chǎn)生理想質(zhì)量的晶體。因此，本領域技術人員將會認識到，對這些特征和條件進行一定程度的調(diào)整，以使用本發(fā)明的方法和設備得到晶體，可以是必要的。
本文使用的術語“蛋白質(zhì)晶體”或“晶體”是可交換的，以描述以晶格排列的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)晶體含有一種特定蛋白-蛋白連接的方式，其周期地在三維重復。本發(fā)明的蛋白晶體不包括蛋白質(zhì)無定形的固體形式或蛋白質(zhì)的沉淀物，諸如由凍干蛋白質(zhì)溶液得到的。晶體表現(xiàn)特有的特征，包括晶格結(jié)構(gòu)、特有的形狀和光學特性諸如折射率和雙折射。晶體由原子組成，原子排列的方式是在三維上周期性地重復。相反，無定形的材料是物體的一種非-結(jié)晶固體形式，有時是指一種無定形沉淀物。這樣的沉淀物沒有結(jié)晶固體狀態(tài)的分子晶格結(jié)構(gòu)特征，也不表現(xiàn)雙折射或物質(zhì)晶形典型的其他光譜特征。
本文使用的術語“濃縮的蛋白質(zhì)溶液”或“濃縮溶液”是可交換的，以描述包括至少一種蛋白質(zhì)的介質(zhì)，其中蛋白質(zhì)的濃度范圍從飽和，或甚至過飽和到相當于50％飽和的濃度。如果IEF緩沖液是聚合的，那么蛋白質(zhì)在濃縮時形成一條帶，因此使用術語“濃縮蛋白質(zhì)帶”或“濃縮帶”。
典型地，根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶可以開始于在一種電泳緩沖液中的一種蛋白質(zhì)溶液，這種蛋白質(zhì)溶液包括具有至少一種已知等電點(pI)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)溶液可以是稀溶液。引入電場到蛋白質(zhì)溶液時，蛋白質(zhì)被驅(qū)動進入一個結(jié)晶反應器，此結(jié)晶反應器包括具有與蛋白質(zhì)的pI重合的一個pH范圍的IEF緩沖液。因此，當每個蛋白質(zhì)分子驅(qū)動進入所述反應器體積內(nèi)時，釋放其電荷并在電場中停止移動，在結(jié)晶反應器中得到無電荷的蛋白質(zhì)的濃縮溶液或濃縮帶。蛋白質(zhì)從初始的稀溶液的電泳聚集和濃縮的方法是很快并有效的，典型的發(fā)生在以分鐘為數(shù)量級的時間跨度內(nèi)，甚至在幾十分鐘內(nèi)。聚集的蛋白質(zhì)分子在結(jié)晶反應器內(nèi)由擴散而蔓延，導致快速的晶核形成并在其中生長。
“等電聚焦”或“IEF”是一種常用的分離技術，基于暴露于IEF方法的分子的靜電荷，此分子典型的是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的靜電荷從其氨基酸含量來確定。在典型蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的20種氨基酸中，在一些pH范圍中，4種(天冬氨酸和谷氨酸、胱氨酸和酪氨酸)攜帶負電荷，3種(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)攜帶正電荷。由其特定的氨基酸順序定義的一種特定蛋白質(zhì)，因此可能沿著其長度混合了許多帶電基團。每個氨基酸貢獻的電荷數(shù)量由環(huán)境溶液的主要pH控制，根據(jù)相關的電荷和pH的滴定曲線以及所討論氨基酸的pK，電荷數(shù)量能夠從最小值為0向最大值為1變化(正還是負取決于氨基酸)。在所有氨基酸置于變性的條件下，蛋白質(zhì)分子的總電荷近似地由其組成氨基酸的總電荷提供，所有氨基酸都在主要溶液pH下。
IEF是一種廣泛使用的根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點分離蛋白質(zhì)的電泳方法。IEF包括帶電蛋白質(zhì)在期望的IEF緩沖液建立的pH梯度中的遷移，尤其是在凝膠中，其中蛋白質(zhì)遷移是源自電場或者由電場引導。一旦到達pH梯度凝膠中pH值等于蛋白質(zhì)pI的位置，具有特定pI的蛋白質(zhì)失去其電荷，就停止在凝膠中的遷移。蛋白質(zhì)聚集在此位置。IEF的優(yōu)點是將多種各有特定pI的蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)混合物溶液中直接溶解到不連續(xù)的帶中的能力。經(jīng)典IEF方法的最終產(chǎn)出是多個pH帶，每個pH帶載有具有特定pI的一種特定蛋白質(zhì)。具有不同帶電氨基酸比例的兩種蛋白質(zhì)可以由于它們在某些pH的不同靜電荷的特征而分離。在施加電場的作用下，帶較高電荷的蛋白質(zhì)將比具有相同大小和形狀的帶較低電荷蛋白質(zhì)移動更快。如果蛋白質(zhì)從一個樣品區(qū)域移動穿過一個非-傳導介質(zhì)(典型的是諸如聚丙烯酰胺等的凝膠)，將導致一電泳分離。在施加電場下遷移的過程中，如果蛋白質(zhì)進入一個區(qū)域，此區(qū)域pH值是使得此蛋白質(zhì)的靜電荷為零的(等電pH)，蛋白質(zhì)將終止相對于介質(zhì)的遷移。進而，如果此遷移發(fā)生在一種無變化的pH梯度中，蛋白質(zhì)將會“聚焦”于等電pH值。如果蛋白質(zhì)朝著更酸性的pH值移動，它將會帶上更多正電荷，合適-導向的電場將驅(qū)使蛋白質(zhì)回到等電點。類似地，如果蛋白質(zhì)朝著更堿性的pH值移動，它將會帶上更多負電荷，同樣的電場將推動蛋白質(zhì)回到等電點。這種分離方法，稱為等電聚焦，可以溶解在各自序列的上百氨基酸中區(qū)別少于1個帶電氨基酸的兩種蛋白質(zhì)。
等電聚焦法的一個關鍵要求是形成一種合適的空間pH梯度。這可以由動力學達到，由把帶電分子的多相混合物(兩性電解質(zhì))包括到起始均勻分離介質(zhì)中，或者由靜止地把空間梯度的滴定基團結(jié)合到發(fā)生遷移的凝膠母體中。前者代表經(jīng)典的基于兩性電解質(zhì)的等電聚焦，后者代表近來改進的固定化的pH梯度(IPG)等電聚焦技術。IPG方法的優(yōu)點是凝膠中的pH梯度是固定的，而基于兩性電解質(zhì)的方法是隨著兩性電解質(zhì)分子在電場中移動而易于位置漂移的。目前最好的方法學結(jié)合了兩種方法以提供一個系統(tǒng)，其中pH梯度是空間固定的，但是存在少量的兩性電解質(zhì)以減少蛋白質(zhì)在IPG的帶電凝膠母體上的吸收。
形成期望的pH梯度IPG凝膠需要的組成梯度是通常由配制以產(chǎn)生堿性pH的重凝膠單體(heavy gel monomer)組合物、配制以產(chǎn)生酸性pH的輕凝膠單體(light gel monomer)組合物、諸如過硫酸銨等的聚合引發(fā)劑、以及諸如四甲基乙二胺(TEMED)等的聚合催化劑而制備的?？梢允褂酶视秃脱趸?重水)以增加溶液的密度，由所得到密度梯度與地球重力之間的相互作用，從而幫助穩(wěn)定模具中形成的梯度。幾份文獻描述了產(chǎn)生聚合單體梯度的自動裝置。這樣的系統(tǒng)已經(jīng)用于制造用在蛋白質(zhì)的分子量分離的多孔的梯度凝膠。Altland等人(Clin.Chem.30(12Pt1)2098-2103，1984)展示了使用這樣的系統(tǒng)以產(chǎn)生用于制造IPG凝膠的可滴定的單體梯度。美國專利4,169,036介紹了裝有用于電泳分離的平板-凝膠固定器的一種系統(tǒng)。產(chǎn)生梯度凝膠的一種自動設備公開于美國專利4,594,064、6,554,991及其它。
根據(jù)本發(fā)明的快速結(jié)晶需要適合的物理條件以允許本發(fā)明的運作。本發(fā)明的方法和設備中的幾個因素都影響結(jié)晶動力學。
首先，為了確保期望的蛋白質(zhì)進入適合的結(jié)晶反應器，有利的是加速分子在電泳緩沖液中的動力學，以增加任何分子遇到結(jié)晶反應器的概率。
有利地，蛋白質(zhì)在電泳緩沖液中的移動增加，是根據(jù)本發(fā)明的方法引入的電場產(chǎn)生的對流熱的結(jié)果。可預計的是，增強的蛋白質(zhì)動力學增加了任何蛋白質(zhì)遇到結(jié)晶反應器而且被其捕獲到其內(nèi)的概率，結(jié)晶反應器是浸沒在電泳緩沖液中的。
根據(jù)一個實施方案，蛋白質(zhì)在電泳緩沖液中的速度由一種循環(huán)電泳緩沖液的裝置加速。典型的使用攪拌棒、泵、振蕩器例如壓力振蕩器、攪拌器、傾斜裝置或任何本領域已知的攪動裝置和技術來達到循環(huán)。在另一個實施方案中，用于循環(huán)的裝置可以是用于相對于電泳緩沖液移動IEF緩沖液或者結(jié)晶反應器的一種機械裝置。例如，IEF緩沖液或者結(jié)晶反應器可以在電泳緩沖液中旋轉(zhuǎn)。
可替換地，本發(fā)明的方法可以沒有這種循環(huán)裝置。在本發(fā)明的另一個實施方案中，由等電聚焦過程中自然產(chǎn)生的對流而提供循環(huán)。
根據(jù)另一個實施方案，循環(huán)生物分子必需的對流能的量是每1cm3電泳緩沖液10-10焦耳。
根據(jù)又另一個實施方案，本發(fā)明的方法包括使用根據(jù)WO03/008977所公開原理的一種快速IEF方法。
第二，為了確保期望進入適合的結(jié)晶反應器的蛋白質(zhì)遇到所述反應器，形成一種濃縮的蛋白質(zhì)溶液或者濃縮的蛋白質(zhì)帶。典型地，濃縮的蛋白質(zhì)溶液/帶產(chǎn)生于結(jié)晶反應器內(nèi)，靠近結(jié)晶反應器與外部環(huán)境之間的界面的位置，然后蛋白質(zhì)進入結(jié)晶反應器并在其中擴散，然后形成蛋白質(zhì)晶體。
設計結(jié)晶反應器的粘性和體積，以使期望的蛋白質(zhì)能夠進入結(jié)晶反應器并在其中擴散，還能在其中結(jié)晶。當結(jié)晶反應器中的IEF緩沖液是以凝膠的形式時，還可定制凝膠的孔率以得到期望的晶體。典型的，蛋白質(zhì)在凝膠里的擴散常數(shù)是使蛋白質(zhì)的分布擴展0.1mm數(shù)量級的距離的擴散時間是大約1000秒(～20分鐘)。這樣，具有同等尺寸的晶體的晶體生長的預定時間是這個數(shù)量級的。
