專利名稱：拮抗性抗－cd40單克隆抗體和它們的使用方法
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及能結(jié)合CD40的人抗體，所述抗體的使用方法和治療由CD40表達細胞上的CD40信號刺激介導(dǎo)疾病的方法。

背景技術(shù)：
B細胞在正常的體內(nèi)免疫應(yīng)答期間發(fā)揮重要作用。外來抗原與特異性B細胞的表面免疫球蛋白結(jié)合，激發(fā)了一系列反應(yīng)，包括內(nèi)吞作用、加工、MHC-II類分子上加工肽的呈遞和上調(diào)B細胞表面的B7抗原。然后，特異性T細胞經(jīng)T細胞受體(TCR)對MHC-II類分子上呈遞的加工抗原的識別與B細胞結(jié)合。經(jīng)TCR的刺激激活了T細胞并啟動T細胞產(chǎn)生細胞因子。T細胞上的CD28抗原和B細胞上的B7抗原之間的相互作用是進一步激活T細胞的第二信號。當接收到上述信號時，在休眠的人T細胞上不表達的CD40配體(CD40L或CD154)在T細胞表面得到上調(diào)。CD40配體與B細胞表面的CD40抗原結(jié)合刺激了B細胞，導(dǎo)致B細胞成熟為分泌高水平可溶性免疫球蛋白的漿細胞。
CD40是一種55kDa的細胞表面抗原，存在于正常和致瘤性人B細胞、樹突狀細胞、其它抗原呈遞細胞(APC)、內(nèi)皮細胞、單核細胞和上皮細胞表面。患有低級和高級B細胞淋巴瘤、B細胞急性成淋巴細胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細胞白血病和何杰金病的患者的轉(zhuǎn)化細胞表達CD40。在三分之二的急性成髓細胞白血病病例和50％AIDS相關(guān)淋巴瘤中也檢測到CD40表達。B細胞系的幾種腫瘤的惡性B細胞可高度表達CD40并且似乎依賴CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而存活和增殖。
成免疫細胞的B細胞淋巴瘤常發(fā)生在免疫受損個體中，例如同種異體移植受者和其它接收長期免疫抑制治療的個體、AIDS患者和患原發(fā)性免疫缺陷綜合征，如X-連鎖淋巴細胞增殖綜合征或威-奧綜合征的患者(Thomas等，(1991)，Adv.Cancer Res.57329；Straus等，(1993)，Ann.Intern.Med.11845)。
CD40抗原與人神經(jīng)生長因子(NGF)受體、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)受體和Fas相關(guān)，這提示CD40在B細胞激活中有重要功能的配體的受體。APC上的CD40表達在激活T輔助細胞和細胞毒T淋巴細胞中起重要的共同刺激作用。CD40受體也表達在活化的T細胞、活化的血小板和發(fā)炎的血管平滑肌細胞上。在嗜酸性粒細胞、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜、表皮成纖維細胞和其它非淋巴細胞類型細胞上也發(fā)現(xiàn)了CD40受體。CD40L與CD40受體結(jié)合可刺激B-細胞增殖和分化，產(chǎn)生抗體、同種型轉(zhuǎn)換和B-細胞記憶。
發(fā)明簡述
本發(fā)明提供治療由CD40表達細胞上的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激所介導(dǎo)的疾病的組合物和方法，所述疾病包括淋巴瘤、自身免疫疾病和移植排異。這些組合物包含能結(jié)合位于人CD40表達細胞表面的人CD40抗原的單克隆抗體，其中這種結(jié)合能阻止所述細胞的生長和分化。這些組合物也包含能特異性結(jié)合表達于人CD40表達細胞表面的人CD40抗原的單克隆抗體，所述單克隆抗體無明顯的激動活性，其中與相似濃度的嵌合性-CD20單克隆抗體IDEC-C2B8相比，給予所述單克隆抗體在使用Daudi人B細胞淋巴瘤細胞系的分階段(staged)裸鼠異種移植腫瘤模型中可導(dǎo)致腫瘤體積明顯縮小。這些組合物也包含這些單克隆抗體的抗原結(jié)合片段、產(chǎn)生這些抗體的雜交瘤細胞系和編碼這些單克隆抗體氨基酸序列的分離的核酸分子。本發(fā)明還包括含有以藥學(xué)上可接受的載體配制的這些抗-CD40抗體的藥物組合物。
本發(fā)明提供預(yù)防或治療由CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激所介導(dǎo)的疾病的方法，包括用抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段治療患者，當所述抗體或其抗原結(jié)合片段與人CD40表達細胞上的CD40抗原結(jié)合時無明顯的激動活性。由CD40表達細胞的刺激所介導(dǎo)的疾病包括自身免疫疾病、癌癥和器官和組織移植排異?？捎帽景l(fā)明方法預(yù)防或治療的淋巴瘤包括非何杰金淋巴瘤(高級淋巴瘤、中級淋巴瘤和低級淋巴瘤)、何杰金病、急性成淋巴細胞白血病、骨髓瘤、慢性淋巴細胞白血病和成髓細胞白血病。
可考慮用本發(fā)明方法治療的具體自身免疫疾病包括全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、銀屑病、自身免疫血小板減少性紫癜、多發(fā)性硬化癥、強直性脊柱炎、重癥肌無力和尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris)。這種抗體也可用于通過抑制自身免疫應(yīng)答來預(yù)防器官和組織移植排異，通過消除惡性B淋巴細胞的CD40提供的激活信號來治療淋巴瘤并可以特異性方式將毒素遞送至攜帶CD40的細胞。
本發(fā)明提供了抑制人患者的人B細胞生長、分化和/或增殖和抑制B細胞產(chǎn)生抗體的方法，這些方法是抑制B細胞系癌細胞生長的方法。本發(fā)明也提供鑒定對CD40表達細胞具有拮抗活性的抗體的方法。
本文公開的單克隆抗體對CD40具有強親和力，其特征在于解離平衡常數(shù)(KD)至少為10-6M，優(yōu)選至少約10-7M-10-8M，更優(yōu)選至少約10-8M-10-12M。適用于本發(fā)明方法的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段能特異性結(jié)合表達于人細胞上的人CD40抗原。當它們與人細胞上的CD40抗原結(jié)合時，無明顯的激動活性而顯示拮抗活性。在一個實施方案中，當抗-CD40抗體或其片段結(jié)合正常B細胞上的CD40抗原時顯示拮抗活性。在另一個實施方案中，當抗-CD40抗體或其片段結(jié)合惡性人B細胞上的CD40抗原時，顯示拮抗活性。合適的單克隆抗體具有人恒定區(qū)；它們也優(yōu)選具有完全或部分的人源化框架區(qū)；最優(yōu)選完全的人抗體或它們的抗原結(jié)合片段。這種單克隆抗體的例子是本文名為CHIR-5.9和CHIR-12.12的抗體；名為131.2F8.5.9(本文稱為細胞系5.9)和153.8E2.D 10.D6.12.12(稱為細胞系12.12)的雜交瘤細胞系產(chǎn)生的單克隆抗體；含有SEQ ID NO6所示、SEQ ID NO7所示、SEQ ID NO8所示、同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示和同時含有SEQ ID NO6和SEQ IDNO8所示氨基酸序列的單克隆抗體；含有SEQ ID NO2所示、SEQ ID NO4所示、SEQ ID NO5所示、同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示氨基酸序列的單克隆抗體；具有由含有SEQ ID NO1所示、SEQ ID NO3所示、同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體；和保留特異性結(jié)合人CD40能力的這些單克隆抗體的抗原結(jié)合片段，當它們結(jié)合人細胞上的CD40抗原時，無明顯的激動活性而顯示拮抗活性。這種單克隆抗體的例子也包括結(jié)合某表位的單克隆抗體，所述表位能結(jié)合雜交瘤細胞系12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；結(jié)合某表位的單克隆抗體，所述表位含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示氨基酸序列的殘基82-87；在競爭性結(jié)合試驗中與單克隆抗體CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；和為CHIR-12.12單克隆抗體或任一上述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合人CD40抗原的能力。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道本文所公開的拮抗性抗-CD40抗體和這些抗體的抗原結(jié)合片段包括用本領(lǐng)域熟知和下文所述的方法重組產(chǎn)生的抗體和它們的抗原結(jié)合片段，并且包括，例如重組產(chǎn)生的單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12。
在本發(fā)明的一個實施方案中，治療方法包括給予患者治療有效劑量的藥物組合物，該組合物含有合適的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段?？?CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量的范圍是約0.01mg/kg-40mg/kg、約0.01mg/kg-30mg/kg、約0.1mg/kg-30mg/kg、約1mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-25mg/kg、約3mg/kg-20mg/kg、約5mg/kg-15mg/kg或約7mg/kg-12mg/kg。應(yīng)理解該治療方法包括單次給予治療有效劑量或多次給予治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。
可修飾適用于本發(fā)明方法的本文所鑒定的拮抗性抗-CD40抗體。這些拮抗性抗-CD40抗體的修飾物包括，但不限于免疫活性的嵌合抗-CD40抗體、人源化抗-CD40抗體和免疫活性的鼠抗-CD40抗體。
附圖簡述


圖1顯示CHIR-5.9和CHIR-12.12單克隆抗體與淋巴瘤細胞系(Ramos)表面上的CD40的結(jié)合情況。
圖2A和2B為CHIR-5.9和CHIR-12.12單克隆抗-CD40抗體相對于CD40配體的結(jié)合特性。圖2A顯示CHIR-5.9和CHIR-12.12單克隆抗體與細胞表面CD40結(jié)合阻止了隨后的CD40-配體結(jié)合。圖2B顯示CHIR-5.9和CHIR-12.12單克隆抗體能競爭除去預(yù)先已結(jié)合到細胞表面CD40上的CD40配體。
圖3A和3B顯示候選單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12抗非何杰金淋巴瘤(NHL)患者淋巴節(jié)癌細胞的ADCC活性。分離后新鮮的(圖3A)或于37℃培養(yǎng)過夜的(圖3B)正常志愿獻血者(donor)的富集NK細胞在本試驗中用作效應(yīng)細胞。由于NHL細胞也表達利妥昔單抗(rituximab)(Rituxan)的靶抗原，CD20，比較了候選mAb與利妥昔單抗的ADCC活性。
圖4闡述了利用不分階段裸鼠異種移植B細胞淋巴瘤(Namalwa)模型比較的單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12與利妥昔單抗的體內(nèi)抗腫瘤活性。
圖5闡述了利用不分階段裸鼠異種移植B細胞淋巴瘤(Daudi)模型比較單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12與利妥昔單抗的體內(nèi)抗腫瘤活性。RC，對腫瘤攻擊的耐受性。
圖6闡述了利用分階段裸鼠異種移植B細胞淋巴瘤(Daudi)模型比較的單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12與利妥昔單抗的體內(nèi)抗腫瘤活性。CR，完全消退。
圖7顯示了用于測定Namalwa和Daudi細胞上的CD20和CD40分子數(shù)量的方案。
圖8顯示mAb CHIR-12.12和利妥昔單抗抗Daudi腫瘤細胞的相當ADCC(活性)。
圖9顯示了mAb CHIR-12.12的輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖9A顯示輕鏈的前導(dǎo)區(qū)(SEQ ID NO2的殘基1-20)、可變區(qū)(SEQ ID NO2的殘基21-132)和恒定區(qū)(SEQ ID NO2的殘基133-239)。圖9B顯示重鏈的前導(dǎo)區(qū)(SEQ ID NO4的殘基1-19)、可變區(qū)(SEQ ID NO4的殘基20-139)和恒定區(qū)(SEQ ID NO4的殘基140-469)。圖9B所示mAb CHIR-12.12重鏈的交替恒定區(qū)反映了SEQ ID NO4的153位用絲氨酸殘基替換丙氨酸殘基。mAb CHIR-12.12重鏈的該變體的完整序列示于SEQ ID NO5。
圖10顯示mAb CHIR-12.12的輕鏈(圖10A；SEQ ID NO1)和重鏈(圖10B；SEQ ID NO3)的編碼序列。
圖11列出了mAb CHIR-5.9的輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖11A顯示了輕鏈的前導(dǎo)區(qū)(SEQ ID NO6的殘基1-20)、可變區(qū)(SEQ ID NO6的殘基21-132)和恒定區(qū)(SEQ ID NO6的殘基133-239)。圖11B顯示了重鏈的前導(dǎo)區(qū)(SEQ ID NO7的殘基1-19)、可變區(qū)(SEQ ID NO7的殘基20-144)和恒定區(qū)(SEQ ID NO7的殘基145-474)。圖11B所示mAb CHIR-5.9重鏈的交替恒定區(qū)反映了SEQ ID NO7的158位用絲氨酸殘基替換丙氨酸殘基。mAb CHIR-5.9重鏈的該變體的完整序列示于SEQ ID NO8。
圖12顯示了人CD40的短同種型(氨基酸序列示于圖12B；SEQ ID NO10)的編碼序列(圖12A；SEQ ID NO9)和人CD40的長同種型(氨基酸序列示于圖12D)的編碼序列(圖12C；SEQ ID NO11)。
圖13顯示了通過示差掃描量熱法(DSC)測定的CHIR-12.12的不同pH制劑中的熱解鏈溫度。
發(fā)明詳述
本文所用的“腫瘤”指所有致瘤性細胞(無論是惡性還是良性的)的生長和增殖，和所有前癌和癌細胞和組織。
術(shù)語“癌癥”和“癌性的”表示或描述了以不受調(diào)控的細胞增殖為典型特征的哺乳動物的生理狀況。癌癥的例子包括，但不限于淋巴瘤和白血病。
“抗體”和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。雖然抗體顯示對抗原的結(jié)合有特異性，但免疫球蛋白包括抗體和其它缺乏抗原特異性的抗體樣分子。后一類型的多肽有例如淋巴系統(tǒng)以低水平產(chǎn)生和骨髓瘤以高水平產(chǎn)生的多肽。
術(shù)語“抗體”以最廣義用時包括全裝配的抗體、能結(jié)合抗原的抗體片段(例如，F(xiàn)ab′、F′(ab)2、Fv、單鏈抗體、雙體分子)和包含以上物質(zhì)的重組肽。
本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”指得自基本上同質(zhì)的抗體群的抗體，即除了可能存在極少量天然發(fā)生的突變以外，構(gòu)成該群的每個抗體是相同的。
“天然抗體”和“天然免疫球蛋白”通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成的約150,000道爾頓的異源四聚糖蛋白。每條輕鏈經(jīng)共價二硫鍵與重鏈相連，而二硫鍵的數(shù)目視不同免疫球蛋白同種型的重鏈而不同。每條重鏈和輕鏈也具有有規(guī)律地隔開的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈的一端為可變區(qū)(VH)，其后是多個恒定區(qū)。每條輕鏈的一端為可變區(qū)(VL)，在另一端為恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)配對，輕鏈可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)配對。據(jù)信，特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成相互作用界面。
術(shù)語“可變”表示以下內(nèi)容在抗體之間，可變區(qū)的某些部分在序列上差別很大，這部分是每種特定抗體用于與其特定抗原特異性結(jié)合的部分。然而，可變性不是均勻分布于整個抗體可變區(qū)中。它集中于位于輕鏈或重鏈可變區(qū)的稱為互補決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)的3個區(qū)段?？勺儏^(qū)的較保守部分稱為框架(FR)區(qū)。天然輕鏈和重鏈的可變區(qū)包含主要采取β-片層構(gòu)型并由3個CDR相連的4個FR區(qū)，CDR形成(有時形成部分)連接β-片層結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR通過FR區(qū)緊密相聚，并且與另一條鏈的CDR緊靠在一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(參見，Kabat等，(1991)NIH Publ.No.91-3242，第I卷，647-669頁)。
恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但顯示各種效應(yīng)器功能，例如Fc受體(FcR)結(jié)合、抗體參與依賴抗體的細胞毒性、調(diào)理作用、啟動依賴補體的細胞毒性和肥大細胞脫顆粒。
本文使用的術(shù)語“超變區(qū)”指負責(zé)結(jié)合抗原的抗體氨基酸殘基。超變區(qū)包括“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(即，輕鏈可變區(qū)的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變區(qū)的殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，(1991)《免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列》(Sequences of proteins of ImmunologicalInterest)(第5版，Public Health Service，National Institute of Health，Bethesda，MD)和/或“超變環(huán)”的氨基酸殘基(即，輕鏈可變區(qū)的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區(qū)的殘基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Clothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196901-917)。“框架”或“FR”殘基是除超變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；雙體分子；線性抗體(Zapata等，(1995)Protein Eng 8(10)1057-1062)；單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性(multispecific)抗體。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個稱為“Fab”片段的相同的抗原結(jié)合片段(每種具有一個抗原結(jié)合位點)與一殘留的“Fc”片段(其名字反映它易于結(jié)晶)。胃蛋白酶處理得到具有兩個抗原結(jié)合位點的F(ab′)2片段，該片段仍能交聯(lián)抗原。
“Fv”是含有完整的抗原識別和結(jié)合位點的最小抗體片段。在雙鏈Fv抗體中，該區(qū)由緊密的非共價締合的一條重鏈可變區(qū)和一條輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。在單鏈Fv抗體中，一條重鏈可變區(qū)和一條輕鏈可變區(qū)經(jīng)可彎曲的肽接頭共價相連從而使輕鏈和重鏈締合成類似于雙鏈Fv抗體中的“二聚體”結(jié)構(gòu)。每個可變區(qū)的3個CDR正是在這種構(gòu)型中相互作用而確定了VH-VL二聚體表面上的抗原結(jié)合位點。6個CDR共同賦予了該抗體的抗原結(jié)合特異性。然而，即使一個可變區(qū)(或僅含有3個抗原特異性CDR的半個Fv)也能識別并結(jié)合抗原，雖然親和力低于完整的結(jié)合位點。
Fab片段也含有輕鏈恒定區(qū)和重鏈第一恒定區(qū)(CH1)。Fab片段因在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端多幾個殘基(包括抗體絞鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸殘基)而不同于Fab’片段。本文稱為Fab′-SH的是其恒定區(qū)半胱氨酸殘基帶有一個游離巰基的Fab′。F(ab′)2抗體片段最初制備為之間具有絞鏈半胱氨酸的成對Fab′片段?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)也是已知的。
任何脊椎動物種類的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可分為兩種明顯不同的類型，該兩種類型根據(jù)它們恒定區(qū)的氨基酸序列稱為kappa(κ)和lambda(λ)。
免疫球蛋白可依它們重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列分為不同類型。人免疫球蛋白主要有5類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中幾類可進一步分成亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。不同的同種型具有不同的效應(yīng)器功能。例如，人IgG1和IgG3同種型可介導(dǎo)依賴抗體的細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)活性。
本文所用的“標記”指直接或間接與抗體偶聯(lián)而產(chǎn)生“標記”抗體的可檢測化合物或組合物。標記本身可檢測(例如，放射性同位素標記或熒光標記)，或者就酶標記而言，可催化底物化合物或組合物化學(xué)轉(zhuǎn)變成可檢測化合物。
術(shù)語“拮抗劑”以最廣義使用，包括能部分或完全阻斷、抑制或中和本文公開的天然靶分子的生物活性或其轉(zhuǎn)錄或翻譯的任何分子。
本文所用的“載體”包括當其以所用劑量和濃度與細胞或哺乳動物接觸時沒有毒性的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑。生理上可接受的載體通常是pH緩沖水溶液。生理上可接受的載體的例子包括緩沖液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖或其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子，例如鈉；和/或非離子表面活性劑，例如吐溫、聚乙二醇(PEG)和普朗尼克。“聯(lián)合”一種或多種其它治療性藥物給藥包括同步(同時)和以任何順序連續(xù)給藥。
本文所用的術(shù)語“宿主細胞”指以單核實體培養(yǎng)的微生物或真核細胞或細胞系，它們可以是或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移多核苷酸的受者，并且包括受轉(zhuǎn)染原始細胞的后代。應(yīng)理解，由于天然的、偶發(fā)的或設(shè)計的突變，一個細胞的后代在形態(tài)或基因組或總DNA互補性上無需和原始的親代完全相同。
“人效應(yīng)細胞”是表達一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細胞。這些細胞優(yōu)選至少表達FcγRII并行使依賴抗原的細胞介導(dǎo)細胞毒性(ADCC)效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細胞的例子包括外周血單核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞，優(yōu)選PBMC和NK細胞。具有ADCC活性的抗體通常是IgG1或IgG3同種型。應(yīng)注意，除了分離得到IgG1和IgG3抗體以外，這種ADCC介導(dǎo)性抗體可通過將非ADCC抗體的可變區(qū)或可變區(qū)片段工程改造為IgG1或IgG3同種型的恒定區(qū)來制備。
術(shù)語“Fc受體”或“FcR”用于描述能結(jié)合抗體Fc區(qū)域的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列的人FcR。此外，優(yōu)選的FcR可結(jié)合IgG抗體(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體或者交替剪接形式。FcγRII受體包括具有相似氨基酸序列、主要在于胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域不同的FcγIIA(“活化性受體”)和FcγIIB(“抑制性受體”)?；罨允荏wFcγRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受體FcγRIIB在其細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見Daeron(1997)Annu.Rev.Immunol.15203-234)。FcR綜述見Ravetch和Kinet(1991)Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991)；Capel等，(1994)Immunomethods 425-34和de Haas等，(1995)J.Lab.Clin.Med.126330-341。本文的術(shù)語“FcR”包括其它FcR，包括將來鑒定到的FcR。該術(shù)語也包括將成熟IgG轉(zhuǎn)移至胎兒的新生受體，F(xiàn)cRn(Guyer等，(1976)J.Immunol.117587和Kim等，(1994)J.Immunol.24249(1994))。
制備人抗體的方法有很多。例如，可用Epstein-Barr病毒(EBV)感染使分泌細胞無限增殖。然而，EBV-感染的細胞難于克隆并且通常得到的免疫球蛋白產(chǎn)量較低(James和Bell(1987)J.Immunol.Methods 1005-40)。將來，可能通過引入轉(zhuǎn)化基因的有限組合來實現(xiàn)人B細胞的無限增殖。近來的發(fā)現(xiàn)增加了這種可能性，即端粒酶催化性亞基連同H-ras的SV40大癌蛋白和H-ras癌等位基因一起表達可導(dǎo)致正常人上皮細胞和成纖維細胞的致癌性轉(zhuǎn)變(Hahn等，(1999)Nature 400464-468)?，F(xiàn)在已可能制備經(jīng)過免疫后能產(chǎn)生全套人抗體不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)(Jakobovits等，(1993)Nature 362255-258；Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.1365-93；Fishwild等，(1996)Nat.Biotechnol.14845-851；Mendez等，(1997)Nat.Genet.15146-156；Green(1999)J.Immunol.Methods 23111-23；Tomizuka等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97722-727；綜述見Little等，(2000)Immunol.Today 21364-370)。例如，嵌合型和種系突變小鼠的抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合子消除可完全抑制內(nèi)源性抗體的產(chǎn)生已見描述(Jakobovits等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551-2555)。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移入這種種系突變小鼠可制備轉(zhuǎn)基因小鼠品系(Jakobovits等，(1993)Nature 362255-258)。Mendez等，(1997)(Nature Genetics 15146-156)，當用抗原攻擊后可產(chǎn)生高親和力完全人抗體。這可通過將兆堿基的人重鏈和輕鏈基因座通過種系整合入刪除了上述內(nèi)源性JH區(qū)段的小鼠來實現(xiàn)。這些小鼠(XenoMouseII technology(Abgenix；Fremont，California))具有1,020kb的人重鏈基因座和800kb的人κ基因座，其中人重鏈基因座含有約66個VH基因、完全的DH和JH區(qū)域，以及3個不同的恒定區(qū)，人κ基因座含有32個Vκ基因、Jκ片段和Cκ基因。這些小鼠中產(chǎn)生的抗體在各方面，包括基因重排、裝配和所有成分極其類似于在人中觀察到的抗體。由于刪除了內(nèi)源性片段從而防止了鼠基因座中基因重排，此種人抗體的表達優(yōu)先壓倒內(nèi)源性抗體。這種小鼠可用特別感興趣的抗原免疫。
可篩選這種免疫動物血清對原先(接種)抗原的抗體反應(yīng)性?？蓮牧馨凸?jié)或脾細胞分離淋巴細胞，選擇CD138-陰性和CD19-陽性淋巴細胞來選擇B細胞。一方面，可將這種B細胞培養(yǎng)物(BCC)與骨髓瘤細胞融合以產(chǎn)生上述雜交瘤。
在另一方面，宜進一步篩選這種B細胞培養(yǎng)物對原先(接種)抗原的反應(yīng)性。這種篩選包括用靶/抗原蛋白質(zhì)的ELISA、用能與感興趣抗原結(jié)合的已知抗體進行競爭性試驗和與瞬時感染的表達該靶抗原的CHO或其它細胞的體外結(jié)合試驗。
本發(fā)明涉及治療患因CD40信號傳導(dǎo)對CD40表達細胞的刺激所介導(dǎo)疾病的人患者的組合物和方法。這些方法包括用本發(fā)明的抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段治療，其中給予該抗體或其抗原結(jié)合片段可在接受該治療方法的對象內(nèi)提高陽性治療應(yīng)答。適用于本發(fā)明方法的抗-CD40抗體能特異性結(jié)合表達于人細胞表面的人CD40抗原，并且當與人CD40表達細胞上的CD40抗原結(jié)合后無明顯激動活性而顯示拮抗活性。這些抗-CD40抗體和其抗原結(jié)合片段在本文中稱為拮抗性抗-CD40抗體。這種抗體包括，但不限于下文所述的完整的人單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12，和具有單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12結(jié)合特性的單克隆抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知道本文公開的拮抗性抗體和這些抗體的抗原結(jié)合片段包括用本領(lǐng)域熟知和下文所述的方法重組產(chǎn)生的抗體和它們的抗原結(jié)合片段，包括，例如重組產(chǎn)生的單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12。
具有單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12結(jié)合特性的抗體包括能競爭性干擾CD40結(jié)合和/或與CHIR-5.9和CHIR-12.12相同表位結(jié)合的抗體。技術(shù)人員可采用標準方法確定某抗體是否競爭性干擾CHIR-5.9或CHIR-12.12。
