專(zhuān)利名稱(chēng)：編碼催化木脂素物生合成的酶的基因及其利用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及催化芝麻的胡椒醇及芝麻素生物合成的酶、編碼該酶的基因以及該蛋白質(zhì)和該基因的利用。
背景技術(shù)：
一般為人所知的芝麻(Sesamum indicum)這種植物，屬于胡麻科胡麻屬(Sesamum)。芝麻的原產(chǎn)地是中非，是具有6000年左右歷史的最古老的栽培油料作物，在全世界均有栽培。
芝麻種子的成分中含有約50％的脂質(zhì)及約20％的蛋白質(zhì)。芝麻種子中還含有維生素B1、B2及E等。芝麻種子中，作為脂質(zhì)的主要成分，含有以油酸和亞油酸為主要構(gòu)成要素的甘油三酯，特別是作為特征成分，還含有芝麻素、芝麻林酚素(Sesamolin)等總稱(chēng)為木脂素的植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物。
已知此芝麻素具有多種生理活性，對(duì)膽固醇代謝、肝功能及免疫功能的改善很有效(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。從芝麻種子或芝麻種子的芝麻粕中分離純化芝麻素的方法已被實(shí)際應(yīng)用(例如，參考專(zhuān)利文獻(xiàn)1、2)，且以芝麻素為主要成分，具有促進(jìn)酒精分解作用等的肝功能活性增強(qiáng)劑也已被市場(chǎng)銷(xiāo)售。另外，有報(bào)道認(rèn)為芝麻素以外的芝麻木脂素(芝麻醇、芝麻林酚素等)也具有生理活性作用(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。
關(guān)于木脂素的生物合成，在該領(lǐng)域有若干見(jiàn)解(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。圖1表示了一般為人所知的木脂素生物合成途徑的模式圖。木脂素以苯丙素(phenylpropanoid)化合物為起始物質(zhì)合成，在植物中對(duì)植物的生物體防御機(jī)構(gòu)起作用。如圖1所示，松柏醇聚合合成的松脂醇是生物合成中最初的木脂素，從松脂醇再經(jīng)各植物種特有的生物合成途徑合成各種木脂素。
并且，有關(guān)芝麻素的生物合成如圖1所示，胡椒醇合成酶催化(+)-松脂醇，通過(guò)一處形成甲二氧基氧橋(圖中，用圓圈出的區(qū)域)的酶學(xué)作用合成胡椒醇。之后，通過(guò)芝麻素合成酶進(jìn)一步在此胡椒醇的另一處形成甲二氧基氧橋，以合成芝麻素。而且，在使用芝麻種子的膜組分的實(shí)驗(yàn)中顯示了，催化上述兩反應(yīng)的酶分別是2種不同的細(xì)胞色素P450(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。
上述甲二氧基氧橋的形成，在生物堿、類(lèi)黃酮的生物合成中屢屢可見(jiàn)。例如在花菱草(Eschscholtzia californica)培養(yǎng)細(xì)胞的膜組分中，由于(S)-金黃紫堇堿(scoulerine)及(S)-碎葉紫堇堿(cheilanthifoline)形成了甲二氧基氧橋，所以可知其存在著分別催化生成(S)-碎葉紫堇堿及(S)-刺罌粟堿(stylopine)的反應(yīng)的細(xì)胞色素P450(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)5)。
有報(bào)道認(rèn)為在鷹嘴豆(Cicer arietinum)的培養(yǎng)細(xì)胞的膜組分中，由于毛蕊異黃酮(calycosin)及紅車(chē)軸草素(pratensein)形成了甲二氧基氧橋，所以分別存在著催化生物合成野靛黃素(pseudobaptigenin)及5’-羥基野靛黃素的反應(yīng)的酶，其酶是細(xì)胞色素P450(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。
并且，也有文獻(xiàn)指出了Linum flavum的培養(yǎng)細(xì)胞中去氧鬼臼毒素(deoxypodophyllotoxin)6-羥化酶是細(xì)胞色素P450(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)7)。
另外，通過(guò)在(S)-四氫非洲防己胺(tetrahydrocolimbamine)中形成甲二氧基氧橋，合成(S)-四氫小蘗堿，所以參與生物合成芐基異喹啉生物堿小檗堿的酶仍然是細(xì)胞色素P450，已從Coptis japonica中克隆出編碼此酶的基因(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)8)。
如上述催化種種反應(yīng)的細(xì)胞色素P450，形成含有多種分子種的超家族，并通過(guò)其氨基酸序列的同源性分類(lèi)。大致上，將同一性為40％或大于40％的作為家族，55％或大于55％的作為亞家族分類(lèi)，家族用數(shù)字，亞家族用羅馬字母表示(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)9)。各家族及其相互關(guān)系用圖3的系統(tǒng)樹(shù)表示。例如，與上述小檗堿的生物合成有關(guān)的細(xì)胞色素P450屬于“CYP719”。
細(xì)胞色素P450在一個(gè)植物種中存在數(shù)百個(gè)分子種。但是，如圖4所示，其中鑒定了生物化學(xué)機(jī)能或生理機(jī)能的細(xì)胞色素P450分子種只為少數(shù)。
作為來(lái)源于芝麻的細(xì)胞色素P450，雖與本發(fā)明涉及的芝麻素或胡椒醇的合成反應(yīng)無(wú)直接關(guān)系，但編碼p-香豆酸鹽(coumarate)3-羥化酶的基因已被克隆(AY065995)。
在其他生物種中的細(xì)胞色素P450基因的克隆與其功能分析，有如下的一些報(bào)告。
例如，來(lái)源于矮牽牛的類(lèi)黃酮3’，5’羥化酶(F3’，5’H)基因(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)10)、或類(lèi)黃酮3’-羥化酶(F3’HCYP75B)基因(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)11)、或編碼來(lái)源于甘草的(2S)-二氫黃酮2-羥化酶(F2HCYP93B1)(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)12)、2-羥基-異二氫黃酮合成酶(IFSCYP93C2)(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)13)、或異黃酮2’-羥化酶(I2’HCYP81E1)(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)14)的基因已被克隆。并且，編碼黃酮合成酶II(FNSII，CYP93B3)(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)15)的基因，已使用I2’H從金魚(yú)草中被克隆。
另外，屬于CYP81家族的細(xì)胞色素P450的氨基酸序列在「http//drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html」中也有許多記載。其功能為，來(lái)源于菊芋(Helianthus tuberosus)的CYP81B1催化脂肪酸的羥化反應(yīng)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)16)，上述的I2’H屬于CPY81E。
但是，此處列舉的細(xì)胞色素P450不參與甲二氧基氧橋的形成。
與木脂素生物合成有關(guān)的酶的基因，報(bào)道了在連翹(Forsythiaintermedia)等中參與松脂醇合成的dirigent蛋白質(zhì)(例如，參考非專(zhuān)利文獻(xiàn)17、專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。還有關(guān)于連翹的松脂醇-落葉松脂素還原酶的基因(非專(zhuān)利文獻(xiàn)18、專(zhuān)利文獻(xiàn)3)及北美喬柏(Thuja plicata)的松脂醇-落葉松脂素還原酶的基因(非專(zhuān)利文獻(xiàn)19)的報(bào)道。也有關(guān)于重組閉聯(lián)異落葉松脂素(secoisolariciresinol)脫氫酶及其使用方法的報(bào)道(專(zhuān)利文獻(xiàn)4、非專(zhuān)利文獻(xiàn)20)。
日本特開(kāi)2001-139579號(hào)公報(bào)(
公開(kāi)日2001年5月22日)[專(zhuān)利文獻(xiàn)2]日本特開(kāi)平10-7676號(hào)公報(bào)(
公開(kāi)日1998年1月13日)[專(zhuān)利文獻(xiàn)3]日本特表2001-507931號(hào)公報(bào)(公表日2001年6月19日)[專(zhuān)利文獻(xiàn)4]日本特表2002-512790號(hào)公報(bào)(公表日2002年5月8日)[非專(zhuān)利文獻(xiàn)1]并木滿夫著《芝麻其科學(xué)和功能性》日本丸善PLANET株式會(huì)社出版[非專(zhuān)利文獻(xiàn)2]日本農(nóng)藝化學(xué)會(huì)志76 805-813 2002[非專(zhuān)利文獻(xiàn)3]Lignansbiosynthesis and function，Comprehensive natural productschemistry vol 1.640-713，1999[非專(zhuān)利文獻(xiàn)4]Phytochemisity，49，387，1998[非專(zhuān)利文獻(xiàn)5]Phytochemisity，30，2953，1991[非專(zhuān)利文獻(xiàn)6]
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如上述，已證明芝麻素是有多種生理活性，具有各種改善效果的物質(zhì)。但是，以往的芝麻素的生產(chǎn)方法，如上所述，只有從芝麻種子中獲得的方法。因此，由于芝麻素的生產(chǎn)依賴(lài)于芝麻種子，其結(jié)果，對(duì)芝麻素的產(chǎn)量擴(kuò)大及/或生產(chǎn)成本的削減造成了困難。
為解決上述問(wèn)題，優(yōu)選使用基因工程的方法。但是，對(duì)于已知的、在芝麻種子中參與芝麻素生物合成的上述2種細(xì)胞色素P450，這些酶還未被純化，編碼其酶的基因也未被克隆。而且，對(duì)于其他生物種中形成甲二氧基氧橋的上述細(xì)胞色素P450，這些酶也未被純化，編碼其酶的基因也未被克隆。另外，關(guān)于上述的其他的細(xì)胞色素P450，這些酶也未被純化，編碼其酶的基因也未被克隆。特別是已被克隆的其他生物種中木脂素的生物合成酶，不是參與芝麻素及/或胡椒醇合成的酶。
來(lái)源于芝麻種子的基因中，存在著一些被克隆的基因。例如，種子的貯存蛋白質(zhì)球蛋白AF240004、AF240005、AF240006等、與脂質(zhì)的合成及貯藏有關(guān)的基因油質(zhì)蛋白(oleosin)(J Biochem.122819-24.1997)、酰基載體蛋白不飽和酶(Plant Cell Physiol.1996 37，201-5)、油體固醇蛋白(sterolesin)(Plant Physiol.2002 1281200-11)、脂肪酸不飽和酶[PlantSci.161 935-941(2001)]等。但這些均不是參與木脂素合成的基因。
所以，編碼參與木脂素合成的酶的基因還不明了。因此，十分需要鑒定這樣的酶及編碼該酶的基因。
鑒于上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于鑒定催化由木脂素的羥基和甲基形成甲二氧基氧橋的反應(yīng)的酶，優(yōu)選鑒定催化由松脂醇向胡椒醇的反應(yīng)及/或從胡椒醇向芝麻素的反應(yīng)的酶的基因，并使用所得到的來(lái)源于芝麻的酶的基因，由重組生物等實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)芝麻素及/或胡椒醇的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者等為解決上述問(wèn)題銳意研究的結(jié)果，從芝麻種子的cDNA文庫(kù)中獲得了芝麻種子細(xì)胞色素P450基因群(以下，稱(chēng)SiP基因)，并使其在酵母中表達(dá)。并且，從其重組酵母中回收微粒體組分，使其與松脂醇或胡椒醇反應(yīng)，通過(guò)HPLC分析檢測(cè)是否分別生成了胡椒醇或芝麻素。其結(jié)果，鑒定了催化從松脂醇向胡椒醇反應(yīng)、及從胡椒醇向芝麻素反應(yīng)的蛋白質(zhì)及其基因，使本發(fā)明得以完成。
即，本發(fā)明作為工業(yè)上有用的物質(zhì)或方法，包含下述1)～21)的發(fā)明。
1)編碼催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)的基因(編碼催化從松脂醇向胡椒醇、及/或從胡椒醇向芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)的基因)。
2)編碼催化松脂醇及/或胡椒醇形成甲二氧基氧橋反應(yīng)的蛋白質(zhì)的基因。
3)編碼催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)，且含有以下(a)或(b)的基因(a)序列號(hào)1、64或78中所示的氨基酸序列；或(b)在上述氨基酸序列中，1個(gè)或大于1個(gè)的氨基酸被取代、缺失、插入及/或附加了的氨基酸序列。
4)編碼催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)，且含有對(duì)于序列號(hào)1、64或78中所示的氨基酸序列具有50％或大于50％同源性的氨基酸的基因。
5)具有把序列號(hào)2、65或79中所示的堿基序列作為開(kāi)放閱讀框區(qū)域的基因。
6)編碼催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)，且在以下(a)～(c)中任一嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的基因(a)含有序列號(hào)2、65或79中所示的堿基序列的多核苷酸；(b)含有編碼序列號(hào)1、64或78中所示氨基酸序列的堿基序列的多核苷酸；或(c)上述多核苷酸的片段。
7)來(lái)源于芝麻的、上述1)～6)中任一項(xiàng)所述的基因。
8)由上述1)～7)中任一項(xiàng)所述的基因編碼的蛋白質(zhì)。
9)催化胡椒醇及/或芝麻素的生物合成，且含有以下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)序列號(hào)1、64或78中所示的氨基酸序列；或(b)在上述氨基酸序列中，1個(gè)或大于1個(gè)的氨基酸被取代、缺失、插入及/或附加了的氨基酸序列。
10)識(shí)別上述8)或9)中所述蛋白質(zhì)的抗體。
11)含有上述1)～7)中任一項(xiàng)所述基因的重組表達(dá)載體。
12)含有包含上述1)～7)中任一項(xiàng)所述基因的重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。
13)包含培養(yǎng)或繁殖上述12)中所述轉(zhuǎn)化體的過(guò)程，及從該轉(zhuǎn)化體中獲得催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)的過(guò)程的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法。
14)導(dǎo)入了上述1)～7)中任一項(xiàng)所述基因的植物或該植物的后代或其組織。
15)包含使用上述1)～7)中任一項(xiàng)所述的基因、或8)或9)中所述蛋白質(zhì)的過(guò)程的胡椒醇及/或芝麻素的生產(chǎn)方法。
16)包含使用上述1)～7)中任一項(xiàng)所述基因的過(guò)程的生產(chǎn)高含量木脂素的轉(zhuǎn)化體的方法。
17)包含使用上述1)～7)中任一項(xiàng)所述基因的過(guò)程的生產(chǎn)高含量胡椒醇及/或芝麻素的植物體的方法。
18)包含使用上述1)～7)中任一項(xiàng)所述基因的過(guò)程的生產(chǎn)低含量木脂素的轉(zhuǎn)化體的方法。
19)包含使用上述1)～7)中任一項(xiàng)所述基因的過(guò)程的生產(chǎn)低含量胡椒醇及/或芝麻素的植物體的方法。
20)包含使用上述1)～7)中任一項(xiàng)所述基因的過(guò)程的培育芝麻的方法。
21)具備以含有上述1)～7)中任一項(xiàng)所述基因中至少一部分的堿基序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸為探針的基因檢測(cè)工具。
本發(fā)明其他的目的、特征及優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)以下說(shuō)明可十分明了。并且，本發(fā)明的益處從參考附圖的以下說(shuō)明中也會(huì)非常清楚。


圖1是表示芝麻木脂素一般合成途徑的模式圖。1松柏醇；2松脂醇；3胡椒醇合成酶；4胡椒醇；5芝麻素合成酶；6芝麻素。
圖2a～圖2f是表示測(cè)定了SiP189基因編碼的酶活性的HPLC結(jié)果示意圖。
圖3是從細(xì)胞色素P450編碼的氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)分析得到的樹(shù)形圖。
圖4是表示與SiP189基因編碼的蛋白質(zhì)之間同源性分析的結(jié)果示意圖。
圖5是表示SiP189基因Southern分析的結(jié)果示意圖。
圖6a～圖6d是表示測(cè)定了SrSiP189基因編碼的蛋白質(zhì)活性的HPLC分析結(jié)果示意圖。
圖7是表示轉(zhuǎn)基因煙草中SiP基因表達(dá)分析的結(jié)果示意圖。
圖8a～圖8d是表示植物細(xì)胞內(nèi)SiP蛋白質(zhì)的功能分析結(jié)果示意圖。
圖9A～圖9H是表示對(duì)表達(dá)調(diào)節(jié)因子分析SiP189基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)果示意圖。
圖10是表示存在于SiP189基因啟動(dòng)子區(qū)域的表達(dá)調(diào)節(jié)因子的示意圖。
圖11A～圖11H是表示對(duì)表達(dá)調(diào)節(jié)因子分析SrSiP189基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)果示意圖。
圖12A～圖12C是表示SiP189基因與SrSiP基因之間同源性比較的示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，但本發(fā)明不限于以下所述。
(1)與本發(fā)明有關(guān)的基因及該基因編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與本發(fā)明有關(guān)的基因，編碼催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)。在此所述的“胡椒醇及/或芝麻素的生物合成”，是指由松脂醇向胡椒醇、及/或由胡椒醇向芝麻素的生物合成，更詳細(xì)地說(shuō)，是指松脂醇及/或胡椒醇形成甲二氧基氧橋的反應(yīng)。本實(shí)施方式中，與本發(fā)明有關(guān)的基因，以編碼催化來(lái)源于芝麻種子的胡椒醇及芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)的基因SiP189(序列號(hào)2所示的堿基序列)為例，進(jìn)行說(shuō)明。且本申請(qǐng)中，把開(kāi)放閱讀框區(qū)域看作從起始密碼子到終止密碼子的區(qū)域。
(1-1)與本發(fā)明有關(guān)的基因在本說(shuō)明書(shū)中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基因”與“多核苷酸”、“核酸”或“核酸分子”可交換使用，意指核苷酸的聚合物。在本說(shuō)明書(shū)中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“堿基序列”與“核酸序列”或“核苷酸序列”可交換使用，作為脫氧核糖核苷酸(省略為A、G、C及T)的序列表示。
本發(fā)明的基因，例如，可為編碼序列號(hào)1、64或78中所示的氨基酸序列的基因。但是，具有通過(guò)復(fù)數(shù)個(gè)氨基酸附加、缺失及/或與其他的氨基酸取代而修飾的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，也可維持與原有蛋白質(zhì)同樣的酶活性。即在本發(fā)明中，只要是編碼催化胡椒醇及芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)的基因，即包含(a)編碼含有序列號(hào)1、64或78中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因，(b)在上述氨基酸序列中，含有1個(gè)或大于1個(gè)的氨基酸被取代、缺失、插入及/或附加了的氨基酸序列、且編碼具有催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成作用的蛋白質(zhì)的基因。此種基因，可例舉為將序列號(hào)2、65或79中所示的堿基序列作為開(kāi)放閱讀框(ORF)的基因。且在后述實(shí)施例中也有說(shuō)明，與本發(fā)明有關(guān)的基因可換說(shuō)成編碼細(xì)胞色素P450蛋白質(zhì)的基因。
此處，“1個(gè)或大于1個(gè)的氨基酸被取代、缺失、插入及/或附加了”是指使用定位誘變法[Hashimoto-Gotoh，Gene 152，271-275(1995)其他]等公知的突變蛋白質(zhì)制作法，可取代、缺失、插入及/或附加數(shù)量(優(yōu)選為10個(gè)或小于10個(gè)，更優(yōu)選為7個(gè)或小于7個(gè)，特別優(yōu)選為5個(gè)或小于5個(gè))的氨基酸被取代、缺失、插入及/或附加了。因此，編碼上述(b)中蛋白質(zhì)的基因是編碼上述(a)中蛋白質(zhì)的突變蛋白質(zhì)的基因。并且在本說(shuō)明書(shū)中使用時(shí)，“突變蛋白質(zhì)”主要是指通過(guò)公知的突變蛋白質(zhì)制作法人為導(dǎo)入的突變蛋白質(zhì)，但也可指從天然分離純化的同樣的突變蛋白質(zhì)。
并且，與本發(fā)明有關(guān)的基因不只是雙鏈DNA，也可是構(gòu)成它的有義鏈及反義鏈的各單鏈DNA或RNA。反義鏈可作為探針或反義藥利用。DNA中包含使用克隆技術(shù)或化學(xué)合成技術(shù)或其組合得到的cDNA或基因組DNA等。而且，與本發(fā)明有關(guān)的基因還可包含編碼上述(a)或(b)的氨基酸序列以外的、非翻譯區(qū)域(UTR)的序列或載體序列(包含表達(dá)載體序列)等的序列。
另外與本發(fā)明有關(guān)的基因，對(duì)于序列號(hào)1、64或78中所示的氨基酸序列，是具有20％或大于20％、優(yōu)選為50％或大于50％、特別優(yōu)選為60％或大于60％、或70％或大于70％同源性的蛋白質(zhì)，且包含編碼催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)的基因，相關(guān)基因還可用于木脂素量的控制或植物育種。并且，在本說(shuō)明書(shū)中使用時(shí)，“同源性”是指氨基酸序列中相同序列所占的比例，此值越高，兩者越為近緣關(guān)系。