另一個影響結(jié)晶效率的重要參數(shù)，是結(jié)晶反應器的pH。略微地改變結(jié)晶反應器的pH使其高于或低于生物分子的pI，將導致生物分子在進入反應器之后保持帶有一種邊緣電荷(marginal charge)并因此在結(jié)晶反應器中有一種另外的運動方式。
而且，結(jié)晶反應器的結(jié)構(gòu)必須適合分離晶體以進一步應用或/和在結(jié)晶反應器內(nèi)收集晶體的X-射線衍射數(shù)據(jù)。
在結(jié)晶反應器的構(gòu)造中可以使用固定化的液膜。尤其是，固定化的液膜可以用作本發(fā)明的結(jié)晶反應器的外部被膜，對結(jié)晶反應器提供對期望的生物分子的選擇性滲透的邊界。固定化的液膜典型地被限制在多微孔的固體內(nèi)。制備多孔膜的最廣泛使用和最簡單的工藝之一是GelgardTM工藝，其中從融化而擠壓出半晶質(zhì)的膜或纖維。由拉伸固體-狀態(tài)的聚合物諸如聚丙烯而帶來孔率。多至0.04μm的孔徑是可得到的，以及具有100-1500μmID和25μm壁厚度使用在例如血液充氧器中的中空纖維也是可以得到的。這樣固定化的液膜通常與乙醇、乙二醇、和異丙醇是相容的。另一種廣泛使用的多孔膜的例子是Gore-TexTM，一種多微孔的聚(四氟乙烯)，其也由拉伸工藝制造，是化學上惰性的并且是一種疏水的合成高分子膜。
結(jié)晶反應器的尺寸依賴于使用的期望蛋白質(zhì)的量和所使用的系統(tǒng)和/或設備的類型。結(jié)晶反應器的體積可以設計為(1)促進在反應器內(nèi)形成濃縮的生物分子溶液/帶，典型的是在接近反應器和外部環(huán)境的界面的位置；和(2)使生物分子能夠在其中的擴散并從而使所述生物分子能夠結(jié)晶。
第三，本發(fā)明的方法需要在每個結(jié)晶反應器只有一種蛋白質(zhì)，因為不相關蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的存在干擾期望的結(jié)晶過程。為了確保只有一種蛋白質(zhì)進入一個結(jié)晶反應器，結(jié)晶反應器中由IEF緩沖液覆蓋的pH范圍包含該一種蛋白質(zhì)的pI。然而，本發(fā)明的方法促進任何期望類型的蛋白質(zhì)結(jié)晶，即使所述的類型沒有純化。在提供了一種非-純化蛋白質(zhì)溶液的情況，需要至少一個結(jié)晶反應器包括包含期望的類型蛋白質(zhì)的pI的一種IEF緩沖液，其中結(jié)晶反應器中由IEF緩沖液覆蓋的pH范圍是十分狹窄的，優(yōu)選地極端-窄，這樣避免了雜質(zhì)的結(jié)晶。
這樣，根據(jù)某一個實施方案，每個結(jié)晶反應器內(nèi)的IEF緩沖液具有非常狹窄的pH范圍，如5.50-5.60(0.1pH單位或更小差別)或極端窄的pH范圍，如5.52-5.54(0.02pH單位差別或更小差別)。因為根據(jù)本發(fā)明的一種IEF緩沖液可以是一種緩沖劑，其被調(diào)整到一定的pH值，所以所述PH范圍是可能的。在這種情況，IEF緩沖液的pH范圍相當于一種緩沖劑在其PH值左右的緩沖能力，緩沖劑被調(diào)整到此pH值。根據(jù)本發(fā)明可以使用的一種IEF緩沖液的例子是Tris Glycine(pH 8.20+/-0.05，Biorad，目錄編號161-0771)。
術語“pH范圍”是指一種IEF緩沖液的最高和最低pH值(如，pH7.9-pH8.9)，或者一種IEF緩沖液中最高和最低pH值的差(如，1.0pH單位)。
根據(jù)另一個實施方案，多種結(jié)晶反應器的pH范圍不重疊。根據(jù)又另一個實施方案，一種或多種IEF緩沖液之間的pH差不超過0.1pH單位，優(yōu)選地不超過0.02pH單位。
本文使用的術語“差”或“pH差”是可以互換的，描述具有不同的或部分不同的pH范圍的兩種不同的IEF緩沖液之間的pH值的增量差。例如，如果結(jié)晶反應器#1與結(jié)晶反應器#2之間的pH差是0.1pH單位，那么結(jié)晶反應器#1的pH梯度開始于pH6.8結(jié)束于pH7.8，結(jié)晶反應器#2的pH梯度開始于pH7.9結(jié)束于pH8.9(即，結(jié)晶反應器#1的下限pH7.9與結(jié)晶反應器#2的上限pH7.8之間的差值，符合0.1pH單位的差值)。
根據(jù)多個實施方案，多于兩個的結(jié)晶反應器之間的pH差不必是均一的。
根據(jù)又另一個實施方案，一個結(jié)晶反應器內(nèi)的間距不必是均一的。術語“間距”是指IEF緩沖液產(chǎn)生的pH梯度內(nèi)的pH值之間的增量差別。例如，在一個結(jié)晶反應器內(nèi)，間距可以小至在該反應器中整個pH范圍內(nèi)的0.02pH單位(例如，pH6.8、pH6.82、pH6.84、pH6.86等等)根據(jù)一些實施方案，一個結(jié)晶反應器內(nèi)的間距不必是均一的。
根據(jù)一個實施方案，一個結(jié)晶反應器的一種IEF緩沖液的一pH范圍是相對寬的，例如，超過1個pH單位，可替換地超過2個pH單位。根據(jù)另一個實施方案，一個結(jié)晶反應器的一種IEF緩沖液的pH范圍是狹窄的，例如，大約1個pH單位或更小。根據(jù)又另一個實施方案，一個結(jié)晶反應器的一種IEF緩沖液的pH范圍是極窄的，例如，大約0.2個pH單位或更小，可替換地大約0.02個pH單位或更小。
根據(jù)一個實施方案，一種IEF緩沖液的pH間距是0.1pH單位或更小。根據(jù)另一個實施方案，一種IEF緩沖液的pH間距是0.02pH單位或更小。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，兩種或多種IEF緩沖液之間的pH差是0.01單位或更小。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，兩種或多種IEF緩沖液之間的pH差是0.02單位或更小。
根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明提供了生物分子快速結(jié)晶的一種方法，包括(a)提供至少一生物分子種類；(b)提供至少一個結(jié)晶反應器，其包括具有一個pH范圍的一種IEF緩沖液，所述pH范圍包含一pH與至少一生物分子種類的pI相符合。
(c)把所述至少一生物分子種類與至少一個結(jié)晶反應器接觸；(d)引入電場到所述電泳緩沖液，從而在所述結(jié)晶反應器中產(chǎn)生所述至少一生物分子種類的一種濃縮溶液；并且
(e)允許在濃縮溶液中的所述至少一生物分子種類在至少一個結(jié)晶反應器中結(jié)晶。
根據(jù)又另一個實施方案，步驟(c)還包括將至少一生物分子種類和所述至少一個結(jié)晶反應器放置于電泳緩沖液中。根據(jù)又另一個實施方案，步驟(c)還包括攪拌電泳緩沖液。有利地，步驟(e)還包括監(jiān)控和/或檢測生物分子晶體的形成。
根據(jù)本發(fā)明所述方法的步驟(c)，把至少一生物分子種類與至少一個結(jié)晶反應器的接觸可以以多種途徑實現(xiàn)。例如，在生物分子提供于一種溶液中的情況，可以通過把一滴或更多溶液施加于結(jié)晶反應器上而實現(xiàn)把至少一生物分子種類與至少一個結(jié)晶反應器的接觸?？梢允┘由锓肿拥揭荒?、一母體或任何其它吸收性物質(zhì)上，其覆蓋、鋪設或安置在一個結(jié)晶反應器上，以達到在生物分子和結(jié)晶反應器之間的接觸。如果以凝膠段提供生物分子，允許凝膠段接觸至少一個結(jié)晶反應器。
根據(jù)又另一個實施方案，本發(fā)明所述方法的步驟(c)還可以包括將基本上連接生物分子與至少一個結(jié)晶反應器放置于電泳緩沖液溶液內(nèi)。
本文使用的術語“生物分子”是指任何化合物，該化合物是人工制造的或天然的，對細胞、細胞成分或有機體具有可見效果。這個術語應用于蛋白質(zhì)、包括化學個體的蛋白質(zhì)復合體、蛋白質(zhì)-DNA復合體、DNA、RNA、酶、肽、多肽、抗體、抗原、抗原決定部位和其變體、多核苷酸、激素、碳水化合物、類脂、磷脂和生物素標記探針。術語“生物分子”在優(yōu)選實施方案中通常以“蛋白質(zhì)”作為例子。
術語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換地使用，是指任何長度的氨基酸聚合物。這些術語也適用于氨基酸聚合物，其中一種或多種氨基酸殘基是一種對應天然存在氨基酸的人造化學類似物，以及也適用于天然存在的氨基酸聚合物。一種氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基酸殘基是一種“非天然”氨基酸，非對應于任何天然存在的氨基酸，也包含在本文的術語“蛋白質(zhì)”、“肽”和“多肽”的用途中。
“核酸”或“多核苷酸”是指一種核苷酸序列，包括多個以5’至3’磷酸二酯鍵連接的核酸，可以或是DNA或是RNA序列。如果核酸是DNA，核苷酸序列可以或是單鏈或是雙鏈的。編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸是RNA或DNA，其編碼一種能夠以高親和力結(jié)合纖維素的蛋白質(zhì)，所述核酸與編碼這種蛋白質(zhì)的核酸序列互補，或者與編碼這種蛋白質(zhì)的核酸序列雜交，并在嚴格(stringent)的條件下保持穩(wěn)定地與編碼這種蛋白質(zhì)的核酸序列結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明的方法，任何形式的蛋白質(zhì)都可以結(jié)晶。蛋白質(zhì)可以是糖蛋白、磷蛋白、硫蛋白(sulphoproteins)、碘蛋白、甲基化蛋白、未改性的蛋白質(zhì)或含有其它修飾的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可以是，例如，治療蛋白、包括抗體的預防蛋白、包括去污蛋白的清洗劑蛋白、包括美容蛋白的個人護理蛋白、獸醫(yī)蛋白、食物蛋白、飼料蛋白、診斷蛋白和凈化蛋白。包括在這些蛋白質(zhì)中的有酶，諸如，溶菌酶、脫氫酶、水解酶、異構(gòu)酶、裂解酶、連接酶、腺苷酸環(huán)化酶、轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶。水解酶的例子包括彈性蛋白酶、酯酶、脂肪酶、腈水解酶、淀粉酶、果膠酶、乙內(nèi)酰脲酶(hydantoinase)、天冬酰胺酶、脲酶、枯草桿菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶和其它蛋白酶和溶菌酶。裂解酶的例子包括醛縮酶和羥基腈裂解酶(hydroxynitrile lyase)。氧化還原酶的例子包括過氧化物酶、漆酶、葡糖氧化酶、醇脫氫酶、谷氨酸脫氫酶和其它脫氫酶。其它酶包括纖維素酶和氧化酶。
