專利名稱：：包含重組序列基序的構建體在增強蘚類中基因表達中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及在真核細胞內、具體為包括于蘚類中的植物細胞(例如蘚類原絲體細胞)內提高基因表達的方法和材料?，F(xiàn)有技術在哺乳動物細胞培養(yǎng)中用于提高重組蛋白質表達的基因擴增是常用的策略(Herlitschka等人，(1996)ProteinExpr.Purif.8，358-364，Ringold等人，(1981)J.Mol.Appl.)。由于異源DNA的多拷貝整合能夠觸發(fā)的沉默事件，在植物中實現(xiàn)基因擴增策略是難以解決的(Asaad等人，(1993)PlantMolBiol.22，1067-1085)。最近，開發(fā)了植物中的基因擴增策略以克服這些局限性。從煙草核糖體DNA的非轉錄間隔區(qū)分離了順式作用遺傳因子aps。將所述間隔元件與目的報道基因融合，并引起目的異源基因拷貝數(shù)增加以及由此導致的異源蛋白質的更高的表達水平(Borisjuk等人，(2000)NatureBiotechnol.18，1303-1306)。Klimyuk等人描述了涉及通過反式剪接表達異源蛋白質的另一個策略(WO02/097080)。至今，關于轉基因蘚類植物中拷貝數(shù)與異源基因表達的相關性知之甚少。蘚類在生產重組蛋白質中的用途是相當確定的技術(EP1206561，Gorr等人，2001，Naunyn-Schmiedeberg′sArch.Pharmacol.363Suppl.R85)。通?？梢詫?至約50拷貝的轉化質粒中的任何一種整合到轉化的蘚類組織基因組中(Schaefer(2002)Annu.Rev.PlantBiol.53，477-501)。取決于使用的轉化構建體的設計，可以發(fā)生同源重組(即定向整合事件)和/或異源重組(即隨機或非定向整合事件)。因此，使用與蘚類基因組DNA序列同源的DNA序列(即包含編碼或非編碼序列)用于轉化，可以通過引入的或轉化DNA向同源DNA基因組基因座中的整合引起一個或多個同源重組事件。使用與蘚類基因組DNA序列缺乏任何可評估的同源性的DNA序列(即包含編碼或非編碼序列)用于轉化，可以通過引入的DNA向基因組中的隨機整合引起一個或多個異源重組事件。蘚類是唯一已知的顯示高頻率同源重組的植物體系(Strepp等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，4368-4373；Schaefer(2002)Annu.Rev.PlantBiol.53，477-501)。蘚類這一明顯獨特的性質已被用于基因的定向引入。然而，通過增加目的質?？截悢?shù)來擴增基因表達以產生每單位質量穩(wěn)定轉化的蘚類組織中更高水平的蛋白質迄今尚未得到描述。令人驚訝的是，以至少兩個含有至少一套重組序列的異源核酸序列轉化(通常共轉化)蘚類組織細胞(原生質體)，在再生組織(例如蘚類原絲體中含有的細胞)中會引起異源核酸構建體的整合拷貝數(shù)的增加，所述整合拷貝數(shù)的增加反過來與蛋白質表達水平的增加相關。因此本發(fā)明的目的是提供改進的在蘚類組織所含細胞中產生目的蛋白質的方法。
發(fā)明內容根據(jù)本發(fā)明，提供了在蘚類植物細胞中擴增基因表達的方法，其包括1)提供至少第一個異源核酸構建體，所述異源核酸構建體包含至少一個與啟動子可操作地連接的異源核苷酸序列，其中該構建體在其5′末端以第一個重組序列為側翼，在該構建體的3′末端以與第一個相同方向的第二個重組序列為側翼；2)提供至少第二個異源核酸構建體，所述異源核酸構建體包含至少一個與啟動子可操作地連接的異源核苷酸序列，其中該構建體在其5′末端以所述第二個重組序列為側翼，在該構建體的3′末端以與第二個相同方向的所述第一個重組序列為側翼；以及3)將至少所述第一個和所述第二個異源核酸構建體轉化到蘚類植物細胞中。技術人員將理解，一旦將所述至少兩個異源構建體轉化到蘚類植物細胞(諸如蘚類原生質體，例如允許后來再生為例如小立碗蘚(Physcomitrellapatens)的蘚類原絲體的小立碗蘚原生質體)中，它們將經歷重復多次的相互重組。一旦在蘚類植物細胞中啟動，該過程將增加整合的本發(fā)明的轉化DNA構建體的拷貝數(shù)。因此，作為本發(fā)明的另一方面，提供了蘚類原絲體(優(yōu)選小立碗蘚原絲體)，所述原絲體包含以至少兩個本發(fā)明的互補構建體穩(wěn)定轉化、更優(yōu)選共轉化的細胞。最后，來自至少一個目的異源基因的目的異源蛋白質水平的顯著增加超過了在蘚類原絲體細胞中可測量的來自缺少本發(fā)明構建體特性的常規(guī)轉化構建體的蛋白質水平。至少第一個和至少第二個重組序列形成使本發(fā)明的構建體可能彼此重組的互補組(complementaryset)。