同時(shí)，與本發(fā)明有關(guān)的基因，可以是含有序列號(hào)2、65或79中所示的堿基序列的多核苷酸，也可以是含有編碼序列號(hào)1、64或78中所示氨基酸序列的堿基序列的多核苷酸，或這些多核苷酸的片段，還包含例如，對(duì)于含有編碼6個(gè)或大于6個(gè)氨基酸的堿基序列(即18個(gè)堿基)的多核苷酸，編碼在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)的基因。上述“嚴(yán)謹(jǐn)條件”是指，在序列間至少有80％的同一性，優(yōu)選至少有95％的同一性，最優(yōu)選至少有97％的同一性時(shí)發(fā)生的雜交。具體地說(shuō)，可例舉為可在5×SSC、50℃的條件下雜交的條件。
上述的雜交可用J.Sambrook et al.Molecular Cloning，A LaboratoryManual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等記載的公知的方法進(jìn)行。通常，溫度越高，及/或鹽濃度越低，嚴(yán)謹(jǐn)性越高(雜交越難)。且適宜的雜交溫度因堿基序列或其堿基序列的長(zhǎng)度不同而不同，例如，以含有編碼6個(gè)氨基酸的18個(gè)堿基的DNA片段為探針時(shí)，優(yōu)選50℃或小于50℃的溫度。
通過(guò)上述雜交選擇的基因，可例舉為來(lái)自天然的基因[如，來(lái)源于植物的基因(例如，來(lái)源于苔蘚類(lèi)植物的基因)]，但也可為來(lái)自植物以外的基因。另外，通過(guò)上述雜交選擇的基因可以是cDNA，也可以是基因組DNA。
(1-2)與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)，最好是由上述(1-1)所述的與本發(fā)明有關(guān)的基因編碼的蛋白質(zhì)。只要是這樣的蛋白質(zhì)，就可催化由松脂醇向胡椒醇、或由胡椒醇向芝麻素的生物合成。且在本發(fā)明中，也包含催化松脂醇或胡椒醇形成甲二氧基氧橋反應(yīng)的蛋白質(zhì)。作為相關(guān)蛋白質(zhì)，還可例舉為具有上述(a)序列號(hào)1、64或78中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或(b)在上述氨基酸序列中，含有1個(gè)或大于1個(gè)的氨基酸被取代、缺失、插入及/或附加了的氨基酸序列，且具有催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成作用的蛋白質(zhì)。
與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)，可以是將上述(1-1)所述的與本發(fā)明有關(guān)的基因?qū)胨拗骷?xì)胞，并使其蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的狀態(tài)，也可以是從細(xì)胞或組織等中分離純化出來(lái)的狀態(tài)。另外，與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)還可以是與其他的蛋白質(zhì)融合的蛋白質(zhì)。特別是與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)還可以是經(jīng)化學(xué)合成的物質(zhì)。
而且，與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)，最好是氨基酸以肽鍵結(jié)合形成的多肽，但并不限于此，可以是包含多肽以外結(jié)構(gòu)的復(fù)合蛋白質(zhì)，也可以是包含附加多肽的蛋白質(zhì)。多肽被附加時(shí)，例如，可為His、Myc、Flag等的種種表位(epitope)標(biāo)記與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)。
(2)與本發(fā)明有關(guān)的基因及蛋白質(zhì)的獲得方法與本發(fā)明有關(guān)的基因及蛋白質(zhì)的獲得方法(生產(chǎn)方法)不受特別限定，其代表性方法可例舉為以下所示的各種方法。
(2-1)基因的獲得方法與本發(fā)明有關(guān)的基因的獲得方法，對(duì)于具有與生俱來(lái)的堿基序列的基因，如后述實(shí)施例具體所示，例如，可通過(guò)cDNA文庫(kù)的篩選獲得。
另外，獲得與本發(fā)明有關(guān)的基因的方法，例如可使用PCR等擴(kuò)增的方法。例如，與本發(fā)明有關(guān)的基因的cDNA序列中，以5’側(cè)及3’側(cè)的序列(或其互補(bǔ)序列)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，使用其引物以基因組DNA(或cDNA)等為模板進(jìn)行PCR，由擴(kuò)增兩引物間的DNA區(qū)域，可獲得大量含有與本發(fā)明有關(guān)基因的DNA片段。
并且，以基因序列信息為基礎(chǔ)，使用公知的化學(xué)合成方法，也可合成具有所需序列的多核苷酸。
編碼具有被修飾的氨基酸序列的酶的DNA，相對(duì)于具有與生俱來(lái)的堿基序列的DNA，可使用常用的定位誘變法或PCR法合成。例如，通過(guò)原有的cDNA或基因組DNA的限制性?xún)?nèi)切酶處理，得到應(yīng)導(dǎo)入修飾的DNA片段，以此為模板，使用導(dǎo)入了所需突變的引物進(jìn)行定位誘變法或PCR法，可得到導(dǎo)入了所需修飾的DNA片段。之后，只需將導(dǎo)入了此突變的DNA片段的DNA片段，與從編碼目的酶的多核苷酸(DNA)中去除與此DNA片段對(duì)應(yīng)的區(qū)域后的多核苷酸連接即可?；蛘撸瑸楂@得編碼含有短縮了的氨基酸序列的酶的DNA時(shí)，例如，通過(guò)由所需限制性?xún)?nèi)切酶切斷，可獲得編碼比目的氨基酸序列長(zhǎng)的氨基酸序列(例如，全長(zhǎng)氨基酸序列)。所得DNA片段未編碼目的氨基酸序列的全體時(shí)，只需合成包含不足部分的序列的DNA片段后連接即可。
另外，將所得基因用于大腸桿菌或酵母中的基因表達(dá)系統(tǒng)，使編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)。通過(guò)測(cè)定此蛋白質(zhì)的酶活性，可鑒定所得基因是編碼催化從松脂醇向胡椒醇、或從胡椒醇向芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)的基因。而且，通過(guò)將該基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，可得到該基因的產(chǎn)物，即催化從松脂醇向胡椒醇的生物合成、或從胡椒醇向芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)。
或者使用相對(duì)于含有序列號(hào)1、64或78中所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)的抗體，也可克隆其他生物的胡椒醇及芝麻素合成酶基因。
(2-2)蛋白質(zhì)的獲得方法獲得與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)的方法(生產(chǎn)方法)，可例舉為從表達(dá)與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)的細(xì)胞、組織等中分離純化的方法，但并不限于此。表達(dá)與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)的細(xì)胞或組織，可以是自然發(fā)生型，例如也可以是感染了重組昆蟲(chóng)桿狀病毒的細(xì)胞、組織。純化方法無(wú)限定，可通過(guò)含有如上所述與本發(fā)明有關(guān)的基因的表達(dá)載體，培養(yǎng)、栽培或飼育被轉(zhuǎn)化的宿主后，根據(jù)通常方法，例如過(guò)濾、離心分離、細(xì)胞破碎(細(xì)胞融解)、凝膠過(guò)濾層析法、離子交換色譜法等，從培養(yǎng)物中回收及/或純化目的蛋白質(zhì)。
另外獲得與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)的方法，還可例舉為使用基因重組技術(shù)等方法。此時(shí)，例如可使用如下方法，將與本發(fā)明有關(guān)的基因整合到載體等后，用公知方法導(dǎo)入到宿主細(xì)胞，使其能表達(dá)，并純化在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)翻譯后所得的上述蛋白質(zhì)等?；虻膶?dǎo)入(轉(zhuǎn)化)或基因的表達(dá)等具體方法見(jiàn)后述。
或者，使用相對(duì)于含有序列號(hào)1、64或78中所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的抗體，也可得到胡椒醇及芝麻素合成酶的蛋白質(zhì)。特別是使用此抗體，還可克隆催化其他生物的胡椒醇及芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)、及編碼該蛋白質(zhì)的基因。
同時(shí)，將外源基因?qū)胨拗鲿r(shí)，為使宿主及外源基因表達(dá)，而在宿主內(nèi)整合了發(fā)揮作用的啟動(dòng)子的表達(dá)載體有各種各樣，可根據(jù)目的適宜選擇。純化生成的蛋白質(zhì)的方法，根據(jù)使用的宿主或目的蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同而不同，但通過(guò)利用標(biāo)記等，可較容易地純化目的蛋白質(zhì)。
對(duì)制作突變蛋白質(zhì)的方法無(wú)特別限定。例如，可使用如下眾所周知的突變蛋白質(zhì)的制作法，如利用定位誘變法(Hashimoto-Gotoh，Gene 152，271-275(1995)其他)或PCR法在堿基序列導(dǎo)入點(diǎn)突變以制作突變蛋白質(zhì)的方法，或通過(guò)插入轉(zhuǎn)座子、制作突變株的方法等。還可使用上述方法，在編碼上述(a)蛋白質(zhì)的cDNA的堿基序列中，可通過(guò)加入使1個(gè)或大于1個(gè)的堿基被取代、缺失、插入及/或附加的改變，制作突變蛋白質(zhì)。另外，突變蛋白質(zhì)的制作，也可利用市場(chǎng)銷(xiāo)售的試劑盒。
而且，與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)，其獲得方法不限于上述方法，例如，可使用市場(chǎng)銷(xiāo)售的肽合成器等進(jìn)行化學(xué)合成。作為其他實(shí)例，也可利用無(wú)細(xì)胞體系的蛋白質(zhì)合成液[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，5598-5602(1981)、J.Biol.Chem.、253，3753-3756(1978)等]，由與本發(fā)明有關(guān)的基因合成與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)。
(3)與本發(fā)明有關(guān)的抗體與本發(fā)明有關(guān)的抗體，是以上述(1-2)中所述的與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)[例如，上述(a)或(b)的蛋白質(zhì)，或其片段]為抗原，通過(guò)公知的方法獲得的抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)。公知的方法例如可例舉為[Harlow等的《AntibodiesA laboratory manual》美國(guó)紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)，巖崎等的《單克隆抗體雜交瘤與ELISA》、日本講談社(1991)]中所述的方法。所得抗體可用于與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)的檢測(cè)及/或測(cè)定等。
(4)與本發(fā)明有關(guān)的重組載體與本發(fā)明有關(guān)的重組表達(dá)載體含有如上述(1-1)中所述的與本發(fā)明有關(guān)的基因[例如，編碼上述(a)或(b)蛋白質(zhì)的基因]。與本發(fā)明有關(guān)的重組表達(dá)載體，例如，可為插入了cDNA的重組表達(dá)載體。在重組表達(dá)載體的制作中，可使用質(zhì)粒、噬菌體或粘粒等，但并不限于此。且重組表達(dá)載體的制作方法可使用公知的方法。
對(duì)載體無(wú)限定，可例舉為在宿主細(xì)胞中能表達(dá)的載體。即對(duì)應(yīng)于宿主細(xì)胞的種類(lèi)，適宜選擇確實(shí)可使基因表達(dá)的啟動(dòng)子序列，再使用將此啟動(dòng)子序列和與本發(fā)明有關(guān)的基因整合進(jìn)質(zhì)粒等中的表達(dá)載體即可。
為鑒定與本發(fā)明有關(guān)的基因是否導(dǎo)入了宿主細(xì)胞，且被編碼的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中是否確實(shí)進(jìn)行了表達(dá)，可使用各種標(biāo)記物。將含有標(biāo)記物(例如，在使用的宿主細(xì)胞缺失的基因)和與本發(fā)明有關(guān)的基因的質(zhì)粒等作為表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在導(dǎo)入了此表達(dá)載體的宿主細(xì)胞中，根據(jù)標(biāo)記物是否表達(dá)，可鑒定與本發(fā)明有關(guān)的基因的導(dǎo)入。或者，也可把與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)作為融合蛋白質(zhì)，使其在宿主細(xì)胞中表達(dá)。例如，也可使與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)和來(lái)自Aequorea coerulescensBRANDT的綠色熒光蛋白質(zhì)GFP(Green Fluorescent Protein)融合形成融合蛋白質(zhì)，并使其表達(dá)后，將GFP作為標(biāo)記物使用。
對(duì)上述宿主細(xì)胞無(wú)特別限定，可使用以往公知的各種細(xì)胞。具體地說(shuō)，作為原核宿主，可使用細(xì)菌[例如，屬于埃希氏菌屬(Escherichia)的細(xì)菌(例如大腸桿菌(Escherichia coli))或芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物(例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))]等。真核生物宿主可使用低等真核生物[例如，真核微生物(例如，真菌的酵母或絲狀菌)]。酵母，例如可為酵母屬(Saccharomyces)微生物，[例如，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)]等，或絲狀菌可例舉為，曲霉屬(Aspergillus)微生物[例如，米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)]及青霉屬(Penicillium)微生物。特別是可將動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞使用。植物細(xì)胞可利用胡麻科植物、禾本科植物等種種的植物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞可利用小鼠、倉(cāng)鼠、猴、人等的細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞。而且，也可利用昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如，蠶細(xì)胞或蠶的成蟲(chóng)自身)。
與本發(fā)明有關(guān)的重組表達(dá)載體，依賴(lài)于目的宿主細(xì)胞的種類(lèi)，含有表達(dá)控制區(qū)域(例如，啟動(dòng)子、終止子及/或復(fù)制起點(diǎn)等)。作為細(xì)菌用的表達(dá)載體的啟動(dòng)子，可使用常用的啟動(dòng)子(例如，trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子等)，酵母用啟動(dòng)子，例如可使用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)啟動(dòng)子、PH05啟動(dòng)子等，絲狀菌用啟動(dòng)子，例如可使用淀粉酶啟動(dòng)子、trpC啟動(dòng)子等。且動(dòng)物細(xì)胞宿主用啟動(dòng)子，可使用病毒性啟動(dòng)子(例如，SV40初期啟動(dòng)子、SV40后期啟動(dòng)子等)。表達(dá)載體的制作，可使用限制性?xún)?nèi)切梅及/或連接酶等根據(jù)常法進(jìn)行。并且，通過(guò)表達(dá)載體的宿主的轉(zhuǎn)化，也可根據(jù)通常方法進(jìn)行。
將上述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，即轉(zhuǎn)化方法，不受特別限制，可使用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、DEAE葡聚糖法、顯微注射法等公知的方法進(jìn)行。
(5)與本發(fā)明有關(guān)的轉(zhuǎn)化體與本發(fā)明有關(guān)的轉(zhuǎn)化體，是導(dǎo)入了上述(1-1)中記載的與本發(fā)明有關(guān)的基因[例如，編碼上述(a)或(b)蛋白質(zhì)的基因]的轉(zhuǎn)化體。在此，“導(dǎo)入了基因”是指利用公知的基因操作技術(shù)，導(dǎo)入到目的細(xì)胞(宿主細(xì)胞)內(nèi)。另外，于本說(shuō)明書(shū)中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”不只指細(xì)胞、組織或器官，生物個(gè)體也包含在內(nèi)。
與本發(fā)明有關(guān)的轉(zhuǎn)化體的制作方法(生產(chǎn)方法)，可以是使用上述(4)中所述與本發(fā)明有關(guān)的重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化方法。且作為轉(zhuǎn)化對(duì)象的生物也不受特別限制，可使用上述舉例的各種微生物或植物。同時(shí)，如適宜選擇啟動(dòng)子或載體，動(dòng)物或昆蟲(chóng)也可作為轉(zhuǎn)化的對(duì)象。
優(yōu)選的實(shí)施形態(tài)中，可使用芝麻制作與本發(fā)明有關(guān)的轉(zhuǎn)化體。芝麻轉(zhuǎn)化體的制作方法，例如T.AsamizuTransformation of sesame plants using MATvector systemintroduction of fatty acid desaturase genes.Sesame Newsletter 1622～25(2002)中所述的公知的方法。
并且，于本說(shuō)明書(shū)中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”還包含導(dǎo)入了與本發(fā)明有關(guān)的基因的植物、或與其具有同樣特性的該植物的后代或其組織。
(6)與本發(fā)明有關(guān)的基因檢測(cè)工具與本發(fā)明有關(guān)的基因檢測(cè)工具，具備作為探針的、含有與本發(fā)明有關(guān)的基因中至少一部分的堿基序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。與本發(fā)明有關(guān)的基因檢測(cè)工具，可用于各種條件下、與本發(fā)明有關(guān)的基因的表達(dá)方式的檢測(cè)及/或測(cè)定等。
與本發(fā)明有關(guān)的基因檢測(cè)工具，可例舉為，將與本發(fā)明的基因特異性雜交的上述探針固定于基板(載體)上的DNA芯片。在本說(shuō)明書(shū)中使用時(shí)，“DNA芯片”主要指，將合成的寡核苷酸用于探針的合成型DNA芯片，但將PCR產(chǎn)物等的cDNA作為探針使用的粘貼型DNA微陣列也包含于“DNA芯片”內(nèi)。
在本發(fā)明中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指核苷酸從數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)結(jié)合的產(chǎn)物，可與“多核苷酸”交換使用。寡核苷酸可作為更長(zhǎng)的多核苷酸的片段生成，也可被化學(xué)合成。
作為探針使用多核苷酸的堿基序列，可通過(guò)從cDNA序列中特定特異性配列的公知的方法[例如，SAGE(Serial Analysis of GeneExpression)法(Science 2761268，1997；Cell 88243，1997；Science 270484，1995；Nature 389300，1997；美國(guó)專(zhuān)利第5,695,937號(hào))等]測(cè)定。
DNA芯片的制造可采用公知的方法。例如，使用合成寡核苷酸時(shí)，可通過(guò)組合使用照相技術(shù)(Photo Lithography)和固相法DNA合成技術(shù)，在基板上合成該寡核苷酸。同時(shí)，作為寡核苷酸使用cDNA時(shí)，可使用陣列機(jī)粘貼于基板上。
另外，與一般的DNA芯片相同，通過(guò)配置完全匹配探針(寡核苷酸)和在該完全匹配探針中，一個(gè)堿基被取代了的錯(cuò)配探針，也可更加提高基因的檢測(cè)精度。而且，為同時(shí)檢測(cè)不同的基因，還可制造將復(fù)數(shù)種寡核苷酸固定于同一基板上的DNA芯片。
(7)與本發(fā)明有關(guān)的基因及蛋白質(zhì)等的利用方法(有效性)本說(shuō)明書(shū)中，主要敘述了有關(guān)生物合成芝麻的胡椒醇及/或芝麻素的酶，但本發(fā)明不只限于來(lái)源于芝麻的基因，還涉及生物合成胡椒醇及/或芝麻素的酶的利用。生物合成胡椒醇及/或芝麻素的酶的起源，可以是植物、動(dòng)物或微生物，只要具有生物合成胡椒醇及/或芝麻素的酶活性，同樣可用于木脂素的量的控制。特別是本發(fā)明涉及通過(guò)導(dǎo)入編碼生物合成胡椒醇及/或芝麻素的酶的基因而得到的、使木脂素的量得到調(diào)節(jié)的植物、或其后代或其組織，其形態(tài)也可為切花形態(tài)。使用由本發(fā)明獲得的編碼生物合成胡椒醇及/或芝麻素的酶的基因時(shí)，可生成胡椒醇或芝麻素，也可抑制胡椒醇或芝麻素的生成。根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)水平，可在植物中導(dǎo)入基因，使其基因組成性或組織特異性表達(dá)，也可通過(guò)反義法、共抑制法及RNAi法等，抑制目的基因的表達(dá)。可轉(zhuǎn)化的植物可例舉為，芝麻、稻、連翹、煙草、擬南芥、百脈根、大麥、小麥、菜籽、馬鈴薯、番茄、楊樹(shù)、香蕉、桉樹(shù)、甘薯、黃豆、紫花苜蓿、羽扇豆、玉米、菜花、月季、菊花、香石竹、金魚(yú)草、仙客來(lái)、蘭花、洋桔梗、小蒼蘭、非洲菊、唐菖蒲、霞草、長(zhǎng)壽花、百合、天竺葵、矮牽牛、藍(lán)豬耳、郁金香等，但并不限于此。