當這些抗體結(jié)合展示于人細胞，例如人B細胞表面上的CD40時，無明顯的激動活性；在一些實施方案中，抗體與展示于人細胞表面的CD40結(jié)合抑制了這些人細胞的增殖與分化。因此，適用于本發(fā)明方法的拮抗性抗-CD40抗體包括對表達細胞表面CD40抗原的正常和惡性人細胞可顯示拮抗活性的單克隆抗體。
在一些實施方案中，與嵌合性抗-CD20單克隆抗體IDEC-C2B8相比，本發(fā)明的抗-CD40抗體顯示抗腫瘤活性更強，其中抗腫瘤活性是在裸鼠異種移植腫瘤模型中用人淋巴瘤細胞系以這些抗體的相等量進行測定。IDEC-C2B8(IDECPharmaceuticals Corp.，San Diego，California；以商品名Rituxan購得，也稱為利妥昔單抗)是一種嵌合性抗-CD20單克隆抗體，含有人IgG1和κ恒定區(qū)與分離自鼠抗-CD20單克隆抗體，IDEC-2B8的鼠可變區(qū)的(Reff等，(1994)，Blood83435-445)。Rituximab批準用于治療復(fù)發(fā)性B細胞低分化瘤或濾泡性非何杰金淋巴瘤(NHL)。發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)于Rituximab的抗腫瘤活性的抗體可極大提高B細胞淋巴瘤，特別是B細胞非何杰金淋巴瘤的癌癥治療效果。
合適的裸鼠異種移植腫瘤模型包括使用稱為為Namalwa和Daudi的人伯基特淋巴瘤細胞系的模型。優(yōu)選的實施方案如本文以下實施例17所述，采用在Daudi人淋巴瘤細胞系分階段裸鼠異種移植腫瘤模型中測定抗腫瘤活性。由于在分階段模型中僅在腫瘤達到可檢測大小后開始抗體給藥，故用Daudi淋巴瘤細胞系的分階段裸鼠異種移植腫瘤模型比不分階段的模型能更有效地區(qū)分抗體的療效。在不分階段模型中，通常在腫瘤接種約1天內(nèi)并在可觸診的腫瘤存在前開始抗體給藥。在分階段模型中某抗體的能力勝過Rituxan(即，顯示抗腫瘤活性增加)強烈表明此抗體比Rituxan治療更有效。此外，在Daudi模型中，抗-CD20，Rituxan的靶分子在細胞表面的表達水平高于CD40。
“相等量”的本發(fā)明抗-CD40抗體和Rituxan指以每單位體重為基準計給予的相同的毫克劑量。因此，當本發(fā)明的抗-CD40抗體以0.01mg/kg小鼠體重給藥用于腫瘤模型時，Rituxan也以0.01mg/kg小鼠體重給藥。類似地，當本發(fā)明的抗-CD40抗體以0.1、1或10mg/kg小鼠體重給藥用于腫瘤模型時，Rituxan也分別以0.1、1或10mg/kg小鼠體重給藥。
與等量的Rituxan相比，當本發(fā)明的一些抗體在裸鼠異種移植腫瘤模型中給予時，它們導(dǎo)致腫瘤體積明顯減小。因此，例如當在以下文實施例所述方式用Daudi人淋巴瘤細胞系在分階段裸鼠異種移植腫瘤模型中測定時，完全的人單克隆抗體CHIR-12.12顯示比用相等劑量的Rituxan觀察到的抗腫瘤活性至少增加20％，并且在該項試驗中顯示抗腫瘤活性可增加多達50％-60％。當與相等劑量的Rituxan相比時，這種抗腫瘤活性的增加反映在用本發(fā)明的抗-CD40抗體時觀察到的腫瘤體積降低更多。因此，例如單克隆抗體CHIR-12.12可顯示腫瘤體積約為相等劑量Rituxan觀察到的三分之一到約二分之一，這取決于腫瘤接種后的時間長度。
抗體效力的另一差異是體外測定在存在NK細胞時體外可獲得最大腫瘤細胞裂解所需的抗體濃度。例如，本發(fā)明的抗-CD40抗體達到最大Daudi細胞裂解的EC50不到Rituxan濃度的1/2、優(yōu)選1/4、最優(yōu)選1/10。
除了單克隆抗體CHIR-12.12外，在上述試驗中具有其效力特征明顯高于相等量Rituxan的其它抗-CD40抗體包括，但不限于(1)雜交瘤細胞系12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；(2)含有SEQ ID NO2所示、SEQ ID NO4所示、SEQ ID NO5所示、同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示氨基酸序列的單克隆抗體；(3)含有由選自SEQ ID NO1所示、SEQ ID NO3所示和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體；(4)能與雜交瘤細胞系12.12產(chǎn)生的單克隆抗體所結(jié)合表位相結(jié)合的單克隆抗體；(5)能與含有SEQ IDNO10或SEQ ID NO12所示氨基酸序列的殘基82-87表位相結(jié)合的單克隆抗體；(6)在競爭性結(jié)合試驗中能與單克隆抗體CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；和(7)作為CHIR-12.12單克隆抗體的或前項(1)-(6)中所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合人CD40抗原的能力。
拮抗性抗-CD40抗體
單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12代表了用于本發(fā)明方法的合適的拮抗性抗-CD40抗體。CHIR-5.9和CHIR-12.12抗體是雜交瘤細胞系131.2F8.5.9(本文稱為細胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(本文稱為細胞系12.12)產(chǎn)生的IgG1同種型完全人抗-CD40單克隆抗體。采用含有人IgG1重鏈基因座和人κ鏈基因座的免疫的異種小鼠(XenoMousetechnology；Abgenix；Fremont，Califomia)脾細胞獲得了這些細胞系。使脾細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細胞(Sierra BioSource)融合。將得到的雜交瘤亞克隆數(shù)次得到穩(wěn)定的單克隆細胞系5.9和12.12。本發(fā)明的其它抗體可用含有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠或通過本領(lǐng)域已知和/或本文所述的其它方法類似地制備。
本文公開了CHIR-12.12抗體可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列，CHIR-5.9抗體可變區(qū)的氨基酸序列。更具體地說，mAb CHIR-12.12的輕鏈和重鏈的前導(dǎo)區(qū)、可變區(qū)和恒定區(qū)的氨基酸序列分別示于圖9A和9B。也參見SEQ ID NO2(mAbCHIR-12.12輕鏈的完整序列)、SEQ ID NO4(mAb CHIR-12.12重鏈的完整序列)和SEQ ID NO5(SEQ ID NO4所示mAb CHIR-12.12的重鏈變體的完整序列，其變體包含在SEQ ID NO4所示153位絲氨酸殘基替換了丙氨酸殘基)。編碼mAbCHIR-12.12輕鏈和重鏈的核苷酸序列分別示于圖11A和11B。也參見SEQ ID NO1(mAb CHIR-12.12輕鏈的編碼序列)和SEQ ID NO3(mAb CHIR-12.12重鏈的編碼序列)。CHIR-5.9mAb輕鏈和重鏈的前導(dǎo)區(qū)、可變區(qū)和恒定區(qū)的氨基酸序列分別示于圖10A和10B。也參見SEQ ID NO6(mAb CHIR-5.9輕鏈的完整序列)、SEQID NO7(mAb CHIR-5.9重鏈的完整序列)和SEQ ID NO8(SEQ ID NO7所示mAb CHIR-5.9的重鏈變體的完整序列，其變體包含在SEQ ID NO7所示158位絲氨酸殘基替換了丙氨酸殘基)。此外，表達CHIR-5.9和CHIR-12.12抗體的雜交瘤分別在ATCC中以專利保藏號PTA-5542和PTA-5543保藏。
除了拮抗活性外，本發(fā)明的抗-CD40抗體優(yōu)選具有另一種抗腫瘤細胞的作用機理。例如，天然CHIR-5.9和CHIR-12.12抗體具有ADCC活性?；蛘撸珻HIR-5.9和CHIR-12.12抗體的可變區(qū)可表達在具有ADCC活性的另一種抗體同種型上。如下文所述，也可將CHIR-5.9或CHIR-12.12的天然形式、重組形式或其抗原結(jié)合片段偶聯(lián)于細胞毒素、治療性藥物或放射性金屬離子或放射性同位素。
如流式細胞術(shù)試驗測定的那樣，在ELISA型測定中CHIR-5.9和CHIR-12.12單克隆抗體與可溶性CD40結(jié)合、阻止了CD40-配體與細胞表面CD40結(jié)合并置換了先前結(jié)合的CD40-配體。抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12可彼此競爭而不與15B8競爭結(jié)合CD40，15B8是2000年10月2日提交的名為“人抗-CD40抗體”的美國臨時申請系列號60/237,556和2001年10月2日提交的也名為“人抗-CD40抗體”的PCT國際申請?zhí)朠CT/US01/30857(代理人審理號PP 16092.003)中所述的抗-CD40單克隆抗體，該兩篇申請的內(nèi)容均全文納入引為參考。當在體外測試對正常人對象的B細胞增殖的作用時，CHIR-5.9和CHIR-12.12起拮抗性抗-CD40抗體作用。此外，CHIR-5.9和CHIR-12.12不誘導(dǎo)正常人對象的淋巴細胞強增殖。這些抗體能通過依賴抗體的細胞毒性(ADCC)殺死CD40表達靶細胞。如BiacoreTM試驗所測定的，CHIR-5.9與人CD40的結(jié)合親和力是1.2×10-8M，CHIR-12.12的結(jié)合親和力是5×10-10M。
用于本發(fā)明方法的合適的拮抗性抗-CD40抗體對CD40細胞表面抗原顯示強的單一位點結(jié)合親和力。采用標準試驗，例如BiacoreTM測定本發(fā)明的單克隆抗體對CD40的解離平衡常數(shù)(KD)顯示為至少10-5M、至少3×10-5M、優(yōu)選至少10-6M-10-7M、更優(yōu)選至少10-8M-約10-12M。Biacore分析是本領(lǐng)域已知的并詳述于《BIA應(yīng)用手冊》(BIAapplications handbook)。WO 01/27160所述的方法用于調(diào)節(jié)結(jié)合親和力。
“CD40抗原”、“CD40細胞表面抗原”、“CD40受體”或“CD40”指屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族的跨膜糖蛋白(參見，例如美國專利號5,674,492和4,708,871；Stamenkovic等，(1989)EMBO 81403；Clark(1990)Tissue Antigens 3633；Barclay等，(1997)《白血球抗原手冊》(The Leucocyte Antigen Facts Book)(第二版；Academic Press，San Diego))。已鑒定到該基因交替剪接轉(zhuǎn)錄變體編碼的人CD40的兩種同種型。第一種同種型(也稱為“長同種型”或“同種型1”)表達為具有由前19個殘基代表的信號序列的277個氨基酸的前體多肽(SEQ ID NO12(首次報道為GenBank登錄號CAA43045，在GenBank登錄號NP_001241中鑒定為同種型1)，由SEQ ID NO11(參見GenBank登錄號X60592和NM_001250)編碼)。第二種同種型(也稱為“短同種型”或“同種型2”)表達為也具有由前19個殘基表示的信號序列的203個氨基酸的前體多肽(SEQ ID NO10(首次報道為GenBank登錄號NP 690593)，由SEQ ID NO9(GenBank登錄號NM_152854)編碼)。人CD40的這兩種同種型的前體多肽的前165個殘基相同(即，SEQ ID NO10和SEQ IDNO12的殘基1-165)。短同種型的前體多肽(SEQ ID NO10所示)由缺乏編碼區(qū)段，導(dǎo)致翻譯讀框移位的轉(zhuǎn)錄物變體(SEQ ID NO9)編碼；與CD40長同種型所含有的(SEQ ID NO12的殘基166-277所示C-末端)相比，得到的CD40同種型含有較短且不同的C-末端(SEQ ID NO10的殘基166-203)。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“CD40抗原”、“CD40細胞表面抗原”、“CD40受體”或“CD40”包括CD40的短和長同種型。本發(fā)明的抗-CD40抗體可與下文所述該細胞表面抗原的短同種型或長同種型中相同位置的人CD40表位結(jié)合。
如本文別處所述，CD40抗原展示在各種類型細胞的表面?！罢故居诒砻妗焙汀氨磉_于表面”指CD40抗原的全部或一部分暴露在細胞的外部。展示的或表達的CD40抗原可完全或部分糖基化。
“激動活性”指作為激動劑的物質(zhì)功能。激動劑可結(jié)合細胞的受體，引起與該受體的天然配體所引起的類似或相同的反應(yīng)或活性。CD40激動劑可誘導(dǎo)但不限于以下所有應(yīng)答B(yǎng)細胞增殖和/或分化；抗體產(chǎn)生；胞內(nèi)粘附；B細胞記憶產(chǎn)生(memory generation)；同種型轉(zhuǎn)換、上調(diào)II型MHC和CD80/60的細胞表面表達；分泌促炎性細胞因子，例如IL-8、IL-12和TNF等?！稗卓够钚浴敝缸鳛檗卓箘┑奈镔|(zhì)功能。CD40的拮抗劑可防止或降低通過CD40受體與激動劑配體，特別是CD40L結(jié)合所誘導(dǎo)的應(yīng)答。拮抗劑可使激動劑結(jié)合所誘導(dǎo)的一種或多種應(yīng)答降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、優(yōu)選40％、45％、50％、55％、60％、更優(yōu)選70％、80％、85％和最優(yōu)選90％、95％、99％或100％。檢測抗-CD40抗體和CD40-配體結(jié)合特異性與拮抗活性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但不限于標準的競爭性結(jié)合試驗、監(jiān)測B細胞分泌免疫球蛋白的試驗、B細胞增殖試驗、Banchereau樣B細胞增殖試驗、抗體產(chǎn)生的T細胞輔助試驗、B細胞增殖的共同刺激試驗和上調(diào)B細胞激活標記的試驗。參見，例如分別公開并全文納入本文作為參考的WO 00/75348和美國專利號6,087,329中的試驗。
“明顯的”激動活性指在B細胞應(yīng)答試驗中所檢測的激動活性比天然物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的高至少30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％?！懊黠@的”激動活性優(yōu)選在B細胞應(yīng)答試驗中檢測到的激動活性比天然物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的高至少2倍或3倍。因此，例如當感興趣的B細胞應(yīng)答是B細胞增殖時，“明顯的”B細胞增殖指誘導(dǎo)的B細胞增殖水平比天然物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的B細胞增殖水平大至少2倍或3倍。在一個實施方案中，不結(jié)合CD40的非特異性免疫球蛋白，例如IgG1作為陰性對照?！盁o明顯激動活性”的物質(zhì)顯示在B細胞應(yīng)答試驗中檢測到的激動活性不高于天然物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的激動活性約25％，優(yōu)選不高約20％、15％、10％、5％、1％、0.5％或甚至不高約0.1％。如上所述，當與人細胞上的CD40抗原結(jié)合時，本發(fā)明方法所用的拮抗性抗-CD40抗體無明顯的激動活性。在本發(fā)明的一個實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體在B細胞應(yīng)答中無明顯的激動活性。在本發(fā)明的另一個實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體在多種細胞應(yīng)答試驗中(例如，增殖和分化，或增殖、分化和抗體產(chǎn)生)無明顯的激動活性。
本文所用的“抗-CD40抗體”包括特能異性識別CD40 B細胞表面抗原的抗體，包括多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體以及它們的片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv和保留了親代抗-CD40抗體的抗原結(jié)合功能的其它片段。對本發(fā)明而言，特別感興趣的是與上述單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12具有相同結(jié)合特性的本文公開的拮抗性抗-CD40抗體。這種抗體包括，但不限于以下抗體(1)分別以專利保藏號PTA-5542和PTA-5543由ATCC保藏的，命名為131.2F8.5.9(本文稱為細胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(本文稱為細胞系12.12)的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體；(2)含有選自SEQ ID NO2所示、SEQ ID NO4所示、SEQ ID NO5所示氨基酸序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示，與同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示氨基酸序列的單克隆抗體；(3)含有選自SEQ ID NO6所示、SEQ ID NO7所示、SEQ ID NO8所示氨基酸序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示，與同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示氨基酸序列的單克隆抗體；(4)具有由選自含有SEQ ID NO1所示、SEQ ID NO3所示、同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體；(5)能與雜交瘤細胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體所結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體；(6)能結(jié)合含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示氨基酸序列的殘基82-87表位的單克隆抗體；(7)在競爭性結(jié)合試驗中能與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；和(8)作為CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或前項(1)-(7)中所述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合人CD40抗原的能力。
制備拮抗性抗-CD40抗體
本文公開的和用于本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法制備。因此，可通過常規(guī)方法制備多克隆血清。通常先用含CD40抗原的溶液免疫合適的動物，優(yōu)選小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可得到的血清體積多和可用已有的抗-家兔和抗-山羊標記抗體，優(yōu)選用家兔和山羊制備多克隆血清。
可在轉(zhuǎn)基因動物，優(yōu)選攜帶人免疫球蛋白基因座的小鼠中制備多克隆血清。在一優(yōu)選的實施方案中，表達CD40的SF9細胞用作免疫原。也可用鹽水，優(yōu)選用完全弗氏佐劑混合或乳化含有抗原的溶液，經(jīng)胃腸外(通常是皮下或肌肉內(nèi))注射該混合物或乳劑來免疫。每次注射50-200μg的劑量一般足夠。通常在2-6周后注射用鹽水配制，優(yōu)選用不完全弗氏佐劑配制的蛋白質(zhì)加強免疫一次或多次?；蛘呖捎帽绢I(lǐng)域已知的方法體外免疫產(chǎn)生抗體，就本發(fā)明目的而言體外與體內(nèi)免疫等效。將免疫動物的血液放入玻璃或塑料容器25℃孵育該血液1小時，然后4℃孵育2-18小時獲得多克隆抗血清。離心(例如，1,000×g 10分鐘)回收血清。每次放血可自家兔獲得約20-50ml血清。
Sf9(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))細胞的制備方法見納入本文作為參考的美國專利號6,004,552中所述。簡言之，將編碼人CD40的序列用轉(zhuǎn)移載體重組入桿狀病毒。將質(zhì)粒與野生型桿狀病毒DNA共同轉(zhuǎn)染入Sf9細胞。鑒定重組桿狀病毒感染的Sf9細胞并克隆純化。
優(yōu)選的抗體性質(zhì)上是單克隆抗體?！皢慰寺】贵w”指得自基本上均質(zhì)抗體群的抗體，即除了存在極少量天然發(fā)生的突變以外，組成該群的每個抗體是相同的。該術(shù)語不受限于抗體的種類或來源。該術(shù)語包括完整的免疫球蛋白及其片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv和保留了抗體結(jié)合功能的其它片段。單克隆抗體是高度特異性的，針對一個的抗原性位點，即在本發(fā)明中為CD40細胞表面抗原。此外，與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑相反，每種單克隆抗體針對抗原上一個決定簇。修修詞“單克隆的”表示得自基本上均質(zhì)的抗體群的抗體特性，不可理解為需要通過任何具體方法產(chǎn)生該抗體。例如，本發(fā)明所用的單克隆抗體可通過Kohler等，(1975)Nature 256495首次描述的雜交瘤方法或重組DNA方法制備(參見，例如美國專利號4,816,567)?！皢慰寺】贵w”也可用，例如Clackson等，(1991)Nature 352624-628；Marks等，(1991)J.Mol.Biol.222581-597；和美國專利號5,514,548中所述技術(shù)自噬菌體抗體文庫分離得到。
“表位”指抗原性分子中能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體并結(jié)合該抗體的那一部分。表位可含有線性氨基酸殘基(即，表位內(nèi)的殘基以線性方式一個接一個順序排列)，非線性氨基酸殘基(本文稱為“非線性表位”；這些表位非順序排列)或線性與非線性氨基酸殘基。
可使用Kohler等，(1975)Nature 256495-496所述方法或其改進形式制備單克隆抗體。通常用含抗原的溶液免疫小鼠。可用鹽水，優(yōu)選用完全弗氏佐劑混合或乳化含有抗原的溶液，經(jīng)胃腸外注射混合物或乳劑來免疫?？捎帽绢I(lǐng)域已知的任何免疫方法來獲得本發(fā)明的單克隆抗體。免疫動物后，取出脾臟(任選取出幾個大的淋巴結(jié))解離成為單個細胞。使細胞混懸液涂布于包被有感興趣抗原的板或孔來篩選脾細胞。表達抗原特異性膜結(jié)合免疫球蛋白的B細胞與板結(jié)合而不被洗掉。然后誘導(dǎo)得到的B細胞或所有分離的脾細胞與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤，用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。接種得到的細胞系列稀釋液并測定能特異性結(jié)合感興趣抗原的抗體(和不結(jié)合無關(guān)抗原的抗體)的產(chǎn)生。然后將分泌單克隆抗體(mAb)的選出的雜交瘤在體外(例如，在組織培養(yǎng)瓶或中空纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(作為小鼠的腹水)培養(yǎng)。
當用重組DNA方法制備本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體時，使用常規(guī)方法(例如，用能特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)不難分離得到并測序編碼單克隆抗體的DNA。本文所述的雜交瘤細胞是這種DNA的優(yōu)選來源。一旦分離后，可將此DNA置于表達載體中，然后將載體轉(zhuǎn)染入本身不產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細胞，例如大腸桿菌、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞中從而獲得在該重組宿主細胞中合成的單克隆抗體。在細菌中重組表達編碼抗體的DNA的綜述性文章包括Skerra等，(1993)Curr.Opinion in Immunol.5256和Phickthun(1992)Immunol.Revs.130151?；蛘?，如納入本文作為參考的美國專利號5,545,403；5,545,405和5,998,144中所公開的，可在細胞系，例如CHO細胞系中制備抗體。簡言之，用能表達輕鏈和重鏈的載體分別轉(zhuǎn)染該細胞系。嵌合性抗體可通過轉(zhuǎn)染不同載體上的兩種蛋白質(zhì)來制備。另一優(yōu)點是該抗體正確糖基化。
在一些實施方案中，用GS基因表達系統(tǒng)(Lonza Biologics，Portsmouth，NewHampshire)在CHO細胞中制備拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體或其抗原結(jié)合片段，所述表達系統(tǒng)使用谷氨酰胺合成酶作為標記。也參見其內(nèi)容全文納入本文作為參考的美國專利號5,122,464；5,591,639；5,658,759；5,770,359；5,827,739；5,879,936；5,891,693；和5,981,216。
CD40的單克隆抗體是本領(lǐng)域已知的。參見，例如以下文獻中有關(guān)B-細胞抗原的章節(jié)，McMichael編，(1987；1989)《白細胞分型III和IV》(Leukocyte TypingIII and IV)(牛津大學(xué)出版社，紐約)；美國專利號5,674,492；5,874,082；5,677,165；6,056,959；WO 00/63395；國際公布號WO 02/28905和WO 02/28904；Gordon等，(1988)J.Immunol.1401425；Valle等，(1989)Eur.J.Immunol.191463；Clark等，(1986)PNAS 834494；Paulie等，(1989)J.Immunol.142590；Gordon等，(1987)Eur.JImmunol 171535；Jabara等，(1990)J.Exp.Med.1721861；Zhang等，(1991)J.Immunol.1461836；Gascan等，(1991)J.Immunol.1478；Banchereau等，(1991)Clin.Immunol.Spectrunt 38；和Banchereau等，(1991)Science 25170；所有文獻納入本文作為參考。本發(fā)明特別感興趣的是本文公開的與上述單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12具有相同結(jié)合特性的拮抗性抗-CD40抗體。
本文使用的術(shù)語“CD40-抗原表位”指除CD40抗原本身以外能與本發(fā)明的抗-CD40單克隆抗體起免疫反應(yīng)的分子。CD40-抗原表位包括蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、肽、碳水化合物、脂質(zhì)和其它分子，但就本發(fā)明的目的而言，最常用蛋白質(zhì)、短的寡肽、寡肽模擬物(即，能模擬CD40抗原的抗體結(jié)合性能的有機化合物)或它們的組合。PCT申請US 91/04282描述了合適的寡肽模擬物。
此外，本文使用的術(shù)語“抗-CD40抗體”包括嵌合性抗-CD40抗體；用于本發(fā)明方法的這種嵌合性抗-CD40抗體具有本文所述CHIR-5.9和CHIR-12.12單克隆抗體的結(jié)合特性?！扒逗稀笨贵w指最好是用重組脫氧核糖核酸技術(shù)衍生的含有人(包括免疫相關(guān)種類，例如黑猩猩)和非人組分的抗體。因此，嵌合性抗體恒定區(qū)最好基本上與天然的人抗體恒定區(qū)相同；嵌合性抗體可變區(qū)最好衍生自非人來源具有所需CD40細胞表面抗原的抗原性特異性。非人來源是可用來產(chǎn)生針對人CD40細胞表面抗原或含有人CD40細胞表面抗原物質(zhì)的抗體的任何脊椎動物來源。這種非人來源包括，但不限于嚙齒類(例如，家兔、大鼠、小鼠等；參見，例如，納入本文作為參考的美國專利號4,816,567)和非人靈長類(例如，古猴(Old World Monkey)，類人猿等；例如納入本文作為參考的美國專利號5,750,105和5,756,096)。當本文所用的短語“免疫活性”指嵌合性抗-CD40抗體時，指能結(jié)合人CD40的嵌合性抗體。
本文所用的術(shù)語抗-CD40抗體也包括嵌合性與人源化抗-CD40抗體。嵌合性抗體含有衍生自不同種類的抗體的片段。Rituxan是具有鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合性抗體例子。
“人源化”指含有衍生自非人免疫球蛋白序列的最小序列的抗-CD40抗體形式。就大部分序列而言，人源化抗體指其中受者的超變區(qū)殘基(也稱為互補決定區(qū)或CDR)被非人種類(供體抗體)，例如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類的超變區(qū)殘基取代的，具有所需特異性、親和力或能力的人免疫球蛋白(受者抗體)。短語“互補決定區(qū)”指共同確定了天然免疫球蛋白結(jié)合位點的天然Fv區(qū)域的結(jié)合親和力和特異性的氨基酸序列。參見，例如Chothia等，(1987)J.Mol.Biol.196901-917；Kabat等，(1991)美國健康與人類服務(wù)部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，NIH公布號91-3242)。短語“恒定區(qū)”指抗體分子中賦予效應(yīng)器功能的那部分。在以前涉及產(chǎn)生用于治療人疾病的無免疫原性抗體的研究中，小鼠恒定區(qū)被人恒定區(qū)取代。所述人源化抗體的恒定區(qū)衍生自人免疫球蛋白。然而，這些人源化抗體仍能在人中引發(fā)有害且可能危險的免疫應(yīng)答并且喪失了親和力。用于本發(fā)明方法的人源化抗-CD40抗體具有類似于本文所述CHIR-5.9和CHIR-12.12單克隆抗體所顯示的結(jié)合特性。
人源化基本上可根據(jù)Winter及其同事(Jones等，(1986)Nature 321522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332323-327；Verhoeyen等，(1988)Science 2391534-1536)的方法通過用嚙齒類或突變型嚙齒類CDR或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列來進行。也參見納入本文作為參考的美國專利號5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762和5,859,205。在一些例子中，人免疫球蛋白的一個或多個可變區(qū)的框架區(qū)內(nèi)的殘基為對應(yīng)的非人殘基所取代(參見，例如美國專利號5,585,089；5,693,761；5,693,762和6，180,370)。此外，人源化抗體可含有在受者抗體或供體抗體中沒發(fā)現(xiàn)的殘基。制備這些修飾物可進一步精制抗體的性能(例如，獲得所需的親和力)?？傮w上，人源化抗體基本上含有所有可變區(qū)、至少一個，通常兩個可變區(qū)，其中所有或基本上所有的超變區(qū)是對應(yīng)的非人免疫球蛋白序列，所有或基本上所有的框架區(qū)是對應(yīng)的人免疫球蛋白序列。人源化抗體也任選包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。更多的細節(jié)見引作參考的Jones等，(1986)Nature 331522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2593-596。因此，這種“人源化”抗體可包括其中基本上小于完整的人可變區(qū)被非人種類的相應(yīng)序列取代的抗體。實際上，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可能的一些框架殘基被嚙齒類抗體中類似位點的殘基取代的人抗體。參見，例如美國專利號5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。也參見美國專利號6,180,370，和國際公布號WO 01/27160，其中公開了人源化抗體和產(chǎn)生對預(yù)定抗原具有改進親和力的人源化抗體的技術(shù)。