技術人員自然會理解，根據(jù)計劃利用多少個相同或不同的目的核苷酸序列來產生蛋白質，可以采用在其中可能使用一個或多個重組序列互補組(例如1、2、3、4或5或更多組)的本發(fā)明的構建體。為方便起見，優(yōu)選使用單個重組序列互補組。本發(fā)明的另一方面，提供了本發(fā)明的異源DNA構建體，其在5′至3′方向包含1)引入的第一個重組序列；2)至少一個目的異源核酸序列，所述核酸序列包含與其可操作地連接的啟動子及任選的其終止子；以及3)引入的第二個重組序列。本發(fā)明的另一方面，提供了本發(fā)明的異源DNA構建體，其在5′至3′方向包含1)引入的第二個重組序列；2)至少一個目的異源核酸序列，所述核酸序列包含與其可操作地連接的啟動子及任選的其終止子；以及3)引入的第一個重組序列。因此兩個構建體含有定位于其中不同位點的相似的互補重組序列，所述互補重組序列使得或允許構建體在蘚類原絲體(例如小立碗蘚原絲體)中含有的轉化的蘚類原絲體細胞中彼此原位重組。本發(fā)明的構建體優(yōu)選為線性形式。可以使用這類構建體以至少兩個單獨的轉化事件轉化蘚類原生質體，其中第一個轉化事件與第二個轉化事件在時間上分離，或可以將本發(fā)明的構建體共轉化到后來允許或能夠再生為蘚類原絲體的蘚類原生質體中。轉化事件優(yōu)選包括以至少兩個如上所述之本發(fā)明的構建體共轉化蘚類原生質體。在本發(fā)明的構建體中利用的重組序列可以是選自任何生物的任何序列，例如植物基因組DNA，例如小立碗蘚基因組DNA、cDNA、內含子或外顯子區(qū)或非編碼區(qū)或其任何組合。用作重組序列的合適的基因組DNA可以包含來自外顯子或內含子或二者雜交體的DNA。優(yōu)選由內含子DNA或非編碼區(qū)DNA形成重組序列。如在此所討論的，兩個側翼重組序列的方向優(yōu)選為相同方向，例如在兩個轉化構建體二者中都為5′至3′方向或為3′至5′方向，盡管重組序列在兩個構建體中的實際位置如上文所提及的各不相同。技術人員自然會理解，本發(fā)明的異源構建體將在使二者之間能夠發(fā)生重組事件的合適的位置和方向包含重組序列。本發(fā)明的構建體的重組核苷酸序列可以是任何長度，前提是其能夠引起或允許重組事件發(fā)生。在本發(fā)明的構建體中采用的重組序列的合適長度在25-1000個核苷酸長度或更長；25-650個核苷酸長度；50-650個核苷酸長度；100-400個核苷酸長度；或200-400個核苷酸長度(例如約200+/-50個核苷酸長度)的范圍內。技術人員將理解，本發(fā)明構建體的重組序列的長度可以根據(jù)設計而變化。作為本發(fā)明的另一方面，提供了含有本發(fā)明的構建體的蘚類細胞、含有所述蘚類細胞的蘚類原絲體和/或含有本發(fā)明的構建體的蘚類植物，具體為蘚類原絲體細胞、包含含有本發(fā)明的構建體的原絲體細胞的蘚類原絲體和/或含有本發(fā)明的構建體的蘚類植物小立碗蘚。現(xiàn)在將更詳細地對本發(fā)明的具體方面進行討論。定義下文廣泛使用術語“異源的”指使用基因工程(即人為干涉)將討論中的基因/核苷酸序列引入蘚類原生質體。異源基因可能增加來自內源等價基因(即通常執(zhí)行相同或相似功能的基因)的目的蛋白質的表達，或者該插入序列可能對于內源基因或其它序列是額外的。對細胞異源的核酸可以非天然存在于該類型、變種或物種的蘚類原生質體中。因此異源核酸可以包含置于蘚類原生質體(例如來自小立碗蘚的原生質體)背景中的特定類型生物(例如哺乳動物物種，例如人類、綿羊、牛、馬或豬物種)的或衍生自該生物的編碼序列。另一種可能是關于將被置于蘚類原生質體中的核酸序列的，該核酸序列或類似物天然存在于所述蘚類原生質體中，但是其中核酸序列與該細胞或該植物的類型或物種或變種的細胞中非天然存在的核酸連接和/或鄰近，例如與一個或多個控制表達的調節(jié)序列(例如啟動子序列)可操作地連接。除非文中另外要求，“基因”指編碼翻譯為肽、多肽或蛋白質的遺傳信息的任何核酸。將“載體”定義為尤其包括可以或不可以自我傳遞或活動、且可以轉化原核或真核宿主并存在于染色體外的、雙鏈或單鏈線性或環(huán)狀形式的任何質粒、粘粒、噬菌體或病毒載體(例如具有復制起點的自主復制質粒)。具體地包括穿梭載體，所述穿梭載體指能夠天然地或經過設計在兩種不同的宿主生物中復制的DNA載體，所述宿主生物選自放線菌及有關物種、細菌和真核生物(例如高等植物、蘚類、哺乳動物、酵母或真菌)細胞?！氨磉_載體”指這樣的載體，在所述載體中，核酸處于合適的啟動子或其它例如微生物細胞或蘚類原生質體的宿主細胞中的轉錄調節(jié)元件的控制下、并與其可操作地連接。該載體可以是在多種宿主中行使功能的雙功能表達載體。在基因組或亞基因組DNA的情況下，所述DNA可以含有其自身的啟動子或其它調節(jié)元件，且在cDNA的情況下，所述cDNA可以處于合適的啟動子或其它宿主細胞中的表達調節(jié)元件的控制下?！