而且，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，其包含培養(yǎng)、繁殖上述(5)中所述的轉(zhuǎn)化體，并從該轉(zhuǎn)化體中獲得催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)的過(guò)程。根據(jù)上述方法，可簡(jiǎn)便、大量地生產(chǎn)具有催化生物合成胡椒醇或芝麻素的反應(yīng)活性的蛋白質(zhì)。并且，本方法只要包含上述過(guò)程即可，對(duì)其他的具體條件(例如，宿主的種類(lèi)、使用的材料、條件等)無(wú)特別限制，可適宜設(shè)定。
另外，與本發(fā)明有關(guān)的基因或與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)，也可用于生物合成胡椒醇及/或芝麻素的、胡椒醇及/或芝麻素的生產(chǎn)方法。根據(jù)上述方法，可簡(jiǎn)便且大量地生產(chǎn)胡椒醇及/或芝麻素，還可用于含有胡椒醇及/或芝麻素的食品(特別是保健食品)或醫(yī)藥品等的制造。且，“使用基因或蛋白質(zhì)”是指在體內(nèi)、體外或來(lái)自體內(nèi)等各種條件下使用基因或蛋白質(zhì)。胡椒醇及/或芝麻素的生產(chǎn)方法，可例舉為在植物細(xì)胞中導(dǎo)入上述基因，在所得轉(zhuǎn)基因植物的生物體內(nèi)生物合成胡椒醇及/或芝麻素的方法，在生物體外，使與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)與胡椒醇或芝麻素的前體反應(yīng)，生物合成胡椒醇及/或芝麻素的方法，或使用生物反應(yīng)器等生產(chǎn)胡椒醇及/或芝麻素的方法等。因基因直接使用時(shí)不具有生物合成的酶活性，所以，優(yōu)選以由該基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)的狀態(tài)使用。
同時(shí)，通過(guò)使用與本發(fā)明有關(guān)的基因，生產(chǎn)高含量木脂素的轉(zhuǎn)化體或低含量木脂素的轉(zhuǎn)化體的方法也包含于本發(fā)明。根據(jù)上述方法，可簡(jiǎn)便、容易地生產(chǎn)調(diào)節(jié)了木脂素含量的轉(zhuǎn)化體，還可從轉(zhuǎn)化體中提取木脂素，或?qū)⑥D(zhuǎn)化體自身作為食品、醫(yī)藥品或其前體物質(zhì)進(jìn)行利用。
并且，在本說(shuō)明書(shū)中使用時(shí)，“高含量胡椒醇及/或芝麻素的植物體”是指胡椒醇及/或芝麻素含量多的植物體，“低含量胡椒醇及/或芝麻素的植物體”是指胡椒醇及/或芝麻素含量少的植物體。
與本發(fā)明有關(guān)的基因，也可用于培育芝麻的方法。根據(jù)此方法，例如，將與本發(fā)明有關(guān)的基因?qū)胫ヂ?，可培育胡椒醇?或芝麻素含量多的芝麻。所以，從相關(guān)的轉(zhuǎn)基因芝麻的種子中，可提取胡椒醇或芝麻素含量多的脂質(zhì)。
以下，根據(jù)附圖顯示實(shí)施例，進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施形態(tài)。當(dāng)然，本發(fā)明不限于以下實(shí)施例，對(duì)于細(xì)部可有各種形態(tài)，不一一進(jìn)行說(shuō)明。特別是，本發(fā)明不限于上述實(shí)施形態(tài)，可在權(quán)利要求所示的范圍內(nèi)進(jìn)行種種變更，對(duì)于適當(dāng)組合各種已公開(kāi)的技術(shù)方法所獲得的實(shí)施形態(tài)，也包含于本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例以下，根據(jù)實(shí)施例詳述本發(fā)明。在無(wú)特殊情況下，分子生物學(xué)的方法遵照Molecular Cloning(Sambrook等)。
〔實(shí)施例1從連翹中配制木脂素〕將干燥后的連翹葉60g置于3L水中煮沸30分鐘后，使用濾紙(circle；300mm日本東京濾紙株式會(huì)社制)過(guò)濾提取液。使用蒸發(fā)器，在分注的濾液的溶劑體積減少后，冷凍干燥(30/N)，得到提取物冷凍干燥樣品(21.6837g)。
將此提取物冷凍干燥樣品7g再溶解于100ml的水中，用超聲波均化。將充填了離子交換樹(shù)脂HP-20樹(shù)脂(日本三菱化學(xué)公司制)400ml的色譜柱，用50％丙酮800ml清洗后，用2L水平衡。將上述均化后的樣品使用色譜柱粗純化。具體地說(shuō)，在色譜柱中注入上述樣品后，用800ml水清洗，用50％甲醇800ml一次洗脫，之后再用100％甲醇800ml二次洗脫。
上述一次洗脫樣品及二次洗脫樣品，用以下條件進(jìn)行HPLC分析，確認(rèn)了木脂素的存在。流動(dòng)相，使用A液
、和B液(0.1％TFA、90％乙腈)，色譜柱，使用Develosil C30-UG-5(日本野村化學(xué)公司制、4.6mm×150mm)。用A60％、B40％的混合液平衡色譜柱(20分鐘)后，使用A60％、B40％→A10％、B90％的直線濃度梯度，流速0.6ml/分鐘洗脫15分鐘，再用A10％、B90％洗脫10分鐘。用吸收波長(zhǎng)287nm檢測(cè)出蛋白質(zhì)，分離每1分鐘的組分(粗分離分析)。使用SPD-10AV(日本島津制作所制)，對(duì)各組分，測(cè)定了從220nm～400nm的光譜，找到了具有木脂素特有的2個(gè)最大吸收波長(zhǎng)(230nm及280nm)的物質(zhì)。其結(jié)果顯示，具有木脂素最大吸收波長(zhǎng)的物質(zhì)，主要包含于二次洗脫液中。
之后，為分離木脂素，用以下條件進(jìn)行了分離(正式分離)。將二次洗脫液用蒸發(fā)器濃縮后，冷凍干燥(干重1.0325g)。將此提取物冷凍干燥樣品1g利用超聲波溶解于1ml的二甲基亞砜(DMSO)中后，再利用超聲波溶解于6ml的B30％溶液中。將其溶解液通過(guò)1，5000rpm離心分離后，取其上清約6ml注入色譜柱[DevelosilODS-UG-15/30；C-18(日本野村化學(xué)公司制、50mm×500mm)]。流動(dòng)相使用A液(0.05％TFA)、B液(0.05％TFA、90％乙腈)。用流速32ml/分鐘，A70％、B30％平衡20分鐘后，注入樣品，用A70％、B30％→A10％、B90％的直線濃度梯度洗脫60分鐘后，用A10％、B90％洗脫30分鐘。在吸收波長(zhǎng)280nm進(jìn)行檢測(cè)，分離每1分鐘的洗脫液(32ml)(檢測(cè)器115UV detector.Gilson公司)。最后，得到了具有280nm吸收峰值的組分8個(gè)。將所得8個(gè)組分用蒸發(fā)器濃縮后，冷凍干燥。對(duì)于上述組分，使用與上述粗分離分析時(shí)同樣的條件進(jìn)行了HPLC分析。在顯示了此8種木脂素特有吸收光譜的組分中，對(duì)被認(rèn)為是單一木脂素的組分，通過(guò)1H NMR分析鑒定松脂醇。最后得到了49.7mg的松脂醇。
〔實(shí)施例2芝麻種子的木脂素分析〕從栽培中的芝麻蒴果中回收未成熟的芝麻種子，冷凍干燥后，用丙酮提取木脂素成分。丙酮提取液的配制方法如下所示。
將粉碎后的芝麻種子的冷凍干燥物(約100mg)溶解于1ml的丙酮中，得到丙酮提取液。將此丙酮提取液100μl干燥后，在20μl DMSO中再次溶解，加入80μl的含有0.1％TFA的50％乙腈。之后，將此溶液用Millex-LH過(guò)濾器(MILLIPORE公司制、0.45μm/4mm)過(guò)濾，作為HPLC分析用樣品。對(duì)此樣品進(jìn)行HPLC分析的結(jié)果，確認(rèn)了其中存在有與對(duì)照品(control)芝麻木脂素的胡椒醇(保留時(shí)間約12分鐘)、芝麻素(保留時(shí)間約16分鐘)及芝麻林酚素(sesamolin)(保留時(shí)間約18分鐘)的保留時(shí)間一致的木脂素。
進(jìn)一步將芝麻種子按從小到大的成長(zhǎng)階段分為4階段。
階段1種子蒴果為1.5cm或小于1.5cm階段2種子蒴果為1.5～2cm、階段3種子蒴果為2cm或大于2cm，蒴果色為黃綠色階段4種子蒴果為2cm或大于2cm，蒴果色為深綠色。
將這些種子使用上述條件同樣進(jìn)行HPLC分析的結(jié)果，確認(rèn)了在階段3及階段4中，有胡椒醇、芝麻素及芝麻林酚素的積累。
以上結(jié)果顯示，在本實(shí)施例中使用的芝麻品種中，存在生成胡椒醇及芝麻素的酶、以及編碼該酶的基因。
〔實(shí)施例3芝麻cDNA文庫(kù)的構(gòu)建〕
從實(shí)施例2中使用的芝麻種子中，按照制造業(yè)者推薦的方法，使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen公司制)，提取total RNA，之后使用OLIGO TEX-MAG mRNA純化試劑盒(日本TaKaRa公司制)，得到了polyA(+)RNA 5μg。以此polyA(+)RNA為模板，按照制造業(yè)者推薦的方法，使用ZAP Express cDNA Synthesis Kitand ZAP Express cDNA Gigapack3 Gold Cloning Kit(Stratagene公司制)，構(gòu)建了cDNA文庫(kù)。構(gòu)建的文庫(kù)為1×107pfu/ml。
〔實(shí)施例4來(lái)自芝麻的木脂素生物合成酶基因的克隆〕將基因組序列已全被測(cè)定的擬南芥的細(xì)胞色素P450基因的序列作為探針使用，篩選了上述cDNA文庫(kù)約30萬(wàn)pfu。
具體地說(shuō)，把擬南芥細(xì)胞色素P450基因群以一級(jí)序列為基礎(chǔ)系統(tǒng)分類(lèi)(參照?qǐng)D3)，把含有CYP90A、CYP72B、CYP71B、CYP84A、CYP96A、CYP710A、CYP86A、CYP74、CYP75B、CYP79F、CYP81D、CYP705A、及CYP83A的13種擬南芥細(xì)胞色素P450基因作為篩選芝麻種子文庫(kù)的探針使用。通過(guò)使用序列號(hào)5～30的引物進(jìn)行擴(kuò)增，在探針內(nèi)導(dǎo)入了DIG標(biāo)記。PCR條件如下所示。使用RNeasyPlant Mini Kit(Qiagen公司制)，從擬南芥中提取total RNA后，以total RNA 1μg為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA。根據(jù)制造業(yè)者推薦的條件，利用SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System forRT-PCR(Invitrogen公司)進(jìn)行了cDNA合成。PCR反應(yīng)液(50μl)含有擬南芥的基因組DNA 1μl、1×Taq buffer(TaKaRa)、0.2mM dNTPs、引物(序列號(hào)5～30分別為0.4pmol/μl)、及rTaq polymerase 2.5U。94℃反應(yīng)5分鐘后，進(jìn)行了94℃ 1分鐘、53℃ 1分鐘、72℃ 2分鐘的反應(yīng)28個(gè)循環(huán)。在探針中導(dǎo)入DIG標(biāo)記時(shí)，也用與PCR相同的條件進(jìn)行。篩選及陽(yáng)性克隆的檢測(cè)，使用DIG-DNA標(biāo)記&診斷試劑盒(Detection Kit)(Roche公司制)進(jìn)行。
以制造業(yè)者推薦的方法為基本，在下述低嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的檢測(cè)。即，使用雜交緩沖液[含有5×SSC、30％甲酰胺、50mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)、1％SDS、2％Bloking試劑(Roche公司制)、0.1％十二烷基肌氨酸、80μg/ml鮭魚(yú)精子DNA]，在37℃下進(jìn)行2小時(shí)預(yù)雜交后，加入由DIG標(biāo)記了的混合探針，再雜交一夜。將膜置于含有1％SDS的5×SSC洗滌液中，58℃下清洗1小時(shí)。
二次篩選后，得到了獨(dú)立的96個(gè)陽(yáng)性克隆。之后使用cDNA文庫(kù)合成試劑盒制造業(yè)者推薦的方法，將此96個(gè)克隆插入到pBK-CMV質(zhì)粒(Stratagene公司制)，將插入?yún)^(qū)域5’末端及3’末端的核苷酸序列分別使用M13 RV引物及M13 M4(-20)引物確定。其結(jié)果，46個(gè)克隆具有類(lèi)似細(xì)胞色素P450的序列。并測(cè)定了插入?yún)^(qū)域的全核苷酸序列。其結(jié)果，將所得克隆分類(lèi)成SiP168、SiP189、SiP236、SiP249、及SiP288的獨(dú)立的5種P450同源基因(Sesamum indicum P450；SiP)。然后，將從芝麻葉及種子配制的RNA逆轉(zhuǎn)錄后所得的cDNA用于模板，使用此5種SiP基因的特異性引物(序列號(hào)31～40)，進(jìn)行了RT-PCR。由其結(jié)果可知，此5種SiP基因在種子中進(jìn)行了表達(dá)。且在上述RT-PCR中使用的PCR反應(yīng)液(25μl)，含有各cDNA 1μl、1×Ex-Taq buffer(日本TaKaRa公司制)、0.2mM dNTPs、引物各0.2pmol/μl、及Ex-Taq polymerase1.25U。94℃反應(yīng)3分鐘后，進(jìn)行了94℃ 1分鐘、53℃ 1分鐘、72℃ 2分鐘的反應(yīng)26個(gè)循環(huán)。為比較表達(dá)量，芝麻內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)基因采用了Ribosomal 18 SRNA(AJ236041)。擴(kuò)增引物使用含有序列號(hào)3及4的引物。
〔實(shí)施例5含有SiP基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體的制作〕上述5種Sip基因中，SiP249(pSPB2031)及SiP288(pSPB2034)編碼全部的開(kāi)放閱讀框(ORF)(序列號(hào)53～56)。把含有cDNA在內(nèi)、用BamHI及XhoI酶切pSPB2031后所得的約1.8kb的DNA片段，插入到酵母表達(dá)載體pYE22m(Holton，T.A et al.，Nature 366，276-279.1993)的BamHI位點(diǎn)及SalI位點(diǎn)，得到了pSPB2046。酵母表達(dá)載體pYE22m的多克隆位點(diǎn)，夾在3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)基因(GAPDH)啟動(dòng)子和GAPD H終止子之間，插入到此多克隆位點(diǎn)的插入片段，在酵母中，GAPDH啟動(dòng)子的控制下組成性表達(dá)。且與此載體有關(guān)的選擇標(biāo)記是色氨酸。同時(shí)，將含有cDNA在內(nèi)的、通過(guò)BamHI及XhoI酶切pSPB2034后所得的約1.8kb DNA片段，插入到酵母表達(dá)載體pYE22m的BamHI位點(diǎn)及SalI位點(diǎn)，得到了pSPB2047。之后，使用2種酵母表達(dá)載體，根據(jù)通常方法轉(zhuǎn)化酵母INVsc株(Invitrogen公司制)，分別得到了INVsc/pYE22m/SiP249及INVsc/pYE22m/SiP288。
另外，因SiP168、189、236的開(kāi)放閱讀框不完全，所以按照制造業(yè)者推薦的方法，使用GeneRacer試劑盒(Invitrogen公司制)擴(kuò)增5’區(qū)域，獲得了含有完全開(kāi)放閱讀框的序列(序列號(hào)1～2、57～60)。擴(kuò)增用引物，使用含有序列號(hào)41～46的引物。
為克隆3種SiP基因的全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框，使用附加了以下限制酶切位點(diǎn)的引物，以來(lái)源于芝麻的cDNA為模板，進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。PCR條件如下所示。PCR反應(yīng)液(50μl)含有來(lái)源于模板芝麻種子的cDNA 1μl、1×KOD plus buffer(日本TOYOBO公司制)、0.2mM dNTPs、引物(序列號(hào)47～52)各0.4pmol/μl、1mM MgSO4、KOD plus DNA polymerase 1U。94℃反應(yīng)5分鐘后，進(jìn)行了94℃ 1分鐘、55℃ 1分鐘、72℃ 2分鐘的反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。將含有全長(zhǎng)SiP的此擴(kuò)增片段，插入到pCR-blunt II TOPO載體(Invitrogen公司制)的多克隆位點(diǎn)，得至了TOPO-SiP168(pSPB2064)、TOPO-SiP189(pSPB2055)、及TOPO-SiP236(pSPB2048)。
酶切擴(kuò)增pSPB2064、pSPB2055、及pSPB2048時(shí)使用的附加在引物上的限制酶切位點(diǎn)后，獲得含有cDNA在內(nèi)的約1.5kb的DNA片段，將其與用BamHI及SalI酶切pYE22m載體后得到的約8.3kb DNA片段連接，得到了pYE22m/SiP168(pSPB2052)、pYE22m/SiP189(pSPB2053)、及pYE22m/SiP236(pSPB2049)。
之后，使用此3種酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化酵母INVsc株(Invitrogen社製)，得到了INVsc/pYE22m/SiP168、INVsc/pYE22m/SiP189、及INVsc/pYE22m/SiP236。
〔實(shí)施例6在轉(zhuǎn)化體中芝麻木脂素的生物合成〕將上述INVsc/pYE22m/SiP249、INVsc/pYE22m/SiP288、和INVsc/pYE22m/SiP168、INVsc/pYE22m/SiP189、及INVsc/pYE22m/SiP236置于具有以下組成的YNBDglc培養(yǎng)基400mL(0.67％Yeast Nitrogen Base、2％Glucose、20mg/L除色氨酸以外的各種氨基酸)中，30℃、培養(yǎng)36小時(shí)。根據(jù)公知的超離心分離法(Holton，T.A et al.，Nature 366，276-279.1993)，從上述轉(zhuǎn)基因酵母培養(yǎng)液中回收了微粒體組分。
將微粒體沉淀，懸浮于懸浮緩沖液
1ml中，得到了微粒體溶液。在此微粒體溶液240μl中，加入1M磷酸鉀緩沖液(pH7.4)30μl、50mM NADPH6μl、267μM松脂醇或胡椒醇24μl，于30℃反應(yīng)1小時(shí)。在此酶反應(yīng)液中，等量加入含有0.1％TFA的100％乙腈(最終濃度為50％的乙腈溶液)。之后，離心分離此溶液(15000rpm、3分鐘、4℃)，將其上清150μl使用Millex-LH過(guò)濾器(MILLIPORE公司制、0.45μm/4mm)純化，用與實(shí)施例1的粗分離分析同樣的條件進(jìn)行了HPLC分析。
對(duì)于INVsc/pYE22m/SiP189進(jìn)行的HPLC分析的結(jié)果，如下所示。松脂醇[圖2(a)保留時(shí)間約8分]在INVsc/pYE22m/SiP189中，變成了保留時(shí)間分別約為12分鐘及約為16分鐘、具有類(lèi)似新型木脂素的吸收光譜的2個(gè)生成物[圖2(b)]。特別是，胡椒醇[圖2(d)保留時(shí)間約12分鐘]，通過(guò)INVsc/pYE22m/SiP189，變成了保留時(shí)間約為16分鐘的、具有類(lèi)似新型木脂素的吸收光譜的生成物[圖2(e)]。這些物質(zhì)，從保留時(shí)間考慮，分別應(yīng)為胡椒醇(保留時(shí)間約為12分鐘)及芝麻素(保留時(shí)間約為16分鐘)。
之后，對(duì)此2個(gè)峰值(保留時(shí)間約12分鐘和約16分鐘)，通過(guò)LC-MS/MS分析(LC為Waters 2790，Waters公司制、MS為QUATRO micro，Micro MS公司制)，比較分子量及片段類(lèi)型時(shí)，與分子量對(duì)照品一致。因此，可知通過(guò)SiP189的2個(gè)生成物，是胡椒醇及芝麻素。LC-MS/MS分析的條件如下所示。LC，使用Develosil C30-UG-5(日本野村化學(xué)公司制、2.0×50mm)，流動(dòng)相A液使用H2O、B液甲醇、C液10mM CH3COONH4，洗脫使用10％C液，用流速為0.25ml/min.進(jìn)行。在此條件下，胡椒醇在8.4分鐘、芝麻素在10.1分鐘時(shí)被檢測(cè)出。MS用測(cè)定模式POSITIVE進(jìn)行。由此可知，SiP189編碼了由松脂醇經(jīng)過(guò)胡椒醇合成芝麻素的酶。另外，曾認(rèn)為合成從松脂醇到胡椒醇、從胡椒醇到芝麻素的反應(yīng)是由不同的酶催化的，但結(jié)果證明了，用本發(fā)明得到的基因編碼的單一的酶催化雙方的反應(yīng)。
而且，從使用上述酶反應(yīng)液中不加NADPH的反應(yīng)系統(tǒng)分析的結(jié)果，可知INVsc/pYE22m/SiP189的胡椒醇的生成活性依賴(lài)于NADPH[圖2(b)·(c)]。此現(xiàn)象在芝麻素的生成活性上也同樣[圖2(e)·(f)]。另外，與NADPH存在時(shí)相比，不存在NADPH時(shí)，胡椒醇的生成活性和芝麻素的生成活性分別減少到約14％和約18％。
之后，將INVsc/pYE22m/SiP189的微粒體組分通過(guò)一氧化碳還原后，使用分光光度計(jì)(日本日立制作所制U-3000PSpectrophotometer)測(cè)定了吸收光譜。其結(jié)果，此微粒體組分與對(duì)照轉(zhuǎn)基因酵母INVsc/pYE22m比較，顯示了450nm時(shí)的吸收。由此可知，INVsc/pYE22m/SiP189的微粒體組分中，生成了細(xì)胞色素P450蛋白質(zhì)。
如實(shí)施例2中所示，從分離成生長(zhǎng)階段不同的4個(gè)階段的芝麻種子中，使用與實(shí)施例2同樣的方法提取RNA，并使用擴(kuò)增SiP189的序列號(hào)49和50的Primer Set及擴(kuò)增Si18SrRNA的序列號(hào)3和4的Primer Set，進(jìn)行了RT-PCR。PCR反應(yīng)液(25μl)含有各cDNA 1μl、1×Ex-Taq buffer(TaKaRa公司制)、0.2mM dNTPs、引物各0.2pmol/μl、Ex-Taq polymerase 1.25U。94℃反應(yīng)3分鐘后，進(jìn)行94℃ 1分鐘、53℃ 1分鐘、72℃ 2分鐘的反應(yīng)26個(gè)循環(huán)。其結(jié)果，在種子中芝麻素的顯著積累的種子階段4中，確認(rèn)了SiP189呈高表達(dá)。從依賴(lài)于生長(zhǎng)階段的木脂素的積累、與具有生成活性的SiP189基因表達(dá)的時(shí)期一致上，可顯示出芝麻種子內(nèi)生成胡椒醇及芝麻素的酶基因是SiP189。
以上結(jié)果顯示出，SiP189基因編碼催化從松脂醇到胡椒醇、及從胡椒醇到芝麻素的生物合成反應(yīng)的細(xì)胞色素P450。圖3中、SiP189用箭頭表示。由圖3可知，SiP189屬于細(xì)胞色素P450超家族的CYP81家族。
通過(guò)利用本基因，使用芝麻或其他的植物或生物，或使用生物反應(yīng)器等系統(tǒng)，可合成芝麻素及胡椒醇。
〔實(shí)施例7栽培種芝麻Sesamum indicum中SiP189基因的基因組分析〕為明確S.indicum基因組內(nèi)SiP189基因的拷貝數(shù)，進(jìn)行了基因組Southern分析。