術(shù)語抗-CD40抗體也包括非人哺乳動物宿主，更具體說是以滅活的內(nèi)源性免疫球蛋白(Ig)基因座為特征的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的異種或修飾的抗-CD40抗體。在這種轉(zhuǎn)基因動物中，使得表達宿主免疫球蛋白輕鏈和重鏈的活性內(nèi)源性基因無功能，并用同類人免疫球蛋白基因座取代。這些轉(zhuǎn)基因動物可產(chǎn)生基本上無宿主免疫球蛋白輕或重鏈亞基的人抗體。參見，例如納入本文作為參考的美國專利號5,877,397和5,939,598。
針對CD40的完整人抗體優(yōu)選通過免疫轉(zhuǎn)基因小鼠獲得。這種小鼠可用XenoMouse技術(shù)(Abgenix；Fremont，California)獲得并公開于納入本文作為參考的美國專利號6,075,181；6,091,001和6,114,598中。為制備本文公開的抗體，用表達人CD40的Sf9細胞免疫具有人IgG1重鏈基因座和人K輕鏈基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠。小鼠也可以是其它同種型的轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明所用的完整人抗體的特征在于其結(jié)合特性與本文公開的CHIR-5.9和CHIR-12.12單克隆抗體所顯示的特征相似。
只要抗-CD40抗體的片段保留了所需的全長抗體的親和力，它們就適用于本發(fā)明的方法。因此，抗-CD40抗體的片段保留了結(jié)合CD40B細胞表面抗原的能力。這種片段的特征在于其性能與相應(yīng)的全長拮抗性抗-CD40抗體相似，即這種片段能特異性結(jié)合表達于人細胞表面的人CD40抗原，并且當與人CD40表達細胞上的CD40抗原結(jié)合時無明顯激動活性而顯示拮抗活性。本文將這種片段稱為“抗原結(jié)合”片段。
抗體的合適的抗原結(jié)合片段含有全長抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括，但不限于Fab、F(ab′)2、Fv片段和單鏈抗體分子?！癋ab”指由輕鏈或重鏈的一部分組成的免疫球蛋白的單價抗原結(jié)合片段。F(ab′)2指含有兩條輕鏈和兩條重鏈的一部分的免疫球蛋白的二價抗原結(jié)合片段?！皢捂淔v”或“sFv”抗體片段指含有抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域的片段，其中這些結(jié)構(gòu)域以一條多肽鏈的形式存在。參見，例如納入本文作為參考的美國專利號4,946,778；5,260,203；5,455,030和5,856,456。Fv多肽通常在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還含有一多肽接頭使sFv形成能與抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。sFv的綜述見Pluckthun(1994)《單克隆抗體的藥理學(xué)》(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore編，(Springer-Verlag，New York)，269-315頁。如下文所述，本文公開的拮抗性抗-CD40抗體的抗原結(jié)合片段也可與細胞毒素偶連以起殺死靶癌細胞的作用。
可利用例如McCafferty等，(1990)Nature 348552-554(1990)和美國專利號5,514,548中描述的技術(shù)從抗體噬菌體文庫分離得到抗體或抗體片段。Clackson等，(1991)Nature 352624-628和Marks等，(1991)J.Mol.Bird.222581-597分別描述了利用噬菌體文庫分離得到鼠和人抗體。隨后的出版物描述了通過構(gòu)建非常大的噬菌體文庫方案的鏈改組(Marks等，(1992)Bio/Technology 10779-783)以及組合感染和體內(nèi)重組來產(chǎn)生高親和力(nM范圍)人抗體(Waterhouse等，(1993)Nucleic.Acids Res.212265-2266)。因此，這些技術(shù)是分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代方法。
已開發(fā)了各種技術(shù)來制備抗體片段。這些片段通過使完整抗體蛋白水解消化而獲得(參見，例如Morimoto等，(1992)Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24107-117(1992)和Brennan等，(1985)Science 22981)。然而，現(xiàn)在這些片段可通過重組宿主細胞直接制備。例如，可從上述噬菌體文庫分離抗體片段?；蛘撸蓮拇竽c桿菌中直接回收Fab′-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab′)2片段(Carter等，(1992)Bio/Technology 10163-167)。根據(jù)另一方法，可從重組宿主細胞培養(yǎng)物直接分離得到F(ab′)2片段。其它制備抗體片段的技術(shù)是技術(shù)人員熟知的。
本發(fā)明方法所用的拮抗性抗-CD40抗體包括本文公開的CHIR-5.9和CHIR-12.12單克隆抗體以及與該抗體不同但保留了CDR的抗體；具有一個或多個氨基酸添加、刪除或取代的抗體，可通過抑制B細胞增殖和/或分化來測定其拮抗活性。本發(fā)明也包括脫免疫的(de-immunized)拮抗性抗-CD40抗體，該抗體可按納入本文作為參考的國際公布號WO 98/52976和WO 0034317所述制備。本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體內(nèi)的殘基以該方式修飾而使得該抗體對人無免疫原性或較低，但卻保留了對人CD40表達細胞的拮抗活性，所述活性可用本文其它部分所述試驗測定。權(quán)利要求的范圍也包括本領(lǐng)域已知的含有本發(fā)明拮抗性抗-CD40抗體或其片段的融合蛋白，所述融合蛋白可合成或從相應(yīng)的多核苷酸載體表達。參考下述抗體偶聯(lián)法所描述的這種融合蛋白。
本發(fā)明的抗體可具有用例如納入本文作為參考的專利公布號EP 0 983 303 A1、WO00/34317和WO98/52976中所述方法產(chǎn)生的序列變異。例如，CDR中的序列顯示可導(dǎo)致抗體與II型MHC結(jié)合并引發(fā)有害的輔助性T細胞應(yīng)答。保守取代可使得該抗體保留結(jié)合活性而喪失其引發(fā)有害T細胞應(yīng)答的能力?？捎帽绢I(lǐng)域已知，例如本文其它部分所述的方法進行任何這種保守或非保守取代，得到的抗體屬于本發(fā)明的范圍。用本文所述方法常規(guī)測試變體抗體的拮抗活性、親和力和特異性。
如果上述任何方法或其它本文未公開的方法制備的抗體在體外和/或體內(nèi)擁有至少一種以下生物活性，其屬于本發(fā)明范圍抑制T細胞刺激的正常人外周B細胞分泌免疫球蛋白；抑制Jurkat T細胞刺激的正常人外周B細胞存活和/或增殖；抑制表達CD40L的細胞或可溶CD40配體(sCD40L)刺激的正常人外周B細胞存活和/或增殖；抑制sCD40L或固態(tài)CD40L刺激的任何細胞中“存活性”抗-凋亡胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；抑制細胞與sCD40L或固態(tài)CD40L結(jié)合時的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；和抑制下述人惡性B細胞增殖。這些試驗可如本文實施例所述進行。也參見納入本文作為參考的以下文獻所述的試驗Schultze等，(1998)，Proc.Natl.Sci.USA 928200-8204；Denton等，(1998)，Pediatr.Transplant.26-15；Evans等，(2000)，J.Immunol.164688-697；Noelle等，(1998)，Agents Actions Suppl.4917-22；Lederman等，(1996)，Curr.Opin.Hematol.377-86；Coligan等，(1991)，《當代免疫學(xué)方法》(Current Protocols in Immunology)1312；Kwekkeboom等，(1993)，Immunology 79439-444和美國專利號5,674,492和5,847,082。
檢測本文所鑒定的CD40-抗原表位特異性拮抗性抗-CD40抗體的代表性試驗是“競爭性結(jié)合試驗”。競爭性結(jié)合試驗是通過抑制標記的已知配體和其特異抗體結(jié)合的能力來檢測和定量未知物的血清學(xué)試驗。也稱為競爭性抑制試驗。在代表性的競爭性結(jié)合試驗中，標記的CD40多肽與樣品中的候選抗體，例如與針對本發(fā)明單克隆抗體的一種或多種表位而產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合而沉淀?？赏ㄟ^篩選針對CD40蛋白或含有感興趣CD40蛋白特定表位的蛋白片段而制備的一系列抗體來鑒定能與感興趣某表位特異性反應(yīng)的抗-CD40抗體。例如，就人CD40而言，感興趣的表位包括含有以下同種型的線性和/或非線性氨基酸殘基的表位如圖12B所示(SEQ ID NO10)由圖12A所示序列(SEQ ID NO9；也參見GenBank登錄號Nom152854)編碼的人CD40短同種型(見GenBank登錄號NP690593)，或如圖12D所示(SEQ ID NO12)由圖12C所示序列(SEQ ID NO11；參見GenBank登錄號X60592和NM001250)編碼的人CD40長同種型(參見GenBank登錄號CAA43045和NP001241)?；蛘?，可用以前鑒定的合適的拮抗性抗-CD40抗體進行競爭性結(jié)合試驗來選擇與以前鑒定的抗體相當?shù)膯慰寺】贵w。
這種免疫試驗采用的抗體可以是標記的或未標記的。未標記的抗體可用于凝結(jié)試驗；采用各種各樣標記物的標記抗體可用于各種試驗。通過使抗體與可檢測物質(zhì)連接有助于檢測抗-CD40抗體與感興趣表位之間形成的抗體-抗原復(fù)合物。合適的檢測方式包括使用例如放射性核素、酶、輔酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、色原、酶底物或輔助因子、酶抑制劑、輔基復(fù)合物、自由基、顆粒、染料等標記。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物例子包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和親和素/生物素；合適的熒光物質(zhì)例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的例子是魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括螢光素酶、螢光素和水母蛋白；合適的放射性物質(zhì)的例子包括125I、131I、35S或3H。這種標記的試劑可用于各種熟知的試驗，例如放射性免疫試驗，酶免疫試驗如ELISA、熒光免疫試驗等。參見，例如美國專利號3,766,162；3,791,932；3,817,837和4,233,402。
可將任何前述的拮抗性抗-CD40抗體或它們的抗體片段偶聯(lián)然后用于本發(fā)明方法。制備偶聯(lián)抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。因此，可用間接標記或間接標記方法來標記抗-CD40抗體。“間接標記”或“間接標記方法”指將螯合劑共價偶聯(lián)于抗體并且將至少一種放射性核素插入該螯合劑中。例如，參見納入本文作為參考的Srivagtava和Mease，(1991)Nucl.Med.Bio.18589-603中所述的螯合劑和放射性核素。合適的標記包括熒光基團、生色團、放射性原子(特別是32P和125I)、電子密集試劑(electron-dense reagent)、酶和具有特異性結(jié)合伴侶(partner)的配體。一般通過其活性來檢測酶。例如，常通過將3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)變?yōu)榭捎梅止夤舛扔嫸康乃{色色素的能力來檢測辣根過氧化物酶?！疤禺愋越Y(jié)合伴侶”指能以高特異性結(jié)合配體分子的蛋白質(zhì)，例如抗原和其特異性單克隆抗體。其它特異性結(jié)合伴侶包括生物素和親和素或鏈霉抗生物素蛋白、IgG和蛋白A、本領(lǐng)域已知的許多受體-配體對。因為相同的標記可以幾種不同模式使用，以上描述應(yīng)該理解為不是要將各種標記歸為截然不同的種類。例如，125I可用作放射性標記或作為電子密集試劑。HRP可用作酶或mAb的抗原。此外，可為所需的作用組合各種標記。例如，mAb與親和素在實施本發(fā)明中也需要標記因此，可用生物素標記mAb，然后用標記125I的親和素或用標記HRP的抗-生物素mAb檢測其存在。其它預(yù)先(制備)的突變與可能性對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難理解，應(yīng)認為是本發(fā)明范圍內(nèi)的等價物。
或者，抗-CD40抗體可使用放射性核素與抗體直接共價相連(一般通過氨基酸殘基)的“直接標記”或“直接標記方法”標記。優(yōu)選的核素見Srivagtava和Mease(1991)，同上。特別優(yōu)選間接標記方法。也參見，例如國際公布號WO 00/52031和WO 00/52473，其中接頭用于連接放射性標記與抗體；抗-CD40抗體的受標記形式描述于納入本文作為參考的美國專利號6,015,542。此外，抗體(或其片段)可與治療性部分，例如細胞毒素、治療性藥物或放射性金屬離子或放射性同位素偶聯(lián)。細胞毒素或細胞毒藥物包括對細胞有害的任何藥物。例子包括紫杉醇、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、足葉乙苷、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、長春新堿、長春堿、秋水仙素、阿霉素、道諾紅菌素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及它們的類似物或同系物。治療性藥物包括，但不限于抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪(decarbazine))、烷化劑(例如，氮芥、thioepa、瘤可寧、美法侖、卡氮芥(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C和順二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環(huán)類(例如，道諾紅菌素(曾用名道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放線菌素D(曾用名放線菌素)、博萊霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))、和抗有絲分裂藥物(例如，長春新堿和長春堿)。放射性同位素包括，但不限于I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111等。本發(fā)明的偶聯(lián)物可用于修飾給定的生物應(yīng)答；此類藥物部分不應(yīng)理解為限制于典型的化學(xué)治療劑。例如，此類藥物部分可以是擁有所需生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這種蛋白質(zhì)可包括，例如毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子、干擾素-α、干擾素-β、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖溶酶原激活物；或生物應(yīng)答修飾劑，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生長因子。
將這種治療性部分偶聯(lián)于抗體的技術(shù)是熟知的。參見，例如《單克隆抗體和癌癥治療》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)中的Arnon等，(1985)，“癌癥治療中用于藥物的免疫靶向的單克隆抗體”(Monoclonal Antibodies forImmunotargeting of Drugs in Cancer Therapy)，Reisfeld等編，(Alan R.Liss，Inc.)，第243-256頁；Hellstrom等，(1987)，《受控藥物遞送》(Controlled Drug Delivery)中的“用于藥物遞送的抗體”(Antidodies for Drug Delivery)，Robinson等編，(第二版；MarcelDekker，Inc.)，第623-653頁；《單克隆抗體’84生物學(xué)和臨床應(yīng)用》(Monoclonal Antibodies′84Biological and Clinical Applications)中的Thorpe，(1985)，“癌癥治療中細胞毒性藥物的抗體載體綜述”(Antibody carriers of Cytoxic Agentsin Cancer TherapyA review)，Pinchera等編，第475-506頁，(Editrice Kurtis，Milano，Italy，1985)；《癌癥診斷和治療的單克隆抗體》(Monoclonal Antibodies for CancerDetection and Therapy)中的“在癌癥治療中治療性應(yīng)用放射性標記抗體的分析、結(jié)果和前景”(Analysis，Results，and Future Prospective of Therapeutic Use ofRadiolabeled Antibody in Cancer Therpy)，Baldwin等編，(Academic Press，New York，1985)，第303-316頁；和Thorpe等，(1982)Immunol.Rev.62119-158。
或者，可將抗體與二抗偶聯(lián)形成如美國專利號4,676,980所述的抗體雜合偶聯(lián)物。此外，可在標記和本發(fā)明的抗體之間使用接頭(參見美國專利號4,831,175)?？贵w或其抗原結(jié)合片段可用放射性碘、銦、銥或本領(lǐng)域已知的其它放射性顆粒直接標記(美國專利號5,595,721)。治療方案可由同時或依次給予偶聯(lián)和非偶聯(lián)抗體的組合治療方案構(gòu)成(WO 00/52031和WO 00/52473)。
拮抗性抗-CD40抗體的變體
拮抗性抗-CD40抗體的合適的生物活性變體可用于本發(fā)明的方法。這種變體保留了親代拮抗性抗-CD40抗體的所需結(jié)合特性。制備抗體變體的方法一般是本領(lǐng)域可用的。
例如，拮抗性抗-CD40抗體，如本文所述的CHIR-5.9或CHIR-12.12單克隆抗體的氨基酸序列變體可通過突變克隆的編碼感興趣抗體的DNA序列來制備。誘變與核苷酸序列改變的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，參見納入本文作為參考的Walker和Gaastra編，(1983)，《分子生物學(xué)技術(shù)》(Techniques in Molecular Biology)，(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel等，(1987)Methods Enzymol.154367-382；Sambrook等，(1989)，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，(冷泉港，紐約)；美國專利號4,873,192；和本文引用的參考文獻。適當?shù)陌被崛〈挥绊懜信d趣多肽的生物活性的指南見納入本文作為參考的Dayhoff等，(1978)《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖》(Atlas of Protezh Sequence and Structure)，(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)中的模型。優(yōu)選保守取代，例如用具有相似特性的另一氨基酸取代一個氨基酸。保守取代的例子包括，但不限于GlyAla、ValIleLeu、AspGlu、LysArg、AsnGln和PheTrpTyr。
在構(gòu)建感興趣的拮抗性抗-CD40抗體多肽的變體過程中，進行修飾使變體繼續(xù)具有所需活性，即相似的結(jié)合親和力并能特異性地結(jié)合表達于人細胞表面的人CD40抗原，并且當與人CD40表達細胞上的CD40抗原結(jié)合時無明顯的激動活性而顯示拮抗活性。編碼這種變體多肽的DNA中的任何突變顯然無須將其序列置于讀框外并且優(yōu)選不要生成可能產(chǎn)生二級mRNA結(jié)構(gòu)的互補區(qū)。參見歐洲專利公布號75,444。
此外，可以許多方式使拮抗性抗-CD40抗體的恒定區(qū)突變而改變其效應(yīng)器功能。例如，參見美國專利號6,737,056B1和美國專利申請公布號2004/0132101A1所述的優(yōu)化抗體與Fc受體結(jié)合的Fc突變。
參比的拮抗性抗-CD40抗體的變體的氨基酸序列優(yōu)選與該參比拮抗性抗-CD40抗體分子，例如本文所述的CHIR-5.9或CHIR-12.12單克隆抗體的氨基酸序列，或與該參比抗體分子的較短部分具有至少70％或75％序列相同性，優(yōu)選至少80％或85％序列相同性，更優(yōu)選至少90％、91％、92％、93％、94％或95％序列相同性。這些分子更優(yōu)選具有至少96％、97％、98％或99％序列相同性。出于本發(fā)明的目的，可使用Smith-Waterman同源性檢索算法以相關(guān)空格(affine gap)檢索確定序列相同性百分比，所用參數(shù)為空格開放罰分12、空格延伸罰分2和BLOSUM矩陣62。Smith-Waterman同源性檢索算法的說明見Smith和Waterman，(1981)，Adv.Appl.Math.2482-489。例如，變體與參比的抗-CD40抗體有少至1-15個氨基酸殘基、少至1-10個氨基酸殘基，如6-10，少至5個、少至4個、3個、2個、甚至1個氨基酸殘基的不同。
就兩條氨基酸序列的最佳比對而言，與參比氨基酸序列相比，變體氨基酸序列的毗連區(qū)段可具有額外的氨基酸殘基或刪除的氨基酸殘基。用于和參比氨基酸序列比較的毗連區(qū)段包括至少20個毗連氨基酸殘基，可以是30、40、50或更多個氨基酸殘基。可對與保守殘基取代或空格相關(guān)的序列相同性進行校正(參見Smith-Waterman同源性檢索算法)。
能特異性結(jié)合CD40并保留拮抗活性的多肽的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)，特別是當與惡性B細胞上的CD40抗原結(jié)合時取決于許多因素。由于分子中存在可電離的氨基和羧基，特定的多肽可以酸性鹽或堿性鹽，或以中性鹽形式獲得。在合適的環(huán)境中可保留它們的生物活性的所有這種制劑包括在本文所用的拮抗性抗-CD40抗體的定義中。此外，可通過使用糖組分衍生(糖基化)或通過其它補充分子，例如脂質(zhì)、磷酸、乙?；仍黾釉摱嚯牡囊患壈被嵝蛄小Ｒ部赏ㄟ^和糖偶聯(lián)來增加該多肽的一級氨基酸序列。這種增加的某些方面可通過生產(chǎn)宿主的翻譯后加工系統(tǒng)來實現(xiàn)；可在體外引入其它這種修飾。在任何情況中，只要抗-CD40抗體的拮抗特性能未遭破壞，這種修飾就包括在本文所用的抗-CD40抗體的定義中。在各種試驗中，期望這種修飾可通過提高或降低該多肽的活性來定量或定性地影響其活性。此外，可通過氧化、還原或其它衍生方式來修飾鏈中的各個氨基酸殘基，可切割該多肽得到保留活性的片段。這種不破壞拮抗活性的改變未將該多肽序列排除在本文所用感興趣的抗-CD40抗體的定義之外。
本領(lǐng)域為有關(guān)多肽變體的制備和使用提供了基本指南。在制備抗-CD40抗體變體過程中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員易于確定對天然蛋白質(zhì)的核苷酸或氨基酸序列的哪種修飾將導(dǎo)致適合用作本發(fā)明方法藥物組合物中治療性活性組分的變體。
使用本發(fā)明拮抗性抗-CD40抗體的治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的方法涉及使用拮抗性抗-CD40抗體來治療患CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活CD40表達細胞所介導(dǎo)疾病的患者。“CD40表達細胞”指表達CD40抗原的正?；驉盒訠細胞。檢測CD40在細胞中表達的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于PCR技術(shù)、免疫組織化學(xué)方法、流式細胞術(shù)、Western印跡、ELISA等。“惡性”B細胞指任何致瘤性B細胞，包括但不限于衍生自淋巴瘤的B細胞，包括低級、中級和高級B細胞淋巴瘤、免疫母細胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、何杰金病、Epstein-Barr病毒(EBV)誘導(dǎo)的淋巴瘤和AIDS相關(guān)淋巴瘤以及B細胞急性成淋巴細胞白血病、骨髓瘤、慢性淋巴細胞白血病、急性成髓細胞白血病等。
本文將“治療”定義為將拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段應(yīng)用于或給予患者，或?qū)⑥卓剐钥?CD40抗體或其抗原結(jié)合片段應(yīng)用于或給予患者的分離的組織或細胞系，所述患者患有疾病，疾病癥狀，或疾病的易感性，給藥的目的是為治愈、治療、緩解、減輕、改變、補救、改善、提高或影響該疾病、疾病的癥狀、或疾病的易感性?！爸委煛币仓笇⒑修卓剐钥?CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物應(yīng)用于或給予患者，或?qū)⒑修卓剐钥?CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物應(yīng)用于或給予患者的分離的組織或細胞系，所述患者患有疾病，疾病的癥狀，或疾病的易感性，給藥的目的是為治愈、治療、緩解、減輕、改變、補救、改善、提高或影響該疾病、疾病的癥狀、或疾病的易感性。
“抗腫瘤活性”指降低惡性的CD40表達細胞增殖或積累的速率從而降低已存在的腫瘤或在治療期間產(chǎn)生的腫瘤的生長速率，和/或破壞已存在的致瘤性(腫瘤)細胞或新形成的致瘤性細胞從而減小治療期間腫瘤的總體積。用至少一種抗-CD40抗體(或其抗原結(jié)合片段)治療可導(dǎo)致對治療人體中CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活CD40表達細胞相關(guān)疾病的有益生理應(yīng)答。
本發(fā)明的方法可用于治療異常的失控B細胞增殖或積累有關(guān)的非何杰金淋巴瘤。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)《工作試劑》(working formulation)分類表，這種淋巴瘤的分類為低級、中級或高級的B細胞淋巴瘤(參見“非何杰金淋巴瘤病理分類項目”(The Non-Hodgkin′s Lymphoma Pathologic Classification Project)，Cancer49(1982)2112-2135)。因此，低級B細胞淋巴瘤包括小淋巴細胞性、濾泡小粘著性細胞(small-cleaved)和濾泡混合小粘著性和大細胞淋巴瘤；中級淋巴瘤包括濾泡大細胞、彌散性小粘著性細胞、彌散性小和大細胞、和彌散性大細胞淋巴瘤；和高級淋巴瘤，包括伯基特類型和非伯基特類型的大細胞免疫母細胞、成淋巴細胞、和小粘著性細胞淋巴瘤。
應(yīng)該知道本發(fā)明的方法可用于治療按修正的歐美淋巴瘤分類(REAL)系統(tǒng)分類為B細胞型的淋巴瘤。這種B細胞淋巴瘤包括，但不限于按以下分類的淋巴瘤前B細胞瘤，例如B淋巴細胞性白血病/淋巴瘤；外周B細胞瘤，包括慢性B細胞型淋巴細胞性白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤、漿細胞樣淋巴細胞(lymphoplasmacytoid)淋巴瘤/免疫細胞瘤、外套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡中心淋巴瘤(濾泡性)(包括彌散性小細胞、彌散性小和大細胞，與彌散性大細胞淋巴瘤)、邊緣層B細胞淋巴瘤(包括結(jié)節(jié)外、結(jié)節(jié)的和脾臟類型)、毛細胞性白血病、漿細胞瘤/骨髓瘤、原發(fā)性縱隔(胸腺)亞型彌散性大細胞型B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和伯基特樣高級B細胞淋巴瘤；急性白血??；急性淋巴細胞性白血病；成髓細胞白血病；急性髓細胞性白血病；前髓細胞性白血?。涣魏思毎籽?；單核細胞性白血??；紅白血病；髓細胞性白血病(慢性髓細胞性白血病)；慢性淋巴細胞性白血病；真紅細胞增多；多發(fā)性骨髓瘤；特發(fā)性巨球蛋白血癥；重鏈疾病；和不可分類的低級或高級B細胞淋巴瘤。
應(yīng)該知道本發(fā)明的方法可用于預(yù)防治療期間發(fā)生的腫瘤進一步增殖。本發(fā)明的方法特別可用于治療患低級B細胞淋巴瘤的對象，特別是標準化療后復(fù)發(fā)的對象中特別有用。低級B細胞淋巴瘤比中級和高級B細胞淋巴瘤的痛苦更小，其特征具有復(fù)發(fā)/減輕過程。因此，使用本發(fā)明的方法提高了對這些淋巴瘤的治療，從而降低了復(fù)發(fā)的次數(shù)和嚴重性。
本文所述的拮抗性抗-CD40抗體也發(fā)現(xiàn)可用于治療炎性疾病和免疫系統(tǒng)缺陷或病癥，所述炎性疾病和免疫系統(tǒng)缺陷或病癥包括，但不限于全身性紅斑狼瘡、銀屑病、硬皮病、CREST綜合征、炎性肌炎、斯耶格倫綜合征、混合型結(jié)締組織病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、炎性腸病、急性呼吸道窘迫綜合征、肺部炎癥、特發(fā)性肺纖維變性、骨質(zhì)疏松癥、遲發(fā)型超敏性(疾病)、哮喘、原發(fā)性膽汁性肝硬化和特發(fā)性血小板減少性紫癜。
根據(jù)本發(fā)明的方法，至少一種本文它處所定義的拮抗性抗-CD40抗體(或其抗原結(jié)合片段)可用于促進對惡性人B細胞相關(guān)的陽性治療性應(yīng)答。癌癥治療相關(guān)的“陽性治療性應(yīng)答”指與這些抗體或其片段的抗腫瘤活性相關(guān)疾病的改善，和/或疾病相關(guān)癥狀的改善。即，可觀察到抗增殖作用、防止腫瘤進一步增殖，腫瘤體積減小、腫瘤細胞數(shù)量降低、和/或CD40表達細胞激活所介導(dǎo)的一種或多種癥狀的減輕。因此，疾病改善的特征可以是完全的應(yīng)答。“完全的應(yīng)答”指以前異常的放射顯影研究、骨髓和腦脊髓液(CSF)正?；呐R床上無可檢測的疾病。用本發(fā)明的方法治療后這種應(yīng)答必須維持至少一個月?；蛘撸膊〉母纳瓶蓺w類為部分應(yīng)答?！安糠謶?yīng)答”指在無新的病損時，所有可檢測的腫瘤負荷(即，對象中腫瘤細胞的數(shù)量)至少降低約50％并至少持續(xù)一個月。這種應(yīng)答僅適用于可檢測的腫瘤。
可用以下篩選技術(shù)評價腫瘤應(yīng)答所導(dǎo)致的腫瘤形態(tài)(即，總的腫瘤負荷、腫瘤體積等)變化例如磁共振成像(MRI)掃描、x-放射顯影成像、計算機化斷層顯像(CT)掃描、生物發(fā)光成像，如螢光素酶成像、骨掃描成像和包括抽取骨髓(BMA)的腫瘤活體組織取樣。除了這些陽性治療性應(yīng)答以外，用拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段治療的對象可經(jīng)歷疾病相關(guān)癥狀改善的有益作用。因此，就B細胞腫瘤而言，對象可經(jīng)歷所謂的B癥狀，即盜汗、發(fā)熱、體重降低和/或蕁麻疹的減輕。