皢幼印笔且欢魏塑账嵝蛄?，可以由此起始在下游(即在雙鏈DNA有義鏈的3′方向)可操作地連接的DNA的轉錄?！翱刹僮鞯剡B接的”指作為相同核酸分子的部分連接、為從啟動子起始的轉錄合適地定位并定向。本領域技術人員充分理解應用于啟動子的術語“誘導型的”。處于誘導型啟動子控制下的表達對施加的刺激的反應基本上是“接通”或增加的。刺激的性質在啟動子之間變化。在缺乏合適刺激時，一些誘導型啟動子引起很少或不可檢測水平的表達(或沒有表達)。在缺乏刺激時，其它誘導型啟動子引起可檢測的組成性表達。無論缺乏刺激時的表達水平如何，在正確刺激的存在下，任何誘導型啟動子的表達都增加。本發(fā)明也包括使用任何這些序列的變體。變體蛋白質與上文討論的全部或部分序列具有同源性或相同。一般而言，無論怎樣在此使用該術語，變體都可以是(i)有關蛋白質的天然存在的同源變體，(ii)人工產生的同源變體(衍生物)，技術人員可以根據(jù)此公開內容(例如通過定點或隨機誘變或通過直接合成)制備所述同源變體。編碼變體多肽的變體核酸優(yōu)選從原始核酸直接或間接產生(例如經過一個或多個擴增或復制步驟)。對核酸序列的改變可以通過核酸中一個或多個核苷酸的一個或多個添加、插入、缺失或置換來產生衍生物，從而導致所編碼的多肽中添加、插入、缺失或置換一個或多個氨基酸。為了改變所編碼的多肽的活性(例如特異性)或穩(wěn)定性，所需突變可以是隨機或定點誘變?？梢酝ㄟ^保守變異進行改變，即一個疏水性殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一個，或一個極性殘基取代另一個，例如精氨酸取代賴氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酰胺取代天冬酰胺。也包括具有非保守置換的變體。在決定肽構象或活性的關鍵區(qū)域內，這類改變可能為多肽賦予有利的特性，例如改變的穩(wěn)定性或特異性。在變體的情況下，優(yōu)選通過使用FASTA和FASTP(見Pearson和Lipman，1988.MethodsinEnzymology18363-98)進行的序列比較建立相似性或同源性。使用默認矩陣，優(yōu)選如下設置參數(shù)Gapopen(缺口中第一個殘基的罰分)蛋白質為-12/DNA為-16Gapext(缺口中額外殘基的罰分)蛋白質為-2/DNA為-4KTUP字長蛋白質為2/DNA為6。同源性可以處于核苷酸序列和/或所編碼的氨基酸序列水平。核酸和/或氨基酸序列優(yōu)選具有至少約75％或80％的同一性，最優(yōu)選至少約90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。也可以使用探針方法學(probingmethodology)評定同源性(Sambrook等人，1989)。計算實現(xiàn)具有特定序列同源性的核酸分子之間雜交所需的嚴格性條件的一個通式是Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/雙鏈體中堿基數(shù)。作為對上述通式的說明，使用[Na+]＝及50-％甲酰胺，以42％的GC含量和200個堿基的平均探針大小，Tm為57℃。同源性每降低1％，DNA雙鏈體的Tm降低1-1.5℃。因此，使用42℃的雜交溫度將觀察到序列同一性高于約75％的靶。在蘚類植物中的用途如下所述，在其多個方面，一般將本發(fā)明用于蘚類原生質體，其中使用編碼目的蛋白質的核酸。在蘚類原生質體中有效的穩(wěn)定啟動子包括花椰菜花葉病毒35S(CaMV35S)。其它實例公開于Lindsey和Jones(1989)PlantBiotechnologyinAgriculture@Pub.OUPress，MiltonKeynes，UK的第120頁中?？梢赃x擇啟動子以含有一個或多個賦予表達的發(fā)育和/或組織特異性調節(jié)控制的序列基序或元件。誘導型的植物啟動子包括Caddick等人，(1998)NatureBiotechnology16177-180中的乙醇誘導的啟動子。預期將發(fā)送轉錄終止信號的終止子作為轉錄單元末端的DNA序列。這些元件是含有多腺苷酸化信號的3′非翻譯序列，所述序列作用引起向初級轉錄物的3′末端添加多腺苷酸序列。對于在植物細胞中的表達，胭脂氨酸合酶轉錄終止子(A.Depicker等人，1982，J.ofMol.&AppliedGen.1561-573)序列可以起轉錄終止信號的作用，CaMV35S終止子也可以(Tpfer等人，(1987)NAR15，5890)。如果需要，選擇性遺傳標記也可以包含于另外的常規(guī)構建體(例如環(huán)形質粒)中或另外的共轉化到本發(fā)明的蘚類細胞中的線性化DNA構建體中，所述遺傳標記例如賦予諸如抗生素或除草劑(例如卡那霉素、潮霉素、膦絲菌素、綠黃隆、氨甲蝶呤、慶大霉素、壯觀霉素、咪唑啉和草甘膦)抗性這類選擇性表型的那些。