按照制造業(yè)者推薦的方法，使用Nucleon Phytopure for PlantExtraction Kit(Amersham公司制)，從S.indicum的葉(真瀨金品種)中提取了基因組DNA。將提取的基因組DNA10μg，分別用EcoRI、NcoI、及XbaI的3種限制內(nèi)切酶完全酶切，再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離基因組DNA。使用0.25M HCl，將瓊脂糖凝膠加水分解15分鐘，然后使用含有1.5M NaCl和0.5MNaOH的溶液進(jìn)行30分鐘變性反應(yīng)，再使用含有1.5M NaCl和Tris-HCl(pH 7.5)的溶液進(jìn)行中和。之后，在20×SSC中，將基因組DNA轉(zhuǎn)錄到膜上(Hybribond-N、Amersham公司制)。將轉(zhuǎn)錄到膜上的基因組DNA通過(guò)UV照射，使其結(jié)合到膜上。將此膜置于含有7％SDS、50％甲酰胺、5×SSC、2％封閉液(blocking reagent)、0.1％十二烷基肌氨酸、及50mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)的雜交緩沖液(高SDS緩沖液、Roche公司)中，42℃預(yù)雜交1小時(shí)。
在雜交探針中，使用了從SiP189 cDNA起始蛋氨酸位點(diǎn)開(kāi)始的、約900bp的ORF區(qū)域。將此區(qū)域使用序列號(hào)61(Bam-SST-FW2)的引物及序列號(hào)62(SiP189-Nco-RV)的引物，通過(guò)PCR，導(dǎo)入了DIG標(biāo)記。PCR反應(yīng)液含有包含SiP189 cDNA的質(zhì)粒(pSPB2055)1ng、1×PCR緩沖液、1×DIG-dNTP mixture(PCR DIG Labeling Mix、Roche公司)、0.2pmol/μl各引物、及rTaq polymerase 1U(日本TAKARA BIO公司制)。PCR反應(yīng)用95℃ 30秒、53℃ 30秒、72℃ 1分鐘的反應(yīng)、30個(gè)循環(huán)的條件進(jìn)行。
將使用葡聚糖凝膠G(Sephadex G)-50 Quick Spin Columns(Boehringer公司制)純化的PCR產(chǎn)物熱變性后，立即置于冰上，并將其作為雜交探針，加入到預(yù)雜交液中10μl，42℃溫育一夜。
在含有0.1％SDS的0.2×SSC溶液中，用65℃ 30分鐘的條件，洗滌膜2次(高嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件)。根據(jù)DIG應(yīng)用手冊(cè)(Roche公司制)，使用DIG-標(biāo)記&診斷試劑盒(Roche公司制)獲得雜交信號(hào)。
檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。如圖5所示，在上述3種限制性?xún)?nèi)切酶處理中，SiP189基因均以單一擴(kuò)增帶被檢測(cè)出。其結(jié)果顯示，S.indicum基因組中SiP189作為單一基因存在，而不存在與SiP189同源性高的基因。也就是說(shuō)，在芝麻植物中，生成胡椒醇及芝麻素的活性是由SiP189產(chǎn)生的。
〔實(shí)施例8從非洲芝麻Sesamum radiatum中分離類(lèi)似SiP189的基因〕非洲芝麻Sesamum radiatum是非洲現(xiàn)存的芝麻植物，通過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)分析，染色體數(shù)2n＝64，與栽培芝麻(S.indicum)(2n＝26)是細(xì)胞遺傳學(xué)上不同的系統(tǒng)(參考文獻(xiàn)、并木滿夫、小林貞作《芝麻的科學(xué)》日本朝倉(cāng)書(shū)店)。但是，有關(guān)于非洲芝麻種子中木脂素含量分析的報(bào)道，證實(shí)了其有芝麻素的積累(參考文獻(xiàn)、Bedigian，D.等人，Biochemical Systematics and Ecology 13，133-139.1985)。因此，非洲芝麻的基因組中，應(yīng)存在編碼與栽培芝麻SiP189對(duì)應(yīng)的酶的基因(SrSiP189)。而且，期望非洲芝麻中具有的基因(SrSiP189)，是與SiP189序列同源性高的基因。
從非洲芝麻的種子中，與實(shí)施例4同法配制了cDNA。以此cDNA 1μl為模板，把[序列號(hào)61(Bam-SST-FW2)及序列號(hào)63(GR-SST-RV1)]作為引物使用，與實(shí)施例4同法進(jìn)行了RT-PCR反應(yīng)。以SiP189的序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)上述引物，以擴(kuò)增可含有全長(zhǎng)ORF的片段。RT-PCR的結(jié)果，得到了認(rèn)為是含有SrSiP189的約1.5kb的擴(kuò)增片段。將此片段插入到pCR-blunt IITOPO載體(Invitrogen公司制)，獲得了pSPB2068。確定了插入了片段的核苷酸序列。其結(jié)果，與來(lái)源于S.indicum的SiP189比較，在DNA水平上顯示了96％的序列同一性，在氨基酸水平上顯示了95％的序列同一性(序列號(hào)64表示了SrSiP189的氨基酸序列，序列號(hào)65表示了SrSiP189的核苷酸序列)。根據(jù)實(shí)施例4，使用前述的引物(序列號(hào)61及序列號(hào)63)，以從S.radiatum種子及葉中配制的cDNA為模板，進(jìn)行了RT-PCR。從結(jié)果可知，SrSiP189的表達(dá)在種子是高表達(dá)，而在葉中則幾乎不表達(dá)。由此RT-PCR的表達(dá)分析，可顯示出SrSiP189在種子中發(fā)揮了作用。
〔實(shí)施例9非洲芝麻Sesamum radiatum中SrSiP189基因的功能分析〕為證明SrSiP189具有的生物化學(xué)的功能，在酵母中使重組SrSiP189蛋白質(zhì)表達(dá)，并檢測(cè)了此重組SrSiP189蛋白質(zhì)所具有的木脂素生物合成活性。首先，將用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI及XhoI酶切pSPB2068后所得到的、含有cDNA在內(nèi)、約1.5kb的全長(zhǎng)SrSiP189的片段，插入到酵母表達(dá)載體pYE22m的BamHI位點(diǎn)及SalI位點(diǎn)，得到了pSPB2069。與實(shí)施例6同法，進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因酵母的微粒體配制及木脂素生物合成活性的測(cè)定。圖6顯示了通過(guò)HPLC分析的測(cè)定結(jié)果。如圖6所示，重組SrSiP189蛋白質(zhì)，與來(lái)源于S.indicum的SiP189同樣，依存于NADPH，具有從松脂醇向胡椒醇變換的活性及從胡椒醇向芝麻素變換的活性[圖6(a)及圖6(b)]。在不含有NADPH的酶反應(yīng)液中，胡椒醇的生成活性降低到16.9％，芝麻素的生成活性降低到8.4％[圖6(c)及圖6(d)]。由上可證實(shí)，SrSiP189在S.radiatum中，是SiP189的counterpart基因。
從以上結(jié)果可證實(shí)，持有類(lèi)似SiP189的序列的基因超越了種而存在，此基因編碼具有從松脂醇向胡椒醇變換的活性、及從胡椒醇向芝麻素變換的活性的酶。
〔實(shí)施例10植物細(xì)胞中SiP189蛋白質(zhì)的功能分析〕為明確植物細(xì)胞中SiP189蛋白質(zhì)的生物化學(xué)功能，使用SiP189基因轉(zhuǎn)化了煙草(N.tabaccum)。
將含有SiP189的pSPB2055用BamHI及XhoI酶切，得到了含有SiP189的ORF的約1.5kb的DNA片段。將此片段與植物轉(zhuǎn)化用雙元載體pSPB176的BamHI位點(diǎn)及SalI位點(diǎn)聯(lián)接，得到了雙元載體pSPB2057。pSPB176的多克隆位點(diǎn)，在CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子之間，插入到此位點(diǎn)的插入片段，在植物細(xì)胞內(nèi)、CaMV35S啟動(dòng)子的控制下，組成性超表達(dá)。
之后，利用公知的方法[下西等、新·生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)入門(mén)3.日本化學(xué)同人(122～124頁(yè))]，使用pSPB2057轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(菌株Aglo)，使具有pSPB2057的轉(zhuǎn)化體農(nóng)桿菌感染煙草葉盤(pán)。
從所得到的轉(zhuǎn)化體13系統(tǒng)的葉中，使用與實(shí)施例2同樣的方法配制cDNA，使用含有序列號(hào)49及序列號(hào)50中所示的堿基序列的引物，按照與實(shí)施例4同樣的方法，進(jìn)行了RT-PCR。將作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)基因的煙草的泛素基因(NtUBQ存取號(hào)U66264)，使用含有序列號(hào)66及序列號(hào)67中所示的核苷酸序列的引物(分別為NtUBQ-FW及NtUBQ-RW)進(jìn)行了擴(kuò)增。其結(jié)果，在系統(tǒng)6、系統(tǒng)7及系統(tǒng)12中，鑒定了高表達(dá)的SiP189基因(圖7)。
以下的操作在冰上或4℃下進(jìn)行。將轉(zhuǎn)化體(系統(tǒng)6、系統(tǒng)7及系統(tǒng)12)、以及非轉(zhuǎn)化體的葉約15g，用在液氮中的研缽粉碎，溶解于30ml的均質(zhì)緩沖液(0.1M磷酸鉀緩沖液，pH 7.0、0.5M甘露糖醇、5mM EDTA、42mM巰基乙醇、50mM抗壞血酸鈉、0.1％BSA、1mM PMSF、1％PVPP)中。
將粉碎溶液用10,000×g離心分離20分鐘后所得的上清，用Miller Cross過(guò)濾。將此過(guò)濾液用100,000×g超離心分離90分鐘后，得到粗提取微粒體組分。使用此微粒體組分(240μl)，按照與實(shí)施例4同樣的方法，與胡椒醇進(jìn)行酶反應(yīng)，用HPLC分析生成物。
HPLC分析的結(jié)果，在超表達(dá)SiP189的、來(lái)源于煙草的微粒體中，觀察到了具有280nm吸收波長(zhǎng)、保留時(shí)間約為17分鐘的峰。此峰在非轉(zhuǎn)化體中未觀察到，且依存于酶反應(yīng)液中存在的NADPH。因?yàn)榇朔逯蹬c芝麻素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致，所以SiP189作為植物細(xì)胞內(nèi)具有芝麻素生成活性的蛋白質(zhì)發(fā)揮作用(圖8)。
〔實(shí)施例11SiP189基因表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)域的鑒定〕為獲得有關(guān)SiP189基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的結(jié)論，分離SiP189基因的5’-非編碼區(qū)域，測(cè)定序列，且進(jìn)行了分析。使用λBlueSTARTMVector system(NOVAGEN公司制)，從芝麻(S.indicum)的基因組DNA中，制作了基因組文庫(kù)。
將芝麻基因組DNA 200μg用限制性?xún)?nèi)切酶Sau3AI酶切，使片段長(zhǎng)度約為20kb，之后，在10℃下、25000rpm、進(jìn)行蔗糖密度梯度離心分離(10％～40％)24小時(shí)(SW28rotor、Beckman公司制)。將離心分離后的樣品，使用AUTOMATIC LIQUID CHARGER(Advantec公司制)及Micro Tube Pump(EYELA公司制)，按每1ml分離。對(duì)于分離了的樣品，通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed-field Gelelectrophoresis)，確認(rèn)了片段的長(zhǎng)度。脈沖場(chǎng)凝膠電泳電泳使用含有1％Agarose NA(Amersham bioscience公司制)、0.5×TBE的凝膠，在0.5×TBE的緩沖液內(nèi)，用120°/1秒-1秒6V/cm的條件下進(jìn)行(CHEF MAPPER、Invitrogen公司制)。使用包含此具有約20kb平均片段長(zhǎng)度的片段的組分，按照制造業(yè)者推薦的方法，制作了基因組文庫(kù)。制作的文庫(kù)具有1.5×106pfu/500μl的效價(jià)。將通過(guò)含有序列號(hào)68及序列號(hào)69中所示的堿基序列的引物(分別為SiP189-bam-FW及SiP189-nco-RV)擴(kuò)增了的SiP189基因的約850bp ORF區(qū)域用作探針，篩選此基因組文庫(kù)(500,000克隆)。
按照制造業(yè)者推薦的方法，使用Alka Phos的直接標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)(Direct Labeling and Detection system)(Amersham bioscience公司制)，進(jìn)行探針的標(biāo)記及檢測(cè)。雜交的條件如下所示。
探針5ng/ml雜化作用緩沖液預(yù)雜交55℃1小時(shí)雜交55℃一夜洗滌55℃30分鐘2次。
篩選3次后，分離9種陽(yáng)性克隆，從其中得到了插入物長(zhǎng)度約為12kb的gSiP189-#6。
之后，使用含有序列號(hào)68及序列號(hào)69中所示的核苷酸序列的引物、噬菌體臂引物STAR-LF1(序列號(hào)70)及STAR-LR1(序列號(hào)71)，進(jìn)行PCR，鑒定了gSiP189-#6內(nèi)探針的插入方向及位置關(guān)系。
其結(jié)果，PCR分析顯示了gSiP189-#6包含5kb或大于5kb的SiP189 5’非編碼區(qū)域。因此，對(duì)此gSiP189-#6的全部堿基進(jìn)行了序列測(cè)定。
以gSiP189-#6為模板，通過(guò)LA-PCR，擴(kuò)增了插入片段。LA-PCR反應(yīng)液含有陽(yáng)性克隆SM緩沖懸浮液1μl、1×LA緩沖液(日本TaKaRa公司制)、各引物50pmol、0.4mM dNTP、2mM MgCl2、2.5單位的LA-Taq聚合酶。96℃反應(yīng)5分鐘后，進(jìn)行98℃ 10秒、55℃ 10秒、68℃10分鐘的反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后用72℃延伸15分鐘。
將所得擴(kuò)增片段物理式切割后，分離具有約1～2kb范圍長(zhǎng)度的DNA片段，補(bǔ)平這些片段的末端。將補(bǔ)平了末端的片段插入到pUC118(日本TaKaRa公司制)的HincII位點(diǎn)，制作了ShotGun文庫(kù)。此文庫(kù)具有2.8×106cfu/μl的效價(jià)。
使用此來(lái)源于gSiP189-#6的Shot Gun文庫(kù)，利用電穿孔法，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B株(Invitrogen公司制)，隨機(jī)拾取192個(gè)菌落，使用Templi Phi DNA測(cè)序模板放大試劑盒(Sequencing Template Amplification kit)(Amersham bioscience公司制)，配制了DNA。使用DYEnamic ET染料終止子試劑盒(dye terminator kit)(Amersham Bioscience公司制)，將配制的DNA通過(guò)M13-47(F)引物(序列號(hào)72)及RV-M(R)引物(序列號(hào)73)擴(kuò)增。
將此擴(kuò)增產(chǎn)物使用Clean SEQ(Agecourt公司制)純化，通過(guò)Mega BASE4000(Amersham Bioscience公司制)測(cè)定序列。將所得序列數(shù)據(jù)通過(guò)PHRAP(CAP4)裝配，得到了含有從SiP189基因的起始蛋氨酸位點(diǎn)開(kāi)始、上游約13kb序列的鄰近序列。
為鑒定此SiP189基因5’區(qū)域的調(diào)節(jié)cis-因子，對(duì)從SiP189基因的起始蛋氨酸位點(diǎn)開(kāi)始上游的約3kb的序列(序列號(hào)74)，進(jìn)行了PLACE分析(http//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)。PLACE分析的結(jié)果顯示了，從SiP189基因的起始蛋氨酸位點(diǎn)開(kāi)始、上游約3kb的范圍內(nèi)特定的轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)合位點(diǎn)及特定的信號(hào)應(yīng)答的調(diào)節(jié)cis-因子多數(shù)已被鑒定，這些會(huì)影響SiP189基因的表達(dá)(圖9及10)。
之后，分離了合成胡椒醇及芝麻素的、來(lái)源于非洲芝麻的酶的基因SrSiP189基因的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)域。以非洲芝麻基因組DNA為模板，使用含有序列號(hào)75及序列號(hào)76中所示的堿基序列的引物(分別為gSST-FW1及gSST-RV2)，進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。根據(jù)序列號(hào)74中所示的SiP189的基因組序列，設(shè)計(jì)了這些引物。
反應(yīng)溶液包含基因組DNA 1μl(50ng)、1×Ex-Taq buffer(TakaRa公司制)、0.2mM dNTPs、引物各0.2pmol/μl、Ex-Taq polymerase1.25U。94℃反應(yīng)5分鐘后，進(jìn)行94℃ 1分鐘、55℃ 1分鐘、72℃ 4分鐘的反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸4分鐘。將所得擴(kuò)增片段進(jìn)行電泳，得到了約3kb的片段。將所得片段按照制造業(yè)者推薦的方法，插入到pCR-TOPO-XL vector(Invitrogen公司制)的多克隆位點(diǎn)上，得到了pSPB2664。將插入到pSPB2664的片段的全核苷酸序列通過(guò)引物走查法(primer walking法)測(cè)定。其結(jié)果，獲得了含有SrSiP189基因的調(diào)節(jié)cis-因子、基因組SrSiP189基因5’側(cè)的約2.8kb的片段(序列號(hào)77)。與SiP189基因同樣進(jìn)行PLACE分析的結(jié)果，大量鑒定了應(yīng)答特定的轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)合位點(diǎn)及特異性信號(hào)的因子(圖11)。
在來(lái)源于栽培芝麻(S.indicum)的SiP189基因、與來(lái)源于非洲芝麻(S.radiatum)的SrSiP189基因之間，使用Clustal-W分析(Mac Vector ver.7.2.2、Symantech公司)，求出了DNA水平的序列同一性。其結(jié)果，兩基因在5’-非編碼區(qū)域約3kb的區(qū)域，顯示了78％的序列同一性。另外，也證明了兩基因的ORF間序列同一性非常高(96％)(圖12)。以上結(jié)果支持SiP189及SrSiP189雖高度保存了蛋白質(zhì)的功能，但兩基因的表達(dá)方式存在著差異的見(jiàn)解。RT-PCR分析及這些cis-因子分析支持2個(gè)木脂素生物合成基因(來(lái)源于S.indicum的SiP189及來(lái)源于S.radiatum的SrSiP189)不在同一轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下的結(jié)論。
〔實(shí)施例12非洲芝麻Sesamum alatum中類(lèi)似SiP189基因的分離〕S.alatum是在形態(tài)學(xué)上與栽培種S.indicum有很大差異的非洲芝麻野生種(并木等、芝麻的科學(xué)、日本朝倉(cāng)書(shū)店)。染色體數(shù)與S.indicum相同，2n＝26，但其地理位置為非洲的尼日利亞、蘇丹、及莫桑比克。
與實(shí)施例8中從非洲芝麻S.radiatum中分離SrSiP189基因的方法相同，從S.alatum中分離了SiP189的counterpart基因(SaSiP189)。
PCR的模板，使用了S.alatum種子階段4的cDNA。使用序列號(hào)61及序列號(hào)63的引物，將用PCR擴(kuò)增了的約1.5kb的擴(kuò)增片段在pCR-blunt II TOPO(Invitrogen)上亞克隆，通過(guò)引物步查法(Primer Walking法)測(cè)定了插入片段的堿基序列。序列號(hào)78表示了SaSiP189的氨基酸序列，序列號(hào)79表示了SaSiP189的核苷酸序列。
所得SaSiP189與SiP189，在DNA水平上顯示了90％的序列同一性，在氨基酸水平上顯示了86％的序列同一性。上述結(jié)果顯示，木脂素生物合成酶基因SiP189，超越了地理間隔、形態(tài)學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)上的差異，是被高度保存的基因。
并且，在具體實(shí)施方式
中舉出的具體實(shí)施形態(tài)或?qū)嵤├?，只是明確本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容的內(nèi)容，而不應(yīng)狹義地解釋成只限于其中的具體實(shí)例，在本發(fā)明的精神和以下所述的權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可進(jìn)行各種變更。
眾所周知，芝麻素是具有多種生理活性且具有各種各樣改善功能的物質(zhì)，通過(guò)本發(fā)明，鑒定了催化從松脂醇到胡椒醇、或從胡椒醇到芝麻素生物合成的酶的基因，并使用此被鑒定的來(lái)源于芝麻的細(xì)胞色素P450基因(SiP基因)，通過(guò)重組生物使芝麻素及胡椒醇等的生產(chǎn)得以實(shí)現(xiàn)，所以，對(duì)擴(kuò)大芝麻素產(chǎn)量及削減生產(chǎn)成本均很有作用。
綜上所述，與本發(fā)明有關(guān)的來(lái)源于芝麻種子的SiP189基因及SrSiP189基因，是編碼催化從松脂醇到胡椒醇及從胡椒醇到芝麻素生物合成反應(yīng)的細(xì)胞色素P450的基因。從古至今都屬于貴重食品，且作為對(duì)健康有益的食品的代表為人所知的芝麻的種子，及從該種子中獲得的油、芝麻種子的提取物，今后會(huì)日益受到重視和關(guān)注。其中，芝麻素將以其生理活性受到重視。因此，由本發(fā)明鑒定的SiP189基因及SrSiP189基因，可用于至今為止只從芝麻種子中生產(chǎn)芝麻素的生產(chǎn)方式中，并可由衷地期待其產(chǎn)量的擴(kuò)大。
所以，本發(fā)明可用于農(nóng)業(yè)、食品行業(yè)、醫(yī)藥品行業(yè)及其相關(guān)的行業(yè)中。