治療蛋白或預防蛋白的例子包括激素，諸如胰島素、胰高血糖素樣肽-1(glucogon-like peptide-1)和甲狀旁腺激素、抗體、抑制劑、生長因子、postridical激素、神經(jīng)生長激素、凝血因子、粘合分子、骨骼發(fā)生蛋白(bonemorphogenic protein)和外源凝集素營養(yǎng)因子(lectins trophic factor)、細胞因子(cytokines)諸如TGF-β、IL-2、IL-4、α-IFN、β-IFN、γ-IFN、TNF、IL-6、IL-8、淋巴細胞毒素、IL-5、移動抑制因子、GMCSF、IL-7、IL-3、單核細胞-巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子、多藥物抗性蛋白、其它淋巴因子、類毒素、促紅細胞生成素、VIII因子、支鏈淀粉、TPA、脫氧核糖核酸酶-α、α-1-antitripsin、人生長激素、神經(jīng)生長激素、骨形態(tài)形成性蛋白質(zhì)、脲酶、類毒素、生育激素(fertility hormones)、FSH和LSH。
治療蛋白諸如以下蛋白，也包括白細胞標記，諸如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD18、CD19、CE20、CD22、CD23、CD27和其配體、CD28和其配體B7.1、B7.2、B7.3、CD29和其配體、CD30和其配體、CD40和其配體gp39、CD44、CD45和異構(gòu)重整體(isoforms)、Cdw52(Campath抗原)、CD56、CD58、CD69、CD72、CTLA-4、LFA-1和TCR組織相容性抗原，諸如MHC I類或II類抗原、Lewis Y抗原、SLex、SLey、SLea和SLeb；粘合素(integrin)，諸如VLA-1、VLA-2、VLA-3、VLA-4、VLA-5、VLA-6和LFA-1；粘合分子，諸如Mac-1和p150、95；選擇凝集素(selectin)，諸如L-選擇凝集素、P-選擇凝集素和E-選擇凝集素和它們相對的受體VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2和LFA-3；白細胞介素，諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15；白細胞介素受體，諸如IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-8R、IL-10R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-14R、IL-15R；趨化因子(chemokines)，諸如PF4、RANTES、MIP1α、MCP1、NAP-2、Groα、Groβ和IL-8；生長因子，諸如TNFα、TGFβ、TSH、VEGF/VPF、PTHrP、EGF家族、EGF、PDGF家族、內(nèi)皮素(endothelin)和促胃酸激素釋放肽(GRP)；生長因子受體，諸如TNFαR、RGFβR、TSHR、VEGFR/VPFR、PGFR、EGFR、PTHrPR、PDGFR家族、EPO-R；GCSF-R和其它造血受體；干擾素受體，諸如IFNαR、IFNβR和IFNγR；免疫球蛋白和其受體，諸如IgE、FceRI和FceRII；血液因子，諸如補體C3b、補體C5a、補體C5b-9、Rh因子、纖維蛋白原、纖維蛋白和髓鞘質(zhì)關聯(lián)的生長抑制劑。
根據(jù)本發(fā)明方法結(jié)晶的蛋白質(zhì)可以是任何天然的、合成的或重組蛋白抗原，包括例如，破傷風類毒素、白喉類毒素(diptheria toxoid)、病毒表面蛋白、諸如CMV糖蛋白B、H、和gCIII、HIV-1被膜糖蛋白、RSV被膜糖蛋白、HSV被膜糖蛋白、EBV被膜糖蛋白、VZV被膜糖蛋白、HPV被膜糖蛋白、流感病毒糖蛋白、肝炎家族表面抗原；病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒酶、寄生蟲蛋白、寄生蟲糖蛋白、寄生蟲酶和細菌蛋白。還包括腫瘤抗原，諸如her2-neu、粘蛋白、CEA和內(nèi)皮唾液酸蛋白(endosialin)。也包括變態(tài)反應原，諸如室內(nèi)塵螨抗原、lol p1(草)抗原和漆酚。還包括毒素，諸如假單胞桿菌內(nèi)毒素和骨橋蛋白/尿橋蛋白、蛇毒和蜂毒。還包括糖蛋白腫瘤-相關抗原，例如，癌胚抗原(CEA)、人粘蛋白、her-2/neu和前列腺-特異性抗原(PSA；Henderson et al.，Advances in Immunology，62，pp.217-56，1996)。
根據(jù)又另一個實施方案，至少一個結(jié)晶反應器包括一種聚合物，此聚合物包括一種或多種選自線型高聚物、支化聚合物、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、水凝膠、纖維素、改性纖維素、交聯(lián)聚乙烯醇、交聯(lián)聚氧化乙烯和乙二醇聚合物組成的組。除了常規(guī)的丙烯酰胺/雙丙烯酰胺溶液或瓊脂糖溶液之外，結(jié)晶反應器可以包括各種單體。常規(guī)化學聚合膠中已知的是使用甲基丙烯酸羥乙酯(hydroxyethylmethacrylate)和其它低-分子量丙烯酸酯類型的化合物作為單體；已經(jīng)有出售的“Lone-Ranger”凝膠。文獻中也已經(jīng)介紹了使用以一種或多種丙烯酸酯-類基團取代的聚合物(Zewert and Harrington，ElectropHoresis 13824-831，1992)，尤其適合于水與可混溶有機溶劑諸如乙醇或丙酮的混合溶劑中的分離。形成單體的凝膠也可以是任何含有一個光聚合活性基團的基本上水溶的分子，這種分子與能可以成交聯(lián)的一種材料組合，一旦聚合，這種組合就形成一種適合于特定類型電泳的凝膠?？梢蕴砑拥絀EF緩沖液中的范例性的材料包括丙烯酰胺、與亞甲基-雙-丙烯酰胺或其它已知交聯(lián)劑的組合；甲基丙烯酸羥乙酯和丙烯酸的其它低-分子量(小于大約300道爾頓)衍生物、異丁烯酸、及其烷基-取代的衍生物，諸如巴豆酸；乙烯基吡咯烷酮和其它低-分子量乙烯基和烯丙基化合物；非-離子聚合物的乙烯衍生物、烯丙基衍生物、丙烯酸衍生物和甲基丙烯酸衍生物，包括瓊脂糖的這類衍生物(“Acrylaide”交聯(lián)劑，F(xiàn)MCCorp.)、葡聚糖、和其它多糖和衍生物，諸如包括羥甲基纖維素的纖維素等衍生物；聚乙烯醇；單體的、寡聚的和聚合的乙二醇衍生物，包括環(huán)氧乙烷聚合物、1，2-環(huán)氧丙烷聚合物、環(huán)氧丁烷的聚合物，及其共聚物；其它水-相容聚合物的丙烯?；苌?、乙烯基衍生物或烯丙基衍生物，諸如聚HEMA(聚丙烯酸羥乙酯)、聚合N-異丙基丙烯酰胺(其是溫度敏感的)、馬來酸聚合物和共聚物、部分水解的EVAC(乙烯與乙烯基乙酸酯的聚合物)、乙烯亞胺、聚氨基酸、多聚核苷酸等、及這些亞基彼此的共聚物和這些亞基與多種疏水化合物的共聚物，此疏水化合物諸如吡啶、吡咯烷酮、噁唑烷、苯乙烯、和羥基酸等?？删酆系牟牧喜槐厥峭耆苄缘?，尤其是當凝膠形成的溶液中包括溶劑或表面活性劑時。
此外或者可替換地，IEF緩沖液可以包括可以由本領域中已知方法制備的普通聚合物的衍生物。例如，向羥基附加烯丙基縮水甘油醚是已知的，這是羥基與酸、酐或酰氯，諸如丙烯酸酐。胺易于用酰酐或氯化物衍生。
候選的非-丙烯酰胺單體可以包括，例如，烯丙基醇、HEMA([甲基]丙烯酸羥乙酯)、聚乙二醇單丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇單丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯、乙烯基己內(nèi)酰胺、乙烯基吡咯烷酮、烯丙基縮水甘油葡聚糖、聚乙烯醇和纖維素的烯丙基縮水甘油衍生物以及衍生物、乙烯基乙酸酯、和其它含有一個或多個丙烯?；⒁蚁┗蛳┍姆肿?。
根據(jù)一個實施方案，包含一種聚合的IEF緩沖液的結(jié)晶反應器的尺寸為，如大約20μm至大約5mm；長度為大約0.5mm至大約10mm。優(yōu)選地，包含一種聚合的IEF緩沖液的結(jié)晶反應器在浸沒到緩沖室的緩沖溶液中時保持其結(jié)構(gòu)，尤其在緩沖溶液受電場作用時所述結(jié)晶反應器保持其結(jié)構(gòu)。
對結(jié)晶反應器包括一種聚合的IEF緩沖液的情況，在IEF過程中，如果生物分子種類的等電點(pI)落在此IEF緩沖液覆蓋的pH范圍內(nèi)，在臨近結(jié)晶反應器與外部環(huán)境之間的界面的位置形成一生物分子種類的濃縮帶。然后帶中的此生物分子種類在結(jié)晶反應器內(nèi)擴散，并且意想不到地開始快速晶體生長。
如上所述，結(jié)晶反應器的聚合物可以是任何熟知和典型的膠凝劑，其已知適合用于電泳目的。這種材料包括膠凝聚合物，其是充分地化學反應性的以保證引導可電離的原子團，即酸性基團，諸如羧基團、硫酸基團、磷酸基團等和含氮的堿性基團諸如氨基等。典型的合適材料是羥基聚合物，包括纖維素、改性纖維素、交聯(lián)聚乙烯醇和交聯(lián)聚環(huán)氧乙烷。也可以使用適宜的化學改性的交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂凝膠或瓊脂糖凝膠。包含一種聚合的IEF緩沖液的結(jié)晶反應器通?？梢杂商峁┮环N緩沖液而制備，此緩沖液由使用電泳領域中已知的聚合物和方法，添加一種聚合物而聚合。見于例如Sambrook等人.(1989)ElectropHoresis buffers in MolecularCloning(Nolan，C.ed.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，pp.B.23-24.