“治療有效劑量或量”或“有效量”指給予拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段后，可導(dǎo)致與治療患病患者相關(guān)的陽性治療性應(yīng)答的量，所述疾病包括CD40表達細胞的激活。在本發(fā)明的一些實施方案中，抗-CD40抗體或其片段的治療有效量為約0.01mg/kg-40mg/kg、約0.01mg/kg-30mg/kg、約0.1mg/kg-30mg/kg、約1mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-25mg/kg、約3mg/kg-20mg/kg、約5mg/kg-15mg/kg或約7mg/kg-12mg/kg。應(yīng)知道該治療方法可包括一次給予或多次給予治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明的另一實施方案是將拮抗性抗-CD40抗體用作臨床測試過程的一部分來診斷性監(jiān)測組織中蛋白質(zhì)水平，例如用于檢測給定治療方案的有效性。將該抗體與可檢測的物質(zhì)偶聯(lián)有助于檢測?？蓹z測物質(zhì)的例子包括各種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的例子包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和親和素/生物素；合適的熒光物質(zhì)的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的例子包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括螢光素酶、螢光素和水母蛋白；合適的放射性物質(zhì)的例子包括125I、131I、35S或3H。
本文所述的抗-CD40抗體還可用于提供試劑(reagent)，例如標記的抗體可用于鑒定表達CD40的細胞。這在確定未知樣品的細胞類型中非常有用?？墒褂靡唤M單克隆抗體通過種類和/或器官類型來鑒定組織。這些抗-CD40抗體可以類似的方式用于篩選組織培養(yǎng)細胞中的污染(即，篩選培養(yǎng)物中是否存在CD40表達細胞和非CD40表達細胞)。
拮抗性抗-CD40抗體可與已知的用于治療含有激活的CD40表達細胞的疾病的化療(藥物)和細胞因子聯(lián)用。例如，本發(fā)明的抗-CD40抗體可與細胞因子，例如白介素-2聯(lián)用。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗-CD40抗體可與利妥昔單抗(IDEC-C2B8；Rituxan；IDEC Pharmaceuticals Corp.，San Diego，California)聯(lián)用。
本文所述拮抗性抗-CD40抗體或它們的抗原結(jié)合片段可以此方式與至少一種已知的癌癥療法組合給予，所述癌癥療法包括，但不限于外科或手術(shù)方法(例如，脾切除術(shù)、肝切除術(shù)、淋巴結(jié)切除術(shù)、白細胞去除術(shù)(leukophoresis)、骨髓移植等)；放療；化療，任選與自體骨髓移植組合，其中合適的化療藥物包括，但不限于氟達拉濱或鹽酸氟達拉濱、瘤可寧、長春新堿、噴司他丁、2-氯脫氧腺苷(cladribine)、環(huán)磷酰胺、阿霉素、潑尼松和它們的組合，例如含有蒽環(huán)類的聯(lián)用方案，如CAP(環(huán)磷酰胺、阿霉素加潑尼松)、CHOP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松加阿霉素)、VAD(長春新堿、阿霉素加地塞米松)、MP(美法侖加潑尼松)，和用于化療的其它細胞毒和/或治療性藥物，如米托蒽醌、道諾紅菌素、依達比星、天冬酰胺酶和抗代謝物，包括但不限于阿糖胞苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪、6-硫代鳥嘌呤、6-巰基嘌呤和奈拉濱(nelarabine)；其它抗癌癥單克隆抗體療法(例如，阿來組單抗(alemtuzumab)(Campath)或其它靶向惡性B細胞上CD52細胞表面糖蛋白的抗-CD52抗體；利妥昔單抗(Rituxan)、完整的人抗體HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫單抗(tositumomab)/I-131托西莫單抗(Bexxar)、替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan)(Zevalin)或任何其它靶向惡性B細胞上CD20抗原的治療性抗-CD20抗體；抗-CD19抗體(例如，MT103，雙特異性抗體)；抗-CD22抗體(例如，人源化單克隆抗體埃坡組單抗(epratuzumab))；貝伐單抗(bevacizumab)(Avastin)或其它靶向人血管內(nèi)皮細胞生長因子的抗癌癥抗體；靶向惡性B細胞上CD22抗原的抗-CD22抗體(例如，單克隆抗體BL-22，αCD22毒素)；靶向巨噬細胞集落刺激因子的α-M-CSF抗體；靶向多發(fā)性骨髓瘤中過度表達的核因子-κB(RANK)及其配體(RANKL)的受體激活劑的抗體；靶向惡性B細胞上CD23抗原的抗-CD23抗體(例如，IDEC-152)；靶向CD80抗原的抗-CD80抗體(例如，IDEC-114)；靶向惡性B細胞上的CD38抗原的抗-CD38抗體；靶向表達于惡性B細胞上主要組織相容性復(fù)合體II類受體的抗體(抗-MHC抗體)；其它靶向惡性B細胞上CD40抗原的抗-CD40抗體(例如，SGN-40)；和靶向表達于許多實體腫瘤和造血來源腫瘤上腫瘤壞死因子相關(guān)促凋亡配體受體1(TRAIL-R1)的抗體(例如，激動性人單克隆抗體HGS-ETR1)和靶向TRAIL-R2的抗體)；基于小分子的癌癥療法，所述小分子包括但不限于微管和/或托撲異構(gòu)酶抑制劑(例如，有絲分裂抑制劑多拉斯他汀(dolastatin)和其類似物；微管蛋白結(jié)合藥物T900607；XL119；和托撲異構(gòu)酶抑制劑氨基喜樹堿)、SDX-105(鹽酸苯達莫司汀)、ixabepilone(埃坡霉素(epothilone)類似物，也稱為BMS-247550)、蛋白激酶C抑制劑，例如米哚妥林(midostaurin)((PKC-412、CGP41251、N-苯甲?；宙邏A)、pixantrone、奧沙利鉑(eloxatin)(一種抗腫瘤藥物)、硝酸鎵(硝酸鎵)、Thalomide(沙立度胺)、沙立度胺的免疫調(diào)節(jié)衍生物(例如，revlimid(曾用名revimid))、AffinitakTM(蛋白質(zhì)激酶C-α的反義抑制劑)、SDX-101(誘導(dǎo)惡性淋巴細胞凋亡的R-依托度酸)、第二代嘌呤核苷類似物，如氯法拉濱(clofarabine)、癌細胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)Bcl-2的抑制劑(例如，反義藥物奧利默森(oblimersen)和Genasense)、蛋白酶體抑制劑(例如，VelcadeTM(硼替佐米(bortezomib)))、小分子激酶抑制劑(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制劑(例如，ZD-6474)、熱激蛋白(HSP)90的小分子抑制劑(例如，17-AAG)、組蛋白脫乙酰酶的小分子抑制劑(例如，雜交/極性細胞分化HPC)藥物，如N-辛二酰苯異羥肟酸(suberanilohydroxamic acid)(SAHA)、和FR-901228)和凋亡藥物，如Trisenox(三氧化砷)和Xcytrin(莫特沙芬釓(motexafin gadolinium))；基于疫苗/免疫治療的癌癥療法，包括但不限于疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、個性化的免疫療法或活性獨特型免疫療法(例如，MyVaxPersonalizedImmunothcrapy，以前命名為GTOP-99)、Promues(CpG 7909，一種toll-樣受體9(TLR9)的合成激動劑)、干擾素-α療法、白介素-2(IL-2)療法、IL-12療法、IL-15療法和IL-21療法；類固醇療法；或其它癌癥療法；其中其它癌癥療法在拮抗性抗-CD40抗體治療給予之前、期間或之后給予。因此，當該組合療法包括給予拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段時聯(lián)合給予例如化療、放療、其它抗癌癥抗體療法、基于小分子的癌癥療法或基于疫苗/免疫治療的癌癥療法的另一種治療性藥物，本發(fā)明的方法包括用不同制劑或一種藥物制劑共同給藥，或以兩種順序之一連續(xù)給藥。當本發(fā)明的方法包括組合治療方案時，這些治療可同時進行，即拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時給予或在與其它癌癥療法相同的時間范圍內(nèi)給予(即，同時進行治療，但拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段不是在正好與其它療法相同的時間給予)?；蛘?，本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段也可在其它療法之前或之后給予。依次進行不同的癌癥療法而不論受治療的對象對第一療程的反應(yīng)是否降低了緩解或復(fù)發(fā)的可能性。當該組合療法包括聯(lián)合給予拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段和細胞毒藥物時，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段優(yōu)選在給予細胞毒藥物之前給予。
在本發(fā)明的一些實施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與化療聯(lián)合給予，并且任選與自體骨髓移植聯(lián)合，其中抗體和化療藥物可以依次給予，以任一順序給予或同時給予(即，同時或在相同時間范圍內(nèi))。合適的化療藥物的例子包括，但不限于氟達拉濱或鹽酸氟達拉濱、瘤可寧、長春新堿、噴司他丁、2-氯脫氧腺苷、環(huán)磷酰胺、阿霉素、潑尼松和它們的組合，例如含有蒽環(huán)類的方案，如CAP(環(huán)磷酰胺、阿霉素加潑尼松)、CHOP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松加阿霉素)、VAD(長春新堿、阿霉素加地塞米松)、MP(美法侖加潑尼松)，和用于化療的其它細胞毒和/或治療性藥物，如米托蒽醌、道諾紅菌素、依達比星、天冬酰胺酶和抗代謝物，包括但不限于阿糖胞苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪、6-硫代鳥嘌呤、6-巰基嘌呤和奈拉濱。在一些實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體，例如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段在用化療藥物治療之前給予。在其它實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體在用化療藥物治療之后給予。在還有的其它實施方案中，化療藥物與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時給予。
因此，例如，在一些實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體，例如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段與氟達拉濱或鹽酸氟達拉濱聯(lián)合給予。在一個這種實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在給予氟達拉濱或鹽酸氟達拉濱之前給予。在其它實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用氟達拉濱或鹽酸氟達拉濱治療之后給予。在還有其它的實施方案中，氟達拉濱或鹽酸氟達拉濱與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時給予。
在一些實施方案中，瘤可寧，一種烷化藥物與本文所述拮抗性抗-CD40抗體，例如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段聯(lián)合給予。在一個這種實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在給予瘤可寧之前給予。在其它實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用瘤可寧治療之后給予。在還有其它的實施方案中，瘤可寧與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時給予。
在還有其它的實施方案中，含有蒽環(huán)類的方案，如CAP(環(huán)磷酰胺、阿霉素加潑尼松)、CHOP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松加阿霉素)與本文所述拮抗性抗-CD40抗體，例如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段聯(lián)合給予。在一個這種實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在給予含有蒽環(huán)類的方案之前給予。在其它實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用含有蒽環(huán)類的方案治療之后給予。在還有其它的實施方案中，含有蒽環(huán)類的方案與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時給予。
在其它實施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗體，例如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段與阿來組單抗(alemtuzumab)(Campath；Berlex Laboratories，Richmond，California經(jīng)銷)聯(lián)合給予。阿來組單抗是靶向表達于惡性B細胞上CD52抗原的重組人源化單克隆抗體(Campath-1H)。在一個這種實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在給予阿來組單抗之前給予。在其它實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用阿來組單抗治療之后給予。在還有其它的實施方案中，阿來組單抗與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時給予。
在其它實施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗體，例如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段與靶向惡性B細胞上的CD20抗原的治療性抗-CD20抗體，例如利妥昔單抗(Rituxan)、完整的人抗體HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫單抗/I-131托西莫單抗(Bexxar)或替伊莫單抗(Zevalin)聯(lián)合給予。在一個這種實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在給予抗-CD20抗體之前給予。在其它實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用抗-CD20抗體治療之后給予。在還有其它的實施方案中，抗-CD20抗體與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時給予。
在其它實施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗體，例如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段與基于小分子的癌癥療法聯(lián)合給予，所述小分子包括但不限于微管和/或拓撲異構(gòu)酶抑制劑(例如，有絲分裂抑制劑多拉斯他汀和其類似物；微管蛋白結(jié)合藥物T900607；XL 119；和拓撲異構(gòu)酶抑制劑氨基喜樹堿)、SDX-105(鹽酸苯達莫司汀)、ixabepilone(埃坡霉素(epothilone)類似物，也稱為BMS-247550)、蛋白激酶C抑制劑，例如米哚妥林((PKC-412、CGP41251、N-苯甲?；宙邏A)、pixantrone、奧沙利鉑(一種抗腫瘤藥物)、硝酸鎵(硝酸鎵)、Thalomide(沙立度胺)、沙立度胺的免疫調(diào)節(jié)衍生物(例如，revlimid(曾用名revimid))、AffinitakTM(蛋白質(zhì)激酶C-α的反義抑制劑)、SDX-101(誘導(dǎo)惡性淋巴細胞凋亡的R-依托度酸)、第二代嘌呤核苷類似物，如氯法拉濱、癌細胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)Bcl-2的抑制劑(例如，反義藥物奧利默森和Genasense)、蛋白酶體抑制劑(例如，VelcadeTM(硼替佐米))、小分子激酶抑制劑(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制劑(例如，ZD-6474)、熱激蛋白(HSP)90的小分子抑制劑(例如，17-AAG)、組蛋白脫乙酰酶的小分子抑制劑(例如，雜交/極型細胞分化HPC)藥物，如N-辛二酰苯異羥肟酸(SAHA)、和FR-901228)和凋亡藥物，如Trisenox(三氧化砷)和Xcytrin(莫特沙芬釓)。阿來組單抗是靶向表達于惡性B細胞上CD52抗原的重組人源化單克隆抗體(Campath-1H)。在一個這種實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在給予基于小分子的癌癥療法之前給予。在其它實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用基于小分子的癌癥療法治療之后給予。在還有其它的實施方案中，基于小分子的癌癥療法與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時給予。
在還有其它的實施方案中，本文所述拮抗性抗-CD40抗體，例如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段與基于疫苗/免疫治療的癌癥療法聯(lián)合給予，所述療法包括但不限于疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、個性化的免疫療法或活性獨特型免疫療法(例如，MyVaxPersonalizedImmunothcrapy，以前命名為GTOP-99)、Promues(CpG 7909，一種toll-樣受體9(TLR9)的合成激動劑)、干擾素-α療法、白介素-2(IL-2)療法、IL-12療法、IL-15療法和IL-21療法；或類固醇療法。在一個這種實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在給予基于疫苗/免疫治療的癌癥療法之前給予。在其它實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用基于疫苗/免疫治療的癌癥療法治療之后給予。在還有其它的實施方案中，基于疫苗/免疫治療的癌癥療法與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時給予。
在一個這種實施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗體，例如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段與IL2聯(lián)合給予。IL2是已知的一種可擴增受治療患者的天然殺傷(NK)效應(yīng)細胞數(shù)量的藥物，可在給予本發(fā)明拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段之前或同時給予。NK效應(yīng)細胞的數(shù)量增加可提高給予的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的ADCC活性。在其它實施方案中，當IL-21與拮抗性抗-CD40抗體，例如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段聯(lián)合給予時，可用作刺激NK細胞活性的免疫治療藥物。
此外，兩種或多種治療性藥物和本文所述的拮抗性抗-CD40抗體的組合治療也可用于治療包含激活的CD40表達細胞的疾病狀態(tài)，例如B細胞相關(guān)癌癥和自身免疫和/或炎性病癥。非限制性例子包括三重聯(lián)合治療，其中兩種化療藥物與本文所述拮抗性抗-CD40抗體聯(lián)合給予，其中一種化療藥物和另一種抗癌癥單克隆抗體(例如，阿來組單抗、利妥昔單抗或抗-CD23抗體)與本文所述拮抗性抗-CD40抗體聯(lián)合給予。這種組合的例子包括，但不限于氟達拉濱、環(huán)磷酰胺和拮抗性抗-CD40抗體，例如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段的組合；氟達拉濱、抗-CD20抗體，例如利妥昔單抗(Rituxan；IDEC PharmaceuticalsCorp.，San Diego，California)和拮抗性抗-CD40抗體，例如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段的組合。
藥物制劑和給藥方式
本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體的給藥濃度可在治療上有效預(yù)防或治療CD40表達細胞所介導(dǎo)的疾病，所述疾病例如是SLE、PBC、ITP、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、克羅恩病、移植物排異和B-細胞淋巴瘤。為實現(xiàn)此目的，可用本領(lǐng)域已知的各種可接受的賦形劑配制此抗體。此抗體一般通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射給藥。實現(xiàn)此種給藥的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。也可能獲得可局部或口服給藥，或能透過粘膜輸送的組合物。
取決于所施用的抗-CD40抗體，靜脈內(nèi)給藥優(yōu)選通過輸液在約1-10小時期間進行，更優(yōu)選約1-8小時，甚至更優(yōu)選約2-7小時、還要優(yōu)選約4-6小時。該藥物組合物的最初輸液可在約4-6小時期間進行，后續(xù)輸液可較快遞送。后續(xù)輸液可在約1-6小時期間，例如約1-4小時、約1-3小時或約1-2小時給予。
可將本發(fā)明的藥物組合物配制成與其要采用的給藥途徑相容?？赡艿慕o藥途徑的例子包括胃腸外(例如，靜脈內(nèi)(IV)、肌肉內(nèi)(IM)、真皮內(nèi)、皮下(SC)或輸液)、口服和肺部(例如，吸入)、鼻、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜和直腸給藥。用于胃腸外、真皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或混懸液可含有以下組分無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、不易揮發(fā)的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細菌試劑，例如芐醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如維生素C或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩沖液，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調(diào)整張力的試劑，例如氯化鈉和葡萄糖?？捎盟峄驂A，例如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。胃腸外制劑可包裝在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。
抗-CD40抗體通常用標準技術(shù)以藥學(xué)上可接受的緩沖液提供，例如無菌鹽水、無菌緩沖水、丙二醇、上述物質(zhì)的組合等。納入本文作為參考的《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(第18版；Mack Publishing Company，Eaton，Pennsylvania，1990)描述了制備可胃腸外給予藥物的方法。也參見，例如描述了適用于本發(fā)明方法的穩(wěn)定的抗體藥物制劑的WO98/56418。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員不難確定待給予的至少一種抗-CD40抗體或其片段的量而無需過多實驗。影響給藥方式和至少一種拮抗性抗-CD40抗體(或其片段)的各自用量的因素包括，但不限于疾病的嚴重性、病史、所治療個體的年齡、身高、體重、重量、健康和身體狀況。類似地，待給予的拮抗性抗-CD40抗體或其片段的用量取決于給藥方式和對象是接受單劑量還是多劑量的該抗腫瘤藥物。隨著所治療患者體重的增加，一般優(yōu)選較高劑量的抗-CD40抗體或其片段。待給予的抗-CD40抗體或其片段的劑量為約0.003mg/kg-50mg/kg、優(yōu)選0.01mg/kg-約40mg/kg。因此，例如劑量可以是0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，該方法包括給予多劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其片段。該方法可包括給予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多次治療有效劑量的含拮抗性抗-CD40抗體或其片段的藥物組合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員不難確定多劑量的含抗-CD40抗體或其片段的藥物組合物的給藥頻率和持續(xù)時間而無需過多實驗。此外，用治療有效量的抗體治療對象包括一次治療，或優(yōu)選可包括一系列治療。在一優(yōu)選的實施例中，用拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段以約0.1-20mg/kg體重，在約1-10周之間進行每周一次的治療，優(yōu)選在約2-8周之間、更優(yōu)選約3-7周之間、甚至更優(yōu)選約4、5或6周?？擅磕赀M行治療以防復(fù)發(fā)或根據(jù)復(fù)發(fā)的跡象進行治療。也要理解用于治療的抗體或其抗原結(jié)合片段的有效劑量在具體治療期間可增加或減少。根據(jù)本文所述診斷試驗的結(jié)果決定劑量的變化。
因此，在一個實施方案中，給藥方案包括在治療期間的第1、7、14和21天先給予治療有效劑量的至少一種抗-CD40抗體或其片段。在另一個實施方案中，給藥方案包括在治療期間的每周的第1、2、3、4、5、6和7天先給予治療有效劑量的至少一種抗-CD40抗體或其片段。其它實施方案包括在治療期間的每周的第1、3、5和7天先給予治療有效劑量的至少一種抗-CD40抗體或其片段的給藥方案；包括在治療期間每周第1和3天先給予治療有效劑量的至少一種抗-CD40抗體或其片段的給藥方案；和在治療期間每周第1天先給予治療有效劑量的至少一種抗-CD40抗體或其片段的優(yōu)選給藥方案。治療時期可包括1周、2周、3周、1個月、3個月、6個月或1年。治療時期可連續(xù)或間隔1天、1周、2周、1個月、3個月、6個月或1年。
在一些實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量是約0.003mg/kg-50mg/kg、約0.01mg/kg-40mg/kg、約0.01mg/kg-30mg/kg、約0.1mg/kg-30mg/kg、約0.5mg/kg-30mg/kg、約1mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-25mg/kg、約3mg/kg-20mg/kg、約5mg/kg-15mg/kg或約7mg/kg-12mg/kg。因此，例如，任何一種拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段，如抗-CD40單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或它們的抗原結(jié)合片段的劑量可以是0.003mg/kg、0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg或在約0.003mg/kg-50mg/kg范圍內(nèi)的其它這種劑量。在整個抗體給藥的每周可給予相同治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段?；蛘?，可在治療期間采用不同的治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。
在一些實施方案中，本文它處定義的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的最初治療有效劑量可在較低的劑量范圍(即，約0.003mg/kg-20mg/kg)內(nèi)，后續(xù)的劑量可在較高的劑量范圍(即，約20mg/kg-50mg/kg)內(nèi)。
在其它實施方案中，本文它處定義的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的最初治療有效劑量可在較高的劑量范圍(即，約20mg/kg-50mg/kg)內(nèi)，后續(xù)劑量可在較低的劑量范圍(即，約0.003mg/kg-20mg/kg)內(nèi)。因此，在一個實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的最初治療有效劑量是約20mg/kg-35mg/kg，包括約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg和約35mg/kg，隨后的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量為約5mg/kg-15mg/kg，包括約5mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、12mg/kg和約15mg/kg。
在本發(fā)明的一些實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體治療先是給予需要拮抗性抗-CD40抗體治療的對象以“負荷劑量”的抗體或其抗原結(jié)合片段?！柏摵蓜┝俊敝附o予對象的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的初始劑量，其中給予的抗體或其抗原結(jié)合片段的劑量在較高的劑量范圍內(nèi)(即，約20mg/kg-50mg/kg)。只要全部的“負荷劑量”在約24小時期間給予，該“負荷劑量”可以一次給藥，例如該抗體或其抗原結(jié)合片段經(jīng)靜脈內(nèi)一次輸液；或可以多次給藥，例如該抗體或其抗原結(jié)合片段經(jīng)靜脈內(nèi)多次輸液。給予“負荷劑量”后，可給予對象一次或多次額外治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。隨后可按，例如每周給藥時間表、或每兩周一次、每三周一次或每四周一次給予治療有效劑量。在這種實施方案中，后續(xù)的治療有效劑量在較低的劑量范圍內(nèi)(即，0.003mg/kg-約20mg/kg)。