序列表<110>三得利株式會(huì)社(SUNTORY LIMITED)<120>編碼催化木脂素生物合成的酶的基因及其利用(A gene encoding an enzyme catalyzingbiosynthesis of lignan，and the use thereof)<130>SU0411/PCT<150>JP 2003-341313<151>2003-09-30<150>JP 2003-432383<151>2003-12-26<160>79<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>506<212>PRT<213>芝麻(Sesamum indicum)<220>
<223>SiP189<400>1Met Glu Ala Glu Met Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Thr Phe Ala Ile1 5 10 15Phe Met Val Tyr Arg Ile Leu Ser Asn Ser Gln Asp Lys Arg Ser Leu20 25 30Thr Lys Leu Pro Pro Ser Pro Pro Gly Trp Leu Pro Val Ile Gly His35 40 45Ala His Leu Met Lys Asn Leu Leu His Arg Thr Leu Tyr Asp Phe Ser50 55 60Gln Lys Leu Gly Pro Ile Phe Ser Ile Arg Phe Gly Ser Arg Leu Val65 70 75 80Val Val Val Ser Ser Ser Ser Leu Val Glu Glu Cys Phe Thr Lys Tyr85 90 95
Asp Ile Val Leu Ala Asn Arg Pro Gln Ala Ser Val Asp Arg Arg Ser100 105 110Leu Gly Phe Ser Thr Thr Ser Val Ile Gly Ala Pro Tyr Gly Asp His115 120 125Trp Arg Asn Leu Arg Lys Leu Cys Asp Leu Glu Val Phe Ala Pro Thr130 135 140Arg Leu Ala Ser Phe Leu Ser Ile Arg Leu Asp Glu Arg Asp Arg Met145 150 155 160Ile Ser Ala Leu Tyr Lys Ile Ser Ser Ala Gly Phe Ala Lys Val Asn165 170 175Leu Glu Ala Lys Ile Val Glu Leu Thr Phe Asn Asn Ile Met Arg Met180 185 190Val Ala Ala Lys Arg Tyr Tyr Gly Glu Glu Ala Glu Asp Asp Glu Glu195 200 205Ala Lys Arg Phe Arg Asp Leu Thr Lys Glu Ala Leu Glu Leu Thr Ser210 215 220Ala Ser Asn Pro Gly Glu Ile Phe Pro Ile Leu Arg Trp Leu Gly Cys225 230 235 240Asn Gly Leu Glu Lys Lys Leu Ala Val His Ser Arg Lys Thr Asp Glu245 250 255Phe Met Gln Gly Leu Leu Asp Glu His Arg Arg Gly Glu Arg Gln Asn260 265 270Thr Met Val Asp His Leu Leu Ser Leu Gln Glu Ser Gln Pro Glu Tyr275 280 285Tyr Thr Asp Glu Ile Ile Thr Gly Leu Ile Val Ala Leu Ile Ile Ala290 295 300Gly Thr Asp Ala Ser Val Val Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu305 310 315 320Leu Asn His Pro Lys Val Leu Glu Lys Ala Arg Lys Glu Leu Asp Thr325 330 335
Leu Val Gly His Glu Arg Met Val Asp Glu His Asp Leu Pro Lys Leu340 345 350Arg Tyr Leu His Cys Ile Val Leu Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Ser355 360 365Val Pro Thr Leu Val Pro His Glu Pro Ser Glu Asp Cys Lys Ile Gly370 375 380Gly Tyr Asn Val Pro Lys Gly Thr Met Val Leu Val Asn Ala Trp Ala385 390 395 400Ile His Arg Asp Pro Lys Val Trp Asp Asp Pro Leu Ser Phe Lys Pro405 410 415Asp Arg Phe Glu Ile Met Glu Val Glu Thr His Lys Leu Leu Pro Phe420 425 430Gly Met Gly Arg Arg Ala Cys Pro Gly Ala Gly Leu Ala Gln Lys Phe435 440 445Val Gly Leu Ala Leu Gly Ser Leu Ile Gln Cys Phe Asp Trp Glu Arg450 455 460Thr Ser Pro Glu Lys Ile Asp Leu Asn Glu Gly Ser Gly Ile Thr Leu465 470 475 480Pro Lys Ala Lys Thr Leu Glu Ala Met Cys Lys Pro Arg His Val Met485 490 495Glu Lys Val Leu Arg Gln Val Ser Asn Val500 505<210>2<211>1518<212>DNA<213>芝麻(Sesamum indicum)<220>
<223>SiP189<400>2atggaagctg aaatgctata ttcagctctc gctctcacct tcgccatatt catggtttac60
agaattcttt ctaattcgca ggacaagcgc agcctgacta agctgcctcc gagcccgccc120ggttggctgc cggtgatcgg ccacgctcat ctcatgaaaa atctcctcca tagaacacta180tacgacttct cccagaaact gggacccata ttttccatcc ggttcgggtc gcgcctcgtg240gtggtggtgt cctcctcctc cctggtggag gaatgtttca ccaagtatga cattgtcttg300gcaaatcgcc ctcaggcttc tgttgaccgg cgctcacttg ggttcagcac caccagcgta360atcggggccc cgtacgggga ccattggcgc aacctgcgaa agttgtgcga tcttgaagta420ttcgccccga cccgtctcgc ctcgttttta tccatcaggc ttgacgagag ggaccgcatg480atttccgcgt tatacaaaat ctcgtccgcc ggtttcgcga aggtgaattt ggaagcgaag540attgtggagc tgacgtttaa taacataatg aggatggtgg cggcgaagag atactatggg600gaggaggcgg aggacgacga ggaggcgaag aggttcaggg acctgacgaa ggaggctttg660gagttgacga gcgcttccaa tcctggtgag atatttccaa tattgcggtg gcttggttgc720aatgggctgg agaagaagct ggctgttcac tcgcggaaga cggatgagtt catgcaaggg780ctgctggacg aacaccgacg gggcgagcgc cagaacacca tggttgatca tttgctttcg840ttgcaggaat ctcaacctga gtactacact gatgaaatca tcactggcct catagttgca900ttgataattg cgggaacgga tgcatcggtt gtaactacag aatgggcgat gtccctttta960ctaaatcatc ccaaagtact tgaaaaggct agaaaagaac tggacactct agtaggacac1020gaacgcatgg ttgatgaaca cgatctcccc aaactacgtt accttcactg catagtcttg1080gagaccttaa ggttattccc ttctgttcca actttggtgc cacacgaacc atcagaggat1140tgtaaaattg ggggatacaa tgtccccaag gggacaatgg tattagtgaa tgcttgggca1200atacaccgag accccaaggt gtgggacgac cccttgagct ttaagcccga caggtttgag1260ataatggaag tggagacaca caagttgttg ccgttcggaa tgggcaggag agcgtgtcct1320ggagctggac tggcgcagaa gtttgtgggg ttggctttgg ggtcgctgat tcagtgtttc1380gactgggaga gaacgagtcc cgagaaaatt gacttgaacg aaggttctgg gataaccttg1440cctaaagcta agacgttgga agccatgtgc aaacctagac atgtcatgga aaaagttctt1500cgtcaggttt ccaacgtt 1518<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，Si18SrRNA-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，Si18SrRNA-FW)<400>3tatgcttgtc tcaaagatta a 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，Si18SrRNA-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，Si18SrRNA-RV)<400>4aacatctaag ggcatcacag a 21<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP90A-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP90A-FW)<400>5ttttccgatg aagagattgt tgac 24<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP90A-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP90A-RV)<400>6tgccatctcc aagggttg 18<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP72B-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP72B-FW)<400>7cttaatgttc aaatgataat ggat 24
<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP72B-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP72B-RV)<400>8gtaaatcgtt cagggttg 18<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP71B-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP71B-FW)<400>9ttcaccactg atcatctcaa agga 24<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP71B-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP71B-RV)<400>10agaaacctgt cagggtta 18<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP84A-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP84A-FW)<400>11cttacccgtg acaatatcaa agca 24<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP84A-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP84A-RV)<400>12aaaaacctcg atggtcta 18<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP96A-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP96A-FW)<400>13agtcatgata agttcctcag ggac 24<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP96A-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP96A-RV)<400>14
atccatctct ctggcttg 18<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP710A-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP710A-FW)<400>15tccgaagacg aagccatcgg cggt 24<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP710A-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP710A-RV)<400>16ctaaaccggt ccggatcg 18<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP86A-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP86A-FW)<400>17cgcgtggcgc tcaacttcat ccta 24<210>18<211>18<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP86A-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP86A-RV)<400>18atccatctct ctggtttg 18<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP74-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP74-FW)<400>19cgagaagaag ctactcacaa tctt 24<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP74-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP74-RV)<400>20acgaatctct ccggcaca 18<210>21<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP75B-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP75B-FW)
<400>21ttaacggata ctgagattaa agcct 25<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP75B-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesi zed Primer Sequence，CYP75B-RV)<400>22aagaatctct cgggttta 18<210>23<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP79F-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP79F-FW)<400>23gtcacaccag acgaaatcaa agct 24<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP79F-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP79F-RV)<400>24aggtgacgct ccggtttg 18<210>25<211>24
<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP81D-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP81D-FW)<400>25tacatggacc gcatcatcaa agga 24<210>26<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP81D-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP81D-RV)<400>26tcgaacctct ctggcttg 18<210>27<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP705A-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP705A-FW)<400>27catatcaagt cgcttctcac ggta 24<210>28<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP705A-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP705A-RV)
<400>28agaaacctct ctggttta 18<210>29<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP83A-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP83A-FW)<400>29tttactgatg ataatgtcaa agcc 24<210>30<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，CYP83A-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，CYP83A-RV)<400>30agaaacctct cgggccta 18<210>31<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP168-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP168-FW<400>31tttcccttgt tctcctactc t 21<210>32
<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP168-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP168-RV)<400>32aaataatgat agctaaattt t 21<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP189-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP189-FW)<400>33tcgtttttat ccatcaggct t 21<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP189-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP189-RV)<400>34caaacgttgg aaacctgacg a 21<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP236-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP236-FW)<400>35ggatgttctg tggaagttaa a 21<210>36<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP236-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP236-RV)<400>36atctaagttt catgcagttt t 21<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP249-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP249-FW)<400>37ctaagcttca aaatgtcgat a 21<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP249-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP249-RV)<400>38ccaacttact tattacagat a 21
<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP288-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP288-FW)<400>39aaaatggtgg gaattgtgta t 21<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP288-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP288-RV)<400>40tacatctcaa tttttctta 19<210>41<211>32<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，GR-SiP168-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，GR-SiP168-RV)<400>41cacgatcctg gagatttccg gggaggatac aa 32<210>42<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，GR-SiP168-Nest-RV(Description ofArtificial SequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，GR-SiP168-Nest-RV)<400>42gtaggttttg gagagttt 18<210>43<211>31<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，GR-SiP189-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，GR-SiP189-RV)<400>43ctcgtcgtcc tccgcctcct ccccatagta t 31<210>44<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，GR-SiP189-Nest-RV(Description ofArtificial SequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，GR-SiP189-Nest-RV)<400>44accatcctca ttatgttatt a 21<210>45<211>28<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，GR-SiP236-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，GR-SiP236-RV)<400>45ccaggagaga gttgttgctg ttgtgtct 28