本發(fā)明也提供這樣的方法，其包括將這類含有適當異源序列的構建體引入蘚類植物細胞和/或通過應用合適的刺激(例如有效的外源性誘導物)誘導本發(fā)明的構建體在蘚類植物細胞內表達。合適的蘚類植物細胞包括蘚類原生質體以及原絲體(例如來自小立碗蘚的原絲體)中含有的細胞?？梢允褂萌魏魏线m的技術將核酸引入蘚類原生質體中，例如在此所述的PEG介導的DNA攝取、粒子或微粒轟擊(US5100792、EP-A-444882、EP-A-434616)、顯微注射(WO92/09696、WO94/00583、EP331083、EP175966，Green等人，(1987)PlantTissueandCellCulture，AcademicPress)、電穿孔(EP290395、WO8706614GelvinDebeyser)、其它直接攝取DNA的形式(DE4005152、WO9012096、US4684611)、脂質體介導的DNA攝取(例如Freeman等人，PlantCellPhysiol.291353(1984))或渦旋方法(vortexingmethod)(例如Kindle，PNASU.S.A.871228(1990d)。在Oard，1991，Biotech.Adv.91-11中綜述了轉化植物細胞的物理方法。優(yōu)選電穿孔、PEG介導的DNA攝取和直接DNA攝取。尤其優(yōu)選如此處實例中所公開的改良的PEG介導的DNA攝取程序。通過其轉化某些蘚類物種的效率和以選擇的具體方法學實施本發(fā)明的人員的經歷和偏愛確定轉化技術的具體選擇。對技術人員而言顯而易見的是，將核酸引入蘚類原生質體的轉化體系的具體選擇對本發(fā)明并非必要。然而，優(yōu)選使用如此所述的PEG介導的DNA轉化體系。因此本發(fā)明的各個方面提供了轉化蘚類原生質體的方法，其涉及將如此所述的基于異源核酸的本發(fā)明的構建體引入蘚類原生質體和原生質體再生為原絲體組織，以及引起或允許表達來自本發(fā)明的構建體的蛋白質。因此，技術人員可以預期通過使用本發(fā)明的構建體和方法提高靶向細胞溶膠或其它細胞區(qū)室的蛋白質的表達。優(yōu)選將以本發(fā)明的方法產生的重組蛋白質分泌到穩(wěn)定轉化的原絲體組織的培養(yǎng)基中。因此，通過采用至少兩種如此描述的本發(fā)明的構建體，可以產生具有高拷貝數(shù)靶基因的生產品系(productionlines)，這反過來導致在合適的生物反應器中在培養(yǎng)期間的高蛋白質產量。要增強的基因的選擇目的基因包括那些編碼其自身為天然藥物(例如藥物或獸醫(yī)產物)的蛋白質的基因。異源核酸尤其可以編碼細菌、真菌、植物或動物起源的基因。產生的多肽可以用于產生能夠純化后用于別處的多肽。這類蛋白質包括，但是不限于成視網膜細胞瘤蛋白、p53、制管張素和苗條蛋白。同樣，也可以使用本發(fā)明的方法產生哺乳動物調節(jié)蛋白。其它目的序列包括蛋白質、激素(例如促卵泡激素)、生長因子、細胞因子、血清清蛋白、血紅蛋白、膠原蛋白、奇甜蛋白、奇甜蛋白樣蛋白質、表皮生長因子例如VEGF、異源二聚體、抗體、免疫球蛋白、融合抗體和單鏈抗體。靶基因的表達一般而言，可以通過本領域使用的任何適當?shù)姆椒ū磉_異源核酸，或者可以將其如下進行轉錄或表達(i)“裸”DNA的表達，所述“裸”DNA例如含有與本發(fā)明的構建體中的異源序列可操作地連接的啟動子，(ii)表達載體(例如復制載體)的表達。一般而言，本領域技術人員完全可以為重組基因表達構建載體并設計方案?？梢赃x擇或構建含有合適的調節(jié)序列(包括啟動子序列、終止子片段、多腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因及其它合適的序列)的合適載體。更多細節(jié)見例如MolecularCloningaLaboratoryManual第二版，Sambrook等人，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress或CurrentProtocolsinMolecularBiology第二版，Ausubel等編，JohnWiley&Sons，1992。如上文所討論的，本發(fā)明顯示，優(yōu)選以高水平引入優(yōu)選高細胞密度的蘚類原生質體(例如小立碗蘚)的本發(fā)明的構建體增加的表達產生了轉錄的mRNA，所述構建體整合入基因組中。因此本發(fā)明的一方面是能夠產生mRNA的轉化的蘚類原生質體的公開用途，所述mRNA編碼由引入的本發(fā)明的核酸構建體轉錄產生的靶蛋白質，其中核酸構建體被引入生物細胞內，包含與啟動子可操作地連接的靶核酸序列?！