或者，在一些實施方案中，給予“負荷劑量”后，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段按照“維持時間表”給予，其中治療有效劑量的抗體或其抗原結(jié)合片段按每月一次、每六周一次、每兩個月一次、每十周一次、每三個月一次、每十四周一次、每四個月一次、每十八周一次、每五個月一次、每二十二周一次、每六個月一次、每七個月一次、每八個月一次、每九個月一次、每十個月一次、每十一個月一次或每十二個月一次給藥。在這種實施方案中，特別是當隨后的劑量以更高頻率的間隔給藥，例如每兩個月一次到每月一次時，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量在較低劑量范圍內(nèi)(即，0.003mg/kg-約20mg/kg)；或者特別是當隨后的劑量以更低頻率的間隔給藥，例如約間隔一個月到約十二個月時，治療有效劑量在較高劑量范圍內(nèi)(即，約20mg/kg-50mg/kg)。
用于本發(fā)明方法的本文所述藥物組合物中的拮抗性抗-CD40抗體可以是天然的或通過重組技術(shù)獲得，可以是任何來源的，包括哺乳動物來源，例如小鼠、大鼠、家兔、靈長類、豬和人。這種多肽優(yōu)選得自人來源，更優(yōu)選得自雜交瘤細胞系的重組人蛋白。
本發(fā)明方法所用的藥物組合物包含本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體的生物活性變體。這種變體應(yīng)該保留天然多肽的生物活性，從而使得當將包含變體多肽的藥物組合物給予對象時具有與包含天然多肽的藥物組合物相同的治療作用。即，該變體抗-CD40抗體可以類似于天然拮抗性抗體，例如分別由雜交瘤細胞系5.9或12.12表達的CHIR-5.9或CHIR-12.12觀察到的作用方式作為藥物組合物中的治療活性組分。本領(lǐng)域已建立了可用于確定變體抗-CD40抗體是否保留了所需生物活性從而可用作藥物組合物中治療活性組分的方法。可采用為檢測天然拮抗性抗體活性而特別設(shè)計的試驗，包括本發(fā)明所述的試驗來測定抗體變體的生物活性。
任何含有本文所述結(jié)合特性的拮抗性抗-CD40抗體作為活性組分的藥物組合物可用于本發(fā)明的方法。因此，包含一種或多種本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體的液體、凍干或噴霧干燥的組合物可根據(jù)本發(fā)明的方法制備用作隨后給予對象的水性或非水性溶液或混懸液。這些組合物中的每種包含至少一種本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體作為治療或預(yù)防活性組分?！爸委熁蝾A(yù)防活性組分”指特別引入該組合物中的抗-CD40抗體，當將該藥物組合物給予對象時，可產(chǎn)生治療、預(yù)防或診斷對象疾病或病癥的所需治療性或預(yù)防性應(yīng)答。該藥物組合物優(yōu)選包含合適的穩(wěn)定劑、填充劑，或同時包含二者以最大程度降低制備和儲存期間與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和生物活性喪失相關(guān)的問題。
可在包含本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體的藥物組合物中加入一些制劑(formulant)。這些制劑包括，但不限于油、聚合物、維生素、碳水化合物、氨基酸、鹽、緩沖劑、白蛋白、表面活性劑或填充劑。碳水化合物優(yōu)選包括糖或糖醇，例如單糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、葡聚糖、支鏈淀粉、糊精、α和β環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素或它們的混合物?！疤谴肌倍x為具有羥基的C4-C8烴，包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨醇、甘油和阿拉伯糖醇。這些糖或糖醇可單獨或組合使用。糖或糖醇的濃度在1.0％和7％w/v之間，更優(yōu)選在2.0％和6.0％w/v之間。優(yōu)選的氨基酸包括左旋(L)形式的肉毒堿、精氨酸和甜菜堿；然而，也可加入其它氨基酸。優(yōu)選的聚合物包括平均分子量為2,000和3,000之間的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或平均分子量為3,000和5,000之間的聚乙二醇(PEG)?？杉尤朐撝苿┑谋砻婊钚詣┮姎W洲專利號270,799和268,110。
此外，例如可通過與聚合物共價偶聯(lián)來化學(xué)修飾抗體以增加它們的循環(huán)半衰期。優(yōu)選的聚合物和連接肽的方法見全文納入本文作為參考的美國專利號4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546。優(yōu)選的聚合物是聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室溫可溶于水并如通式R(O--CH2--CH2)nO--R所示，其中R可以是氫或保護性基團，如烷基或烷醇基團。保護性基團優(yōu)選具有1-8個碳原子，更優(yōu)選是甲基。符號n是優(yōu)選1-1,000之間，更優(yōu)選2-500之間的正整數(shù)。PEG優(yōu)選具有平均分子量1,000-40,000、更優(yōu)選2,000-20,000、最優(yōu)選3,000-12,000。PEG優(yōu)選具有至少一個羥基、更優(yōu)選是末端羥基。優(yōu)選激活該羥基以和抑制劑上的游離氨基反應(yīng)。然而，應(yīng)理解可改變反應(yīng)基團的類型和數(shù)量以獲得共價偶聯(lián)的PEG/本發(fā)明的抗體。
水溶性聚氧乙基化多元醇也可用于本發(fā)明。它們包括聚氧乙基化山梨醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油(POG)。優(yōu)選POG。原因之一是聚氧乙基化甘油的骨架與例如動物和人的單、二、甘油三酯中天然存在的骨架相同。因此，該分支在體內(nèi)不會被視作外來物質(zhì)。POG的優(yōu)選分子量與PEG的相同。POG的結(jié)構(gòu)見Knauf等，(1988)，J.Bio.Chem.26315064-15070，美國專利號4,766,106描述了POG/IL-2偶聯(lián)物，兩篇文獻均全文納入本文作為參考。
另一種增加循環(huán)半衰期的藥物遞送系統(tǒng)是脂質(zhì)體。制備脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的方法見Gabizon等，(1982)，Cancer Research 424734；Cafiso(1981)，BiochemBiophys Acta 649129和Szoka(1980)，Ann.Rev.Bioplays.Eng.9467所述。本領(lǐng)域已知的其它藥物遞送系統(tǒng)描述見，例如Poznansky等，(1980)，《藥物遞送系統(tǒng)》(Drug Delivery Systems)，(R.L.Juliano編，Oxford，N.Y.)，第253-315頁；Poznansky，(1984)，Pharm Revs 36277。
引入藥物組合物中的制劑應(yīng)使得拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段穩(wěn)定。即，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段應(yīng)保留其物理和/或化學(xué)穩(wěn)定性并具有所需生物活性，即，一種或多種本文以上定義的拮抗活性，包括但不限于抑制T細胞刺激的正常人外周B細胞分泌免疫球蛋白；抑制Jurkat T細胞刺激的正常人外周B細胞存活和/或增殖；抑制CD40L表達細胞或可溶CD40配體(sCD40L)刺激的正常人外周B細胞存活和/或增殖；抑制sCD40L或固態(tài)CD40L刺激的任何細胞中“存活性”抗-凋亡胞內(nèi)信號；抑制結(jié)合sCD40L或固態(tài)CD40L后任何細胞中的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；和抑制本文它處所述人惡性B細胞的增殖。
監(jiān)測蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如Jones，(1993)Adv.DrugDelivery Rev.1029-90；Lee編，(1991)，《肽和蛋白質(zhì)藥物遞送》(Peptide andProtein Drug Delivery)，(Marcel Dekker，Inc.，紐約，紐約)和本文公開的穩(wěn)定性試驗。通常在所選擇的溫度下，測定蛋白質(zhì)在一段特定時期內(nèi)的穩(wěn)定性。在優(yōu)選的實施方案中，當在室溫(約25℃)儲存至少1個月、至少3個月、或至少6個月，和/或在約2-8℃儲存至少6個月、至少9個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月時，穩(wěn)定的抗體藥物制劑將使得拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段穩(wěn)定。
當將某種蛋白質(zhì)，例如抗體配制入藥物組合物時，如果在該藥物組合物中未出現(xiàn)沉淀、凝聚和/或變性的可見跡象(即，變色或澄清度喪失)或可測跡象(例如，采用體積排阻層析(SEC)或紫外光散射法)時，則可認為該蛋白質(zhì)在給定時間點保留了其物理穩(wěn)定性。就化學(xué)穩(wěn)定性而言，當將某種蛋白質(zhì)，例如抗體配制入藥物組合物時，如果化學(xué)穩(wěn)定性的測定顯示該蛋白質(zhì)(即，抗體)在該藥物組合物中保留了其感興趣的生物活性，則可認為該蛋白質(zhì)保留了其化學(xué)穩(wěn)定性。測定化學(xué)穩(wěn)定性變化的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于用例如SDS-PAGE、SEC和/或襯質(zhì)輔助激光解析與電離-飛行時間質(zhì)譜檢測因剪切所致蛋白質(zhì)的化學(xué)改變形式的方法；和用例如離子交換色譜檢測與分子荷電改變相關(guān)(例如，與脫氨基相關(guān))的降解的方法。參見，例如下文所述的方法。
當將拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段配制入藥物組合物時，如果在給定時間的所需生物活性處于該藥物組合物制備之時用所需生物活性的合適試驗檢測到的所需生物活性的約30％以內(nèi)，優(yōu)選約20％以內(nèi)，則可認為所述拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在該時間點保留了所需生物活性。檢測拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的所需生物活性的試驗可如本文的實施例所述進行。也參見納入本文作為參考的以下文獻所述的試驗Schutze等，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928200-8204；Denton等，(1998)，Pediatr Transplant.26-15；Evans等，(2000)，J.Immunol.164688-697；Noelle，(1998)，Agents ActionsSuppl.4917-22；Lederman等，(1996)，Curr Opin.Hematol.377-86；Coligan等，(1991)，Current Protocols in Immunology 1312；Kwekkeboom等，(1993)Immunology 79439-444；和美國專利號5,674,492和5,847,082。
在本發(fā)明的一些實施方案中，將拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段配制入液體藥物制劑中。拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段可用本領(lǐng)域已知的任何方法，包括上文公開的方法制備。在一個實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段在CHO細胞系中重組產(chǎn)生。
拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段制備和純化后可以本文所述方式配制為液體藥物制劑。當拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在配制前要保存時，可在，例如≤-20℃冷凍，然后于室溫融化作進一步配制。該液體藥物制劑含有治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。該制劑中的抗體或其抗原結(jié)合片段的用量要考慮給藥途徑和所需劑量體積。
在此方式中，該液體藥物組合物包含以下濃度的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體或其抗原結(jié)合片段約0.1mg/ml-50.0mg/ml、約0.5mg/ml-40.0mg/ml、約1.0mg/ml-30.0mg/ml、約5.0mg/ml-25.0mg/ml、約5.0mg/ml-20.0mg/ml或約15.0mg/ml-25.0mg/ml。在一些實施方案中，該液體藥物組合物包含以下濃度的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段約0.1mg/ml-5.0mg/ml、約5.0mg/ml-10.0mg/ml、約10.0mg/ml-15.0mg/ml、約15.0mg/ml-20.0mg/ml、約20.0mg/ml-25.0mg/ml、約25.0mg/ml-30.0mg/ml、約30.0mg/ml-35.0mg/ml、約35.0mg/ml-40.0mg/ml、約40.0mg/ml-45.0mg/ml或約45.0mg/ml-50.0mg/ml。在其它實施方案中，該液體藥物組合物包含以下濃度的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段約15.0mg/ml、約16.0mg/ml、約17.0mg/ml、約18.0mg/ml、約19.0mg/ml、約20.0mg/ml、約21.0mg/ml、約22.0mg/ml、約23.0mg/ml、約24.0mg/ml或約25.0mg/ml。該液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體或其抗原結(jié)合片段和維持該制劑的pH于約pH 5.0-pH 7.0的緩沖劑，所述pH包括約pH 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0和約pH 5.0-pH 7.0范圍內(nèi)的其它這種數(shù)值。在一些實施方案中，緩沖劑可維持制劑的pH于約pH 5.0-pH 6.5、約pH 5.0-pH 6.0、約pH 5.0-pH 5.5、約pH 5.5-7.0、約pH 5.5-pH 6.5或約pH 5.5-pH 6.0的范圍。
可在該制劑中采用維持液體抗-CD40抗體制劑的pH約pH 5.0-pH 7.0范圍的任何合適緩沖劑，只要所述抗體保留上述理化穩(wěn)定性和所需生物活性。合成的緩沖劑包括，但不限于常規(guī)的酸及它們的鹽，其中反荷離子可以是，例如鈉、鉀、銨、鈣或鎂。用于緩沖該液體藥物制劑的常規(guī)酸及它們的鹽的例子包括，但不限于琥珀酸或琥珀酸鹽、檸檬酸或檸檬酸鹽、乙酸或乙酸鹽、酒石酸或酒石酸鹽、磷酸或磷酸鹽、葡糖酸或葡糖酸鹽、谷氨酸或谷氨酸鹽、天冬氨酸或天冬氨酸鹽、馬來酸或馬來酸鹽和蘋果酸或蘋果酸鹽。該制劑中緩沖劑的濃度可以是約1mM-50mM，包括約1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或在約1mM-50mM范圍內(nèi)的其它這種數(shù)值。在一些實施方案中，該制劑中緩沖劑的濃度可以是約5mM-15mM，包括約5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM或在約5mM-15mM范圍內(nèi)的其它這種數(shù)值。
在本發(fā)明的一些實施方案中，該液體藥物制劑包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段和琥珀酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液，所述緩沖液的濃度可維持該制劑的pH于約pH5.0-pH7.0、優(yōu)選約pH5.0-pH6.5?！扮晁猁}緩沖液”或“檸檬酸鹽緩沖液”指分別含有琥珀酸鹽或檸檬酸鹽的緩沖液。在一優(yōu)選的實施方案中，琥珀酸鹽或檸檬酸鹽反荷離子分別是鈉陽離子，因此該緩沖劑分別是琥珀酸鈉或檸檬酸鈉。然而，預(yù)計任何陽離子均有效。其它可能的琥珀酸鹽或檸檬酸鹽陽離子包括，但不限于鉀、銨、鈣和鎂。如上所述，該制劑中琥珀酸鹽和檸檬酸鹽緩沖劑的濃度可以是約1mM-50mM，包括約1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或在約1mM-50mM范圍內(nèi)的其它這種數(shù)值。在一些實施方案中，該制劑中緩沖劑的濃度可以是約5mM-15mM，包括約5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM或約15mM。在其它實施方案中，液體藥物組合物包含濃度為約0.1mg/ml-50.0mg/ml或約5.0mg/ml-25.0mg/ml的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；和濃度為約1mM-20mM、約5mM-15mM，優(yōu)選約10mM的琥珀酸鹽或檸檬酸鹽緩沖劑，例如琥珀酸鈉或檸檬酸鈉緩沖劑。
該液體藥物制劑接近等滲是理想的，該液體藥物制劑除了包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段和維持制劑的pH于約pH5.0-pH7.0內(nèi)的緩沖劑外，還可包含其量足以使得該制劑接近等滲的等滲劑?！敖咏葷B”指水性制劑具有以下重量克分子的滲透濃度約240mmol/kg-360mmol/kg、優(yōu)選約240-340mmol/kg、更優(yōu)選約250-330mmol/kg、再要優(yōu)選約260-320mmol/kg、還要優(yōu)選約270-310mmol/kg。確定溶液等滲性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見，例如Setnikar等，(1959)，J.Am.Pharm.Assoc.48628。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉用于提供藥物組合物等滲性的各種藥學(xué)上可接受的溶質(zhì)。等滲劑可以是能將本發(fā)明液體藥物制劑的滲透壓調(diào)節(jié)至與體液的滲透壓接近等值的任何試劑。使用生理上可接受的等滲劑是理想的。因此，該液體藥物制劑除了包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段和維持制劑的pH于約pH5.0-pH7.0內(nèi)的緩沖劑外，還可包含用于提供等滲性的組分，例如氯化鈉；氨基酸，如丙氨酸、纈氨酸和甘氨酸；糖和糖醇(多元醇)包括，但不限于葡萄糖、右旋糖、果糖、蔗糖、甘露糖、海藻糖、甘油、山梨醇和木糖醇；乙酸，其它有機酸或它們的鹽，和用量相對較少的檸檬酸鹽或磷酸鹽。普通技術(shù)人員知道適合提供該液體制劑最佳等滲性的其它試劑。
在一些優(yōu)選的實施方案中，該液體藥物制劑除了包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段和維持制劑的pH于約pH5.0-pH7.0內(nèi)的緩沖劑外，還可包含作為等滲劑的氯化鈉。制劑中氯化鈉的濃度取決于其它組分對張力的作用。在一些實施方案中，氯化鈉的濃度是約50mM-300mM、約50mM-250mM、約50mM-200mM、約50mM-175mM、約50mM-150mM、約75mM-175mM、約75mM-150mM、約100mM-175mM、約100mM-200mM、約100mM-150mM、約125mM-175mM、約125mM-150mM、約130mM-170mM、約130mM-160mM、約135mM-155mM、約140mM-155mM或約145mM-155mM。在一個這樣的實施方案中，氯化鈉的濃度是約150mM。在其它這樣的實施方案中，氯化鈉的濃度是約150mM，緩沖劑是濃度為約5mM-15mM的琥珀酸鈉或檸檬酸鈉緩沖劑，該液體藥物制劑包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，該制劑的pH為約pH5.0-pH7.0、約pH5.0-pH6.0或約pH5.5-pH6.5。在其它實施方案中，該液體藥物制劑包含濃度為約0.1mg/ml-50.0mg/ml或約5.0mg/ml-25.0mg/ml的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，約150mM的氯化鈉和約10mM的琥珀酸或檸檬酸鈉，pH為約pH5.5。
可在制劑中加入表面活性劑以降低溶液-空氣界面的表面張力而抑制本發(fā)明液體藥物制劑在加工過程中由于凍融或機械剪切力所導(dǎo)致的蛋白質(zhì)降解。因此，在一些實施方案中，該液體藥物制劑包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，維持制劑的pH于約pH5.0-pH7.0內(nèi)的緩沖劑，還包含表面活性劑。在其它實施方案中，該液體藥物制劑包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，維持制劑的pH于約pH5.0-pH7.0內(nèi)的緩沖劑，等滲劑，例如濃度為約50mM-300mM的氯化鈉，還包含表面活性劑。
采用的典型表面活性劑是非離子型表面活性劑，包括聚氧乙烯山梨醇酯，例如聚山梨酸酯80(吐溫80)和聚山梨酸酯20(吐溫20)；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯，例如Pluronic F68；聚氧乙烯醇，例如Brij 35；二甲硅油；聚乙二醇，例如PEG400；溶血磷脂酰膽堿；和聚氧乙烯-對-叔-辛酚，例如Triton X-100。表面活性劑或乳化劑經(jīng)典藥物穩(wěn)定作用的描述見，例如納入本文作為參考的Levine等，(1991)，J.Parenteral Sci.Technol.45(3)160-165。用于實施本發(fā)明的優(yōu)選表面活性劑是聚山梨酸酯80。當制劑中包含表面活性劑時，一般按以下量加入約0.001％-1.0％(w/v)、約0.001％-0.5％、0.001％-0.4％、約0.001％-0.3％、約0.001％-0.2％、約0.005％-0.5％、約0.005％-0.2％、約0.01％-0.5％、約0.01％-0.2％、約0.03％-0.5％、約0.03％-0.3％、約0.05％-0.5％或約0.05％-0.2％。
因此，在一些實施方案中，該液體藥物制劑包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；緩沖劑是濃度為約1mM-50mM、約5mM-25mM或約5mM-15mM的琥珀酸鈉或檸檬酸鈉緩沖劑；制劑的pH為約pH5.0-pH7.0、約pH5.0-pH6.0或約pH5.5-pH6.5；該制劑還包含用量為約0.001％-1.0％或約0.001％-0.5％的表面活性劑，例如聚山梨酸酯80。這種制劑任選可包含等滲劑，例如濃度為約50mM-300mM、約50mM-200mM或約50mM-150mM的氯化鈉。在其它實施方案中，該液體藥物制劑包含濃度為約0.1mg/ml-50.0mg/ml或約5.0mg/ml-25.0mg/ml，包括約20.0mg/ml的治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；約50mM-200mM的氯化鈉；約5mM-20mM的琥珀酸鈉或檸檬酸鈉，包括約10mM的琥珀酸鈉或檸檬酸鈉；濃度為約50mM-200mM的氯化鈉；和任選的用量為約0.001％-1.0％，包括約0.001％-0.5％的表面活性劑，例如聚山梨酸酯80；其中液體藥物制劑的pH為約pH5.0-pH7.0、約pH5.0-pH6.0、約pH5.0-pH5.5、約pH5.5-pH6.5或約pH5.5-pH6.0。
該液體藥物制劑可基本上不含任何防腐劑和其它載體、賦形劑或本文上述的穩(wěn)定劑?；蛘撸撝苿┛砂环N或多種防腐劑，例如抗細菌劑，藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或本文上述的穩(wěn)定劑，前提是它們對拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的理化穩(wěn)定性無不利影響?？山邮艿妮d體、賦形劑和穩(wěn)定劑的例子包括，但不限于加入的緩沖試劑，助溶劑，表面活性劑，抗氧化劑，包括維生素C和甲硫氨酸，螯合劑，例如EDTA、金屬復(fù)合物(例如，Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)和生物可降解的聚合物，例如聚酯。關(guān)于制劑和選擇藥學(xué)上可接受的載體、穩(wěn)定劑和等滲劑(isomolytes)的詳盡討論見納入本文作為參考的《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，(第18版；Mack PublishingCompany，Eaton，Pennsylvania，1990)。
本文所述液體藥物制劑或其它藥物組合物制備后可凍干以防降解。凍干液體組合物的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。使用前，組合物可用含有其它成分的無菌稀釋劑(例如林格溶液、蒸餾水或無菌鹽水)重建。重建后，組合物優(yōu)選用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法給藥。
拮抗性抗-CD40抗體在生產(chǎn)藥物中的應(yīng)用
本發(fā)明也提供拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療癌癥對象的藥物中的應(yīng)用，所述癌癥的特征為致瘤性B細胞增殖，其中所述藥物與至少一種其它癌癥療法的合作起作用。特征為致瘤性B細胞增殖的癌癥包括，但不限于上文所述的B細胞相關(guān)癌癥，例如非何杰金淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、B細胞淋巴瘤、高級B細胞淋巴瘤、中級B細胞淋巴瘤、低級B細胞淋巴瘤、B細胞急性成淋巴細胞白血病、成髓細胞白血病、何杰金病、漿細胞瘤、濾泡淋巴瘤、濾泡小粘著性淋巴瘤、濾泡大細胞淋巴瘤、濾泡混合小粘著性淋巴瘤、彌散性小粘著性細胞淋巴瘤、彌散性小淋巴細胞性淋巴瘤、前淋巴細胞性白血病、漿細胞樣淋巴細胞淋巴瘤、邊緣層淋巴瘤、粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤、單核細胞樣B細胞性淋巴瘤、脾淋巴瘤、毛細胞性淋巴瘤、彌散性大細胞淋巴瘤、縱隔大B細胞型淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、血管內(nèi)淋巴瘤病、彌散性混合細胞性淋巴瘤、彌散性大細胞淋巴瘤、免疫母細胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、AIDS-相關(guān)淋巴瘤和外套細胞淋巴瘤。
“合作”指含有拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物在用至少一種其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用。其它癌癥療法的例子如本文上述的包括，但不限于手術(shù)；放療；化療，任選與自體骨髓移植組合，其中合適的化療藥物包括，但不限于氟達拉濱或鹽酸氟達拉濱、瘤可寧、長春新堿、噴司他丁、2-氯脫氧腺苷(cladribine)、環(huán)磷酰胺、阿霉素、潑尼松和它們的組合，例如含有蒽環(huán)類的方案，如CAP(環(huán)磷酰胺、阿霉素加潑尼松)、CHOP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松加阿霉素)、VAD(長春新堿、阿霉素加地塞米松)、MP(美法侖加潑尼松)，和用于化療的其它細胞毒性和/或治療性藥物，如米托蒽醌、道諾紅菌素、依達比星、天冬酰胺酶和抗代謝物，包括但不限于阿糖胞苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪、6-硫代鳥嘌呤、6-巰基嘌呤和奈拉濱；其它抗癌癥單克隆抗體療法(例如，阿來組單抗(Campath)或其它靶向惡性B細胞上CD52細胞表面糖蛋白的抗-CD52抗體；利妥昔單抗(Rituxan)、完整的人抗體HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫單抗/I-131托西莫單抗(Bexxar)、替伊莫單抗(Zevalin)或任何其它靶向惡性B細胞上CD20抗原的治療性抗-CD20抗體；抗-CD19抗體(例如，MT103，雙特異性抗體)；抗-CD22抗體(例如，人源化單克隆抗體埃坡組單抗(epratuzumab))；貝伐單抗(bevacizumab)(Avastin)或其它靶向人血管內(nèi)皮細胞生長因子的抗癌癥抗體；靶向惡性B細胞上CD22抗原的抗-CD22抗體(例如，單克隆抗體BL-22，αCD22毒素)；靶向巨噬細胞集落刺激因子的α-M-CSF抗體；靶向多發(fā)性骨髓瘤中過度表達的核因子-κB(RANK)及其配體(RANKL)的受體激活劑的抗體；靶向惡性B細胞上CD23抗原的抗-CD23抗體(例如，IDEC-152)；靶向惡性B細胞上CD38抗原的抗-CD38抗體；靶向表達于惡性B細胞上主要組織相容性復(fù)合體II類受體的抗體(抗-MHC抗體)；其它靶向惡性B細胞上CD40抗原的抗-CD40抗體(例如，SGN-40)；和靶向表達于許多實體腫瘤和造血來源的腫瘤上腫瘤壞死因子相關(guān)促凋亡配體受體1(TRAIL-R1)的抗體(例如，激動性人單克隆抗體HGS-ETR1))；基于小分子的癌癥療法，所述小分子包括但不限于微管和/或拓撲異構(gòu)酶抑制劑(例如，有絲分裂抑制劑多拉斯他汀和其類似物；微管蛋白結(jié)合藥物T900607；XL119；和拓撲異構(gòu)酶抑制劑氨基喜樹堿)、SDX-105(鹽酸苯達莫司汀)、ixabepilone(埃坡霉素(epothilone)類似物，也稱為BMS-247550)、蛋白激酶C抑制劑，例如米哚妥林((PKC-412、CGP41251、N-苯甲?；宙邏A)、pixantrone、奧沙利鉑(一種抗腫瘤藥物)、硝酸鎵(硝酸鎵)、Thalomide(沙立度胺)、沙立度胺的免疫調(diào)節(jié)衍生物(例如，revlimid(曾用名revimid))、AffinitakTM(蛋白質(zhì)激酶C-α的反義抑制劑)、SDX-101(誘導(dǎo)惡性淋巴細胞凋亡的R-依托度酸)、第二代嘌呤核苷類似物，如氯法拉濱、癌細胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)Bcl-2的抑制劑(例如，反義藥物奧利默森和Genasense)、蛋白酶體抑制劑(例如，VelcadeTM(硼替佐米))、小分子激酶抑制劑(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制劑(例如，ZD-6474)、熱激蛋白(HSP)90的小分子抑制劑(例如，17-AAG)、組蛋白脫乙酰酶的小分子抑制劑(例如，雜交/極性細胞分化HPC)藥物，如N-辛二酰苯異羥肟酸(SAHA)、和FR-901228)和凋亡藥物，如Trisenox(三氧化砷)和Xcytrin(莫特沙芬釓)；基于疫苗/免疫治療的癌癥療法，包括但不限于疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、個性化的免疫療法或活性獨特型免疫療法(例如，MyVaxPersonalized Immunothcrapy，以前命名為GTOP-99)、Promues(CpG 7909，一種toll-樣受體9(TLR9)的合成激動劑)、干擾素-α療法、白介素-2(IL-2)療法、IL-12療法、IL-15療法和IL-21療法；類固醇療法；或其它癌癥療法；其中用其它癌癥療法治療可在用上述包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物治療對象之前、期間或之后給予。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了抗-CD40抗體，例如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的B細胞性淋巴瘤，例如非何杰金淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用，所述藥物與用至少一種選自化療、抗癌癥抗體療法、基于小分子的癌癥療法和基于疫苗/基于免疫療法的癌癥療法的其它癌癥療法的治療合作起作用，所述藥物在用其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用，或者，在多重組合療法中，所述藥物在其它癌癥療法之前、期間或之后使用。