<210>46<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，GR-SiP236-Nest-RV(Description ofArtificial SequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，GR-SiP236-Nest-RV)<400>46tataaagctt attgttat 18<210>47<211>33<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP168-BamHI-FW(Description ofArtificial SequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP168-BamHI-FW)<400>47ggatccaaaa gagcaaatta tggatctact act 33<210>48<211>33<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP168-XhoI-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP168-XhoI-RV)<400>48ctcgagaagg gaaaataatg atagctaaat ttt 33<210>49<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP189-BamHI-FW(Description ofArtificial SequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP189-BamHI-FW)<400>49ggatcctttt cagccaacat ggaagctgaa 30<210>50<211>33<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP189-XhoI-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP189-XhoI-RV)<400>50ctcgagaaaa agagcatcat ttaatcatac act 33<210>51<211>35<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP236-BamHI-FW(Description ofArtificial SequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP236-BamHI-FW)<400>51ggatccttca cttcacttca ttgctcaatg gcaaa 35<210>52<211>33<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP236-XhoI-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP236-XhoI-RV)<400>52ctcgagaaca gctgagaccc cacagcaatc taa 33
<210>53<211>1503<212>DNA<213>芝麻(Sesamum indicum)<220>
<223>SiP249<400>53atgtcgatac ctctccttat ctctctctca ttaatcatcc ttgttttcct actagtccga60cgacgccgca acagcccggc tggtcgaaaa ctccggcgtc ctccggggcc tcctggcctt120cccttcctcg ggaacttgct ccaatacaac ccctccgatc tccatctccg cctgacaaaa180ctctcagaaa agtacggccc gcttatgtac atgacgttcg tcggaaagcc cgtggttgtg240atttcatcgg cccgagtggc caaagaggct ttgaagtaca atgaccttgc attttcgagc300aggccttcta ccattgcatc gcgcaaagtg gcttacaaca acagtgacat ctccatgtca360ccgtacacag agtactggag agaactgcgg aaaatggtcg ttcttcgcct ctttacggtc420aaacaagtga actctttccg ccctgctcga gaagaagaag tggcccgcat ggtgaaagag480atttccagac gggccaacgc gcatcagccc gttaacatta atgaaatagc gttgtcgttg540tcgagcagga tgatatctag gtttgcactg gggaagaggt acgacgagga gaacgggccg600gaaaagagga ggttcgacag gattctgcag ctgcttcagt tggtgtcggt ggaaattttc660tttggtgatt attctccatg gctgggctgg attgacagac tgtgtggtaa ggtttctcag720cttgagaagg cgttcaagga tttggattca ttgtatgaag agatgatcgc ggagcatctg780agcccgaata ggcccgagtc tatgaacgga gacattcttg atatgctaat tcagatgaaa840gaagatcggt cgtcgacggt tcaaattgat tgggatcata tcaagggcgt actcatgaac900atgttcgtag ccggaacaga cacaactgca gctacaataa catgggcaat gacagctctg960atcaagaagc ctcaagtact gaacaaagtg caacaagaaa tcagatctgt ggtcggaaag1020aaaggcagcg tagccgaaga tgatatacaa aaacttccct attttaaagc ggtggtgaag1080gagactctga gactgtacgc accagctcca ctctcactgc ccagactgac aatcaaaagc1140agcgtcatag atggatacga cattgaaccc aacaccatag tttacgtgaa cgtttgggcg1200attagccgag acaaggattt ttgggagaac ccggatgagt tcttgcccga aagattcttg1260aacagtagcg tggactttaa aggccaagat ttcgggtttc ttccattcgg gtcggggcga1320agagtgtgcc ctggaatggc cttggggact gcagaagtgg aggtgtcgct tgctaatatt1380ctgtattgct tccactggga attgccgcct ggaatggtag aagatgacgt tgatatggac1440tttttgcctg gaattactac tcataagaaa aatgcactct atttgatggc caaaagctat1500ctg 1503<210>54<211>501<212>PRT<213>芝麻(Sesamum indicum)<220>
<223>SiP249<400>54Met Ser Ile Pro Leu Leu Ile Ser Leu Ser Leu Ile Ile Leu Val Phe1 5 10 15Leu Leu Val Arg Arg Arg Arg Asn Ser Pro Ala Gly Arg Lys Leu Arg20 25 30Arg Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Pro Phe Leu Gly Asn Leu Leu Gln35 40 45Tyr Asn Pro Ser Asp Leu His Leu Arg Leu Thr Lys Leu Ser Glu Lys50 55 60Tyr Gly Pro Leu Met Tyr Met Thr Phe Val Gly Lys Pro Val Val Val65 70 75 80Ile Ser Ser Ala Arg Val Ala Lys Glu Ala Leu Lys Tyr Asn Asp Leu85 90 95Ala Phe Ser Ser Arg Pro Ser Thr Ile Ala Ser Arg Lys Val Ala Tyr100 105 110Asn Asn Ser Asp Ile Ser Met Ser Pro Tyr Thr Glu Tyr Trp Arg Glu115 120 125Leu Arg Lys Met Val Val Leu Arg Leu Phe Thr Val Lys Gln Val Asn130 135 140Ser Phe Arg Pro Ala Arg Glu Glu Glu Val Ala Arg Met Val Lys Glu145 150 155 160Ile Ser Arg Arg Ala Asn Ala His Gln Pro Val Asn Ile Asn Glu Ile165 170 175Ala Leu Ser Leu Ser Ser Arg Met Ile Ser Arg Phe Ala Leu Gly Lys180 185 190Arg Tyr Asp Glu Glu Asn Gly Pro Glu Lys Arg Arg Phe Asp Arg Ile195 200 205Leu Gln Leu Leu Gln Leu Val Ser Val Glu Ile Phe Phe Gly Asp Tyr210 215 220
Ser Pro Trp Leu Gly Trp Ile Asp Arg Leu Cys Gly Lys Val Ser Gln225 230 235 240Leu Glu Lys Ala Phe Lys Asp Leu Asp Ser Leu Tyr Glu Glu Met Ile245 250 255Ala Glu His Leu Ser Pro Asn Arg Pro Glu Ser Met Asn Gly Asp Ile260 265 270Leu Asp Met Leu Ile Gln Met Lys Glu Asp Arg Ser Ser Thr Val Gln275 280 285Ile Asp Trp Asp His Ile Lys Gly Val Leu Met Asn Met Phe Val Ala290 295 300Gly Thr Asp Thr Thr Ala Ala Thr Ile Thr Trp Ala Met Thr Ala Leu305 310 315 320Ile Lys Lys Pro Gln Val Leu Asn Lys Val Gln Gln Glu Ile Arg Ser325 330 335Val Val Gly Lys Lys Gly Ser Val Ala Glu Asp Asp Ile Gln Lys Leu340 345 350Pro Tyr Phe Lys Ala Val Val Lys Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Ala Pro355 360 365Ala Pro Leu Ser Leu Pro Arg Leu Thr Ile Lys Ser Ser Val Ile Asp370 375 380Gly Tyr Asp Ile Glu Pro Asn Thr Ile Val Tyr Val Asn Val Trp Ala385 390 395 400Ile Ser Arg Asp Lys Asp Phe Trp Glu Asn Pro Asp Glu Phe Leu Pro405 410 415Glu Arg Phe Leu Asn Ser Ser Val Asp Phe Lys Gly Gln Asp Phe Gly420 425 430Phe Leu Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Val Cys Pro Gly Met Ala Leu435 440 445Gly Thr Ala Glu Val Glu Val Ser Leu Ala Asn Ile Leu Tyr Cys Phe450 455 460
His Trp Glu Leu Pro Pro Gly Met Val Glu Asp Asp Val Asp Met Asp465 470 475 480Phe Leu Pro Gly Ile Thr Thr His Lys Lys Asn Ala Leu Tyr Leu Met485 490 495Ala Lys Ser Tyr Leu500<210>55<211>1545<212>DNA<213>芝麻(Sesamum indicum)<220>
<223>SiP288<400>55atggtgggaa ttgtgtatat tgagcttttc ttgtcagtta tgtggtttat ggctttgtgg60gtgtggttga attacagggc cctggcgtgg aactggcctg tgatcggaat gctgccgacg120cttctgcttc acgtgagccg gattcacgac aattgcacgg agattatggg gaagtcccga180cggggaactt ttcatttccg gggtccctgg ttggctgata tggacatgat ggggactgct240gatcctgaga atgttcacta cattatgagc gcgaacttcc agaatttccc gaaaggcccc300aagttcaggg aaatttttga tgttcttgga gatgggattt tcaatgcaga ttcggagtcc360tggagggacc agagaagggt tgccagggcc ctgatttctc accatggttt cctccggttt420ctggcgaaga tcagccgtga gaaggtagag aaaggcctga ttccagttct tgaaacggtg480tgcctggaaa atcgggtggt cgatttgcag gatttgttcc agaggttgac gtttgataca540acttgtacat ttgttactgg ttatgatcct ggatgcttgt ctgttgattt gcctgatgtt600cctttctcga aagccctaga tgatgccgaa gaagcgatat tcatgcgcca tgtggttcct660gaaaagattt ggaaacttca gaggtggttt ggggttggat ctgagagaaa attgagcaag720gctcgtgaag tcttggatag cgtcattggc aggtatatcg cgctgaagcg cggcgaaatg780agaagccgag gaatttcgat tgattgtgaa aatgaagatg gtgtggatct gctcacgtct840tacatgactg tgggagacga tggtactcaa acccatgatt tgaaatgtga tgacaagttc900ttgagggaca cgatactgaa tctaatgatt gcagggcggg acacgacgag ttctgctctg960acatggttta tatggcttgt gtcgacacat gctgaagtgg aaaagaggat cagggatgaa1020ctgaagtcct ttctgcccgc cggagaacgt gaaaagtggc gtgtgtttgg ggttgaagaa1080accaagaagt tggtttacat gcatggagca atttgcgaag ccctacgact atatccacca1140gtcccgttcc agcataagga gccggtggaa ccagatatcc ttccgagcgg gcattttgtg1200gaaccgacaa tgaaagtgat gttctcattg tacgccatgg gacggatgga atccgtttgg1260ggcgaggatt gcttggaatt caagccggag aggtggattt ctgatagggg atcgatcaag1320cacgagccct catacaagtt cttggctttc aatgctggtc cgaggacttg cttggggaag1380gatgtggctt tcgctcaggt gaaggcagtg gccgccacct taatccataa ctaccaagtt1440cacgtggcag acggccaccg cgtgctgccc aattgttcca tcatcctcta catgaggaat1500ggattgaagg ttagggttgc caatagatgg tctgctaaga aaaat1545
<210>56<211>515<212>PRT<213>芝麻(Sesamum indicum)<220>
<223>SiP288<400>56Met Val Gly Ile Val Tyr Ile Glu Leu Phe Leu Ser Val Met Trp Phe1 5 10 15Met Ala Leu Trp Val Trp Leu Asn Tyr Arg Ala Leu Ala Trp Asn Trp20 25 30Pro Val Ile Gly Met Leu Pro Thr Leu Leu Leu His Val Ser Arg Ile35 40 45His Asp Asn Cys Thr Glu Ile Met Gly Lys Ser Arg Arg Gly Thr Phe50 55 60His Phe Arg Gly Pro Trp Leu Ala Asp Met Asp Met Met Gly Thr Ala65 70 75 80Asp Pro Glu Asn Val His Tyr Ile Met Ser Ala Asn Phe Gln Asn Phe85 90 95Pro Lys Gly Pro Lys Phe Arg Glu Ile Phe Asp Val Leu Gly Asp Gly100 105 110Ile Phe Asn Ala Asp Ser Glu Ser Trp Arg Asp Gln Arg Arg Val Ala115 120 125Arg Ala Leu Ile Ser His His Gly Phe Leu Arg Phe Leu Ala Lys Ile130 135 140Ser Arg Glu Lys Val Glu Lys Gly Leu Ile Pro Val Leu Glu Thr Val145 150 155 160Cys Leu Glu Asn Arg Val Val Asp Leu Gln Asp Leu Phe Gln Arg Leu165 170 175Thr Phe Asp Thr Thr Cys Thr Phe Val Thr Gly Tyr Asp Pro Gly Cys
180 185 190Leu Ser Val Asp Leu Pro Asp Val Pro Phe Ser Lys Ala Leu Asp Asp195 200 205Ala Glu Glu Ala Ile Phe Met Arg His Val Val Pro Glu Lys Ile Trp210 215 220Lys Leu Gln Arg Trp Phe Gly Val Gly Ser Glu Arg Lys Leu Ser Lys225 230 235 240Ala Arg Glu Val Leu Asp Ser Val Ile Gly Arg Tyr Ile Ala Leu Lys245 250 255Arg Gly Glu Met Arg Ser Arg Gly Ile Ser Ile Asp Cys Glu Asn Glu260 265 270Asp Gly Val Asp Leu Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Gly Asp Asp Gly275 280 285Thr Gln Thr His Asp Leu Lys Cys Asp Asp Lys Phe Leu Arg Asp Thr290 295 300Ile Leu Asn Leu Met Ile Ala Gly Arg Asp Thr Thr Ser Ser Ala Leu305 310 315 320Thr Trp Phe Ile Trp Leu Val Ser Thr His Ala Glu Val Glu Lys Arg325 330 335Ile Arg Asp Glu Leu Lys Ser Phe Leu Pro Ala Gly Glu Arg Glu Lys340 345 350Trp Arg Val Phe Gly Val Glu Glu Thr Lys Lys Leu Val Tyr Met His355 360 365Gly Ala Ile Cys Glu Ala Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Val Pro Phe Gln370 375 380His Lys Glu Pro Val Glu Pro Asp Ile Leu Pro Ser Gly His Phe Val385 390 395 400Glu Pro Thr Met Lys Val Met Phe Ser Leu Tyr Ala Met Gly Arg Met405 410 415Glu Ser Val Trp Gly Glu Asp Cys Leu Glu Phe Lys Pro Glu Arg Trp
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<223>SiP168<400>57atggatctac tactttccct tgttctccta ctctgttctg cagcatgcat ttggtttctc60cgggtggtcc tgaaacccaa tccagggccc cggaaatcag ccaatctccc tccagggcca120aaacctcttc ccataatcgg caacattctt gagcttggtg agaaacccca ccaatctctc180gccaaactct ccaaaaccta cgggcccctg atgcgtctca agctgggaac catgacaaca240gttgttgtat cctccccgga aatctccagg atcgtgctgc aacaatatga ccaagttttc300tccagccgaa cacacgcaga tgccatccga gcacttgacc accacaaaca ttccgtcgcc360tggataccgg cggacaatca gtggcggaaa atccgtaaac tgtgcaaaga gaagatgttt420tcgggccaaa agcttgatgc gaaccagggc ctgaggaggg agaagttgcg taatttgcaa480gactatgtga atgaatgctg cgttagtggc caggtcgtgg atattggtgt agctgccttt540acgacgaccc ttaatctgat atcggccact cttttctcgg tggattttgc tgattttggt600tctggttcgt ctcaagagct taaggatgtt atgagcggga tagcgtctat catcggccga660ccaaattttg ctgattgttt ccctcttctt cggctggttg atccacaggg catcttccgc720cagaccacgt tacatttcaa caagtgtttt aagatctttg atgaaattat ccgtcaaagg780ctacagacca atgattcggg gacgaaaagt gacatgctga aagagcttct tgaaatcaac840cagaaagatg agtctgaatt gagctttgac gagatcaagc atttactcct ggatctactt900