耙氲暮怂帷币虼藢ㄗ鳛镈NA序列以本發(fā)明的構建體形式提供的異源核酸序列，其中相對于通常與穩(wěn)定轉基因表達該DNA序列正常有關的蛋白質生產水平，所述異源核酸序列能引起以升高的水平表達細胞外蛋白質。在本發(fā)明的一個方面，異源核酸序列可以編碼由信號和/或轉運肽組成的蛋白質，所述信號和/或轉運肽與所選蛋白質或多肽序列偶聯(lián)。報道分子可以是任何可檢測的蛋白質，例如標記基因，常用于本領域的例如GUS、GFP、螢光素酶等。報道分子優(yōu)選為非侵入性標記，例如GFP或螢光素酶。本領域技術人員自然會認識到在本發(fā)明的該或每個構建體中可以使用一個以上異源核酸序列，盡管在每種情況下優(yōu)選單個序列。可以通過如此所述的PEG介導的DNA攝取方法將多個載體(每個含有一個或多個編碼所選異源蛋白質的核苷酸序列)引入蘚類原生質體。這對于生產例如酶的例如多個亞基是有用的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過影響整合到基因組中的不同編碼核酸序列的化學計量，可以得到高水平的由多亞基組成的完全且正確組裝的蛋白質。正確組裝的由多亞基組成的蛋白質的量在蛋白質水平取決于亞基的化學計量。對于必須通過信號肽靶向不同區(qū)室(例如靶向分泌途徑)的亞基的情況，化學計量不僅受來自例如啟動子和轉錄信號的表達的影響，而且受靶向信號及靶向信號的處理(例如信號肽的正確切割)的影響。在本發(fā)明的該方面，使用非等摩爾量的編碼不同亞基的核酸序列，可能適合于多聚體蛋白質(例如免疫球蛋白)。因此可以通過提供經過適當設計、使不同亞基能夠正確組裝的本發(fā)明的構建體得到編碼核酸的非等摩爾量，從而導致產生二聚體或多聚體蛋白質的多個亞基的合適化學計量。如下面的實施例中所述，以此方式引入時，使用本發(fā)明的方法表達異源序列，可以在整個表達期間產生非常高水平的靶多肽，根據(jù)采用的精確的方法和材料，所述表達期通常為數(shù)日。通過使用如此所述的本發(fā)明的方法，可以實現(xiàn)從穩(wěn)定整合的本發(fā)明的構建體高水平產生異源多肽，所述構建體來自再生轉化、優(yōu)選共轉化的原絲體。由于可能需要其補充本公開內容，所以在此討論的所有參考文獻都全文引用作為參考。現(xiàn)在將關于下列非限制性附圖和實施例對本發(fā)明進行進一步進行描述。對于本領域技術人員而言，本發(fā)明的其它實施方案將根據(jù)這些而出現(xiàn)。實施例方法和材料植物材料使用小立碗蘚(Hedw.)B.S.G.(Reski等人，1994)野生型株。這是由H.L.K.Whitehouse在GransdenWood，Huntingdonshire英國收集、由Engel繁殖的16/14株的傳代培養(yǎng)物(1968)。載體的構建pRT101VEGFC3的構建將不含前導序列的人類血管內皮生長因子121(VEGF121)cDNA作為NdeI-SalI片段從pCYTEXP-VEGF121(GBF，Braunschweig，德國)切除。通過克列諾反應將該片段平端化，并于SmaI限制位點引入pRT101(Tpfer等人，1987)以形成質粒pRT101VEGFC3。在所述構建體中，將VEGF121cDNA的負前導序列置于CaMV35S啟動子下游及CaMV終止子之后(Gorr，1999)。pRT101TPVEGFC3的構建將VEGF信號肽序列(用于分泌的分選信號)克隆到pRT101VEGFC3中。使用含有XhoI限制位點的5′引物MoB323(5′-ATACTCGAGGAAGATGAACTTTTCTGCCTGTCTTGG-3′，SEQIDNO1)和含有NcoI限制位點的3′引物MoB349(5′-CTGCCATGGGTGCAGCCTGGGACCAC-3′，SEQIDNO2)從質粒pRT101P21(Gorr，1999)擴增信號肽cDNA。將擴增的DNA用XhoI和NcoI消化并連接到pRT101VEGFC3(經過XhoI/NcoI消化的)中產生pRT1o1TPVEGFC3。產生的質粒含有在框內處于CaMV35S啟動子控制下的VEGF信號肽和VEGF121的編碼序列。將5′第一個重組序列克隆到pRT99中的程序使用上游引物Rec1_SalI_SacII(5′-GAGGTCGACCCGCGGAAATGTTCAGAG-3′，SEQIDNO4)和下游引物Rec1_SmaI(5′-CTCCCCGGGTCCAGTGTTTCACTC-3′，SEQIDNO5)，通過Pfu校正PCR(Promega，德國)從小立碗蘚基因組DNA擴增小立碗蘚α1，3-巖藻糖基轉移酶基因第五個內含子的250bp的5′序列(5′-GCGGAAATGTTCAGAGTTAAGCGAAATCACAACTAAAAGAGATTGGAAGCAGAAGAATTTTTGAGCAGCTGTTCTTAATTCACGCAACGACAACGCTATTAACTGTATGTGTAGACGATGCACTTTCGTACTGAAGGGATCTAAATTTATTATATCCCTTCATAACTAGAGGCAAGGCGGAAATCACAAAACTATTGGTACCTACGTACTACAGCCTCCAGGATCAAACATAAGAGTGAAACACTGGACC-3′，SEQIDNO3)。