根據(jù)又另一個實施方案，至少一個結(jié)晶反應器是與一種固體基質(zhì)連接的。方便地，結(jié)晶反應器可以被支撐在一種基質(zhì)上以提供足夠的強度，基質(zhì)例如，多孔的載體基質(zhì)諸如濾紙、棉或亞麻織物等、或其它合適的網(wǎng)狀材料。此外，也建議使用瓊脂或瓊脂糖凝膠的一些交聯(lián)物以經(jīng)得住電場的作用。
根據(jù)又另一個實施方案，至少一個結(jié)晶反應器設在毛細管中。通常，用于由X-射線結(jié)晶學收集衍射花樣的晶體是小心地從其結(jié)晶介質(zhì)分離并插到毛細管中。使用牙蠟或硅脂將管和其內(nèi)少量的用于保持水合的結(jié)晶介質(zhì)一起密封以隔絕空氣(McPHerson et al.，Krieger Publishing，Malabar，p.214，1989)。由使用毛細管中的結(jié)晶反應器而應用本發(fā)明的方法可不必如此。
根據(jù)又另一個實施方案，本發(fā)明的方法包括提供多個結(jié)晶反應器。根據(jù)又另一個實施方案，多個結(jié)晶反應器是連接的、結(jié)合的、或者以空間可尋址的方式基本上接近固體基質(zhì)。根據(jù)又另一個實施方案，本發(fā)明的方法包括得到多個晶體，其中多個晶體可以在同一個結(jié)晶反應器中形成，也可以在一個設備中包含的不同結(jié)晶反應器中形成。在一個設備中包含的不同結(jié)晶反應器中的多個晶體可以是基本上同時形成和/或基本上在同一結(jié)晶裝置下形成。這樣，本發(fā)明的方法和設備適合各種生物分子同時和/或在類似條件和/或裝置下高產(chǎn)量結(jié)晶。
本文使用的“固體基質(zhì)”或“固定器”或“母體”是可互換的，是指一種惰性的支撐元件，其包括至少一個結(jié)晶反應器。這個元件可以是一個帶、膜、芯片、片或任何其它包括至少一個結(jié)晶反應器的支撐構(gòu)造。
根據(jù)又另一個實施方案，固定器包括一種材料，其電阻比結(jié)晶反應器內(nèi)包含的聚合物的電阻大。
根據(jù)又另一個實施方案，固定器包括一種非-傳導材料。這種非-傳導材料可以選自聚-N-甲基異丁烯酰胺、丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯組成的組。
根據(jù)另一個實施方案，固定器包括一種材料，其對生物分子是不可滲透的，以避免蛋白質(zhì)從一個腔中的結(jié)晶反應器擴散到任何其它腔中的結(jié)晶反應器。
根據(jù)本發(fā)明的一個固定器是一種固體材料或半-固體材料，例如陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)諸如甲基丙烯酸甲酯或凝膠，其可以包含一個或多個結(jié)晶反應器，或者包含一個或多個適合包含結(jié)晶反應器的腔。根據(jù)一個實施方案，形成固定器的材料是低傳導性的。根據(jù)另一個實施方案，固定器是部分地或整體地由一種對生物分子和離子都不可滲透的材料制成。結(jié)晶反應器可以設置在固定器的表面，例如作為凝膠或作為凝膠連接、結(jié)合或基本上鄰接到基質(zhì)，或者可以設置在固定器上蝕刻的槽中，或者可以延伸穿過固定器，只要此結(jié)晶反應器可以接觸電泳緩沖液。固定器是可移動的或者固定在本發(fā)明設備的緩沖室中。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，如果結(jié)晶反應器延伸穿過母體，那么結(jié)晶反應器的一側(cè)面與電泳緩沖液接觸，優(yōu)選地用一種生物材料-不可滲透的材料制成的層覆蓋所述側(cè)面。
包括多個腔的固定器，其中每個腔必要的含有一個結(jié)晶反應器，所述腔可以由例如在固定器的一側(cè)鑿孔或通道穿到固定器的相對側(cè)，用諸如瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠的聚合物填充此通道，與一種具有一預設pH范圍的凝固在凝膠中的IEF緩沖液混合而制造。固定器上的凹槽可以不延伸穿過到固定器的相對側(cè)。凹槽可以制造在固定器的任意一側(cè)上。根據(jù)一個實施方案，凹槽在固定器的一個側(cè)面上。
根據(jù)又另一個實施方案，本發(fā)明的方法包括提供多個結(jié)晶反應器，它們包括類似的或不同的IEF緩沖液。根據(jù)又另一個實施方案，多個結(jié)晶反應器的pH范圍不重疊。
根據(jù)又另一個實施方案，包括多個結(jié)晶反應器的固體基質(zhì)選自由以下組成的組固定化的pH梯度(IPG)條，諸如ProteomIQTMIPG條(Proteomesystems)、Servalyt PrecotesTM凝膠(Invitrogen，Inc.)、pH膜和出售的預-制凝膠(如，Invitrogen，Inc.，Amersham PHarmacia Biotech，Stratagene，Ameresco Inc.，Bio-Rad Laboratories及其它)，附帶條件是多個結(jié)晶反應器的排列滿足，或被改進以滿足本發(fā)明的原理。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明多個結(jié)晶反應器形成一個非-連續(xù)的反應器列，每個反應器包括一種具有一個pH范圍的一種IEF緩沖液，其中每種IEF緩沖液覆蓋的pH范圍與非-連續(xù)的反應器列中另一種IEF緩沖液的pH范圍可以重合或可以不重合。
根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明的方法提供了包括聚合的IEF緩沖液的多個結(jié)晶反應器。多個結(jié)晶反應器可以是相同的，或者每個結(jié)晶反應器可以包含不同的凝膠(聚合物)。任意地，多個結(jié)晶反應器包括不同濃度的同一聚合物，導致多個結(jié)晶反應器表現(xiàn)不同的滲透性(例如，不同孔徑)、結(jié)構(gòu)和粘度等。
可以使用市售的IPG條來實現(xiàn)本發(fā)明，假定每個IPG條包括多個隔離的pH帶，每個pH帶包括一pH范圍。然而，市售IPG條的缺點是，每個隔離的pH帶的體積和形狀通常不適合晶體的形成，尤其是因為生物分子的擴散限制在帶內(nèi)。這樣，定制的IPG條是尤其適用于根據(jù)本發(fā)明的原理得到晶體的。優(yōu)化定制IPG條的設計，以促進其內(nèi)生物分子的濃縮、擴散和結(jié)晶。
定制IPG條典型的根據(jù)目前制備薄平面IPG凝膠結(jié)構(gòu)的實踐而制備，此薄平面IPG凝膠結(jié)構(gòu)連接于一個惰性基質(zhì)，典型地是一片Mylar塑料，其已經(jīng)被處理以化學連接于一種丙烯酰胺凝膠(例如，GelbondTMPAG膜，F(xiàn)MC Corporation)。IPG凝膠典型的形成為矩形片，0.5mm厚、10-30cm長(在分離方向上)和10cm寬。在平行通道施加多個樣品到這樣的凝膠上，伴隨的問題是蛋白質(zhì)在各通道之間的擴散產(chǎn)生交叉污染。此情況下重要的是在給定通道施加的所有蛋白質(zhì)都在此通道中回收(這種情況下典型的以2-D電泳)，已經(jīng)有人證明把此凝膠分成窄條(典型的是3mm寬)是必要的，然后其中每個窄條能作為單獨凝膠跑電泳。因為一種樣品的蛋白質(zhì)這樣限制在此表現(xiàn)為單個條的凝膠的體積內(nèi)，它將在此條中回收。IPG技術中蛋白質(zhì)的等電聚焦分離在此領域中廣泛地描述了。IPG的概念公開于美國專利No.4,130,470，并在之后的大量出版物中進一步描述。
可替換地，包括一種聚合IEF緩沖液的結(jié)晶反應器可以由連接劑連接于固定器，諸如在美國專利No.4,243,507中所公開的。
本文使用的術語“IEF緩沖液”是指一種緩沖液，其含有在一個給定pH值附近有緩沖能力(緩沖劑)的成分，或有機化以形成pH梯度的成分(例如，兩性電解質(zhì)、固定化電解質(zhì)或緩沖劑的組合)。
根據(jù)本發(fā)明的IEF緩沖液可以以粘性液體或漿或凝膠的形式，這樣蛋白質(zhì)可以在電場中移動穿過IEF緩沖液，除非蛋白質(zhì)的pI在IEF緩沖液的pH范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一種IEF緩沖液可以包括其它成分，諸如尿素、清潔劑和如所需的還原劑。令人滿意的是，根據(jù)本發(fā)明的IEF緩沖液在電場作用下功能穩(wěn)定。
本文使用的術語“粘性液體”是指一種液體或其它介質(zhì)，其具有一種優(yōu)化的粘度，其促進大分子在粘性液體中的擴散，并帶有最小的對流運動，優(yōu)選沒有對流運動，以及最小的無效沉降。
IEF緩沖液和含有它的結(jié)晶反應器可以由手工或由各種裝置形成。例如，IEF緩沖液可以被沉積(如，涂覆、印刷或點樣)在基質(zhì)表面上，或者可以被固定在基質(zhì)表面上，或者沉積在基質(zhì)的槽或溝槽中?；|(zhì)可以是母體，諸如膜、或與母體同樣材料制成的珠粒。
IEF緩沖液可以由一種裝置制成，此裝置混合一種酸性溶液和一種堿性溶液以形成一種具有所需的pH值的緩沖液(“滴定儀”)?；诰酆系哪康?，緩沖液還可以結(jié)合單體(如，丙烯酰胺)和聚合劑并載入另一個裝置(如，一個腔)，此裝置把IEF緩沖液置于需要的位置。
根據(jù)一個實施方案，用于產(chǎn)生本發(fā)明的IEF緩沖液的兩性電解質(zhì)是一套各種寡-氨基酸和/或寡羧酸，其是兩性的(即，在酸性介質(zhì)中帶正電而在堿性介質(zhì)中帶負電)、可溶的并且Mr值從大約300至1000u。用在本發(fā)明的兩性電解質(zhì)可以制備或購買。例如，本領域中已知幾種載體兩性電解質(zhì)(如，pages 31-50，Righetti，P，G.，(1983)Isoelectric FocusingTheory，Methodology and Applications，Eds.，Work and Burdon，Elsevier SciencePublishers B.V.，Amsterdam；美國專利3,485,736)?？商鎿Q地，購買的兩性電解質(zhì)包括AmpHolines(LKB)、Servalytes(Serva)、Biolytes或PHarmalytes(Amersham PHarmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。
固定化電解質(zhì)(Immobilines)也可以用于制造本發(fā)明的IEF溶液。固定化電解質(zhì)是通式為CH2＝CH-CO-NH-R的非-兩性的、雙功能的丙烯酰胺衍生物。根據(jù)本發(fā)明的使用的固定化電解質(zhì)可以制備或購買。本領域中已知的合成固定化電解質(zhì)的方法，例如，Bjellquist et al.，(J.Biochem.BiopHys.Methods，6317，1983)。固定化電解質(zhì)可以與丙烯酰胺共聚以形成由固定化的pH梯度組成的結(jié)晶反應器。根據(jù)本發(fā)明的pH梯度可以由混合兩性的或非-兩性的緩沖液而形成。例如，這樣的緩沖液組合描述于Allen，RC等人，Gel ElectropHoresis and Isoelectric Focusing of ProteinsSelectedTechniques，BerlinWalter de Gruyter & Co.(1984)和美國專利5,447,612(Bier)中。一些IEF緩沖劑包括的成分選自(1)50mM甘氨酸、14mM NaOH；(2)50mM HEPES、12mM NaOH；(3)50mM THMA、44.6mM HCl；(4)52mM檸檬酸、96mM Na2HPO4；(5)50mM BICINE、18mM NaOH；(6)50mM DMGA、40mM NaOH組成的組。IEF緩沖液在每個小室中產(chǎn)生的pH梯度可以具有狹窄的或?qū)挼膒H范圍(如，分別為pH6.8-pH7.8或pH6.8-pH12.8)。