gtcgcaggaa cggacacaac ttcagttaca gtggaatggg caatgacgga gctagtgcgc960caccctgaga aaatgtcgaa agccagaaat gagttaagaa atgtggtggg actgaataaa1020gaaattcaag aatcagacat ctcaagactc ccttacctac gagcagtggt gaaagaaagt1080ttcaggcttc accctgcaac tcctttatcg gtacctcaca aggccgacga ggaagcagaa1140atcaatggct atatagtccc taaaggagca caagttctca tgaacgtgtg ggccatcggc1200agagattcaa gcatatggag gaaccctgat gtattcatgc ccgagaggtt cttggagaca1260gaaattgatg tccgtggcca acacttcgag ctgcttcctt ttggcggggg gaggaggatt1320tgcgtggggc tgccgttagc ctatcgtatg atccatctcg tgcttgccac tttcataagc1380gactatgatt ggaaacttga aggagggctg aaaactgaag aaatggacat gagtgaaaag1440ttcggcctca ccctgcaaaa agccattcct ctcaaggcac ttccagttaa aatt 1494<210>58<211>498<212>PRT<213>芝麻(Sesamum indicum)<220>
<223>SiP168<400>58Met Asp Leu Leu Leu Ser Leu Val Leu Leu Leu Cys Ser Ala Ala Cys1 5 10 15Ile Trp Phe Leu Arg Val Val Leu Lys Pro Asn Pro Gly Pro Arg Lys20 25 30Ser Ala Asn Leu Pro Pro Gly Pro Lys Pro Leu Pro Ile Ile Gly Asn35 40 45Ile Leu Glu Leu Gly Glu Lys Pro His Gln Ser Leu Ala Lys Leu Ser50 55 60Lys Thr Tyr Gly Pro Leu Met Arg Leu Lys Leu 6ly Thr Met Thr Thr65 70 75 80Val Val Val Ser Ser Pro Glu Ile Ser Arg Ile Val Leu Gln Gln Tyr85 90 95Asp Gln Val Phe Ser Ser Arg Thr His Ala Asp Ala Ile Arg Ala Leu100 105 110Asp His His Lys His Ser Val Ala Trp Ile Pro Ala Asp Asn Gln Trp115 120 125
Arg Lys Ile Arg Lys Leu Cys Lys Glu Lys Met Phe Ser Gly Gln Lys130 135 140Leu Asp Ala Asn Gln Gly Leu Arg Arg Glu Lys Leu Arg Asn Leu Gln145 150 155 160Asp Tyr Val Asn Glu Cys Cys Val Ser Gly Gln Val Val Asp Ile Gly165 170 175Val Ala Ala Phe Thr Thr Thr Leu Asn Leu Ile Ser Ala Thr Leu Phe180 185 190Ser Val Asp Phe Ala Asp Phe Gly Ser Gly Ser Ser Gln Glu Leu Lys195 200 205Asp Val Met Ser Gly Ile Ala Ser Ile Ile Gly Arg Pro Asn Phe Ala210 215 220Asp Cys Phe Pro Leu Leu Arg Leu Val Asp Pro Gln Gly Ile Phe Arg225 230 235 240Gln Thr Thr Leu His Phe Asn Lys Cys Phe Lys Ile Phe Asp Glu Ile245 250 255Ile Arg Gln Arg Leu Gln Thr Asn Asp Ser Gly Thr Lys Ser Asp Met260 265 270Leu Lys Glu Leu Leu Glu Ile Asn Gln Lys Asp Glu Ser Glu Leu Ser275 280 285Phe Asp Glu Ile Lys His Leu Leu Leu Asp Leu Leu Val Ala Gly Thr290 295 300Asp Thr Thr Ser Val Thr Val Glu Trp Ala Met Thr Glu Leu Val Arg305 310 315 320His Pro Glu Lys Met Ser Lys Ala Arg Asn Glu Leu Arg Asn Val Val325 330 335Gly Leu Asn Lys Glu Ile Gln Glu Ser Asp Ile Ser Arg Leu Pro Tyr340 345 350Leu Arg Ala Val Val Lys Glu Ser Phe Arg Leu His Pro Ala Thr Pro355 360 365
Leu Ser Val Pro His Lys Ala Asp Glu Glu Ala Glu Ile Asn Gly Tyr370 375 380Ile Val Pro Lys Gly Ala Gln Val Leu Met Asn Val Trp Ala Ile Gly385 390 395 400Arg Asp Ser Ser Ile Trp Arg Asn Pro Asp Val Phe Met Pro Glu Arg405 410 415Phe Leu Glu Thr Glu Ile Asp Val Arg Gly Gln His Phe Glu Leu Leu420 425 430Pro Phe Gly Gly Gly Arg Arg Ile Cys Val Gly Leu Pro Leu Ala Tyr435 440 445Arg Met Ile His Leu Val Leu Ala Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Asp Trp450 455 460Lys Leu Glu Gly Gly Leu Lys Thr Glu Glu Met Asp Met Ser Glu Lys465 470 475 480Phe Gly Leu Thr Leu Gln Lys Ala Ile Pro Leu Lys Ala Leu Pro Val485 490 495Lys Ile<210>59<211>1545<212>DNA<213>芝麻(Sesamum indicum)<220>
<223>SiP236<400>59atggcaaacc ccattgattt tctcctcagc ccaacaccat atgtggctac aacccttctt60tacgttctct tctctgttct tattgttaga ttcctcagca gaaagctgct cgggaagaag120aggtaccatc ccattggtgg taccgtgttc aaccagctgc tgaacttcta taggttgcat180gattatatgg ctgatcttgc agggaagtac aagacttaca gactgattgc cccttttcgg240actgaggtct atacatctga ccccgctaat gttgagcaca tgttgaaaac gaatttcgaa300agttatggca agggacctta caattgcagc attctggggg atttgtttgg tgaaggaatt360ttcgcaatcg atggccataa gtggagggag cagagaaaag tgtcaagcct tgagttttct420acaagggttc tgagggatta cagtagcatc gtcttcagga aaaacgccgt aaggctcgca480
aaaattctgt ctggagctgc aacttccaac caaccagtgg atattcaaga tcttttcatg540aaatcaactt ttgattctat ttcggaagtt gctttaggag ttgagcttga cagcttgggt600ggttcaaatg aagaaggtgc caaatttagc attgctgcag acgacgtgag tatgaggaca660ctttggagat acgtggatgt tctgtggaag ttaaagagag ctctaaatgt tggttcagaa720gcaaaactga agaaaagcct tcaagtggtt gatgaatttg tgtataagct gattcatagt780aggactcagc aaatgaacat gccaggaaat gattctgtta tgcagctgaa gaaagacgac840attttgtcaa gattcttgca acttactgag gccactccca agtacttgag ggacataaca900ataagcttta tagttgctgg taaagacaca acagcaacaa ctctctcctg gtttatttac960atgctttgca agtatcctca tgttcaggaa aaggtggagc aagagataaa agatgcgaca1020ggctgcaaag aggtagcaga tatctcagaa ttttcagcct gtgtgacaga agaagctttg1080ggcaagatgc attatctcca tgcagcattg acagaaacac tgaggattta tccagcagtt1140gcggtggatg caaagcaatg tttgtgtgat gatataatgc cggatgggtt cagtgttaag1200aagggggaca tggtggctta tcaaccatat gcaatgggaa ggatgaaatc catatggggt1260aatgatgcag aagagttcaa accagagaga tggcttgaca aaaacggttg cttccagcag1320gccagccctt ttaagtttac agctttccag gccggccctc gtctttgttt ggggaaagag1380tttgcttatc ggcagatgaa gatattctca gccattctgc tgagattctt taccatgaaa1440ctaagtgatg aaagaaagac agtaaactac agaccaatgc tcactcttct catcgacggt1500ggtctcattg tccgcccctt tcacagaatg gacgagaaaa ctgca1545<210>60<211>515<212>PRT<213>芝麻(Sesamum indicum)<220>
<223>SiP236<400>60Met Ala Asn Pro Ile Asp Phe Leu Leu Ser Pro Thr Pro Tyr Val Ala1 5 10 15Thr Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Ser Val Leu Ile Val Arg Phe Leu20 25 30Ser Arg Lys Leu Leu Gly Lys Lys Arg Tyr His Pro Ile Gly Gly Thr35 40 45Val Phe Asn Gln Leu Leu Asn Phe Tyr Arg Leu His Asp Tyr Met Ala50 55 60Asp Leu Ala Gly Lys Tyr Lys Thr Tyr Arg Leu Ile Ala Pro Phe Arg65 70 75 80Thr Glu Val Tyr Thr Ser Asp Pro Ala Asn Val Glu His Met Leu Lys
85 90 95Thr Asn Phe Glu Ser Tyr Gly Lys Gly Pro Tyr Asn Cys Ser Ile Leu100 105 110Gly Asp Leu Phe Gly Glu Gly Ile Phe Ala Ile Asp Gly His Lys Trp115 120 125Arg Glu Gln Arg Lys Val Ser Ser Leu Glu Phe Ser Thr Arg Val Leu130 135 140Arg Asp Tyr Ser Ser Ile Val Phe Arg Lys Asn Ala Val Arg Leu Ala145 150 155 160Lys Ile Leu Ser Gly Ala Ala Thr Ser Asn Gln Pro Val Asp Ile Gln165 170 175Asp Leu Phe Met Lys Ser Thr Phe Asp Ser Ile Ser Glu Val Ala Leu180 185 190Gly Val Glu Leu Asp Ser Leu Gly Gly Ser Asn Glu Glu Gly Ala Lys195 200 205Phe Ser Ile Ala Ala Asp Asp Val Ser Met Arg Thr Leu Trp Arg Tyr210 215 220Val Asp Val Leu Trp Lys Leu Lys Arg Ala Leu Asn Val Gly Ser Glu225 230 235 240Ala Lys Leu Lys Lys Ser Leu Gln Val Val Asp Glu Phe Val Tyr Lys245 250 255Leu Ile His Ser Arg Thr Gln Gln Met Asn Met Pro Gly Asn Asp Ser260 265 270Val Met Gln Leu Lys Lys Asp Asp Ile Leu Ser Arg Phe Leu Gln Leu275 280 285Thr Glu Ala Thr Pro Lys Tyr Leu Arg Asp Ile Thr Ile Ser Phe Ile290 295 300Val Ala Gly Lys Asp Thr Thr Ala Thr Thr Leu Ser Trp Phe Ile Tyr305 310 315 320Met Leu Cys Lys Tyr Pro His Val Gln Glu Lys Val Glu Gln Glu Ile
325 330 335Lys Asp Ala Thr Gly Cys Lys Glu Val Ala Asp Ile Ser Glu Phe Ser340 345 350Ala Cys Val Thr Glu Glu Ala Leu Gly Lys Met His Tyr Leu His Ala355 360 365Ala Leu Thr Glu Thr Leu Arg Ile Tyr Pro Ala Val Ala Val Asp Ala370 375 380Lys Gln Cys Leu Cys Asp Asp Ile Met Pro Asp Gly Phe Ser Val Lys385 390 395 400Lys Gly Asp Met Val Ala Tyr Gln Pro Tyr Ala Met Gly Arg Met Lys405 410 415Ser Ile Trp Gly Asn Asp Ala Glu Glu Phe Lys Pro Glu Arg Trp Leu420 425 430Asp Lys Asn Gly Cys Phe Gln Gln Ala Ser Pro Phe Lys Phe Thr Ala435 440 445Phe Gln Ala Gly Pro Arg Leu Cys Leu Gly Lys Glu Phe Ala Tyr Arg450 455 460Gln Met Lys Ile Phe Ser Ala Ile Leu Leu Arg Phe Phe Thr Met Lys465 470 475 480Leu Ser Asp Glu Arg Lys Thr Val Asn Tyr Arg Pro Met Leu Thr Leu485 490 495Leu Ile Asp Gly Gly Leu Ile Val Arg Pro Phe His Arg Met Asp Glu500 505 510Lys Thr Ala515<210>61<211>34<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，Bam-SST-FW2(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，Bam-SST-FW2)<400>61tggatcccaa ctcatagagt actcaaaaac gctt34<210>62<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP189-Nco-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP189-Nco-RV)<400>62gcaaatgatc aaccatggtg ttct 24<210>63<211>27<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，GR-SST-RV1(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，GR-SST-RV1)<400>63cacatgaacg agacgaactg ggtttgg27<210>64<211>506<212>PRT<213>非洲芝麻(Sesamum radiatum)<220>
<223>SrSiP189<400>64
Met Glu Ala Glu Met Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Thr Phe Ala Ile1 5 10 15Phe Met Val Tyr Arg Ile Leu Ser Asn Ser Gln Glu Lys Ser Ser Leu20 25 30Ile Lys Leu Pro Pro Ser Pro Pro Gly Trp Leu Pro Val Ile Gly His35 40 45Val His Leu Met Lys Asn Leu Leu His Arg Thr Leu Tyr Asp Phe Ser50 55 60Gln Lys Leu Gly Pro Ile Phe Ser Leu Arg Phe Gly Thr Arg Leu Val65 70 75 80Val Val Val Ser Ser Ser Ser Leu Val Glu Glu Cys Phe Thr Lys Tyr85 90 95Asp Ile Val Leu Ala Asn Arg Pro Gln Pro Ser Val Asp Arg Arg Ser100 105 110Leu Gly Phe Ser Thr Thr Ser Val Ile Gly Ala Pro Tyr Gly Asp His115 120 125Trp Arg Asn Leu Arg Lys Leu Cys Asp Leu Glu Val Phe Ala Pro Thr130 135 140Arg Leu Ala Ser Phe Leu Ser Ile Arg Leu Asp Glu Arg Asp Arg Met145 150 155 160Ile Ser Ser Leu Tyr Lys Ile Ser Ser Ala Gly Phe Ala Lys Val Asn165 170 175Leu Glu Thr Lys Ile Val Glu Leu Thr Phe Asn Asn Ile Met Arg Met180 185 190Val Ala Gly Lys Arg Tyr Tyr Gly Glu Glu Ala Glu Asp Asp Glu Glu195 200 205Ala Lys Arg Phe Arg Asp Leu Thr Lys Glu Ala Leu Glu Leu Thr Ser210 215 220Ala Ser Asn Pro Gly Glu Ile Phe Pro Ile Leu Arg Trp Leu Gly Phe225 230 235 240
Asn Gly Leu Glu Lys Lys Leu Ala Val His Ala Arg Lys Thr Asp Glu245 250 255Phe Met Gln Gly Leu Leu Asp Glu His Arg Arg Gly Glu Arg Gln Asn260 265 270Thr Met Val Asp His Leu Leu Ser Leu Gln Glu Ser Gln Pro Glu Tyr275 280 285Tyr Thr Asp Glu Ile Ile Thr Gly Leu Ile Val Ala Leu Ile Ile Ala290 295 300Gly Thr Asp Ala Ser Val Val Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Ile305 310 315 320Leu Asn His Pro Gln Val Leu Glu Lys Ala Arg Lys Glu Leu Asp Thr325 330 335Leu Val Gly His Glu Arg Met Val Asp Glu His Asp Leu Pro Lys Leu340 345 350Arg Tyr Leu His Cys Ile Val Leu Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Ser355 360 365Val Pro Thr Leu Val Pro His Glu Pro Ser Glu Asp Cys Lys Ile Gly370 375 380Gly Tyr Asn Val Pro Lys Gly Thr Met Ile Leu Val Asn Ala Trp Ala385 390 395 400Ile His Arg Asp Pro Lys Val Trp Asp Asp Pro Leu Ser Phe Lys Pro405 410 415Asp Arg Phe Glu Thr Met Glu Val Glu Thr His Lys Leu Leu Pro Phe420 425 430Gly Met Gly Arg Arg Ala Cys Pro Gly Ala Gly Leu Ala Gln Lys Phe435 440 445Val Gly Leu Ala Leu Gly Ser Leu Ile Gln Cys Phe Glu Trp Glu Arg450 455 460Met Ser Ala Glu Lys Ile Asp Leu Asn Glu Gly Ser Gly Ile Thr Leu465 470 475 480
Pro Lys Ala Lys Thr Leu Glu Ala Met Cys Lys Pro Arg His Ile Met485 490 495Glu Arg Val Leu Arg Gln Val Ser Asn Val500 505<210>65<211>1518<212>DNA<213>非洲芝麻(Sesamum radiatum)<220>