將得到的擴增產物用SalI和SmaI限制酶切后，將其克隆到載體pRT99(Tpfer等人，1988)(經過SalI和SmaI消化的)中。得到的質粒pRT99Rec1含有5′第一個重組序列。將3′第二個重組序列克隆到pRT99Rec1中的程序使用上游引物Rec11_SmaaI(5′-GAGCCCGGGACCCAAGCGTAAGAAG-3′，SEQIDNO7)和下游引物Rec11_SacII_SsTII(5′-TCTGAGCTCCCGCGGACAATCATTTGTGTTTC-3′，SEQIDNO8)，通過Pfu校正PCR(Promega，德國)從小立碗蘚基因組DNA擴增小立碗蘚α1，3-巖藻糖基轉移酶基因第五個內含子的208bp的3′序列(5′-GGGACCCAAGCGTAAGAAGTCTTATGAAAAAGTTACCTCACAGATTAAAACTAAACATAGGAAAATACCAATGCACTCCAATGTGTCAATGAGATTAACGCTTGACTAACATGAAAATATAAATATTCACCGAATGAAAGAAATTAGAAAACAGGACCTGTAGATTGTAAGAGATAGATTCTTGAGTTAGAAACACAAATGATTGTCC-3′，SEQIDNO6)。將得到的擴增產物用SmaI和SstI限制酶切后，將其克隆到載體pRT99Rec1(經過SmaI和SstI消化的)中。得到的質粒pRT99Rec11含有5′第一個和3′第二個重組序列。pRT99TPVEGFRec1的構建將含有CaMV35S啟動子、TPVEGF121和CaMV35S終止子的表達盒作為PstI片段從pRT101TPVEGFC3切除。通過克列諾反應將該片段平端化并引入到經過SmaI消化并去磷酸化的質粒pRT99Rec11中產生質粒pRT99TPVEGFRec1。將5′第二個量組序列克隆到pRT99中的程序使用上游引物Rec2_SalI_SacII(5′-GAGGTCGACCCGCGGACCCAAGCGTAAGAAG-3′，SEQIDNO9)和下游引物Rec2_SmaI(5′-TCTCCCGGGACAATCATTTGTGTTTC-3′，SEQIDNO10)，通過Pfu校正PCR(Promega，德國)從小立碗蘚基因組DNA擴增小立碗蘚α1，3-巖藻糖基轉移酶基因第五個內含子的208bp的3′序列(5′-GGGACCCAAGCGTAAGAAGTCTTATGAAAAAGTTACCTCACAGATTAAAACTAAACATAGGAAAATACCAATGCACTCCAATGTGTCAATGAGATTAACGCTTGACTAACATGAAAATATAAATATTCACCGAATGAAAGAAATTAGAAAACAGGACCTGTAGATTGTAAGAGATAGATTCTTGAGTTAGAAACACAAATGATTGTCC-3′，SEQIDNO6)。將得到的擴增產物用SalI和SmaI限制酶切后，將其克隆到載體pRT99(Tpfer等人，1988)(經過SalI和SmaI消化的)中。得到的質粒pRT99Rec2含有5′第二個重組序列。將3′第一個重組序列克隆到pRT99Rec2中的程序使用上游引物Rec22_SmaI(5′-GAGCCCGGGAAATGTTCAGAGTTAAGCG-3′，SEQIDNO11)和下游引物Rec22_SacII_SstI(5′-TCTGAGCTCCCGCGGTCCAGTGTTTCACTCTTATG-3′，SEQIDNO12)，通過Pfu校正PCR(Promega，德國)從小立碗蘚基因組DNA擴增小立碗蘚α1，3-巖藻糖基轉移酶基因第5個內含子的250bp的5′序列(5′-GCGGAAATGTTCAGAGTTAAGCGAAATCACAACTAAAAGAGATTGGAAGCAGAAGAATTTTTGAGCAGCTGTTCTTAATTCACGCAACGACAACGCTATTAACTGTATGTGTAGACGATGCACTTTCGTACTGAAGGGATCTAAATTTATTATATCCCTTCATAACTAGAGGCAAGGCGGAAATCACAAAACTATTGGTACCTACGTACTACAGCCTCCAGGATCAAACATAAGAGTGAAACACTGGACC-3′，SEQIDNO3)。將得到的擴增產物用SmaI和SstI限制酶切后，將其克隆到載體pRT99Rec2(經過SmaI及SstI消化)中。得到的質粒pRT99Rec22含有5′第二個和3′第一個重組序列。