本發(fā)明的方法中使用的電場由本發(fā)明的設備和方法的電源產(chǎn)生，可以是此方法和設備能夠容忍的任何電壓，如100至10000伏，或500至10000伏，或500至5000伏，假定產(chǎn)生的熱可以在包含電泳緩沖液的整個緩沖間中驅(qū)散，并且能由合適的冷卻而調(diào)節(jié)。提供的電壓可以是DC或AC?？梢蕴峁〥C和AC電流的電源和電極是市場上有售的并且是本領域中已知的。
根據(jù)一個實施方案，電泳溶液的溫度保持在0-30℃的范圍內(nèi)，電場在50V/cm至2000V/cm之間。
根據(jù)又另一個實施方案，電場選自交流電場、直流電場組成的組。如果含有IEF緩沖液的結(jié)晶反應器是閉合的，從而阻止電流從它進入結(jié)晶反應器的的相對面穿出，那么根據(jù)一個實施方案，電場是可逆的。如果結(jié)晶反應器是打開的，那么電場可以或者是直流的即單向的，或者是交流的。
本文使用的術語“緩沖液”或“緩沖溶液”或“電泳緩沖液”是可交換的，用以描述一種溶液，它一方面或者包括一種弱酸(諸如碳酸)和此酸的一種鹽或者一種弱酸的至少一種酸性鹽；另一方面或者包括一種弱堿(如氨)和此堿的一種鹽。具有了這些成分的一種緩沖液能夠根據(jù)每種成分的濃度建立起此溶液的pH。即使在由于其電阻而改變氫-離子濃度而添加酸或堿之后，緩沖液還能夠保持建立起的pH。一種所給緩沖液建立并保持一pH的能力也稱為“緩沖能力”。
根據(jù)又另一個實施方案，一種分離的基本純的蛋白質(zhì)的溶液可以用在本發(fā)明中以得到蛋白質(zhì)晶體?？梢杂扇魏魏线m的本領域中已知的蛋白純化方法得到純的蛋白質(zhì)，包括那些描述于Deutscher(Meth.Enzymology，18283-89，1990)和Scopes(Protein PurificationPrinciples and Practice，Springer-Verlag，N.Y.，1982)中的方法。蛋白質(zhì)純化包括從其它生物材料中分離所需的蛋白質(zhì)，諸如從用編碼所需蛋白質(zhì)的重組核酸轉(zhuǎn)化的細胞的細胞成分中分離。例如，可以采用免疫親和色譜法達到純化，如，使用特異性結(jié)合所需蛋白的抗體。
本文使用的術語“非純化蛋白質(zhì)”和“非高度純化蛋白質(zhì)”是可互換的，以描述一種蛋白質(zhì)，其還沒有完全從成分中分離出，此成分不是其結(jié)構(gòu)的一部分，或者此成分在其天然狀態(tài)中不是伴隨此蛋白質(zhì)的。典型地，一種純化的蛋白質(zhì)在一蛋白樣品中含有大約60至90％W/W的純蛋白質(zhì)、大約95％和大約99％。用在本發(fā)明中的蛋白質(zhì)在IEF步驟之前不必是高度純化的。
根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明提供了一種溶解多種蛋白質(zhì)和快速結(jié)晶一種所選蛋白質(zhì)的方法，包括(a)提供含有至少一生物分子種類的溶液；(b)由電泳溶解此溶液在一種基質(zhì)上，從而在基質(zhì)上得到對應于至少一生物分子種類的至少一帶；(c)從基質(zhì)上分離一部分，此部分包括(b)中溶解的至少一帶；(d)提供至少一個結(jié)晶反應器，包括具有一pH范圍的一種IEF緩沖液，所述pH范圍包含所述至少一帶的pI；(e)把所述至少一帶與所述至少一個結(jié)晶反應器連接；
(f)引入電場到電泳緩沖液，從而在所述至少一個結(jié)晶反應器中產(chǎn)生(b)中溶解的至少一生物分子種類的一種濃縮溶液；及(g)允許(f)中濃縮溶液中的所述至少一生物分子種類在至少一個結(jié)晶反應器中結(jié)晶。
根據(jù)又另一個實施方案，步驟(e)還包括將連接到至少一個結(jié)晶反應器的至少一帶放置在電泳緩沖液中。優(yōu)選地，步驟(e)還包括攪拌電泳緩沖液。有利地，步驟(g)還包括監(jiān)控和/或檢測蛋白質(zhì)晶體的形成。
監(jiān)控和/或檢測晶體的形成可以由以下之一的裝置達到一種檢測結(jié)晶反應器中生物分子樣品的裝置；一種接收來自檢測裝置的數(shù)據(jù)的裝置；和一個用于處理收到的數(shù)據(jù)的裝置。根據(jù)一個實施方案，一個掃描顯微光密度計檢測、接收和處理來自結(jié)晶反應器的信號。
必要的用于檢測結(jié)晶反應器中生物分子樣品、接收來自檢測裝置的數(shù)據(jù)、并處理收到的數(shù)據(jù)的一個或多個裝置可以裝配進一個計算機中。
可以設計一種檢測裝置以發(fā)射電磁輻射，其是同時或按順序地發(fā)射到一個通道上的一個范圍的波長、多個波長、或一個波長。根據(jù)一個實施方案，照明光源是單色的。例如，檢測裝置可以是一種定制的光度計，其在對每個反應器發(fā)射一窄光譜的光之后，快速、連續(xù)地讀出每個結(jié)晶反應器在特定波長的吸收值?？商鎿Q地，可以設計檢測裝置以同時讀出每個反應器和/或?qū)ι婕懊總€反應器在多個波長下發(fā)射的電磁輻射的讀數(shù)。
合適的檢測裝置包括，但不限于，肉眼、分光光度的檢測裝置、化學發(fā)光的(chemiluminescent)檢測裝置、光度的/密度的檢測裝置、電化學的或放射化學的檢測工具，其依賴于生物分子是否標記以及標記的類型。標記可以需要其它的成分以引起反應，此反應產(chǎn)生一個信號或者增強根據(jù)上述方法的可檢測的信號。合適信號產(chǎn)生的系統(tǒng)的詳細描述可以見于美國專利No.5,185,243。附加標記的技術細節(jié)是本領域中已知的，見于例如，Matthews，等人，Anal.Biochem.(1985)151205-209和歐洲專利申請No.0302175。
根據(jù)又另一個實施方案，步驟(b)的溶液由等電聚焦溶解在一種基質(zhì)上，從而在基質(zhì)內(nèi)得到對應于至少一生物分子的等電點的至少一個帶。
根據(jù)又另一個實施方案，步驟(d)的IEF緩沖液的pH范圍不超過0.2pH單位，優(yōu)選地不超過0.1pH單位，更優(yōu)選地不超過0.02pH單位。
根據(jù)一個實施方案，實施本發(fā)明的方法，保持電泳溶液的溫度在0-30℃范圍內(nèi)。根據(jù)另一個實施方案，電泳溶液的溫度保持在0-30℃的范圍內(nèi)，電場在50V/cm至2000V/cm之間。
根據(jù)又另一個實施方案，本發(fā)明提供了多個結(jié)晶反應器，其中每個結(jié)晶反應器的溫度是獨立于任何其它結(jié)晶反應器的溫度的，優(yōu)選地是不同的。溫度是可以調(diào)節(jié)以在本發(fā)明的方法中優(yōu)化擴散和晶體生長的參數(shù)之各種市售的溫度-控制模塊可以適用于本發(fā)明的上下文。適合模塊的范例是設計用于機器人的聚合酶鏈式反應(PCRs)的自動熱循環(huán)裝置，其可以被調(diào)整以符合本發(fā)明的需要。例如，MJ Research的熱循環(huán)裝置(MJR，Waltham，Mass.；如DNA EngineTM、DyadTM、Mini-Cycler、PTC-100TM、TetradTM)以珀爾帖效應(Peltier)加熱和AlpHaTM模塊為特征，其是可互換的并允許使用者快速地改變樣品規(guī)格的加熱塊。一些這樣的循環(huán)裝置以Hot BonnetTM加熱的蓋為特征，并且能用于多種樣品規(guī)格，包括微孔盤和平坦的顯微鏡載物片。另一種適合的系統(tǒng)是SmartCyclerinstrument(CepHeid，Sunnyvale，Calif.)。此系統(tǒng)是基于company’sI-CORE微觀流體基技術的、溫度-控制模塊，其允許每個樣品處于不同的實踐條件下。Stratagene’s RoboCycler(La Jolla，Calif.)提供了另一種合適的溫度控制模塊。RoboCycler特色為4種程序塊并提供了一種簡化優(yōu)化的梯度特征。這種循環(huán)裝置的獨特在于它采用一個機械臂來從一個塊向另一個塊移動樣品，其中每個塊中的溫度是不同的。
已經(jīng)有一系列公開文件涉及開口(“樣品井”)的各種構(gòu)造，此開口用于裝載大分子和含有-大分子的樣品到凝膠的表面，平板凝膠最通常地用于蛋白質(zhì)或核酸分離。在每個例子中，設計這些樣品井，在所述大分子遷移穿過溶解的凝膠之前，濃縮樣品中的大分子到一個薄的起始區(qū)域。以下的參考描述了裝置的應用，其放置在相對于凝膠的位置以形成井美國專利No.5,304,292描述了可壓縮的墊片在一個平板頂部上形成井壁的應用，此處這些片的末端接觸板的頂部邊緣。美國專利No.5,164,065描述了與DNA序列凝膠一起使用的一種鯊魚齒梳。
快速結(jié)晶的設備本發(fā)明也提供了用于快速結(jié)晶的設備。根據(jù)又另一個實施方案，本發(fā)明提供了適于引導快速形成蛋白質(zhì)晶體的一種設備，包括(a)至少一個結(jié)晶反應器，此至少一個結(jié)晶反應器包括一種IEF緩沖液，此至少一個結(jié)晶反應器被包含在緩沖室中；(b)產(chǎn)生電場的裝置；以及可選的，(c)用于循環(huán)包含在緩沖間中流體的裝置。
根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明的設備包括一個固定器，此固定器具有一個上面和一個下面，此固定器包括至少一個結(jié)晶反應器，或者適于支撐包括至少一個結(jié)晶反應器的基質(zhì)，所述至少一個結(jié)晶反應器含有一種IEF緩沖液，固定器包含在緩沖室中。根據(jù)另一個實施方案，固定器配置在至少一個緩沖間中。根據(jù)某一實施方案，固定器是含有至少一個結(jié)晶反應器的毛細管。
根據(jù)又另一個實施方案，本發(fā)明的設備還包括兩個具有兩個末端的鹽橋，每個鹽橋的一個末端與固定器的一個末端接觸，以及每個鹽橋的一個末端包含在至少一個緩沖室中。優(yōu)選地，本發(fā)明的設備包含兩個緩沖室，這樣每個緩沖室圍繞一個鹽橋的一個末端。
典型地，鹽橋起到一個離子導體的作用，并且通常設在至少一個結(jié)晶反應器和緩沖間內(nèi)的緩沖液之間，結(jié)晶反應器包括一種生物分子溶液或含有所述生物分子溶液的元件諸如固定器和/或基質(zhì)。適于本發(fā)明的設備的鹽橋的例子包括玻璃、陶瓷材料或裝滿離子導體的塑料管，此離子導體可以由溶解一種電解質(zhì)諸如氯化鉀或硝酸鉀到瓊脂中而得到。
根據(jù)另一個實施方案，緩沖間適于儲存一種溶液，此溶液包括一種電泳緩沖液和至少一類溶解在此電泳緩沖液中的生物分子。
根據(jù)又另一個實施方案，固定器具有至少一個腔，其中此至少一個腔適于放置包含一種IEF緩沖液和一種聚合物的一個結(jié)晶反應器。
根據(jù)又另一個實施方案，固定器包括多個腔，每個腔包括一個包含一種IEF緩沖液和一種聚合物的結(jié)晶反應器。