<223>SrSiP189<400>65atggaagctg aaatgctata ttcagctctc gctctcacct tcgccatatt catggtttac60agaattcttt ctaattcgca ggagaaaagc agcctgatta agctgccgcc gagcccgccg120ggttggctcc cggtgatcgg ccacgttcat ctcatgaaaa atctcctcca tagaacacta180tacgacttct cccagaaact gggacccata ttttccctcc ggttcggcac ccgcctcgtg240gtagtggtgt cctcctcctc cctggtcgag gaatgtttca ccaagtacga cattgtcttg300gccaaccgcc ctcagccctc tgtcgaccgg cgctcactcg ggttcagcac caccagcgta360atcggcgccc cgtacgggga ccattggcgc aacctgcgaa agttgtgcga tcttgaagta420ttcgccccga cccgtctcgc ctcgttttta tccatcaggc ttgacgagag ggaccgcatg480atttcgtcgt tgtacaaaat ctcgtccgcc ggtttcgcga aggtgaattt ggagacgaag540attgttgagc tgacgtttaa taacataatg aggatggtgg cggggaagag atactatggg600gaggaggcgg aggacgacga ggaggcgaag aggttcaggg acctgacgaa ggaggctttg660gagttgacga gcgcttccaa tcctggtgag atatttccaa tattgcggtg gcttggtttc720aatgggttgg agaagaagct ggctgttcac gcgcggaaga cggatgagtt catgcaaggg780ctgctggacg aacaccgacg gggcgagcgc cagaacacca tggttgatca tttgctttcg840ttgcaggaat ctcaacctga gtactacact gatgaaatca tcactggcct catagttgca900ttgataattg cgggaacgga tgcatcggtt gtaactacag aatgggcgat gtcccttata960ctaaatcatc cccaagtact tgaaaaggct agaaaagaac tggacactct agtaggacac1020gaacgcatgg tcgatgaaca tgatctgccc aaactacgtt accttcactg catagtcttg1080gagaccttaa ggttatttcc ttctgttcca acgttggtgc cacacgaacc atcggaggat1140tgtaaaattg ggggatacaa tgtccccaag gggacaatga tactggtgaa tgcttgggca1200atacaccgag accccaaggt gtgggacgac cccttgagct ttaagcccga caggtttgag1260acaatggaag tggagacaca caagctgttg ccgttcggga tgggcaggag agcgtgtccc1320ggagctggat tggcgcagaa gtttgtgggg ttggctttgg ggtcgctgat tcagtgtttc1380gagtgggaga gaatgagtgc ggagaaaatt gacttgaacg aaggttctgg gataaccttg1440cctaaagcta agacgttgga agccatgtgc aaacctagac atatcatgga gagagttctt1500cgtcaggttt cgaacgtc 1518
<210>66<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，NtUBQ-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，NtUBQ-FW)<400>66ggaatgcaga tcttcgtcaa20<210>67<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，NtUBQ-RW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，NtUBQ-RW)<400>67cctagaaacc accacgga 18<210>68<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP189-bam-FW(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP189-bam-FW)<400>68ttttcagcca acatggaagc tgaa 24<210>69<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，SiP189-nco-RV(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，SiP189-nco-RV)<400>69gcaaatgatc aaccatggtg ttct 24<210>70<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，STAR-LF1(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，STAR-LF1)<400>70acgaagttat gcggccaatt aaccc 25<210>71<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，STAR-LR1(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，STAR-LR1)<400>71ccacctgacg tcgcggccta atacg 25<210>72<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，M13-47(F)(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，M13-47(F))<400>72cgccagggtt ttcccagtca cgac 24
<210>73<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，RV-M(R)(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，RV-M(R))<400>73gagcggataa caatttcaca cagg 24<210>74<211>3069<212>DNA<213>Sesamun indium<400>74tacgtggttg taaattaagg tggcatagtc aaagctgtgt aggatggagg aattagacac60ttccccagtc ccccacagac tattcccgag ctgaccaaac acagtcgaaa gtgtggggcc120caatgaaatt gacagatgac gtctagtgta gtgtgaatgt gtgatatttt tgcagaatat180tgtaaaagag ggttcaccaa atctcactag tttgtgacta attgactatt tttgcagaaa240attcgtattt agtatagggt cttggtcaaa ttaattaatt atataacaaa tgtgatatat300ttaatttgtt attaattttt ttatatttgt tgtgtaatta gttaggattt tatataagaa360tttgaaaaaa tgagatgttt ttttgtaaat caaattacac aatatcatgt attgggtttt420tcgtcctgaa gtcgcttgaa aattgattag atcggcggac ttgaacagac gagtgaatgg480acatgattta aaattttaag gataaatata tatagtatca gttatcaaaa taaaaaattt540ccttcaaaat catggtcttg tttaagatag ttttttgagt aatgtggcac cataattccc600aagcactaga agtgcaattg taaatccaac ggtacctagt ttaattgata aaattaaagt660ccaaaaattt tcctgagaaa ccaattcgag caagggtaca tcaaaggtgc caccagggag720ttaagcaaga aatgtcccct aaactttagg catgaggtat ccctataaaa taaattgacc780taaaaagatt caaatggctt agagtcgaga aaaagactaa gtagaccatt agggaagccc840acatgcctaa gatcctccag ccgaagtaga ggcctatgcg gcagtcagcc tagtgacttg900ggattcccta gctctgaaag aattaatatt gtcccaagaa tctaaggcta catagtagaa960atgaaaacaa agcgaattta aatttgaagc cagcatgatt gaattttttt tttttttttc1020aggtgtttaa gcactcaaac atgtacaata aataaacgtg tggctaattt aaagaacatt1080gaaagctggc caagaattat accttttaaa gcgagtggag tttccgatgt ttgagctctc1140attcaatccg ttcacatcta gatgaacaaa cgtctctttt aatggtatcc acgatacctt1200tgtcgagggg atttctcgtc tccttgctag aggattcaat attaccaagg ggtcaaaact1260atactaactt aaagaagatt gagaacacac tattaaattc tcgatcccaa ttttcaagcc1320tttgcaccta gttgaaagct tgtgcgtaga gatgcttttg agagagtgtc ggggaggaga1380ggggatggaa cacaaaattt taggcttatt ttttcttttt tttttttgtc aaaaatgtct1440
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<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，gSST-FW1(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，gSST-FW1)<400>75aatgaaattg acagatgacg tctagtgta 29<210>76<211>30
<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的說(shuō)明人工合成的引物序列，gSST-RV2(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence，gSST-RV2)<400>76ctgcgaatta gaaagaattc tgtaaaccat 30<210>77<211>2815<212>DNA<213>非洲芝麻(Sesamum radiatum)<400>77tagtgtagtg tgaatgtgtg atatttttgc agtatatata ttgtaaaaga ggattaacca60aatctctcta gttcgtgatt atgactattt ttgcagaaaa tttgtattta gtttagggtt120ggtaaaatct aatttataga gtaaatatga tgtatttatt ttgtgattga ttacttttat180atttattgta taattagtta taatttgata aagtgtgata ttttttataa attagattac240atattattat gtactgagtt tttcgttctg atgccattta aaaattggtt aggtcggcga300cttgaactga cgagtgaagg gacttgattt aacattttaa ggatatatat atatagtacc360agttatcaaa ataaaagttt tctttcaaaa tcatagtttt gtttaagata attttgtgag420tatatgttgc accacaattc ccaagcacta taagtgcaac tgtaggtcta attggaccta480gtttagttga caaaattgaa gtccaagaat atcttcaaga agccaattcg tgtaatggta540cgtcaaaggt gccaccaggg aatcaagtag gaaatttccc ctaaatgtta ggcatgaggt600gccactataa agaaaattga cccaaagaga tacaagtatc ttagagtcga gaagaagact660acgtagacca ttagggaagt ccacatgcct aagattctgc agctgaagca caggcctagg720tacggtcagc ccagggactc gagatcccct agctctcaaa gaattggtat tggcccagga780atctaaggct acatagcaaa aacgaaaata aaacaaactt aaatttgaag tcaacgggat840tgaatcctat tttctcgggt gttcaaactc aagcatgtaa aataaataaa cgtgtgacta900atttacaaaa cactgaaaac taattacaaa ttatacctta aaagcatgtg tagtttttaa960cgtttgagct ttcgtcaatc cattcacgta gagataaacg gacgtctcct ctaagggtat1020ccacaatacc attggcgagg agatttcttg tctattagag gattcgagat taccatggag1080ttagaactat aaacctaaag aagatcgaga aaatactatt agattagtgt tctcaatctc1140aattctcaag ccttcaaacc tagttaaaag cttgagaaaa tttgtgcgta gatatgtttt1200ggagagagtg tcggagagaa gaggggatcg agcacaaact cttagcccta ttcttttctc1260ttctttgccg aaaaatgtct ttgttagagt ccttgtgcat gttttctata tgccaaatat1320gtggtggtaa gcacaacaaa gttatgtgaa aagaaattgt attagcacta cgttgaataa1380gattgtcttc tactaataga tgatagaggg caaccattgg cttgtcggtt acttattcca1440acataatgta gaggcccaag catgataaga cctatgccac aggacgtcct tgggtggtcc1500aagtgatatt gacgtaagac cttttaacct acttcggcag gctttagcca taacctccag1560cctgtgaaac ccgatcagat gaggatatcc cctcagcccc tccaaaaatc taggaatctc1620atccgcagca gatttcggta tcttttccta gaagatcaaa aaactctaac cactaagaga1680
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Leu Val Gly His Glu Arg Met Val Glu Glu Asp Asp Leu Pro Lys Leu340 345 350Arg Tyr Leu His Tyr Ile Ile Leu Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Ser355 360 365Val Pro Thr Leu Val Pro His Glu Pro Ser Glu Asp Cys Asn Ile Gly370 375 380Gly Tyr Asn Val Pro Lys Gly Thr Met Ile Ile Val Asn Ala Trp Ala385 390 395 400Ile His Arg Asp Pro Lys Val Trp Asp Asp Pro Met Ser Phe Lys Pro405 410 415Asp Arg Phe Glu Thr Leu Glu Val Glu Thr His Lys Leu Leu Pro Phe420 425 430Gly Met Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Ala Gly Leu Ala Lys Lys Phe435 440 445Val Gly Leu Ala Leu Ala Ser Leu Ile Gln Cys Phe Asp Trp Glu Arg450 455 460Ile Ser Ala Glu Lys Ile Asp Leu Lys Glu Gly Ala Ser Arg Ile Thr465 470 475 480Leu Pro Lys Ala Thr Thr Leu Glu Ala Met Cys Lys Pro Arg His Val485 490 495Met Glu Lys Val Leu Arg Gln Val Ser Asn Val500 505<210>79<211>1524<212>DNA<213>非洲芝麻(Sesumum alatum)<400>79atggaagctg aaatgctata ttcagctctc gctctcacct tcgccataat catggttcac 60agaattcttt caaattcaca gaacaagcgc agcctgatca atctgccgcc gagcccgcct 120ggttggctgc cgattatcgg ccaccttcat ctcataaaaa atccactcca tagaacacta 180tacgactgct cccagaaact gggatccata ttctccgtct ggttcgggtc ccgcctcgtg 240gtggtggtgt cctcctcctc cctggtggag gaatgtttca ccaagtacga cattgtcttg 300
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1.基因，其編碼催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)。
2.基因，其編碼催化松脂醇及/或胡椒醇形成甲二氧基氧橋的反應(yīng)的蛋白質(zhì)。
3.基因，其編碼催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)，且含有以下(a)或(b)(a)序列號(hào)1、64或78中所示氨基酸序列；或(b)在上述氨基酸序列中，1個(gè)或大于1個(gè)的氨基酸被取代、缺失、插入及/或附加了的氨基酸序列。
4.基因，其編碼催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)，且含有對(duì)于序列號(hào)1、64或78中所示氨基酸序列具有50％或大于50％同源性的氨基酸。
5.基因，其是具有把序列號(hào)2、65或79中所示堿基序列作為開(kāi)放閱讀框區(qū)域的基因。
6.基因，其編碼催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)，且在以下(a)～(c)的任一嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交(a)含有序列號(hào)2、65或79中所示堿基序列的多核苷酸；(b)含有編碼序列號(hào)1、64或78中所示氨基酸序列的堿基序列的多核苷酸；或(c)上述多核苷酸的片段。
7.基因，其來(lái)源于芝麻、且是權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的基因。
8.蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的基因編碼。
9.蛋白質(zhì)，其催化胡椒醇及/或芝麻素的生物合成，且含有以下(a)或(b)(a)序列號(hào)1、64或78所示的氨基酸序列；或(b)在上述氨基酸序列中，1個(gè)或大于1個(gè)的氨基酸被取代、缺失、插入及/或附加了的氨基酸序列。
10.抗體，其識(shí)別權(quán)利要求8或9中所述的蛋白質(zhì)。
11.重組表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的基因。
12.轉(zhuǎn)化體，其含有包含權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述基因的重組表達(dá)載體。
13.蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，其包含培養(yǎng)或繁殖權(quán)利要求12中所述轉(zhuǎn)化體的過(guò)程，及從該轉(zhuǎn)化體中獲得催化胡椒醇及/或芝麻素生物合成的蛋白質(zhì)的過(guò)程。
14.植物或該植物的后代或其組織，其中導(dǎo)入了權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的基因。
15.胡椒醇及/或芝麻素的生產(chǎn)方法，其包含使用權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的基因、或權(quán)利要求8或9中所述蛋白質(zhì)的過(guò)程。
16.生產(chǎn)高含量木脂素的轉(zhuǎn)化體的方法，其包含使用權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述基因的過(guò)程。
17.生產(chǎn)高含量胡椒醇及/或芝麻素的植物體的方法，其包含使用權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述基因的過(guò)程。
18.生產(chǎn)低含量木脂素的轉(zhuǎn)化體的方法，其包含使用權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述基因的過(guò)程。
19.生產(chǎn)低含量胡椒醇及/或芝麻素的植物體的方法，其包含使用權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述基因的過(guò)程。
20.培育芝麻的方法，其包含使用權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述基因的過(guò)程。
21.基因檢測(cè)工具，其是具備以含有權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述基因中至少一部分堿基序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸為探針的基因檢測(cè)工具。
全文摘要
本發(fā)明提供催化從松脂醇向胡椒醇的反應(yīng)及從胡椒醇向芝麻素的反應(yīng)的酶、以及編碼該酶的基因。本發(fā)明進(jìn)一步提供含有編碼上述酶的基因的載體及轉(zhuǎn)化體、以及使用該轉(zhuǎn)化體的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法。
文檔編號(hào)C12P17/18GK1886499SQ200480028559
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2004年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月30日
發(fā)明者小野榮一郎, 田中良和 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社