因此，例如在一些實施方案中，本發(fā)明提供單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的B細胞性淋巴瘤，例如非何杰金淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用，所述藥物與化學(xué)治療合作起作用，所述化療藥物選自環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿、潑尼松和它們的組合，例如CHOP。在其它實施方案中，本發(fā)明提供單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的B細胞性淋巴瘤，例如非何杰金淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用，所述藥物與至少一種選自以下的抗癌癥抗體的治療合作起作用阿來組單抗(Campath)或其它靶向惡性B細胞上CD52細胞表面糖蛋白的抗-CD52抗體；利妥昔單抗(Rituxan)、完整的人抗體HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫單抗/I-131托西莫單抗(Bexxar)、替伊莫單抗(Zevalin)或任何其它靶向惡性B細胞上CD20抗原的治療性抗-CD20抗體；抗-CD19抗體(例如，MT103，雙特異性抗體)；抗-CD22抗體(例如，人源化單克隆抗體埃坡組單抗)；貝伐單抗(bevacizumab)(Avastin)或其它靶向人血管上皮細胞生長因子的抗癌癥抗體；和它們的任何組合；所述藥物在其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用，或者在多重組合療法中，所述藥物在其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用。
在還有其它實施方案中，本發(fā)明提供單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的B細胞性淋巴瘤，例如非何杰金淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用，所述藥物與用至少一種基于小分子的其它療法的治療合作起作用微管和/或拓撲異構(gòu)酶抑制劑(例如，有絲分裂抑制劑多拉斯他汀和其類似物；微管蛋白結(jié)合藥物T900607；XL 119；和拓撲異構(gòu)酶抑制劑氨基喜樹堿)、SDX-105(鹽酸苯達莫司汀)、ixabepilone(埃坡霉素類似物，也稱為BMS-247550)、蛋白激酶C抑制劑，例如米哚妥林((PKC-412、CGP41251、N-苯甲?；宙邏A)、pixantrone、奧沙利鉑(一種抗腫瘤藥物)、硝酸鎵(硝酸鎵)、Thalomide(沙立度胺)、凋亡藥物，例如Xcytrin(莫特沙芬釓)；癌細胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)Bcl-2的抑制劑(例如，反義藥物奧利默森和Genasense)、奈拉濱，和它們的任何組合；所述藥物在其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用，或者在多重組合療法中，所述藥物在其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用。
在還有其它實施方案中，本發(fā)明提供單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的B細胞性淋巴瘤，例如非何杰金淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用，所述藥物與用至少一種選自以下的基于疫苗/免疫治療的癌癥療法的治療合作起作用疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、個性化的免疫療法或活性獨特型免疫療法(例如，MyVaxPersonalizedImmunothcrapy，以前命名為GTOP-99)、Promues(CpG 7909，一種toll-樣實體9(TLR9)的合成激動劑)、干擾素-α療法、IL-2療法、IL-12療法、IL-15療法和IL-21療法，和它們的任何組合；所述藥物在其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用，或者在多重組合療法中，所述藥物在其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了抗-CD40抗體，例如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的B細胞相關(guān)白血病，例如急性B細胞型淋巴細胞性白血病(B-ALL)的藥物中的應(yīng)用，所述藥物與至少一種選自化療和抗代謝物療法的其它癌癥療法的治療合作起作用，所述藥物在其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用，或者，在多重組合療法中，所述藥物在其它癌癥療法之前、期間或之后使用。這種實施方案的例子包括，但不限于包含拮抗性抗-CD40抗體，例如單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段的藥物與選自以下的化療藥物或抗代謝物的治療合作起作用環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿、潑尼松、阿糖胞苷、米托蒽醌、依達比星、天冬酰胺酶、氨甲喋呤、6-硫代鳥嘌呤、6-巰基嘌呤，和它們的組合；所述藥物在其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用，或者在多重組合療法中，所述藥物在其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用。在一個這樣的實施方案中，所述藥物與阿糖胞苷加道諾紅菌素、阿糖胞苷加米托蒽醌和/或阿糖胞苷加依達比星的治療合作起作用；所述藥物在其它癌癥療法治療B-ALL對象之前、期間或之后使用，或者，在多重組合療法中，所述藥物在其它癌癥療法之前、期間或之后使用。
本發(fā)明也提供拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的癌癥的藥物中的應(yīng)用，所述癌癥的特征為致瘤性B細胞增殖，包括本文上述的B細胞相關(guān)癌癥，所述藥物可用于已預(yù)先采用至少一種其它癌癥療法治療過的對象。“預(yù)先治療過”或“預(yù)先治療”指在接受包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物之前，對象已接受一種或多種其它癌癥療法(即，已用至少一種其它癌癥療法治療過)?！邦A(yù)先治療過”或“預(yù)先治療”包括在用包含拮抗性抗-CD40抗體，例如本文公開的單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段的藥物治療開始前的以下時間內(nèi)曾采用至少一種其它癌癥療法治療過的對象2年、18個月、1年、6個月、2個月、6周、1個月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或甚至1天。對象無需對先前一種或多種癌癥療法產(chǎn)生反應(yīng)。因此，接受包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物的對象可以對先前癌癥療法或一種或多種先前癌癥療法(當預(yù)先治療由多種療法組成時)產(chǎn)生反應(yīng)或不產(chǎn)生反應(yīng)。對象在接受包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物之前可接受的其它癌癥療法的例子包括，但不限于手術(shù)；放療；化療，任選與自體骨髓移植組合，其中合適的化療藥物包括，但不限于上文所列的藥物；其它抗癌癥單克隆抗體療法，包括但不限于上文所列的抗癌癥抗體；基于小分子的癌癥療法，包括但不限于上文所列的小分子；基于疫苗/免疫治療的癌癥療法，包括但不限于上文所列的；類固醇療法；其它癌癥療法；或它們的任何組合。
本文將合作使用本文所述的藥物和一種或多種本文定義的其它癌癥療法的“治療”定義為將所述藥物或其它癌癥療法應(yīng)用于或給予患者，或?qū)⑺鏊幬锘蚱渌┌Y療法應(yīng)用于或給予患者的分離的組織或細胞系，所述患者患有特征為致瘤性B細胞增殖的癌癥、具有這種癌癥相關(guān)的癥狀，或患這種癌癥的易感性，給藥的目的是為治愈、治療、緩解、減輕、改變、補救、改善、提高或影響癌癥、癌癥相關(guān)癥狀、或發(fā)生癌癥的易感性。
提供以下實施例是為了說明，絕非限制。
實驗
用于以下實施例的拮抗性抗-CD40抗體是CHIR-5.9和CHIR-12.12。CHIR-5.9和CHIR-12.12抗-CD40抗體是通過免疫攜帶人IgG1重鏈基因座和人κ輕鏈基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠(XenoMousetechnology(Abgenix；Fremont，California))所產(chǎn)生的人IgG1亞型抗-人CD40單克隆抗體(mAb)。如FACS分析所示，CHIR-12.12和CHIR-5.9能特異性結(jié)合人的CD40并阻止CD40配體的結(jié)合。兩種mAb可與預(yù)先已和細胞表面CD40結(jié)合的CD40-配體競爭而除去該配體。兩種抗體均是強拮抗劑能在體外抑制CD40配體介導(dǎo)的正常B細胞以及NHL和CLL患者的癌細胞增殖。在體外，兩種抗體可通過ADCC殺傷癌細胞系以及NHL患者的原發(fā)性癌細胞。在異種移植的人淋巴瘤模型中觀察到它們的劑量依賴性抗腫瘤活性。CHIR-5.9對人CD40的結(jié)合親和力是1.2×10-8M，CHIR-12.12對人CD40的親和力是5×10-10M。
小鼠雜交瘤細胞系131.2F8.5.9(CMCC#12047)和雜交瘤細胞系153.8E2.D10.D6.12.12(CMCC#12056)由美國模式培養(yǎng)物保藏所[ATCC；10801大學(xué)大道，馬納斯，弗吉尼亞20110-2209(美國)]分別以專利保存號PTA-5542和PTA-5543保存。
以下方案用于下文所述的實施例中。
用于免疫球蛋白定量的ELISA測定
用ELISA估計人IgM和IgG的濃度。用0.05M碳酸鹽緩沖液配制的(pH 9.6)2μg/ml山羊抗-人IgG Mab(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)或2μg/ml山羊抗-人IgM MAb 4102(Bio Source International，California)包被96-孔ELISA板，4℃孵育16小時。用PBS-0.05％吐溫-20(PBS-吐溫)洗滌板三次并用BSA飽和1小時。洗滌兩次后，將板于37℃與測試樣品的不同稀釋液一起孵育2小時。洗滌三次后，37℃孵育2小時用1μg/ml過氧化物酶標記的山羊抗-人IgG Mab或山羊抗-人IgM Mab檢測結(jié)合的Ig。洗滌板四次，加入鄰-苯二胺作為底物顯示結(jié)合的過氧化物酶活性。使用人IgG或IgM標準品(Caltaq，Burlingame，California)建立每個試驗的標準曲線。
分離人外周血的外周血單核細胞(PBMC)
在3只50ml的聚苯乙烯試管中加入20ml Ficoll-Paque溶液(內(nèi)毒素低；Pharmacia)，30分鐘后加入血液。使Ficoll-Paque溶液溫暖至室溫。制備3L 1∶10稀釋的空白液用于洗滌接觸血液的所有試管和移液管。血液以1.5ml血/1mlFicoll-Paque疊加在Ficoll-Paque溶液上部不再攪動Ficoll層。在室溫下1700rpm離心試管30分鐘，離心結(jié)束時制動。盡可能多地吸取上層(血漿)，使真空度盡可能低以避免取出溶液的第二層。用無菌巴斯德移液管收集含有B和T淋巴細胞的第二層置于兩個50ml聚苯乙烯試管中。收集液以3倍體積的無添加物的冷RPMI稀釋，1000RPM離心試管10分鐘。吸棄培養(yǎng)液，將兩個50ml試管的細胞重懸于總體積10ml的冷RPMI中(有添加物)并轉(zhuǎn)移至15ml試管。用血球計數(shù)器計數(shù)細胞，然后1000RPM離心10分鐘。除去培養(yǎng)液，細胞重懸于4ml RPMI中。該組分含有PBMC。
從PBMC中分離B細胞
將100μl Dyna珠(抗-h CD19)置于5-ml塑料試管中。向珠中加入3ml無菌PBS、混合、置于磁力支架上，然后靜置2分鐘。用巴斯德移液管吸棄溶液。加入3ml無菌PBS、混合、置于磁力支架上，然后靜置2分鐘。用無菌PBS的再重復(fù)該過程一次，共洗滌三次。一邊攪拌一邊將PMBC加入珠中并在40℃孵育30分鐘。含有PBMC和珠的試管置于磁力支架上2分鐘，然后將溶液移至磁力支架上的新的5ml試管內(nèi)。2分鐘后，將溶液移至新的15ml試管。再重復(fù)該步驟4次，將前4次的溶液收集在15ml試管中，然后1000RPM離心5分鐘。該步驟產(chǎn)生了沉淀的T細胞分離物。
加入100μl RPMI(有添加物)以收集珠，將溶液移入0.7ml試管內(nèi)。在室溫向懸液中加入10μl Dynal Detacha珠，旋狀45分鐘。將懸液移入新的5ml試管中并加入3ml RPMI(有添加物)。試管置于磁力支架上2分鐘。將溶液移入支架上的新的5ml試管中，2分鐘，然后移入15ml試管中。再重復(fù)前一步驟3次，溶液收集于15ml試管中。1000RPM離心15ml試管10分鐘，細胞重懸于10ml RPMI中。再重復(fù)洗滌步驟兩次，共洗滌3次。在最后離心之前計數(shù)細胞。該步驟完成了B細胞的純化。細胞保存于90％FCS和10％DMSO中并于-800℃冷凍。
分離T細胞
混合2ml的10×柱洗滌緩沖液和18ml無菌蒸餾水，用20ml的1×柱洗滌緩沖液準備好人T細胞富集柱(R & D系統(tǒng)，抗-h CD 3柱試劑盒)。用70％乙醇清潔該柱并將其置于15ml試管的頂部。先取下該柱的頂蓋(top cap)以避免將空氣帶入柱的底部。然后，取代柱的底蓋(bottom cap)并用70％乙醇洗滌尖端(tip)。使柱內(nèi)的液體排入15ml試管。當柱中緩沖液排至白色過濾器水平后，將新的無菌15ml試管置于該柱之下。將去除了B細胞的PBMC組分重懸于1ml緩沖液中并加入該柱頂。細胞與柱在室溫孵育10分鐘。用4等份2ml的1×柱洗滌緩沖液從柱上洗脫T細胞。1000RPM離心收集的T細胞5分鐘。除去上清液，將細胞重懸于10ml RPMI中。計數(shù)細胞并再離心一次。除去上清液，完成T細胞純化。用90％FCS和10％DMSO保存細胞并于-80℃冷凍。
就上述方法而言，RPMI組合物含有10％FCS(56℃滅活45分鐘)、1％Pen/Strep(100u/ml青霉素、0.1μg/ml鏈霉素)、1％谷氨酰胺、1％丙酮酸鈉、50μM 2-ME。
流式細胞術(shù)試驗
將Ramos細胞(106個細胞/樣品)于4℃用100μl一抗(以PBS-BSA配制為10μg/ml)孵育20分鐘。用PBS-BSA或HBSS-BSA洗滌3次后，細胞在4℃用100μl FITC-標記的山羊抗-(人IgG)抗體(Caltaq)的F(ab′)2片段孵育20分鐘。用PBS-BSA洗滌3次和用PBS洗滌1次后，細胞重懸于0.5-ml PBS中。用FACSCAN V(Becton Dickinson，San Jose，California)進行分析。
雜交瘤克隆的產(chǎn)生
如先前de Boer等，(1988)J.Immunol.Meth.113143所述，采用50％聚乙二醇將免疫小鼠的脾細胞與SP 2/0或P 3×63Ag8.653鼠雜交瘤細胞以10∶1的比例融合。將融合的細胞重懸于補加了次黃嘌呤(0.1mM)、氨基喋呤(0.01mM)、胸苷(0.016mM)和0.5ng/ml hIL-6(Genzyme，Cambridge，Massachusetts)的完全IMDM培養(yǎng)基中。然后將融合的細胞分置于96-孔組織培養(yǎng)板的各孔之間，使平均每孔含有1個生長的雜交瘤。
10-14天后，篩選雜交瘤細胞群上清液中產(chǎn)生的特異性抗體。為篩選雜交瘤克隆產(chǎn)生的特異性抗體，合并每孔的上清液并先用ELISA檢測抗-CD40特異性活性。然后將陽性(雜交瘤細胞)用于以上FACS試驗所述EBV-轉(zhuǎn)化B細胞的熒光細胞染色。通過在含有0.5ng/ml hIL-6的IMDM/FBS中有限稀釋克隆陽性雜交瘤細胞兩次。
實施例1產(chǎn)生抗-CD40抗體
產(chǎn)生了幾種IgG1同種型的完全人拮抗性抗-CD40單克隆抗體。利用攜帶人IgG1重鏈基因座和人κ鏈基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠(Abgenix γ-1 XenoMousetechnology(Abgenix；Fremont，California))來產(chǎn)生這些抗體。表達CD40胞外結(jié)構(gòu)域的SF9昆蟲細胞用作免疫原。總共31個小鼠脾(細胞)與小鼠骨髓瘤SP2/0細胞融合得到895種在ELISA中能識別重組CD40的抗體(表1A和1B)。平均約10％的用Abgenix XenoMousetechnology(Abgenix；Fremont，California))產(chǎn)生的雜交瘤細胞可含有小鼠λ輕鏈替代了人κ鏈。選出含有小鼠λ鏈的抗體。選擇也顯示能與細胞表面CD40結(jié)合的260個抗體亞組用于進一步分析。在一系列亞克隆過程中選擇的穩(wěn)定的雜交瘤細胞用于在結(jié)合和功能試驗中作進一步鑒定。
表1A.典型的融合
表1B.4組融合小結(jié)
表2.抗-CD40IgG1抗體的初始數(shù)據(jù)組小結(jié)
7個母雜交瘤的克隆經(jīng)鑒定具有拮抗活性。根據(jù)它們的相對拮抗能力和ADCC活性，選擇了兩個雜交瘤克隆。命名為131.2F8.5.9(5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(12.12)。
7個其它雜交瘤的克隆經(jīng)鑒定具有拮抗活性(上表2)。根據(jù)它們的相對拮抗能力和ADCC活性選擇兩個雜交瘤細胞克隆用于進一步評價。它們命名為131.2F8.5.9(5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(12.12)。這兩種抗體對CD40+淋巴瘤細胞系的結(jié)合特性如圖1中流式細胞術(shù)直方圖所示。
實施例2人抗-CD40抗體的多核苷酸和氨基酸序列
將編碼候選抗體可變區(qū)的cDNA用PCR擴增、克隆和測序。CHIR-12.12抗體輕鏈和重鏈的氨基酸序列分別示于圖9A和9B。也參見SEQ ID NO2(mAbCHIR-12.12的輕鏈)和SEQ ID NO4(mAb CHIR-12.12的重鏈)。mAbCHIR-12.12重鏈的變體示于圖9B(也參見SEQ ID NO5)，其與SEQ ID NO4的區(qū)別在于用絲氨酸殘基取代了SEQ ID NO4的153位丙氨酸殘基。編碼CHIR-12.12抗體輕鏈和重鏈的核苷酸序列分別示于圖10A和10B。也參見SEQID NO1(mAb CHIR-12.12輕鏈的編碼序列)和SEQ ID NO3(mAb CHIR-12.12重鏈的編碼序列)。CHIR-5.9抗體輕鏈和重鏈的氨基酸序列分別示于圖11A和11B。也參見SEQ ID NO6(mAb CHIR-5.9的輕鏈)和SEQ ID NO7(mAbCHIR-5.9的重鏈)。mAb CHIR-5.9重鏈的變體示于圖11B(也參見SEQ IDNO8)，其與SEQ ID NO7的區(qū)別在于用絲氨酸殘基取代SEQ ID NO7的158位丙氨酸殘基。
如預(yù)期的一樣，衍生自獨立雜交瘤的抗體在互補決定區(qū)(CDR)的核苷酸序列中有本質(zhì)差異。據(jù)信，VHCDR3區(qū)中的差異性對決定抗體特異性最重要。
實施例3CHIR-5.9和CHIR-12.12在體外對CD40/CD40L相互作用的影響
候選抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12能阻止CD40配體與細胞表面CD40結(jié)合并取代預(yù)先結(jié)合的CD40配體。測試了抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12阻止CD40配體與淋巴瘤細胞系(Ramos)表面的CD40結(jié)合的能力。流式細胞術(shù)試驗檢測到兩種抗體(未標記的)的結(jié)合阻止了隨后PE-CD40配體的結(jié)合(圖2A)。第二組試驗測試了該兩種抗體取代預(yù)先已與細胞表面CD40結(jié)合的CD40配體的能力。這兩種抗體均有效地競爭除去了預(yù)先結(jié)合的CD40配體，其中CHIR-5.9略微比CHIR-12.12更有效(圖2B)。
實施例4與15B8相比，CHIR-5.9和CHIR-12.12結(jié)合CD40上的不同表位
候選單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12互相競爭與CD40結(jié)合，但不與15B8，一種IgG2抗-CD40mAb(參見國際公布號WO 02/28904)競爭。利用CM5生物傳感器芯片設(shè)計了使用Biacore的抗體競爭結(jié)合研究，所述芯片具有經(jīng)胺偶聯(lián)固定的蛋白質(zhì)A用于捕捉抗-CD40的CHIR-12.12或15B8。用不同濃度的CD40-his觀察到正常的締合/解離結(jié)合曲線(數(shù)據(jù)未顯示)。就競爭研究而言，CHIR-12.12或15B8均被捕捉在蛋白質(zhì)A表面。然后使不同濃度的CD40-his/CHIR-5.9Fab復(fù)合物(100nM CD40∶1μM CHIR-5.9Fab)流過該修飾的表面。就CHIR-12.12而言，未觀察到復(fù)合物的締合，表明CHIR-5.9阻斷了CHIR-12.12與CD40-his的結(jié)合。就15B8而言，觀察到Fab CHIR-5.9復(fù)合物的締合，表明CHIR-5.9不阻斷15B8與CD40結(jié)合位點的結(jié)合。然而，該復(fù)合物的洗脫速率(off rate)顯著增加(數(shù)據(jù)未顯示)。
也確定證實了15B8和CHIR-12.12不競爭與CD40-his結(jié)合。該實驗通過以下步驟建立將CHIR-12.12捕捉在蛋白質(zhì)A生物傳感器芯片上、用對照的hIgG1封閉殘留的蛋白質(zhì)A位點、結(jié)合CD40-his然后使15B8流過該修飾的表面。15B8在這些條件下確實能結(jié)合，表明CHIR-12.12不阻斷15B8與CD40結(jié)合。
實施例5選擇的雜交瘤的結(jié)合特性
將蛋白質(zhì)A經(jīng)胺偶聯(lián)固定于CM5生物傳感器芯片上。使1.5μg/ml的人抗-CD40單克隆抗體在1.5分鐘內(nèi)以10μl/分鐘(流過)捕捉在修飾的生物傳感器表面上。不同濃度的重組可溶CD40-his流過該生物傳感器表面。用0.01M HEPESpH 7.4、0.15 M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性劑P20(HBS-EP)稀釋抗體和抗原。使用Biaevaluation軟件以1∶1相互作用模型/球形擬合(global fit)測定動力學(xué)和親和力常數(shù)。
如下表3所示，CHIR-5.9和CHIR-12.12的洗脫速率有121倍差異，這導(dǎo)致CHIR-12.12的親和力高24倍。
實施例6CHIR-5.9和CHIR-12.12是CD40介導(dǎo)的正常對象的人淋巴細胞增殖的強拮抗劑
CD40與CD40配體結(jié)合可誘導(dǎo)人B細胞增殖。預(yù)計拮抗性抗-CD40抗體可抑制這種增殖。測試了兩種候選抗體(CHIR-5.9和CHIR-12.12)抑制CD40配體誘導(dǎo)的正常人對象的PBMC增殖的能力。表達CD40配體(CD40L)的甲醛固定的CHO細胞轉(zhuǎn)染子用作CD40配體來源的。人PBMC與甲醛固定的表達CD40-配體的CHO細胞在存在各種濃度的抗-CD40 mAb CHIR-5.9或CHIR-12.12時培養(yǎng)4天。通過氚化胸苷摻入法檢測增殖。在37℃用氚標記的胸苷脈沖細胞14-18小時。
發(fā)現(xiàn)這兩種抗體均非常有效地抑制了CD40配體誘導(dǎo)的人PBMC增殖(表4A，mAb CHIR-5.9；表4B，mAb CHIR-12.12)。該實驗用多位獻血者的PBMC(CHIR-5.9為n＝12，CHIR-12.12為n＝2)進行以保證觀察到的抑制不是某一供體細胞特有的。繼續(xù)用4位其他獻血者的PBMC評價觀察到類似趨勢的mAb CHIR-12.12。這些試驗采用寬范圍的抗體濃度(0.01μg/ml-100μg/ml)。在大多數(shù)情況中，抗體濃度為0.1μg/ml時幾乎可完全抑制CD40配體誘導(dǎo)的增殖。就6位獻血者的淋巴細胞而言，抑制50％CD-40配體誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖(IC50)的抗體濃度(pM)得到的平均IC50(pM)為47(SD＝21；獻血者1、24；獻血者2、66；獻血者3、45；獻血者4、84；獻血者5、30；獻血者6、35)，該值不亞于表4B所示49.65的平均IC50(pM)。根據(jù)當前的數(shù)據(jù)組，這兩種候選抗體抑制CD40配體誘導(dǎo)正常PBMC增殖的能力相似。
表4A.mAb CHIR-5.9對CD40L-誘導(dǎo)PBMC增殖的作用
表4A.mAb CHIR-5.9對CD40L-誘導(dǎo)PBMC增殖的作用(續(xù))
抑制％100-(只有Abs-PBMC的CPM-(只有CHO-CD40L)/(只有PBMC+CHO-CD40L-PBMC的CPM-(只有CHO-CD40L))×100％
表4B.mAb CHIR-12.12對CD40L誘導(dǎo)的PBMC增殖的作用
抑制％100-(只有Abs-PBMC的CPM-(只有CHO-CD40L)/(只有PBMC+CHO-CD40L-只有PBMC的CPM)-(只有CHO-CD40L))×100％
除B細胞外，人PBMC中也含有能介導(dǎo)抗體依賴的細胞毒性(ADCC)的天然殺傷細胞。為闡明抗體介導(dǎo)的增殖抑制機理，用從人PBMC純化的B細胞進行了試驗。與用PBMC獲得的結(jié)果相似，這兩種抗體均強烈抑制CD40配體誘導(dǎo)的純化B細胞增殖(表5，n＝3)。這些數(shù)據(jù)表明在這些試驗中增殖抑制的原因是候選抗體的拮抗活性所致，而非ADCC機理。
表5.抗-CD40抗體對CD40配體誘導(dǎo)的純化人B細胞增殖的作用
抑制％100-(只有Abs-B細胞的CPM-(只有CHO-CD40L)/(只有CHO-CD40L和B細胞的CPM-只有B細胞-只有CHO-CD40L)×100％
實施例7CHIR-5.9和CHIR-12.12不誘導(dǎo)正常對象的人B細胞強增殖
CD40配體激活正常B細胞和B細胞性淋巴瘤細胞增殖。一些抗-CD40抗體(激動劑)的結(jié)合可提供引起正常和癌癥B細胞增殖的類似刺激信號。具有強B細胞刺激活性的抗體不適合作為治療B細胞性淋巴瘤的候選藥物。測試了該兩種候選抗體誘導(dǎo)正常志愿獻血者的B細胞增殖的能力。將Ficoll-Hypaque加梯度離心從正常獻血者PBMC獲得的純化B細胞與不同濃度(0.001-100μg/ml)的候選抗體培養(yǎng)于96-孔板中，共4天。在陽性對照組中，PBMC與表達CD40配體的甲醛固定的CHO細胞一起培養(yǎng)。通過37℃摻入氚標記的胸苷14-18小時來檢測B細胞增殖。雖然CHO細胞上的CD40配體誘導(dǎo)了B細胞強烈增殖，導(dǎo)致平均刺激指數(shù)(SI)為145，但候選抗體只誘導(dǎo)了微弱的增殖，CHIR-12.12和CHIR-5.9的刺激指數(shù)(n＝3)分別為2.89和5.08(表6)。
表6.純化的正常人對象的B細胞對候選抗-CD40mAbs的增殖反應(yīng)
刺激.指數(shù)(1)＝CPM(B細胞
+CHO-CD40L)/CPM(僅有B細胞)
刺激.指數(shù)(2)＝CPM(B細胞+Abs)/CPM(僅有
PBMC)
除B細胞外，人PBMC含有攜帶IgG1分子的Fc受體(FcR)的細胞類型，該受體可提供抗-CD40抗體交聯(lián)結(jié)合于B細胞上的CD40。這種交聯(lián)抗可能提高抗-CD40抗體的刺激活性。為證實CHIR-5.0和CHIR-12.12抗體在存在交聯(lián)細胞時缺乏B細胞刺激活性，用含有B細胞以及FcR+細胞的總PBMC進行了增殖實驗。這些實驗的數(shù)據(jù)(表7A，mAb CHIR-5.9；表7B，mAb CHIR-12.12)證實了這些候選抗體即使在存在攜帶FcR的細胞時一般不能刺激B細胞增殖超過對照的人IgG1誘導(dǎo)的背景增殖(n＝10)。CD40配體誘導(dǎo)的平均刺激指數(shù)(SI)SI為7.41。候選抗體CHIR-12.12和CHIR-5.9的平均SI分別為0.55和1.05。測試的10位獻血者的PBMC中只有一位對CHIR-5.9抗體顯示一些刺激性反應(yīng)(表7中的獻血者#2)。通過測定PBMC對固定在塑料上的候選抗-CD40抗體的增殖反應(yīng)進一步證實了候選mAb缺乏刺激活性。
表7A.正常人對象的PBMC對mAb CHIR-5.9的增殖反應(yīng).
指數(shù)(1)＝(PBMC+CHO-CD40L)/PBMC
指數(shù)(2)＝(PBMC+Abs)/PBMC
表7B.正常人對象的PBMC對mAb CHIR-12.12的增殖反應(yīng)
指數(shù)(1)＝(PBMC+CHO-CD40L)的
CPM/PBMC的CPM
指數(shù)(2)＝(PBMC+Abs)的
CPM/PBMC的CPM
培養(yǎng)孔的表面(n＝2)。CD40配體、CHIR-12.12和CHIR-5.9刺激的平均SI分別為22、0.67和1.2(表8)。綜合這些數(shù)據(jù)顯示候選抗-CD40抗體不具有強的B細胞刺激性能。
表8.正常人對象的PBMC對固定的抗-CD40抗體的增殖反應(yīng)
S.指數(shù)(1)＝CPM
(PBMC+CHO-CD40L)/CPM(PBMC)
S.指數(shù)(2)＝CPM(PBMC+mAb)/CPM
(PBMC)
實施例8CHIR-5.9和CHIR-12.12能通過ADCC殺傷攜帶CD40的靶細胞
這些候選抗體能通過ADCC機理殺傷攜帶CD40的靶細胞(淋巴瘤細胞系)。CHIR-5.9和CHIR-12.12均是IgG1同種型完全人抗體，希望它們能通過ADCC機理誘導(dǎo)殺傷靶細胞。在體外試驗中測試了它們殺傷癌癥細胞系的能力。選擇兩種人淋巴瘤細胞系(Ramos和Daudi)作為這些試驗的靶細胞。在這些試驗中，8位正常志愿獻血者的PBMC或富集的NK細胞用作效應(yīng)細胞。與CHIR-5.9相比，用CHIR-12.12觀察到更強的抗淋巴瘤癌癥細胞系靶細胞的ADCC應(yīng)答。淋巴瘤細胞系也表達作為利妥昔單抗(Rituxan)靶抗原的CD20，從而可比較這兩種候選mAb的ADCC活性與利妥昔單抗的ADCC活性。就淋巴瘤細胞系靶而言，當采用1μg/ml濃度的CHIR-5.9、CHIR-12.12和利妥昔單抗時，觀察到的平均特異性細胞裂解率分別為35％、59％和47％(表9)。該兩種抗體在依賴補體的細胞毒性(CDC)試驗中未顯示高活性。
表9.抗-CD40mAb通過ADCC依賴的淋巴瘤細胞系殺傷作用
實施例9CD40存在于患者的淋巴結(jié)活檢NHL細胞的表面
從患者的活檢淋巴結(jié)分離得到NHL細胞保存于液氮待用。分析時的細胞活力超過90％。將兩位利妥昔單抗敏感和三位利妥昔單抗耐受患者(總共五位患者)的細胞用直接標記的15B8-FITC或15B8加上抗-huIgG2-FITC染色作流式細胞術(shù)分析。所有患者的NHL細胞均發(fā)現(xiàn)表達CD40。表10顯示平均76％的NHL細胞表達CD40(范圍是60-91％)。
表10.