根據(jù)又另一個實施方案，多個結(jié)晶反應器中IEF緩沖液的pH范圍不重疊。
在描述的這類設備中的包括多個結(jié)晶反應器的固定器，可以以任何所需的構(gòu)造布置，例如水平串聯(lián)的結(jié)晶反應器并排排列，并由慣用的間隔物分開，或者垂直串聯(lián)。
現(xiàn)在參照圖1，本發(fā)明的設備包括一個緩沖室，其含有一對電極，即陽極和陰極，以及電泳緩沖液。設備還含有結(jié)晶反應器，其包括一種固定化的緩沖液(圖1A)、毛細管中的結(jié)晶反應器(圖1B)或包括多個不同的和隔離的pH帶的定制的IPG條(圖1C)。
現(xiàn)在參照圖2和圖3，本發(fā)明的設備包括封閉于一個緩沖室(2)內(nèi)的一個緩沖間(1)、一個固定器(3)、多個包括結(jié)晶反應器(5)和電極(6)的腔(4)。
根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明的設備包括多個結(jié)晶反應器，每個結(jié)晶反應器包括一種IEF緩沖液，任意地此IEF緩沖液是聚合的。多種IEF緩沖液產(chǎn)生的pH范圍的上限和下限可以是不同或可以是相同的。例如，結(jié)晶反應器#1中的IEF緩沖液的pH范圍可以開始于pH6.8結(jié)束于pH7.8，及結(jié)晶反應器#2中的IEF緩沖液的pH范圍可以開始于pH7.9結(jié)束于pH8.9。而且結(jié)晶反應器#1與結(jié)晶反應器#2中IEF緩沖液之間的pH差可以是不同的或可以是相同的pI單位。
根據(jù)又另一個實施方案，IEF緩沖液的pH范圍可以是寬的、窄的或極窄的，如覆蓋0.1pH單位或更少、0.02pH單位或更少、或0.01pH單位或更少。
根據(jù)又另一個實施方案，使用本發(fā)明的設備進行IEF步驟，其中緩沖間包括電泳緩沖液，還包括一個包含多個腔固定器，所述腔含有多個結(jié)晶反應器，此結(jié)晶反應器中含有IEF緩沖液。使用此裝備，多個腔由物理分離彼此分離，其基本上阻止了生物分子不是穿過電泳緩沖液而是直接從一個結(jié)晶反應器移動向另一個。這樣，生物分子主要是穿過電泳緩沖液從一個結(jié)晶反應器向另一個移動。在另一個實施方案中，結(jié)晶反應器包括同樣的或者不同的pH范圍。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括大量的不連續(xù)的、隔離的結(jié)晶反應器，其具有基本上不-重疊的pH范圍，這樣可以使用一個單獨裝備結(jié)晶多種不同的蛋白質(zhì)。而且，使用本發(fā)明的設備、系統(tǒng)和方法，其中結(jié)晶反應器包括具有狹窄、優(yōu)選地極其窄的pH范圍的IEF緩沖液，由于本發(fā)明方法的大的溶解能力，尤其是與常規(guī)的IEF凝膠比較，可行的是在一個裝備中結(jié)晶多個pI值差距為0.02pH單位或更小的不同蛋白質(zhì)。
根據(jù)此系統(tǒng)的一個結(jié)構(gòu)，通過使用本發(fā)明的設備，假定含有結(jié)晶反應器的固定器包括一種對生物分子是不可滲透的材料，避免了生物分子從一個結(jié)晶反應器向一相鄰的結(jié)晶反應器的擴散，如，在含有略微不同的pH范圍的IEF緩沖液的結(jié)晶反應器之間。
當以下術語出現(xiàn)在整個說明書和權(quán)利要求中，它們用于本發(fā)明的設備的各元件，這些術語如下術語“緩沖室”或“電泳緩沖室”是可互換地使用，表示存儲含有蛋白質(zhì)溶液的緩沖液的容器或儲蓄器。術語“母體”或“芯片”或“陣列”或“固定器”是可互換地使用的，表示含有結(jié)晶反應器的元件。
快速結(jié)晶的應用快速大分子結(jié)晶是對貯藏、藥物設計和藥物運輸有很大工業(yè)價值的。工業(yè)上也需要制備大量的結(jié)晶的大分子。本領域中沒有已知的結(jié)晶工藝適于工業(yè)-規(guī)模的生產(chǎn)，因為通常有晶體不生長的風險，和晶體事實上開始生長了但需要很長時間以得到理想大小的晶體的不切實可行的情況。
產(chǎn)生快速有效的用于大-規(guī)模的大分子結(jié)晶尤其是蛋白質(zhì)結(jié)晶的技術的動機在于首先，期望產(chǎn)生純的結(jié)晶狀態(tài)的大分子。這種晶體構(gòu)成蛋白質(zhì)或核酸用于治療和疫苗的配藥制劑的尤其有利的形式。本發(fā)明提供了結(jié)晶大分子的快速方法?？梢砸龑Т?規(guī)模結(jié)晶作為臨床制造工藝的最終純化步驟和/或濃縮步驟，諸如用于制造治療劑和疫苗的工藝。而且，大-規(guī)模結(jié)晶可以代替制造工藝中的一些純化步驟。例如，蛋白質(zhì)結(jié)晶可以使蛋白質(zhì)制劑的生產(chǎn)流線化而使得它的可提供性更強。
第二，貯存大分子晶體比貯存溶液有利，由于所有反應率的明顯減少，溶液中發(fā)生的大分子的相互作用在晶體狀態(tài)被阻止或顯著減少了。這樣，結(jié)晶狀態(tài)尤其適于貯存生物大分子的混合物。晶體的保存期可以通過把晶體封裝在一種母體中而進一步延長，此母體含有一種聚合載體以形成如美國專利6,541,606公開的組合物。此組合物增強保存蛋白質(zhì)的天然的生物活性的三級結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生一種儲蓄器，其在需要的時間和位置緩慢地釋放活性蛋白質(zhì)。
第三，能夠容易地再生固體結(jié)晶制品以產(chǎn)生易于使用的具有較高蛋白質(zhì)濃度的非腸道制劑。當制劑打算用于皮下給藥時，認為這種蛋白質(zhì)濃度是尤其有用的，見于例如國際專利出版物No.WO97/04801。用于皮下給藥，注射體積1.5ml或更少是較好地耐受性的。因此，對給藥劑量為每周1mg/kg的蛋白質(zhì)，需要蛋白質(zhì)濃度為至少50mg/ml，優(yōu)選地是100-200mg/ml。由于聚集問題，在液體制劑中難以達到這樣的濃度。使用本發(fā)明方法得到的蛋白質(zhì)晶體能容易地達到這樣的濃度。
第四，蛋白質(zhì)晶體也成為用于藥物劑量制劑的一種尤其有利的形式。晶體可以用作體內(nèi)緩慢釋放制劑的一個基礎。本領域技術人員將認識到，顆粒大小對晶體的分解和活性的釋放是重要的。人們也已經(jīng)知道，如果晶體具有大致均勻的顆粒大小并且不含有無定形沉淀，釋放率將更可預測，例如見于歐洲專利No.265,214。這樣，在可植入裝置中可有利地使用蛋白質(zhì)晶體，例如見于國際專利出版物No.WO96/40049。植入的儲蓄器通常為25-250μl的數(shù)量級。在這種體積限制下，優(yōu)選的是高濃度(大于10％)和量最小的懸浮載體的制劑。由本發(fā)明方法得到的蛋白質(zhì)晶體可以容易地在非-含水懸浮液中以這樣的高濃度配制。
第五，晶體的另一個優(yōu)點是可以操縱一些變量以調(diào)節(jié)大分子隨著時間的釋放。例如，晶體大小、形狀、帶有影響溶解的賦形劑的制劑、交聯(lián)、交聯(lián)的水平和在聚合物母體中的封裝，以上這些都可以調(diào)節(jié)以產(chǎn)生生物分子的運輸載體。
本發(fā)明提供了上述的需要。本發(fā)明方法的以下優(yōu)點使它適于大分子的高產(chǎn)量工業(yè)結(jié)晶1.從少量稀的、不必純化的蛋白質(zhì)樣品生長晶體的能力。
2.在幾小時甚至幾分鐘內(nèi)，快速地產(chǎn)生濃縮的蛋白質(zhì)溶液或濃縮蛋白質(zhì)帶。
3.集聚在結(jié)晶反應器中的大分子是不帶電或帶有很小電荷的，這樣靜電排斥是可以忽略或不存在的。
4.在形成濃縮的大分子溶液或形成晶體過程中不發(fā)生沉積、對流或沉淀。
5.晶體生長可以是極其快的，以分鐘或小時為數(shù)量級的時間內(nèi)。
6.由此方法的IEF元件在結(jié)晶過程中的蛋白質(zhì)樣品加工中的純化，排除了雜質(zhì)和其它異構(gòu)重整形式的可能污染物，這樣本方法相對于現(xiàn)有的結(jié)晶方法能夠以較不純的蛋白樣品操作。
7.選擇應用本發(fā)明的方法，使用毛細管中的結(jié)晶反應器尤其適于結(jié)晶學，因為不需要從反應器轉(zhuǎn)移晶體到另一個不同環(huán)境。這樣的轉(zhuǎn)移有破壞晶體的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的風險。
本發(fā)明方法的前述優(yōu)點使它適于對所給蛋白質(zhì)的單獨異構(gòu)重整形式同時分離和結(jié)晶。
根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明提供了用于高產(chǎn)量快速大分子結(jié)晶的小型化和自動的設備和方法?？梢詷?gòu)造本發(fā)明的設備以具有自動的互相作用元件，例如，用于用包括IEF緩沖液(固定化電解質(zhì)、兩性電解質(zhì)等)的預-聚合的結(jié)晶反應器以填充腔的滴定器、用于從腔或結(jié)晶反應器回收蛋白晶體的提出器、和用于監(jiān)控和記錄結(jié)晶反應器中蛋白晶體形成的裝置。
據(jù)本發(fā)明的原理形成的晶體的進一步穩(wěn)定性由用于此目的的本領域中任何已知方法來達到。例如，晶體可以被封裝如在美國專利6,541,606中公開的，或者插入到一個毛細管中，然后使用牙蠟或硅脂把毛細管和其內(nèi)少量的保持水合的結(jié)晶介質(zhì)一起密封以隔絕空氣(McPHerson et al.，ibid)。
根據(jù)本發(fā)明的方法和設備的結(jié)晶工藝的最優(yōu)化，可以通過一個單個試驗得到，此試驗使用帶有不同凝膠濃度(孔徑、擴散常數(shù))和各種蛋白稀釋物的多個結(jié)晶反應器。每個結(jié)晶反應器也可以置于不同溫度下。
實施例實施例1-結(jié)晶p53蛋白的一成分提供3種蛋白樣品(a)p53人DBD[pI(理論的)＝8.83](b)來自秀麗線蟲(C Elegans)的β-轉(zhuǎn)錄因子[pI(理論的)＝5.98](c)人類β-轉(zhuǎn)錄因子-[pI(理論的)＝5.5]所有三種樣品都在pH3-10的市售IPG條(Amersham)上以起始IEF分析確定特定蛋白質(zhì)的pH(圖4)。如圖4中可見，發(fā)現(xiàn)三種“純化的”蛋白質(zhì)溶液中的每一種都被發(fā)現(xiàn)具有大量不同蛋白質(zhì)帶。
用于根據(jù)本發(fā)明方法結(jié)晶，選擇了一條相應于特定蛋白質(zhì)某一pI的帶。使用自制的pH值鄰近理論pI的IPG條和設備來實現(xiàn)結(jié)晶，如圖4C所示?？焖俚匦纬珊苌俚木w。晶體從IPG凝膠萃取出，在2.8埃分辨率從p53樣品得到的散射圖形是典型的多-晶體樣品。
實施例2-由使用一種IPG縮放條結(jié)晶一種IEF分離的蛋白質(zhì)的可行性示范因為我們的結(jié)晶技術只需要微克量的蛋白質(zhì)，由IEF分離可以作為得到晶體的材料來源。對從p53樣品分離得到的帶之中的一條進行這樣的實驗，如圖5所見。
采用以下的步驟從我們選擇的IPG條切下在pH～9.6的帶，選擇使用圖4C表示的系統(tǒng)來結(jié)晶。為了這個目的，制備范圍在9.5-9.75、差為0.05的短IPG縮放條。用標準密度梯度法制備此條。從IEF試驗切下的蛋白質(zhì)帶用聚丙烯酰胺粘到靠近IPG條邊緣上。此條放在圖4C所示電泳室頂部上。標準IEF步驟得到分離片段的聚焦和結(jié)晶，此分離片斷產(chǎn)生高質(zhì)量晶體，如圖6A所示。分辨率為2.4埃的衍射花樣表現(xiàn)于圖6B。