pRT99TPVEGFRec2的構建將含有CaMV35S啟動子、TPVEGF121和CaMV35S終止子的表達盒作為PstI片段從pRT101TPVEGFC3切除。通過克列諾反應將該片段平端化，并引入到經過SmaI消化并去磷酸化的質粒pRT99Rec22產生質粒pRT99TPVEGFRec2。用SacII或SalI和SstI限制酶切pRT99TPVEGFRec1和Rec2引起含有重組序列以及目的異源核酸序列的第一個和第二個異源核酸序列的線性化，其中目的異源核酸序列含有與其可操作地連接的啟動子。使用線性化的異源核酸序列轉化蘚類細胞。標準培養(yǎng)條件將植物在簡單無機液體改良Knop培養(yǎng)基(plaininorganicliquidmodifiedKnopmedium)(1000mg/lCa(NO3)2×4H2O250mg/lKCl，250mg/lKH2PO4，250mg/lMgSO4×7H2O及12.5mg/lFeSO4×7H2O；pH5.8(Reski和Abel1985))中于無菌條件下純性培養(yǎng)。使植物在含有200ml培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中生長，并在設定為120rpm的CertomatR搖床(B.BraunBiotechInternational，德國)上振蕩燒瓶。生長室中的條件為25+/-3℃以及168小時的光照黑暗方案。由兩個提供35μmols-1m-2的熒光管(OsramL58W/25)從上方照射燒瓶。通過使用Ultra-Turrax勻漿器(IKA，Staufen，德國)解體、并接種到兩個新的含有100ml新鮮Knop培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，將培養(yǎng)物每周傳代培養(yǎng)一次。原生質體的分離為了最佳原生質體分離的蘚類組織預培養(yǎng)?？梢栽诓煌瑮l件下預培養(yǎng)蘚類(尤其是小立碗蘚)以獲得最佳原生質體產量I.Rother等人在Ca(NO3)2含量降低(10％)的Knop培養(yǎng)基中將蘚類組織培養(yǎng)7天。解體后3或4天過濾培養(yǎng)物并轉移到Ca(NO3)2含量降低(10％)的新鮮Knop培養(yǎng)基中。II.可以用5mM的酒石酸銨補充預培養(yǎng)培養(yǎng)基或者改變pH至4.5(在未控制pH值的液體培養(yǎng)物中，改良的Knop培養(yǎng)基可以達到平均pH5.8)來替代降低Ca(NO3)2。組織解體后3或4天過濾培養(yǎng)物并轉移到新鮮改良Knop培養(yǎng)基中(補充5mM酒石酸銨或改變到pH4.5)。III.Hohe和Reski(2002)最優(yōu)化了半連續(xù)生物反應器中的培養(yǎng)條件以獲得高產量的原生質體。通過用460mg/l酒石酸銨補充改良的Knop培養(yǎng)基(Reski和Abel1985)或在調定點4.5的受控pH值下(在未控制pH值的生物反應器培養(yǎng)物中，改良的Knop培養(yǎng)基可以達到平均pH5.8)，獲得高產量的分離的原生質體。對于小立碗蘚已描述了分離原生質體(Grimsley等人，1977；Schaefer等人，1991；Rother等人，1994；Zeidler等人，1999；Hohe和Reski，2002，ProtocolSchaefer2001)和轉化(Schaefer等人，1991；Reutter和Reski1996，ProtocolSchaefer2001)的不同方案。對于在此介紹的工作，使用前述方法的修改/組合過濾后將蘚類原絲體在0.5M甘露糖醇中預溫育。30分鐘后，向懸浮液中加入4％的崩潰酶(Sigma，Deisenhofen，德國)。崩潰酶溶解于0.5M甘露糖醇(pH5.6-5.8)中，于3600rpm離心10分鐘，并通過穿過0.22μm濾器(MillexGP，MilliporeCorporation，美國)滅菌。將含有1％崩潰酶(終濃度)的懸浮液于室溫(RT)在暗中溫育并溫和攪拌(溫育2小時后得到原生質體的最佳產量)(ProtocolSchaefer2001)。將該懸浮液通過孔徑100μm和50μm的篩(Wilson，CLF，德國)。將懸浮液在無菌離心管中離心并于室溫以55g(加速度3；于3減速；Multifuge3S-R，Kendro，德國)沉淀原生質體10分鐘(ProtocolSchaefer2001)。將原生質體溫和地重懸于W5培養(yǎng)基(125mMCaCl2×2H2O；137mMNaCl；5.5mM葡萄糖；10mMKCl；pH5.6；660-680mOsm；過濾滅菌的)中。將該懸浮液于室溫以55g(加速度3；于3減速；Multifuge3S-R，Kendro，德國)再次離心10分鐘。