實施例3-肌紅蛋白結(jié)晶在1.5ml水中溶解馬心臟肌紅蛋白(75μg)，并導入結(jié)晶設備中。此溶液作為IEF步驟的電泳緩沖液(pH＝7.00)。ImmobilineTM緩沖液(Amersham)聚合到10％聚丙烯酰胺凝膠圓柱形腔中，其直徑1mm、深1mm(pH＝6.80)。在以下條件下進行IEF分離1200V、30min、電極間距離為0.5cm。
在4℃強烈搖動的設備中進行IEF，以促進蛋白質(zhì)在緩沖溶液中的遷移。對IEF步驟進行的有效標準表明，在凝膠腔中聚集的蛋白質(zhì)的量，是溶液中總蛋白質(zhì)的大約50％。
在顯微鏡下對凝膠腔的檢查表明凝膠中有高度形成的結(jié)晶結(jié)構(gòu)(圖7A)。
實施例4-血紅蛋白S結(jié)晶血紅蛋白S的溶液(水中1μg/ml；Sigma)、pI＝7.0，通過等電聚焦?jié)饪s到一種pH范圍為6.9-7.05的pH緩沖液(4％聚丙烯酰胺凝膠中的ImmobilineTM)中。在25℃下，施加1000V/cm的電場30分鐘。30分鐘后得到一種400μm長的晶體(圖7B)。
實施例5-藻青蛋白結(jié)晶在1μg/ml的市售的藻青蛋白(1μg；Sigma)溶液中，pI大約為4.5，置于pH范圍為4.4-4.6的pH緩沖液(4％聚丙烯酰胺膠中的ImmobilineTM)中進行IEF步驟。等電聚焦條件是25℃、100V/cm的電場、30分鐘試驗時間。30分鐘后得到晶體(圖8A)。
類似地，得到醇脫氫酶(圖8B)和谷氨酸脫氫酶(GDH；圖9A)的晶體。
實施例6-水通道蛋白3結(jié)晶通常認為膜蛋白對結(jié)構(gòu)確定最重要的蛋白質(zhì)。不幸地，用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的大多數(shù)標準方法沒能產(chǎn)生膜蛋白的晶體。本實施例證明了本發(fā)明的方法使水通道蛋白結(jié)晶的能力，水通道蛋白是最重要的膜蛋白之一。
pI＝6.7的鼠水通道蛋白3的溶液(1μg/ml；Alpha DiagnosticInternational)在含有水和AmpholinTM(Amersham)的電泳緩沖液中，用于結(jié)晶步驟。在pH凝膠腔(4％聚丙烯酰胺凝膠，pH 6.65-6.8)中蛋白質(zhì)的濃縮步驟由IEF進行，使用以下條件試驗時間40分鐘、25℃和100V/cm。得到的晶體展示于圖9B。
實施例7-牛碳酸酐酶結(jié)晶牛碳酸酐酶的溶液(1μg；Sigma)，pI為5.95，通過IEF濃縮到pH5.8-6.0的pH凝膠間(腔；4％聚丙烯酰胺)中。此濃縮步驟在25℃和100V/cm電場中耗時40分鐘。40分鐘后，得到晶體(圖10)。
實施例8-胃蛋白酶-4、肌酸激酶1、β-人生長因子、抗生物素蛋白、赫賽汀、Ly1溶菌酶、核糖核酸酶-1和前列腺素結(jié)晶胃蛋白酶-4、肌酸激酶(CK)、β-人類生長因子(βhGF)、抗生物素蛋白、赫賽汀、Ly1溶菌酶、核糖核酸酶-1(RNAse-1)和前列腺素的蛋白質(zhì)結(jié)晶，操作如表1詳述。所得到的晶體和/或結(jié)晶蛋白質(zhì)的衍射片斷見于圖11-15。
表1

1聚丙烯酰胺膠特定實施方案的以上描述將十分完全地揭示本發(fā)明的一般性質(zhì)，以至于其他人可以通過采用現(xiàn)有的知識易于調(diào)整和/或適于這樣的實施方案的各種應用，而沒有不適當試驗和沒有偏離一般概念，因此這樣的調(diào)適和改進應該并且傾向于包括在所公開的實施方案的等價的意義和范圍內(nèi)。需要人們理解的是，本文采用的措詞和術語學是為了描述本發(fā)明而非限制本發(fā)明。用于實現(xiàn)各種所公開的功能的工具、材料、和步驟可以采用各種可替換的形式而不偏離本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種生物分子快速結(jié)晶的方法，包括(a)提供至少一生物分子種類；(b)提供包括具有一pH范圍的IEF緩沖液的至少一個結(jié)晶反應器，所述pH范圍包含所述至少一生物分子種類的pI；(c)把所述至少一生物分子種類與所述至少一個結(jié)晶反應器接觸；(d)引入一電場到所述至少一個結(jié)晶反應器，從而產(chǎn)生所述至少一生物分子種類的一種濃縮溶液；及(e)在所述至少一個結(jié)晶反應器中得到至少一種晶體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(c)還包括將所述至少一個結(jié)晶反應器和所述至少一生物分子種類放置在電泳緩沖液中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，還包括攪拌所述電泳緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(e)還包括監(jiān)控生物分子晶體的形成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其中所述結(jié)晶在24小時內(nèi)發(fā)生，優(yōu)選地在少于12小時內(nèi)發(fā)生。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一生物分子種類選自肽、蛋白質(zhì)、多肽、酶、抗體、蛋白質(zhì)-DNA復合物、包括化學個體的蛋白質(zhì)復合物、多核苷酸、DNA、RNA、抗原、抗原決定部位和其變體、激素、碳水化合物、類脂、磷脂和生物素標記探針組成的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述生物分子種類選自多肽或蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)中所述至少一生物分子種類是固定化到一種基質(zhì)上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個結(jié)晶反應器設在一個毛細管中。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個結(jié)晶反應器連接、結(jié)合或基本上鄰接到一種固體基質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述IEF緩沖液還包括一種聚合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述聚合物選自線型聚合物、支化聚合物、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、水凝膠、纖維素、改性纖維素、交聯(lián)聚乙烯醇、交聯(lián)聚氧化乙烯和乙二醇聚合物組成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述至少一個結(jié)晶反應器是圓柱形。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述圓柱形的直徑從大約20μm至大約10mm，長度從大約0.5mm至大約10mm。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述IEF緩沖液的pH范圍不超過0.2pH單位。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述IEF緩沖液的pH范圍不超過0.02pH單位。
17.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述電泳緩沖液的溫度保持在0-30℃的范圍內(nèi)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述電場保持在50V/cm到2000V/cm之間。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述電場以DC或AC供電。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項所述的方法，其中步驟(b)中提供了多個結(jié)晶反應器，每個結(jié)晶反應器包括一種IEF緩沖液。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述IEF緩沖液的pH范圍不超過0.2pH單位。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述IEF緩沖液的pH范圍不超過0.02pH單位。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述多個結(jié)晶反應器中的所述IEF緩沖液彼此不同。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述多個結(jié)晶反應器中的所述pH范圍彼此部分重疊。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述pH范圍不重疊。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中一種或多種IEF緩沖液之間的所述pH差不超過0.1pH單位。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中一種或多種IEF緩沖液之間的所述pH差不超過0.02pH單位。
28.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述結(jié)晶反應器彼此隔離。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述多個結(jié)晶反應器連接、結(jié)合或基本上鄰接到一種固體基質(zhì)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述多個結(jié)晶反應器以部分可尋址的方式連接、結(jié)合或基本上鄰接到一種固體基質(zhì)。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述基質(zhì)是生物分子不可滲透的。
32.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述基質(zhì)是離子不可滲透的。
33.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述多個結(jié)晶反應器連接、結(jié)合或基本上鄰接到一種固體基質(zhì)，所述基質(zhì)的設置選自固定化pH梯度條、pH膜和預制凝膠組成的組。
34.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括在所述步驟(a)之前將一種含有至少一生物分子種類的溶液分類的步驟。