將原生質體溫和地重懸于W5培養(yǎng)基中(Rother等人，1994)。將小體積的懸浮液轉移到Fuchs-Rosenthal-chamber中用于計數(shù)原生質體。轉化方案將原生質體于冰上在黑暗中溫育30分鐘用于轉化。隨后，于室溫以55g(加速度3；于3減速；Multifuge3S-R，Kendro)離心10分鐘以沉淀原生質體。將原生質體以1.2×106個原生質體/ml的濃度重懸于3M培養(yǎng)基(15mMCaCl2×2H2O；0.1％MES；0.48M甘露糖醇；pH5.6；540mOsm；經過過濾滅菌的，Schaefer等人，1991)中(Reutter和Reski1996)。將250μl該原生質體懸浮液分配到新的無菌離心管中，加入50μl兩種構建體pRT99TPVEGFRec1和pRT99VEGFRec2及含有選擇標記的載體的DNA溶液(溶于H2O中的經過柱純化的DNA(Qiagen，Hilden，德國)；10-100μl；每構建體含有30μg的DNA量；10μg含有選擇標記的載體)，最后加入250μlPEG溶液(40％PEG4000；0.4M甘露糖醇；0.1MCa(NO3)2；高壓滅菌后pH6)。立刻溫和混合該懸浮液，然后于室溫溫育6分鐘，間或溫和混合。通過添加1、2、3和4ml3M培養(yǎng)基逐步稀釋該懸浮液。將該懸浮液于20℃以55g(加速度3；于3減速；Multifuge3S-R，Kendro)離心10分鐘。于3ml再生培養(yǎng)基中重懸沉淀。如Strepp等人(1998)所述實施選擇程序。DNA分析按照Strepp等人(1998)所述實施穩(wěn)定轉化的植物的DNA分析。通過DNA印跡分析以及與含有一個拷貝該異源DNA的穩(wěn)定轉化的植物比較，實施拷貝數(shù)的估計。測定重組VEGF121的定量通過ELISA(R&DSystems，Wiesbaden，德國)定量由穩(wěn)定轉化的蘚類植物表達的重組VEGF121。根據(jù)廠商說明書執(zhí)行ELISA?？蓪悠废♂屢杂糜诙?。結果對于穩(wěn)定轉化的植物，整合的構建體的高拷貝數(shù)的估計與重組蛋白質的高產量相關。參考文獻EngelPP(1968)TheinductionofbiochemicalandmorphologicalmutantsinthemossPhyscomitrellapatens.AmJBot55，438-446.GorrG(1999)BiotechnologischeNutzungvonPhyscomitrellapatens(Hedw.)B.S.G..Dissertation，UniversittHamburg.GrimsleyNH，AshtonNWandCoveDJ(1977)Theproductionofsomatichybridsbyprotoplastfusioninthemoss，Physcomitrellapatens.MolGenGenet154，97-100.HoheA，ReskiR(2002)OptimisationofabioreactorcultureofthemossPhyscomitrellapatensformassproductionofprotoplasts.PlantSci163，69-74.ReskiR，AbelWO(1985)Inductionofbuddingonchloronemataandcaulonemataofthemoss，Physcomitrellapatens，usingisopentenyladenine.Planta165，354-358.ReskiR，F(xiàn)austM，WangX-H，WeheM，AbelWO(1994)GenomeanalysisofthemossPhyscomitrellapatens(Hedw.)B.S.G..MolGenGenet244，352-359.RotherS，HadelerB，OrsiniJM，AbelWOandReskiR(1994)Fateofamutantmacrochloroplastinsomatichybrids.JPlantPhysiol143，72-77.ReutterKandReskiR(1996)Productionofaheterologousproteininbioreactorculturesoffullydifferentiatedmossplants.PlantTissueCultureandBiotechnology2，142-147.SchaeferD，ZrydJ-P，KnightCDandCoveDJ(1991)StabletransformationofthemossPhyscomitrellapatens.MolGenGenet226，418-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