35.一種方法，用于將一種含有至少一生物分子種類的溶液分類并快速結(jié)晶至少一類生物分子，包括(a)提供含有多種生物分子的一種介質(zhì)；(b)在一種基質(zhì)上將多種生物分子分類，從而在所述基質(zhì)上得到包括至少一生物分子種類的至少一個位點；(c)從所述基質(zhì)回收一個部分，所述部分包括所述至少一個位點；(d)提供至少一個結(jié)晶反應器，所述結(jié)晶反應器包括具有一PH范圍的IEF緩沖液，所述PH范圍包含所述至少一類生物分子的pI；(e)把步驟(c)中所述部分與所述至少一個結(jié)晶反應器接觸；(f)引入一電場到所述至少一個結(jié)晶反應器，從而在所述至少一個結(jié)晶反應器內(nèi)產(chǎn)生所述至少一生物分子種類的一種濃縮溶液；及(g)在(f)所述至少一個結(jié)晶反應器中得到至少一種晶體。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中步驟(b)由選自以下之一的方法實現(xiàn)等電聚焦、薄層色譜法包括高效液相色譜(HPLC)技術、和凝膠電泳。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述方法在非-變性條件下進行。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中步驟(b)中的分類是通過聚集所述至少一生物分子種類。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中步驟(e)還包括在電泳緩沖液中沉積所述部分和所述至少一個結(jié)晶反應器。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，還包括攪拌所述電泳緩沖液。
41.根據(jù)權(quán)利要求35-40任一項所述的方法，其中所述至少一生物分子種類選自一種蛋白質(zhì)或一種多肽。
42.根據(jù)權(quán)利要求35-41任一項所述的方法，其中所述晶體是在24小時內(nèi)獲得，優(yōu)選地在少于12小時內(nèi)獲得。
43.根據(jù)權(quán)利要求35-42任一項所述的方法，其中所述IEF緩沖液包括一種聚合物。
44.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述pH范圍覆蓋不超過0.2pH單位。
45.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述電泳緩沖液的溫度保持在0-30℃的范圍內(nèi)。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述電場在50V/cm到2000V/cm之間。
47.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述電場以DC或AC供電。
48.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中步驟(b)中的所述基質(zhì)是一種凝膠。
49.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中步驟(b)中的所述基質(zhì)包括一種聚合物，所述聚合物選自聚丙烯酰胺、瓊脂糖、水凝膠、纖維素、硝化纖維素、改性纖維素、交聯(lián)聚乙烯醇、交聯(lián)聚環(huán)氧乙烷和乙二醇聚合物組成的組。
50.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中步驟(d)中提供了多個包括多種IEF緩沖液的結(jié)晶反應器，每種IEF緩沖液建立一pH范圍，其中至少一種IEF緩沖液建立含有所述至少一種生物分子的pI的一pH范圍。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述pH范圍不超過0.2pH單位。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述狹窄pH范圍不超過0.02pH單位。
53.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述多種IEF緩沖液包括一種聚合物。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述多種IEF緩沖液的pH范圍部分重疊。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述多種IEF緩沖液的pH范圍不重疊。
56.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述多個結(jié)晶反應器彼此分離。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述多個結(jié)晶反應器連接、結(jié)合或基本上鄰接到一種固體基質(zhì)。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述多個結(jié)晶反應器以部分可尋址的方式連接、結(jié)合或基本上鄰接到一種固體基質(zhì)。
59.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述基質(zhì)是生物分子不可滲透的。
60.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述基質(zhì)是離子不可滲透的。
61.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述多個結(jié)晶反應器連接、結(jié)合或基本上鄰接到一種固體基質(zhì)，所述基質(zhì)的設置選自固定化pH梯度條、pH膜和預制凝膠組成的組。
62.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中一種或多種IEF緩沖液之間的所述pH差不超過0.1pH單位。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中一種或多種IEF緩沖液之間的所述pH差不超過0.02pH單位。
64.一種適于引導生物分子晶體快速形成的設備，包括(a)具有一個上面和一個下面的緩沖室，所述下面用一個底密封，如此緩沖室圍繞了至少一個能夠存儲流體的緩沖間；(b)至少一個結(jié)晶反應器，所述至少一個結(jié)晶反應器包括一種IEF緩沖液，所述至少一個結(jié)晶反應器包含在所述緩沖室中；(c)一種產(chǎn)生電場的裝置；及可選的，(d)循環(huán)所述至少一個緩沖間內(nèi)包含的流體的裝置。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的設備，其中組件(b)是一個具有兩個末端、一個上面和一個下面的固定器，所述固定器包括至少一個結(jié)晶反應器，所述至少一個結(jié)晶反應器包括一種IEF緩沖液，所述固定器被包含在所述緩沖間內(nèi)。
66.根據(jù)權(quán)利要求64所述的設備，還包括具有兩個末端的兩個鹽橋，每個鹽橋的一末端與所述固定器的一末端接觸，每個鹽橋的一末端包含在所述至少一個緩沖室內(nèi)。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的設備，包括兩個緩沖室，每個緩沖室圍繞一個鹽橋的一末端。
68.根據(jù)權(quán)利要求65所述的設備，其中所述固定器是一種適于包括至少一個結(jié)晶反應器的毛細管。
69.根據(jù)權(quán)利要求64所述的設備，所述設備還包括一個控制溫度的模塊，所述模塊能夠控制所述至少一個反應器的溫度。
70.根據(jù)權(quán)利要求64所述的設備，其中組件(b)包括一個固定器，所述固定器適于支撐包括至少一個結(jié)晶反應器的一種基質(zhì)。
71.根據(jù)權(quán)利要求65所述的設備，其中所述固定器包括至少一個腔，其中所述至少一個腔適于包含一個結(jié)晶反應器。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的設備，其中所述固定器包括多個腔，如此每個腔都適于包含一個結(jié)晶反應器。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的設備，其中一個腔中的一個結(jié)晶反應器的溫度與另一個腔中的另一個結(jié)晶反應器的溫度不同。
74.根據(jù)權(quán)利要求64所述的設備，其中所述緩沖室包括一種非傳導材料。
75.根據(jù)權(quán)利要求65所述的設備，其中所述固定器包括一種材料，所述材料的電阻比所述結(jié)晶反應器中包含的所述聚合物的電阻大。
76.根據(jù)權(quán)利要求75所述的設備，其中所述非傳導材料選自聚-N-甲基甲基丙酰胺、丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、陶瓷、玻璃和聚-甲基-丙烯酸甲酯組成的組。
77.根據(jù)權(quán)利要求70所述的設備，其中所述固定器包括一種對生物分子不可滲透的材料。
78.根據(jù)權(quán)利要求64所述的設備，還適于在顯微鏡下檢測所述至少一個結(jié)晶反應器。
79.根據(jù)權(quán)利要求64所述的設備，其中所述用于產(chǎn)生電場的裝置包括多個電極。
80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的設備，其中所述多個電極包括一種金屬，所述金屬選自鉑、鈦、鉻、金、鉭、鈀、氧化鈀、鍺、鎳和銠或包括這些的合金組成的組。
81.根據(jù)權(quán)利要求64所述的設備，其中所述產(chǎn)生電場的裝置供應DC或AC電流。
82.根據(jù)權(quán)利要求64所述的設備，其中所述緩沖間適于儲存一種溶液，所述溶液包括電泳緩沖液和溶解在電泳緩沖液中的至少一種生物分子。
83.根據(jù)權(quán)利要求64所述的設備，是小型化的。
84.根據(jù)權(quán)利要求83所述的設備，還是自動的。
85.根據(jù)權(quán)利要求64所述的設備，其中所述生物分子選自肽、蛋白質(zhì)、多肽、酶、抗體、蛋白質(zhì)-DNA復合物、包括化學個體的蛋白質(zhì)復合物、多核苷酸、DNA、RNA、抗原、抗原決定部位和其變體、激素、碳水化合物、類脂、磷脂和生物素標記探針組成的組。
86.根據(jù)權(quán)利要求85所述的設備，其中所述生物分子是一種蛋白質(zhì)。
87.根據(jù)權(quán)利要求64所述的設備，其中結(jié)晶在24小時內(nèi)發(fā)生，優(yōu)選地在少于12小時內(nèi)發(fā)生。
全文摘要
本發(fā)明涉及促進從生物分子的溶液中快速形成生物分子晶體的方法和設備，所述生物分子優(yōu)選蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)溶液在電場中根據(jù)其等電點經(jīng)歷快速濃縮。根據(jù)本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)結(jié)晶在幾小時內(nèi)或更短時間內(nèi)發(fā)生。
文檔編號G01N1/10GK1867706SQ200480030269
公開日2006年11月22日 申請日期2004年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月3日
發(fā)明者史密爾·布克施班 申請人:拜爾弗姆斯公司