平均陽性％ 76
a用抗-CD20 mAb治療的NHL患者
b患者對抗-CD20 mAb的應(yīng)答；CR＝完全應(yīng)答者；NR＝無應(yīng)答者
c淋巴細胞門控(gate)的陽性染色細胞％
dMS81，激動性抗-CD40 mAb
e15B8，拮抗性抗-CD40 Mab
fn.d.，未進行
實施例10CHIR-5.9和CHIR-12.12不刺激NHL患者淋巴結(jié)的癌細胞增殖
已知CD40配體可提供NHL患者淋巴瘤細胞存活和增殖的刺激信號。一些抗-CD40抗體(激動劑)的結(jié)合能提供患者癌細胞增殖的類似刺激信號。具有強的B細胞刺激活性的抗體不是治療B細胞性淋巴瘤的合適候選抗體。測試了該兩種候選抗體誘導(dǎo)三位患者NHL細胞增殖的能力。將自淋巴結(jié)(LN)活檢分離的細胞與不同濃度(0.01-300μg/ml)的候選抗體共培養(yǎng)3天。通過摻入氚化胸苷來檢測細胞增殖。兩種候選mAb在任何測試濃度時均不誘導(dǎo)癌細胞增殖(表11)。這兩種抗體即使在有外源加入的IL-4(一種B細胞生長因子)時也不誘導(dǎo)NHL細胞增殖(在3位患者的細胞之一中測試)。這些結(jié)果表明CHIR-12.12和CHIR-5.9不是激動性抗-CD40抗體，在體外不刺激患者的NHL細胞增殖。
表11.NHL患者淋巴結(jié)的癌細胞對候選抗-CD40mAb的增殖反應(yīng)
實施例11CHIR-5.9和CHIR-12.12能阻斷CD40配體介導(dǎo)的非何杰金淋巴瘤患者的癌細胞增殖
CD40與CD40配體結(jié)合可誘導(dǎo)NHL患者的癌細胞增殖。希望拮抗性抗-CD40抗體可抑制這種增殖。測試了不同濃度(0.01μg/ml-100μg/ml)的兩種候選抗-CD40抗體抑制CD40配體誘導(dǎo)的患者NHL細胞增殖的能力?；颊叩腘HL細胞在存在IL-4時培養(yǎng)在過量表達CD40的飼養(yǎng)細胞懸液中。通過3H-胸苷摻入檢測NHL細胞增殖。發(fā)現(xiàn)兩種抗體均非常有效地抑制CD40配體誘導(dǎo)的NHL細胞增殖(表12，n＝2)?？贵w在1.0-10μg/ml濃度時幾乎完全抑制了CD40配體誘導(dǎo)的增殖。
表12.抑制CD40配體誘導(dǎo)的NHL患者淋巴結(jié)的癌細胞增殖
抑制％100-(測試Abs的CPMs/對照mAb的CPM)×100％
實施例12CHIR-5.9與攜帶CD40配體的細胞一起培養(yǎng)時對活的NHL細胞數(shù)的作用
檢測了CHIR-5.9與攜帶CD40配體的細胞一起培養(yǎng)長時期后(7天、10天和14天)對活的NHL細胞數(shù)的作用。CD40配體通過CD40介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對B細胞存活很重要。該組實驗評估了抗-CD40抗體在7、10和14天對NHL細胞數(shù)的作用。5位患者的NHL細胞在存在IL-4時培養(yǎng)在超量表達CD40L的經(jīng)輻射的飼養(yǎng)細胞的懸液中。第0和第7天加入10μg/ml濃度的對照人IgG和CHIR-5.9抗體。在指定的那天計數(shù)各種條件下的活細胞數(shù)。對照組(IgG)的細胞數(shù)如預(yù)期一樣隨時間增加。與對照組相比，從CHIR05.9處理的培養(yǎng)物中回收的細胞數(shù)減少。與同種型對照(n＝5)相比，第14天觀察到CHIR-5.9使細胞數(shù)減少的水平最大，平均為80.5％(范圍是49-94％)。這些數(shù)據(jù)小結(jié)于表13。
表13.抗-CD40抗體(CHIR-5.9/5.11)在長培養(yǎng)期間(7、10和14天)對NHL患者細胞數(shù)的作用
*與對照Abs相比減少％＝100-(測試Abs/對照Abs)×100
實施例13CHIR-5.9和CHIR-12.12能通過ADCC殺傷NHL患者的淋巴結(jié)的癌細胞
CHIR-5.9和CHIR-12.12均是IgG1同種型的完全人抗體并顯示能通過ADCC機理在體外殺傷淋巴瘤細胞系(表9)。在體外試驗中測試了它們殺傷一位NHL患者癌細胞的能力。將分離后新鮮的或37℃培養(yǎng)過夜的正常志愿獻血者的富集NK細胞在該試驗中用作效應(yīng)細胞。用新鮮分離的NK細胞或用培養(yǎng)過夜的NK細胞均得到類似結(jié)果。與CHIR-5.9相比，用CHIR-12.12觀察到抗患者NHL細胞的ADCC水平更高。NHL細胞也表達作為利妥昔單抗(Rituxan)靶抗原的CD20，從而可比較這兩種候選mAb與利妥昔單抗的ADCC活性。在該試驗中，抗體CHIR-12.12和利妥昔單抗顯示類似的ADCC活性水平，CHIR-5.9評分較低。這些數(shù)據(jù)示于圖3A和3B。
實施例14CHIR-5.9和CHIR-12.12能阻斷CD40介導(dǎo)的CLL患者癌細胞的存活和增殖
該候選抗體可阻斷CD40介導(dǎo)的CLL患者癌細胞的存活和增殖。患者的CLL細胞在兩種條件下在過量表達CD40L的甲醛固定CHO細胞懸液中培養(yǎng)加入人同種型抗體IgG(對照)；和加入CHIR-5.9或CHIR-12.12單克隆抗體。所有抗體在無IL-4時以濃度1、10和100μg/mL加入。在24和48小時通過MTS試驗進行細胞計數(shù)。與對照組相比，從CHIR-5.9-(n＝6)和CHIR-12.12-(n＝2)處理的培養(yǎng)物中回收的細胞數(shù)減少。在48小時時間點觀察到抗-CD40mAb處理的和對照抗體處理的培養(yǎng)物之間細胞數(shù)差異較大。這些數(shù)據(jù)小結(jié)于表14。
表14.培養(yǎng)開始48小時后檢測候選抗體對CD40誘導(dǎo)的CLL患者癌細胞存活和增殖的作用
*與對照Abs相比的減少％＝100-(測試Abs/對照Abs)×100
實施例15CHIR-5.9和CHIR-12.12在動物模型中顯示抗腫瘤活性藥理學(xué)/體內(nèi)效力
希望候選mAb可通過兩種抗腫瘤機理(或其中之一)、阻斷增殖/存活信號和誘導(dǎo)ADCC而產(chǎn)生降低腫瘤負荷所需的藥理作用。當前可利用的人淋巴瘤異種移植模型采用長期淋巴瘤細胞系，該細胞系與原發(fā)性癌細胞相反，其生長和存活不依賴于CD40刺激。因此，根據(jù)阻斷腫瘤增殖/存活信號的這些mAb的抗腫瘤活性預(yù)計在這些模型中不會促進抗腫瘤效力。這些模型中的效力依賴ADCC，與CHIR-5.9和CHIR-12.12mAb相關(guān)的第二種抗腫瘤機理?；贜amalwa和Daudi細胞系的兩種異種移植人淋巴瘤模型評估了候選mAb的抗腫瘤活性。為進一步證明它們的治療活性，在基于Daudi細胞系的不分階段和分階段異種移植人淋巴瘤模型中評估了這些候選mAb。
體內(nèi)效力數(shù)據(jù)總結(jié)
當CHIR-12.12，兩種候選mAb之一每周腹膜內(nèi)(i.p.)給藥一次，總共三次劑量時，其以劑量依賴方式顯著抑制了侵襲性不分階段B細胞性淋巴瘤(Namalwa)的生長(圖4)。第二種候選mAb，CHIR-5.9在該項研究中僅測試了一種劑量，其效力低于相同劑量的CHIR-12.12。有趣的是，發(fā)現(xiàn)CHIR-12.12在該模型中比利妥昔單抗更有效?？赡苁且驗镹amalwa淋巴瘤細胞系CD20表達低導(dǎo)致利妥昔單抗效力低。因為兩種癌細胞殺傷機理中僅有一種(ADCC)在當前異種移植淋巴瘤模型中有效，用候選mAb觀察到的效力具有更重要的意義。希望兩種殺傷機理，即ADCC和阻斷存活信號，有助于人淋巴瘤患者的抗腫瘤活性。這可能增加其在人淋巴瘤患者中實現(xiàn)效力的機會。候選抗-CD40mAb在第二種B細胞淋巴瘤模型(非確認的Daudi模型，數(shù)據(jù)未顯示)中也顯示抑制腫瘤生長的趨勢。在隨后的研究中，這兩種候選抗體在不分階段和分階段Daudi淋巴瘤模型中均顯示劑量依賴的抗腫瘤效力(分別見圖5和圖6)。在分階段Daudi模型中，CHIR-12.12mAb比相似劑量的Rituxan更有效地減小了腫瘤體積。
異種移植人B細胞淋巴瘤模型
為保證腫瘤持續(xù)生長，在腫瘤接種之前以3Gy全身照射T細胞缺乏裸鼠以進一步抑制免疫系統(tǒng)。每只小鼠在右腹側(cè)接種5×106個腫瘤細胞?？稍谀[瘤植入后一天開始治療(不分階段的皮下異種移植人B細胞淋巴瘤模型，Namalwa和Daudi)，或者當腫瘤體積達到200-400mm3時開始治療(分階段的Daudi模型，通常在腫瘤接種后15天)。荷瘤小鼠以所示劑量腹膜內(nèi)(i.p.)每周注射一次抗-CD40mAb。腫瘤體積每周記錄兩次。當任一組的腫瘤體積達到2500mm3時，結(jié)束研究。注意在分階段Daudi模型中，腫瘤體積數(shù)據(jù)分析至第36天，因為在該天后一些小鼠死亡。計數(shù)完全消退(CR)直至研究結(jié)束。用ANOVA或Kruskal-Wallis檢驗和對應(yīng)的多組比較的后檢驗(post-test)分析數(shù)據(jù)。
在不分階段的Namalwa模型中，抗-CD40 mAb CHIR-12.12，而非Rituxan(利妥昔單抗)顯著(p＝＜0.01)抑制了Namalwa腫瘤生長(腫瘤體積減少為60％，利妥昔單抗減少為的25％，每組n＝10只小鼠)(圖4)。因此，在該模型中，抗-CD40 mAb CHIR-12.12比利妥昔單抗更有效。值得注意的是，第二候選mAb，CHIR-5.9在利妥昔單抗劑量的1/10時至少與它一樣有效?？?CD40 mAbCHIR-12.12和rituxan顯著阻止了不分階段Daudi腫瘤模型的腫瘤生長(對腫瘤攻擊14/15有抵抗力)(圖5)。
將這些抗-CD40單克隆抗體在分階段的異種移植Daudi模型中作進一步比較，在皮下腫瘤可觸知時開始治療，1mg/kg的抗-CD40 mAb CHIR-12.12導(dǎo)致腫瘤顯著縮小(p＝0.03)，60％完全消退(6/10)，而相同劑量的利妥昔單抗既不能明顯抑制腫瘤生長也不能導(dǎo)致完全消退(0/10)。見圖6。
總之，抗-CD40 mAb CHIR-12.12顯著抑制了實驗性淋巴瘤模型的腫瘤生長。mAb CHIR-12.12比相同劑量和用法的Rituxan(利妥昔單抗)顯示更好的抗癌癥活性。此外，此劑量和用法沒有觀察到臨床毒性征兆。這些數(shù)據(jù)提示抗-CD40 mAb CHIR-12.12在體外和異種移植模型中具有有效的抗人淋巴瘤活性，可能在臨床上有效地治療淋巴瘤。
實施例16CHIR-5.9和CHIR-12.12的藥代動力學(xué)
經(jīng)單劑量IV和IP給藥后，研究了抗-CD40 mAb在小鼠中的藥代動力學(xué)。IP給藥后抗-CD40 mAb顯示高的全身性生物利用度和延長的最終半衰期(＞5天)(數(shù)據(jù)未顯示)。進行此項前導(dǎo)性研究有助于藥理學(xué)研究的設(shè)計；然而，由于該完全的人mAb不與小鼠CD40起交叉反應(yīng)，此項研究對該mAb的活性開發(fā)意義不大。
實施例17分析鑒定單克隆抗體CHIR-12.12和CHIR-5.9的表位
為確定單克隆抗體CHIR-12.12和CHIR-5.9所識別的CD40上表位的位置，進行了SDS-PAGE和Western印跡分析。在還原性和非還原性條件下在4-12％NUPAGE凝膠上分離純化的CD40(0.5μg)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上并用10μg/ml濃度的單克隆抗體檢測。印跡以堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗-人IgG檢測并用堿性磷酸酶的Western BlueR穩(wěn)定底物(Promega)顯色。
結(jié)果表明抗-CD40單克隆抗體CHIR-12.12識別非還原和還原形式CD40上的表位，非還原形式的CD40顯示強度大于還原形式的CD40(表15；印跡未顯示)。對兩種形式的CD40識別均為陽性表明該抗體可與部分是線形序列的構(gòu)象表位相互作用。單克隆抗體CHIR-5.9主要識別非還原形式的CD40，提示該抗體主要與構(gòu)象表位相互作用(表15；印跡未顯示)。
表15.結(jié)構(gòu)域鑒定
為勘察CD40上的抗原性區(qū)域，克隆了CD40的4個胞外結(jié)構(gòu)域，并在昆蟲細胞中表達為GST融合蛋白。GP67分泌信號肽保證該四個結(jié)構(gòu)域的分泌。昆蟲細胞上清液經(jīng)SDS-PAGE和Western印跡分析鑒定到含有該表位的結(jié)構(gòu)域。
單克隆抗體CHIR-12.12在還原性和非還原性條件下識別結(jié)構(gòu)域2上的表位(表16；印跡未顯示)。相反，單克隆抗體CHIR-5.9顯示對結(jié)構(gòu)域2的識別非常微弱(表16；印跡未顯示)。在該項分析中，這兩種抗體均不識別結(jié)構(gòu)域1、3或4。
表16.結(jié)構(gòu)域2分析
為更精確地確定mAb CHIR-12.12所識別的表位，合成了對應(yīng)于以下序列的CD40胞外結(jié)構(gòu)域2的肽PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICT(SEQ IDNO10或SEQ ID NO12所示序列的殘基61-104)。制備了含有35個10mer肽和1-氨基酸旁支(offset)的SPOT膜(Sigma)。用mAb CHIR-12.12和抗-人IgGβ-半乳糖苷酶作為二抗進行了Western印跡分析。切下印跡條用mAb CHIR-5.9再檢測以確定該抗體所識別的區(qū)域。
用10μg/ml的抗-CD40單克隆抗體CHIR-12.12檢測作SPOT分析與點18-22得到陽性反應(yīng)。這些肽覆蓋的序列區(qū)域示于表5。
表17.用抗-CD40單克隆抗體CHIR-12.12檢測的SPOT分析的結(jié)果
這些結(jié)果對應(yīng)于線形表位YCDPNL(SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示序列的殘基82-87)。該表位含有預(yù)計涉及CD40-CD40配體相互作用的Y82、D84和N86。
用mAb CHIR-5.9作SPOT分析顯示對表18中斑點20-22代表的肽識別弱，提示區(qū)域YCDPNLGL(SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示序列的殘基82-89)涉及mAb CHIR-5.9與CD40的結(jié)合。應(yīng)注意在BIACORE分析中mAbCHIR-12.12和CHIR-5.9相互競爭與CD40結(jié)合。
表18.用抗-CD40單克隆抗體CHIR-5.9檢測作SPOT分析的結(jié)果
SPOT分析鑒定到的線性表位位于CD40 B1模塊中。CD40 B1模塊的序列是HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC(SEQ ID NO10或12的殘基80-103)。
CHIR-12.12在該線性表位中鑒定的是C83。已知該半胱氨酸殘基與C103形成二硫鍵。CHIR-12.12mAb的構(gòu)象表位可能含有該二硫鍵(C83-C103)和/或含有構(gòu)象上接近C103的環(huán)繞氨基酸。
實施例18Namalwa和Daudi細胞上CD20和CD40分子的數(shù)量
用濃度為0.01、0.1、1、10和100μg/ml的抗體測定了圖7所示Namalwa和Daudi細胞上的CD20和CD40分子數(shù)量。如圖7所示，Namalwa和Daudi細胞系上的CD20分子(利妥昔單抗的靶)數(shù)量均多于CD40分子(mAbCHIR-12.12的靶)數(shù)量。
實施例19mAb CHIR-12.12和利妥昔單抗抗Daudi淋巴瘤細胞的ADCC
體外測試了各種濃度的利妥昔單抗和候選mAb CHIR-12.12對作為靶(T)細胞的淋巴瘤細胞系Daudi和作為效應(yīng)(E)細胞的健康人志愿者的純化NK細胞的ADCC活性。將新鮮分離的人NK細胞與鈣黃綠素標記的Daudi淋巴瘤細胞以E∶T之比為10相混合。將細胞混合物在37℃在存在所述濃度的mAbCHIR-12.12或利妥昔單抗時孵育4小時。上清液中靶細胞裂解釋放的鈣黃綠素水平測定為專斷的熒光單位(AFU)。計算特異性裂解百分比為100×(AFU測定值-AFU自發(fā)釋放)/(AFU最大釋放-AFU自發(fā)釋放)，其中AFU自發(fā)釋放是在不存在抗體或NK細胞時靶細胞釋放的非鈣黃綠素。AFU最大釋放是洗滌劑裂解靶細胞所釋放的鈣黃綠素。
觀察到了抗體濃度依賴性Daudi細胞裂解(圖8；下表19)?？?CD40 mAb誘導(dǎo)的靶淋巴瘤細胞的最大特異性裂解高于利妥昔單抗誘導(dǎo)的裂解(63.6％對45.9％，n＝6；mAb CHIR-12.12對利妥昔單抗的配對t檢驗，p＝0.0002)。此外，利妥昔單抗活性的平均ED50(n＝6)為51.6pM，比抗-CD40mAb CHIR-12.12的高13倍。
表19.mAb CHIR-12.12和利妥昔單抗對Daudi淋巴瘤細胞的ADCC比較
實施例20CHIR-12.12阻斷正常人B細胞中CD40L-介導(dǎo)的CD40存活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
可溶性CD40配體(CD40L)能激活B細胞誘導(dǎo)各種功能性應(yīng)答，包括提高存活和增殖，激活NFκB、ERK/MAPK、PI3K/Akt，和p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。此外，CD40L-介導(dǎo)的CD40刺激通過減少正常B細胞中切割的PARP和誘導(dǎo)抗凋亡蛋白、XIAP和Mcl-1提供存活信號。CD40L-介導(dǎo)的CD40刺激也募集TRAF2和TRAF3結(jié)合CD40胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
以下研究證明CHIR-12.12能直接抑制對正常B細胞的所有這些作用。例如，CHIR-12.12處理以時間和劑量依賴方式導(dǎo)致胱冬酶-9、胱冬酶-3和PARP切割增加以及XIAP和Mcl-1減少，恢復(fù)B細胞凋亡。用CHIR-12.12處理在對CD40L-介導(dǎo)的CD40刺激的反應(yīng)中也抑制IκB激酶(IKK)α和β(NFκB途徑)、ERK、Akt和p38的磷酸化。此外，發(fā)現(xiàn)沒有最初的CD40L-介導(dǎo)的CD40刺激時，CHIR-12.12不激發(fā)這些凋亡作用。
CHIR-12.12通過誘導(dǎo)PARP切割抑制CD40配體介導(dǎo)的存活
在這些實驗中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)。然后加入CHIR-12.12(10μg/ml)和對照IgG。于0、20分鐘、2小時、6小時、18小時和26小時收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中切割的胱冬酶-9、切割的胱冬酶-3、切割的PARP和β肌動蛋白對照。
簡言之，觀察到CD40L-介導(dǎo)的CD40刺激提供了存活信號，因為未導(dǎo)致胱冬酶-9、切割的胱冬酶-3或切割的PARP隨時間而增加，表明細胞未經(jīng)歷凋亡。然而，用CHIR-12.12處理導(dǎo)致這些切割產(chǎn)物增加，表明CHIR-12.12處理消除了CD40L結(jié)合對sCD40L-刺激的正常B細胞中存活信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，恢復(fù)了B細胞凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。
CHIR-12.12抑制“存活”性抗凋亡蛋白的表達
在這些實驗中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)。然后加入CHIR-12.12(10μg/ml)和對照IgG。于0、20分鐘、2小時、6小時、18小時和26小時收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中Mcl-1、XIAP、CD40和β肌動蛋白對照。
簡言之，sCD40L刺激導(dǎo)致Mcl-1和XIAP隨時間而持續(xù)表達。然而，用CHIR-12.12處理sCD40L-刺激的細胞導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)隨時間表達減少(數(shù)據(jù)未顯示)。由于Mcl-1和XIAP是能阻斷凋亡途徑的“存活”信號，這些結(jié)果證明CHIR-12.12處理消除了sCD40L-刺激的正常B細胞中凋亡的阻斷。
CHIR-12.12處理抑制了正常B細胞中IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser 181)的磷酸化
在這些實驗中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激1.0×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)。然后加入CHIR-12.12(10μg/ml)和對照IgG。于0和20分鐘收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中磷酸化的IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser 181)與總的IKKβ對照。
簡言之，sCD40L刺激導(dǎo)致IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser 181)隨時間而磷酸化；然而，用CHIR-12.12處理消除了正常B細胞對sCD40L-刺激的此應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示)。
CHIR-12.12處理以劑量依賴方式抑制CD40配體介導(dǎo)的存活
在這些實驗中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)。然后加入CHIR-12.12(0.01、0.1、0.2、0.5、1.0μg/ml)和對照IgG。24小時后收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中切割的PARP和β肌動蛋白對照。
簡言之，CHIR-12.12處理以劑量依賴方式導(dǎo)致sCD40L-刺激的細胞中PARP切割增加，因此消除了sCD40L-刺激的正常B細胞中的存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(數(shù)據(jù)未顯示)。
CHIR-12.12以劑量依賴方式抑制“存活”性抗-凋亡蛋白的表達
在這些實驗中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)。然后加入CHIR-12.12(0.5、2和10μg/ml)和對照IgG。22小時后收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中Mcl-1、XIAP、切割的PARP和β肌動蛋白對照。
簡言之，CHIR-12.12處理以劑量依賴方式減少了sCD40L-刺激細胞中的Mcl-1和XIAP表達并增加了切割的PARP表達，因此消除了對sCD40L-刺激的正常B細胞中凋亡途徑的阻斷(數(shù)據(jù)未顯示)。
在不存在可溶性CD40L信號時，CHIR-12.12不影響抗-凋亡蛋白、切割的PARP和XIAP的表達
在這些實驗中，僅用CHIR-12.12(10μg/ml)和對照IgG(即，在加入抗體之前，細胞未用sCD40L預(yù)刺激)處理1.0×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)。于0、4、14和16小時收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中XIAP、切割的PARP和β-肌動蛋白對照。
簡言之，這些結(jié)果顯示無sCD40L刺激時，IgG處理的對照細胞和CHIR-12.12處理的細胞中，細胞表達的切割的PARP濃度增加，而XIAP表達維持恒定(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明，沒有CD40L刺激時，CHIR-12.12不激發(fā)正常人B細胞凋亡。
CHIR-12.12抑制正常B細胞中IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser181)、Akt、ERK和p38的磷酸化
在這些實驗中，1.0×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)在含有1％FBS的培養(yǎng)基中血清饑餓(serum starve)并用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激。細胞用CHIR-12.12(1和10μg/ml)和對照IgG處理培養(yǎng)物。于0和20分鐘收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中磷酸-IKKα、磷酸-IKKβ、總的IKKβ、磷酸-ERK、總的ERK、磷酸-Akt、總的Akt、磷酸-p38和總的p38。
簡言之，sCD40L刺激導(dǎo)致IKKα/β磷酸化、ERK磷酸化、Akt磷酸化和p38磷酸化增加，導(dǎo)致細胞的存活和增殖。用CHIR-12.12處理細胞消除了正常B細胞中sCD40L-刺激對這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用(數(shù)據(jù)未顯示)。
CHIR-12.12抑制多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，例如CD40信號級聯(lián)反應(yīng)中的PI3K和MEK/ERK
在這些實驗中，1.0×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)在含有1％FBS的培養(yǎng)基中血清饑餓并用1μg/ml sCD40L(AlexisCorp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激。培養(yǎng)物也用CHIR-12.12(1和10μg/ml)、Wortmanin(一種PI3K/Akt抑制劑；1和10μM)、LY 294002(一種PI3K/Akt抑制劑；10和30μM)和PD 98095(一種MEK抑制劑；10和30μg/ml)處理。于0和20分鐘收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中磷酸-ERK、磷酸-Akt、總的Akt、磷酸-IKKα/β和各自總含量。
簡言之，這些結(jié)果顯示CHIR-12.12消除了所有這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的磷酸化，而信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑顯示只特異性消除信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，表明CHIR-12.12可能抑制CD40L刺激介導(dǎo)的這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的上游途徑(數(shù)據(jù)未顯示)。
CHIR-12.12抑制正常B細胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子TRAF2和TRAF3與CD40胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合
在這些實驗中，4.0×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)在含有1％FBS的培養(yǎng)基中血清饑餓并用1μg/ml sCD40L(AlexisCorp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激20分鐘。于0和20分鐘收集細胞。用多克隆抗-CD40(Santa Cruz Biotechnology，CA)免疫沉淀CD40，在Western印跡中用抗-TRAF2 mAb(Santa Cruz Biotechnology，CA)、抗-TRAF3 mAb(SantaCruz Biotechnology，CA)和抗-CD40 mAb(Santa Cruz Biotechnology，CA)檢測。
簡言之，這些結(jié)果顯示sCD40L刺激后TRAF2和TRAF3與CD40共同沉淀。相反，用CHIR-12.12處理消除了sCD40L-刺激的正常B細胞中CD40-TRAF2/3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的形成。CD40的表達沒有變化(數(shù)據(jù)未顯示)。
不受理論的束縛，這些實驗的結(jié)果和上述實施例的結(jié)果表明CHIR-12.12抗體是具有獨特組合特性的雙重作用拮抗性抗-CD40單克隆抗體。該完全的人單克隆抗體能阻斷B細胞存活和增殖的CD40L-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；該拮抗作用最終導(dǎo)致細胞死亡。CHIR-12.12也能介導(dǎo)效應(yīng)細胞的識別和結(jié)合，啟動抗體依賴的細胞毒性(ADCC)。一旦CHIR-12.12與效應(yīng)細胞結(jié)合，釋放溶細胞酶，導(dǎo)致B細胞凋亡和裂解。當在臨床前腫瘤模型中比較時，CHIR-12.12是比利妥昔單抗更有效的抗腫瘤抗體。
實施例21對NHL、CLL和NM患者原發(fā)性癌細胞的激動和拮抗活性
與臨床研究者協(xié)作測試了候選mAb對NHL、CLL和多發(fā)性骨髓瘤患者原發(fā)性癌細胞的各種活性(下列)。
·在增殖試驗中的激動作用(8位NHL患者，8位CLL患者和8位MM患者)
·在增殖試驗中的拮抗作用(8位NHL患者，8位CLL患者和8位MM患者)
·通過Annexin V試驗測試的凋亡作用(3-4位NHL患者，4位CLL患者和4位MM患者)
·通過Annexin V試驗測試逆轉(zhuǎn)存活信號(3位NHL患者，3位CLL患者和3位MM患者)
·補體依賴的細胞毒性(4位NHL患者，4位CLL患者和4位MM患者)
·抗體依賴的細胞毒性(6位NHL患者，6位CLL患者和6位MM患者)
實施例22鑒定用于毒性研究的相關(guān)動物種類
由于這兩種候選抗體不能與嚙齒類CD40發(fā)生交叉反應(yīng)，必須鑒定用于測試毒理學(xué)作用的其它(動物)種類。
通過流式細胞術(shù)測試這兩種候選抗-CD40抗體與動物CD40交叉反應(yīng)的能力。此項研究測試了大鼠、家兔、犬、彌猴和絨猴。
該候選抗體在結(jié)合人B細胞上CD40后顯示拮抗活性。為鑒定對候選抗體有類似應(yīng)答的動物種類，在用于拮抗活性的增殖試驗中測試了對顯示能結(jié)合候選抗體的各種類淋巴細胞。進一步測試了因能與候選抗體拮抗性結(jié)合而選擇的各(動物)種類淋巴細胞是否可用作通過ADCC機理殺傷表達CD40的淋巴瘤細胞系的效應(yīng)細胞。最后在用于候選抗體組織結(jié)合模式的IHC研究中測試選擇的動物種類。選擇在這些試驗中能以類似于人細胞中觀察到的模式對該候選抗體起反應(yīng)的動物種類用于毒理學(xué)研究。
初步研究表明該候選的抗-CD40 mAb能與彌猴CD40起交叉反應(yīng)。
實施例23CHIR-5.9和CHIR-12.12的腫瘤靶向特性
為確定CHIR-12.12和CHIR-5.9 mAb的相對腫瘤靶向特性，將熒光標記的候選mAb和同種型對照抗體給予荷瘤小鼠。給藥后在不同時間點收集腫瘤樣品和正常器官。分析腫瘤和正常器官中標記抗體的積累情況。
實施例CHIR-5.9和CHIR-12.12的作用機理
為闡明CHIR-5.9和CHIR-12.12 mAb介導(dǎo)腫瘤生長抑制的機理，進行以下研究
Fc-受體敲除或阻斷模型效應(yīng)細胞，例如NK、巨噬細胞和單核細胞可通過Fc受體與抗體的Fc部分的結(jié)合而介導(dǎo)ADCC。缺乏活化Fc受體的小鼠以及經(jīng)改造而破壞了Fc與這些受體結(jié)合的抗體可阻斷ADCC介導(dǎo)的腫瘤生長抑制。在該模型中腫瘤抑制的喪失或明顯降低提示這兩種候選mAb抑制腫瘤生長主要是通過ADCC機理介導(dǎo)。
實施例25拮抗性抗-CD40抗體的液體藥物制劑
為選擇拮抗性抗-CD40抗體CHIR-12.12的最佳溶液環(huán)境，本項研究的目標是用生物物理和生物化學(xué)方法研究溶液pH對該抗體穩(wěn)定性的作用。示差掃描量熱法(DSC)結(jié)果顯示CHIR-12.12在pH 5.5-6.5制劑中構(gòu)象穩(wěn)定性最佳。根據(jù)組合的SDS-PAGE、體積排阻HPLC(SEC-HPLC)和陽離子交換HPLC(CEX-HPLC)分析，CHIR-12.12在約pH 5.0-5.5時理化穩(wěn)定性最佳。鑒于這些結(jié)果，含有該抗體的推薦液體藥物制劑是用約10mM琥珀酸鈉、約150mM氯化鈉配制的pH約5.5、濃度約20mg/ml的CHIR-12.12的制劑。
材料與方法
用于該制劑研究的CHIR-12.12抗體是培養(yǎng)CHO細胞方法產(chǎn)生的人單克隆抗體。該mAb的分子量為150kDa，由二硫鍵連接的兩條輕鏈和兩條重鏈組成?？砂邢駽D40表達細胞，包括正常和惡性B細胞上CD40細胞表面受體來治療各種癌癥和自身免疫/炎性疾病。
用于本項研究的抗-CD40藥物是散裝的CHO產(chǎn)生的純化抗-CD40(CHIR-12.12)。該藥物的組成為用10mM琥珀酸鈉、150mM氯化鈉配制的pH 6.5、濃度約9.7mg/ml的CHIR-12.12。該項研究的對照樣品是接受的藥物，然后于≤-60℃冷凍，室溫融化并在預(yù)定的時間點與穩(wěn)定性樣品一起測試。如表20所示，通過在不同pH溶液中透析該藥物來制備穩(wěn)定性樣品并通過UV280檢測每個樣品中的CHIR-12.12濃度。
表20.CHIR-12.12制劑
使用以下方案測定CHIR-12.12抗體在各種制劑中的理化穩(wěn)定性。
示差掃描量熱法(DSC)
采用MicroCal VP-DSC，按1℃/分鐘，從15℃加熱至90℃檢測不同制劑樣品的構(gòu)象穩(wěn)定性。
SDS-PAGE
用4-20％Tris-甘氨酸凝膠在非還原和還原條件下評估斷裂和凝聚情況?？捡R斯亮藍染色檢測蛋白質(zhì)。
體積排阻色譜(SEC-HPLC)
也通過Water Alliance HPLC檢測蛋白質(zhì)斷裂和凝聚，采用TosohaasTSK-GEL 3000SWXL柱，100mM磷酸鈉、pH 7.0作為流動相，流速0.7ml/分鐘。
離子交換色譜(CEX-HPLC)
采用Waters 600s HPLC系統(tǒng)檢測降解相關(guān)的荷電變化，采用Dionex PropacWCX-10柱，50mM HEPES，pH 7.3作為流動相A，含有500mM NaCl的50mMHEPE，pH 7.3作為流動相B，流速0.5℃/分鐘。
結(jié)果與討論
構(gòu)象穩(wěn)定性研究
CHIR-12.12的熱去折疊揭示了至少有兩次熱轉(zhuǎn)換，可能分別代表Fab和Fc結(jié)構(gòu)域的去折疊解鏈。在較高溫度時，該蛋白質(zhì)可能凝聚導(dǎo)致DSC信號喪失。為了篩選制劑，本項研究中將最低的熱轉(zhuǎn)換溫度定義為解鏈溫度，Tm。圖13顯示了作為制劑pH函數(shù)的熱解鏈溫度。較高的熱解鏈溫度證明pH 5.5-6.5的制劑使抗-CD40具有較高的構(gòu)象穩(wěn)定性。
SDS-PAGE分析
將pH4.5-9.0的CHIR-12.12制劑樣品于40℃孵育2個月，作SDS-PAGE分析(數(shù)據(jù)未顯示)。在非還原條件下，在pH大于5.5的制劑中觀察到分子量(MW)為23kDa和27kDa的(抗體)，在所有制劑中均觀察到MW為51kDa的(抗體)，但在pH5.0-5.5的制劑中少些。pH 7.5和pH 9.0的制劑中可見MW為100kDa的(抗體)種類。
在還原條件下，CHIR-12.12被還原為MW分別為50kDa和24kDa的游離重鏈和輕鏈。100kDa的(抗體)種類似乎不是完全可還原的并隨著溶液pH的增加而增加，提示在這些分子中可能發(fā)生非二硫鍵的共價締合。由于SDS-PAGE上無身份未知的其它(抗體)種類，各制劑穩(wěn)定性比較是根據(jù)CHIR-12.12的剩余純度而定。pH 5.0-6.0的制劑為CHIR-12.12提供更穩(wěn)定的環(huán)境。SDS-PAGE幾乎沒有檢測到凝聚(數(shù)據(jù)未顯示)。
SEC-HPLC分析
SEC-HPLC分析檢測到作為主峰的完整CHIR-12.12，從主峰分離出作為前峰的凝聚(抗體)種類，大片段(抗體)種類位于主峰后部的肩峰，小片段(抗體)種類在主峰后檢測到。5℃和25℃儲存3個月后，在上述制劑中檢測到其量可忽略不計的蛋白質(zhì)片段和凝聚物(＜1.0％)，CHIR-12.12主峰(抗體)種類純度維持大于99％(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，儲存于40℃時，蛋白質(zhì)片段逐步增加，如表21所示，pH 4.5和pH 6.5-9.0時形成更多的片段。40℃孵育CHIR-12.12制劑3個月后，在pH 7.5和pH 9.0的制劑中檢測到約2-3％的凝聚物，而在其它pH的制劑中檢測到小于1％的凝聚物(數(shù)據(jù)未顯示)。SEC-HPLC結(jié)果表明CHIR-12.12在約pH 5.0-6.0時更穩(wěn)定。
表21.CHIR-12.12穩(wěn)定性樣品在實時和加速儲存條件下的SEC-HPLC結(jié)果
CEX-HPLC分析
CEX-HPLC分析檢測到作為主峰的完整CHR-12.12，酸性變體早于主峰(抗體)種類洗脫，C-末端添加了賴氨酸的變體在主峰(抗體)種類之后洗脫。表22顯示剩余的主峰CHIR-12.12(抗體)種類和酸性變體的百分比取決于溶液pH。可能是由于早期發(fā)酵和純化方法所致對照樣品已經(jīng)含有高水平的酸性(抗體)種類(約33％)。CHIR-12.12對較高的溶液pH敏感性由兩個事實證明。首先，pH 9.0的最初制劑樣品(t＝0)已經(jīng)比對照多產(chǎn)生了12％的酸性(抗體)種類。其二，酸性(抗體)種類的百分比隨著pH上升急劇增加。荷電變化相關(guān)的降解可能是脫氨基所致。上述數(shù)據(jù)表明CHIR-12.12的該類型的降解在約pH 5.0-5.5時最小。表22.在實時和加速儲存條件下不同pH制劑中的CHIR-12.12在CEX-HPLC中的峰面積百分比
結(jié)論
pH對CHIR-12.12的構(gòu)象和理化穩(wěn)定性有顯著影響。荷電變化相關(guān)的降解經(jīng)確定為CHIR-12.12的主要降解途徑，該降解在pH 5.0-5.5時最小。根據(jù)總的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，含有該抗體的一種推薦的液體藥物制劑是用約10mM琥珀酸鈉、約150mM氯化鈉配制的pH約5.5、濃度約20mg/ml的CHIR-12.12的制劑。
實施例26用CHIR-5.9和CHIR-12.12作的臨床研究
臨床目標
總目標是通過用抗-CD40 IgG1靶向細胞來提供對B細胞性腫瘤的有效療法。這些腫瘤包括B細胞性淋巴瘤、慢性淋巴細胞性淋巴瘤(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、特發(fā)性巨球蛋白血癥、全身性卡斯爾曼病。雖然可在I期獲得對活性的一些衡量，但這些疾病的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在II期測定。該藥物首先作為單一藥物進行研究，但在隨后的過程中聯(lián)用了其它藥物、化療和其它抗體。
I期
·在患B細胞性惡性腫瘤的對象中評價安全性和藥代動力學(xué)-劑量遞增。
·根據(jù)安全性、耐受性和CD40的血清標記變化選擇劑量。一般尋找MTD，但其它效力指標(CD40+細胞的消除等)也足夠確定劑量。
·考慮到不同適應(yīng)癥特別需要多種劑量，例如，CLL劑量不同于NHL劑量。因此在II期可能需要確定一些劑量。
·患者每周給藥并進行實時藥代動力學(xué)(Pk)取樣。最初的4周周期進行最大給藥。Pk依據(jù)所研究的疾病、CD40密度等可能有很大不同。
·該試驗對B細胞性淋巴瘤、CLL和潛在的其它B細胞性惡性腫瘤患者公開。
·根據(jù)安全性、劑量和抗腫瘤活性的初步證據(jù)決定終止還是繼續(xù)研究。
·在II期測定應(yīng)答速率所確定的藥物活性。
·鑒定II期的劑量。
II期
在集中于B細胞性淋巴瘤、CLL和多發(fā)性骨髓瘤(MM)的上述腫瘤類型中開始幾項試驗。由于CD40對不同級別的淋巴瘤具有不同功能，低級和中級/高級NHL可能需要獨立的試驗。在低級疾病中，CD40更多地作為防止凋亡的存活因子。在較高級別的疾病中，干擾CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可導(dǎo)致細胞死亡。在隨機化的II期設(shè)置中可能測試多種劑量或多種給藥時間表。
在每種疾病中，靶向不符合當前護理標準(standard of care)的(患者)群
·CLL對Campath和化療有耐藥性的患者。
·低級NHLRituxan或CHOP-R治療失敗。
·中級NHLCHOP-R治療失敗。
·多發(fā)性骨髓瘤化療失敗
√根據(jù)II期治療概念的證據(jù)決定終止還是繼續(xù)研究
√決定替代標記是否可用作臨床效力的早期指標
√鑒定III期的劑量
III期
III期取決于II期中在何處檢測到信號與何種競爭性療法可認為是標準的。如果信號是在無治療標準的疾病階段，則單臂(single arm)、良好控制的研究可用作關(guān)鍵性試驗。如果存在認為是標準的競爭性藥物，然后可進行一對一(head-to-head)的研究。
本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可從前文描述和相關(guān)附圖中獲益進而想出這些發(fā)明的許多改進形式和其它實施方案。因此，應(yīng)該理解本發(fā)明不受限于所公開的具體實施方案，這些改進形式和其它實施方案均包括在附加權(quán)利要求的范圍和本文所公開實施方案的內(nèi)容中。雖然本文使用了特定的術(shù)語，但它們僅是一般性和描述性地使用并非出于限制的目的。
說明書中述及的所有出版物和專利申請表明本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。如同每篇單獨的出版物或?qū)＠暾執(zhí)囟ㄇ要毩⒌赜米鲄⒖家粯?，所有出版物和專利申請納入本文作為參考。
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交存人給的分類號 專利保存號
小鼠雜交瘤131.2F8.5.9CMCC#12047 PTA-5542
小鼠雜交瘤153.8E2.D10.D6.12.12CMCC#12056PTA-5543
保存物伴有科學(xué)描述；給出的以上分類描述。保存物由本國際保存單位于2003年9月17日收到并接受。
根據(jù)你方要求×我們通知你方要求保存菌株30年
如果簽署布達佩斯條約的專利局證實某人接收的權(quán)利，或者如果引用該菌株的美國專利授權(quán)，并且ATCC收到美國專利和商標局或教存人的指令來發(fā)放所述菌株，則該菌株對公眾可用。
如果在保存的有效時期內(nèi)培養(yǎng)物死亡或破壞，你方應(yīng)用相同的活培養(yǎng)物替換它們。
該菌株將自保存之日起維持至少30年，或需要最新的樣品，無論哪個更長。美國和許多其它國家簽署了布達佩斯條約。
上述培養(yǎng)物的活性于2003年9月23日測試。在該日，培養(yǎng)物是存活的。
國家保存單位美國模式培養(yǎng)物保藏所，馬納斯，弗吉尼亞20110-2209美國。
有權(quán)代表ATCC者的簽名
瑪利亞 哈里斯(Marie Harris)，專利專員，ATCC專利保存 日期2003年10月2日
CC利莎 亞歷山大(Lisa Alexander)
Ref審理或案件號P20107.001
2003年11月3日收到 來自510 923 4766 至 知識產(chǎn)權(quán) 002頁
序列表
<110>B.-L.陳(Chen，Bao-Lu)
D.赫斯特(Hurst，Deborah)
S.H.李(Lee，Sang Hoon)
L.隆(Long，Li)
X.陸(Lu，Xiaofeng)
M.盧克曼(Luqman，Mohammad)
A.亞巴娜發(fā)(Yabannavar，Asha)
I.扎羅(Zaror，Isabel)
<120>拮抗性抗-CD40單克隆抗體和它們的使用方法
<130>PP20107.004(282916)
<150>60/565,710
<151>2004-04-27
<150>60/525,579
<151>2003-11-26
<150>60/517,337
<151>2003-11-04
<160>12
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>720
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>12.12人抗-CD40抗體的輕鏈的編碼序列
<221>CDS
<222>(1)...(720)
<400>1
atg gcg ctc cct gct cag ctc ctg ggg ctg cta atg ctc tgg gtc tct48
Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
gga tcc agt ggg gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg acc96
Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr
20 25 30
gtc acc cct gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tcc agt cag agc144
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
35 40 45
ctc ctg tat agt aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag192
Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys
50 55 60
cca ggg cag tct cca cag gtc ctg atc tct ttg ggt tct aat cgg gcc240
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala
65 70 75 80
tcc ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt288
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac336
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
tgc atg caa gct cga caa act cca ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa384
Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
115 120 125
gtg gat atc aga cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg432
Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
130 135 140
cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg480
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145 150 155 160
ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat528
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
165 170 175
aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac576
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
180 185 190
agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa624
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
195 200 205
gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag672
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
210 215 220
ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag720
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys *
225 230 235
<210>2
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>12.12人抗-CD40抗體的輕鏈
<400>2
Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr
20 25 30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
115 120 125
Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
165 170 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
195 200 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
210 215 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210>3
<211>2016
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>12.12人抗-CD40抗體的重鏈的編碼序列(包括內(nèi)含子)
<400>3
atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctt gtt gct att tta aga ggt48
gtc cag tgt cag gtg cag ttg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag96
cct ggg agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc144
agt agc tat ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg192
gag tgg gtg gca gtt ata tca tat gag gaa agt aat aga tac cat gca240
gac tcc gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag atc288
acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctc aga act gag gac acg gct gtg336
tat tac tgt gcg aga gat ggg ggt ata gca gca cct ggg cct gac tac384
tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gca agt acc aag ggc432
cca tcc gtc ttc ccc ctg gcg ccc gct agc aag agc acc tct ggg ggc480
aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg528
acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc576
ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg624
acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg672
aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt ggt gag agg720
cca gca cag gga ggg agg gtg tct gct gga agc cag gct cag cgc tcc768
tgc ctg gac gca tcc cgg cta tgc agt ccc agt cca ggg cag caa ggc816
agg ccc cgt ctg cct ctt cac ccg gag gcc tct gcc cgc ccc act cat864
gct cag gga gag ggt ctt ctg gct ttt tcc cca ggc tct ggg cag gca912
cag gct agg tgc ccc taa ccc agg ccc tgc aca caa agg ggc agg tgc960
tgg gct cag acc tgc caa gag cca tat ccg gga gga ccc tgc ccc tga1008
cct aag ccc acc cca aag gcc aaa ctc tcc act ccc tca gct cgg aca1056
cct tct ctc ctc cca gat tcc agt aac tcc caa tct tct ctc tgc aga1104
gcc caa atc ttg tga caa aac tca cac atg ccc acc gtg ccc agg taa1152
gcc agc cca ggc ctc gcc ctc cag ctc aag gcg gga cag gtg ccc tag1200
agt agc ctg cat cca ggg aca ggc ccc agc cgg gtg ctg aca cgt cca1248
cct cca tct ctt cct cag cac ctg aac tcc tgg ggg gac cgt cag tct1296
tcc tct tcc ccc caa aac cca agg aca ccc tca tga tct ccc gga ccc1344
ctg agg tca cat gcg tgg tgg tgg acg tga gcc acg aag acc ctg agg1392
tca agt tca act ggt acg tgg acg gcg tgg agg tgc ata atg cca aga1440
caa agc cgc ggg agg agc agt aca aca gca cgt acc gtg tgg tca gcg1488
tcc tca ccg tcc tgc acc agg act ggc tga atg gca agg agt aca agt1536
gca agg tct cca aca aag ccc tcc cag ccc cca tcg aga aaa cca tct1584
cca aag cca aag gtg gga ccc gtg ggg tgc gag ggc cac atg gac aga1632
ggc cgg ctc ggc cca ccc tct gcc ctg aga gtg acc gct gta cca acc1680
tct gtc cct aca ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc1728
cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg1776
gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat1824
ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc1872
gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg1920
tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg1968
cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga2016
<210>4
<211>469
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>12.12人抗-CD40抗體的重鏈
<400>4
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210>5
<211>469
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>1212人抗-CD40抗體的變體的重鏈
<400>5
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210>6
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>5.9人抗-CD40抗體的輕鏈
<400>6
Met Ala Leu Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly Ala Ile Val Met Thr Gln Pro Pro Leu Ser Ser Pro
20 25 30
Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg
50 55 60
Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Phe Phe Arg Arg Leu
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Met Gln Val Thr Gln Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
165 170 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
195 200 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
210 215 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210>7
<211>474
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>5.9人抗-CD40抗體的重鏈
<400>7
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
1 5 10 15
Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser
65 70 75 80
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys
145 150 155 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
210 215 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225 230 235 240
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
370 375 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210>8
<211>474
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>5.9人抗-CD40抗體的變體的重鏈
<400>8
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
1 5 10 15
Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser
65 70 75 80
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
145 150 155 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
210 215 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225 230 235 240
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
370 375 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210>9
<211>612
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(612)
<221>misc_feature
<222>(0)...(0)
<223>人CD40的短同種型的編碼序列
<400>9
atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc48
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta96
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg144
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa192
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac240
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc288
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg336
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
agt gag gcc tgt gag agc tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc384
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag432
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa480
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
tgt cac cct tgg aca agg tcc cca gga tcg gct gag agc cct ggt ggt528
Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly
165 170 175
gat ccc cat cat ctt cgg gat cct gtt tgc cat cct ctt ggt gct ggt576
Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly
180 185 190
ctt tat caa aaa ggt ggc caa gaa gcc aac caa taa612
Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln *
195 200
<210>10
<211>203
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>10
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly
165 170 175
Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly
180 185 190
Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln
195 200
<210>11
<211>834
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(834)
<221>misc_feature
<222>(0)...(0)
<223>人CD40的長同種型的編碼序列
<400>11
atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc48
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta96
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg144
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa192
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac240
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc288
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg336
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
agt gag gcc tgt gag agc tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc384
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag432
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa480
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
tgt cac cct tgg aca agc tgt gag acc aaa gac ctg gtt gtg caa cag528
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
gca ggc aca aac aag act gat gtt gtc tgt ggt ccc cag gat cgg ctg576
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
aga gcc ctg gtg gtg atc ccc atc atc ttc ggg atc ctg ttt gcc atc624
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195 200 205
ctc ttg gtg ctg gtc ttt atc aaa aag gtg gcc aag aag cca acc aat672
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
aag gcc ccc cac ccc aag cag gaa ccc cag gag atc aat ttt ccc gac720
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225 230 235 240
gat ctt cct ggc tcc aac act gct gct cca gtg cag gag act tta cat768
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
gga tgc caa ccg gtc acc cag gag gat ggc aaa gag agt cgc atc tca816
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260 265 270
gtg cag gag aga cag tga834
Val Gln Glu Arg Gln *
275
<210>12
<211>277
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>12
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225 230 235 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260 265 270
Val Gln Glu Arg Gln
27權(quán)利要求
1.一種能特異性結(jié)合表達在人CD40表達細胞表面上的人CD40抗原的人單克隆抗體，所述單克隆抗體無明顯激動活性，所述單克隆抗體與等量的單克隆嵌合型抗-CD20單克隆抗體IDEC-C2B8相比，顯示抗腫瘤活性增加，其中所述抗腫瘤活性在分階段的裸鼠異種移植腫瘤模型中用Daudi人B細胞性淋巴瘤細胞系測定。
2.如權(quán)利要求1所述的人單克隆抗體，其特征在于，所述抗體選自
a)單克隆抗體CHIR-12.12；
b)ATCC以專利保藏號PTA-5543保藏的雜交瘤細胞系12.12所產(chǎn)生的單克隆抗體；
c)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQID NO4所示序列和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；
d)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示序列；
e)能與雜交瘤細胞系12.12產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
f)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
g)在競爭性結(jié)合試驗中與單克隆抗體CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；
h)前項a)所述的單克隆抗體或前項c)-g)中任一項所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產(chǎn)生的；和
i)為前項a)-h)中任一項所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力。
3.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體以至少約10-6M-10-12M的親和力(KD)與所述人CD40抗原結(jié)合。
4.一種能產(chǎn)生如權(quán)利要求1所述單克隆抗體的雜交瘤細胞系。
5.一種治療以CD40表達為特征的癌癥的方法，包括給予人患者有效量的如權(quán)利要求1所述的人抗CD40單克隆抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述癌癥選自非何杰金淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、B細胞性淋巴瘤、高級B細胞性淋巴瘤、中級B細胞性淋巴瘤、低級B細胞性淋巴瘤、急性B細胞性成淋巴細胞性白血病、成髓細胞性白血病和何杰金病。
7.一種能特異性結(jié)合表達在人CD40表達細胞表面上的人CD40抗原的人單克隆抗體，所述單克隆抗體無明顯激動活性，藉此，當所述單克隆抗體與表達在所述細胞表面的CD40抗原結(jié)合時，所述細胞的生長或分化受到抑制，其中所述抗體選自
a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12；
b)雜交瘤細胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；
c)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO6所示序列、SEQID NO7所示序列、SEQ ID NO8所示序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQID NO7所示序列和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示序列；
d)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQID NO4所示序列和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；
e)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示序列；
f)能與雜交瘤細胞系5.9或12.12所產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
g)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
h)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-89的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
i)在競爭性結(jié)合試驗中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；
j)前項a)所述的單克隆抗體或前項c)-i)中任一項所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產(chǎn)生的；和
k)為前項a)-j)中任一項所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力。
8.如權(quán)利要求7所述的抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述片段選自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和單鏈Fv片段。
9.如權(quán)利要求7所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體以至少約10-6M-10-12M的親和力(KD)與所述人CD40抗原結(jié)合。
10.一種含有編碼以下氨基酸序列的多核苷酸的分離的核酸分子，所述氨基酸序列選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQID NO7和SEQ ID NO8。
11.一種能產(chǎn)生對表達在人CD40表達細胞表面的人CD40抗原具有特異性的人單克隆抗體的雜交瘤細胞系，其中所述單克隆抗體無明顯的激動活性，藉此，當所述單克隆抗體與表達在所述細胞表面的CD40抗原結(jié)合時，所述細胞的生長或分化受到抑制，其中所述單克隆抗體選自
a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12；
b)雜交瘤細胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；
c)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO6所示序列、SEQID NO7所示序列、SEQ ID NO8所示序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQID NO7所示序列和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示序列；
d)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQID NO4所示序列和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；
e)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示序列；
f)能與雜交瘤細胞系5.9或12.12所產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
g)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
h)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-89的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
i)在競爭性結(jié)合試驗中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；
j)為前項a)-i)所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力。
12.一種抑制正常人B細胞生長或分化的方法，包括使所述B細胞與有效量的選自以下的人抗-CD40單克隆抗體接觸
a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12；
b)雜交瘤細胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；
c)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO6所示序列、SEQID NO7所示序列、SEQ ID NO8所示序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQID NO7所示序列和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示序列；
d)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQID NO4所示序列和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；
e)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示序列；
f)能與雜交瘤細胞系5.9或12.12所產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
g)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
h)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-89的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
i)在競爭性結(jié)合試驗中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；
j)前項a)所述的單克隆抗體或前項c)-i)中任一項所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產(chǎn)生的；和
k)為前項a)-j)中任一項所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力；
所述抗體或其片段無明顯的激動活性，并且藉此當所述抗體或其片段結(jié)合所述B細胞上的所述CD40抗原時，所述B細胞的生長或分化受到抑制。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體或其片段以至少約10-6M-10-12M的親和力(KD)與所述人CD40抗原結(jié)合。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述片段選自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和單鏈Fv片段。
15.一種抑制正常人B細胞增殖的方法，其中所述增殖通過CD40配體與表達在所述B細胞表面的CD40抗原結(jié)合得到促進，所述方法包括使所述B細胞與有效量的選自以下的人抗-CD40單克隆抗體接觸
a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12；
b)雜交瘤細胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；
c)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO6所示序列、SEQID NO7所示序列、SEQ ID NO8所示序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQID NO7所示序列和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示序列；
d)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQID NO4所示序列和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；
e)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示序列；
f)能與雜交瘤細胞系5.9或12.12所產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
g)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
h)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-89的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
i)在競爭性結(jié)合試驗中能與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；
j)前項a)所述的單克隆抗體或前項c)-i)中任一項所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產(chǎn)生的；和
k)為前項a)-j)中任一項所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力；
所述抗體或其片段無明顯的激動活性，并且藉此當所述抗體或其片段結(jié)合所述B細胞上的所述CD40抗原時，所述B細胞的生長或分化受到抑制。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體或其片段以至少約10-6M-10-12M的親和力(KD)與所述人CD40抗原結(jié)合。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述片段選自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和單鏈Fv片段。
18.一種抑制人患者中B細胞產(chǎn)生抗體的方法，包括給予人患者有效量的選自以下的人抗-CD40單克隆抗體或其片段
a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12；
b)雜交瘤細胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；
c)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO6所示序列、SEQID NO7所示序列、SEQ ID NO8所示序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQID NO7所示序列和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示序列；
d)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQID NO4所示序列和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；
e)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示序列；
f)能與雜交瘤細胞系5.9或12.12所產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
g)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
h)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-89的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
i)在競爭性結(jié)合試驗中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；
j)前項a)所述的單克隆抗體或前項c)-i)中任一項所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產(chǎn)生；和
k)為前項a)-j)中任一項所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力；
所述抗體或其片段無明顯的激動活性，并且藉此當所述抗體或其片段結(jié)合所述B細胞上的所述CD40抗原時，所述B細胞的生長或分化受到抑制。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體或其片段以至少約10-6M-10-12M的親和力(KD)與所述人CD40抗原結(jié)合。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述片段選自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和單鏈Fv片段。
21.一種抑制B細胞系癌細胞生長的方法，包括使所述癌細胞與有效量的選自以下的人抗-CD40單克隆抗體接觸
a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12；
b)雜交瘤細胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；
c)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO6所示序列、SEQID NO7所示序列、SEQ ID NO8所示序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQID NO7所示序列和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示序列；
d)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQID NO4所示序列和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；
e)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示序列；
f)能與雜交瘤細胞系5.9或12.12所產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
g)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
h)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-89的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
i)在競爭性結(jié)合試驗中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；
j)前項a)所述的單克隆抗體或前項c)-i)中任一項所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產(chǎn)生；和
k)為前項a)-j)中任一項所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力；
所述抗體或其片段無明顯的激動活性，并且藉此當所述抗體或其片段結(jié)合所述B細胞上的所述CD40抗原時，所述B細胞的生長或分化受到抑制。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體或其片段以至少約10-6M-10-12M的親和力(KD)與所述人CD40抗原結(jié)合。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述片段選自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和單鏈Fv片段。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述癌癥選自非何杰金淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、B細胞性淋巴瘤、高級B細胞性淋巴瘤、中級B細胞性淋巴瘤、低級B細胞性淋巴瘤、急性B細胞性成淋巴細胞性白血病、成髓細胞性白血病和何杰金病。
25.一種治療自身免疫疾病的方法，包括給予人患者有效量的選自以下的人抗-CD40單克隆抗體
a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12；
b)雜交瘤細胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；
c)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO6所示序列、SEQID NO7所示序列、SEQ ID NO8所示序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQID NO7所示序列和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示序列；
d)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQID NO4所示序列和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；
e)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示序列；
f)能與雜交瘤細胞系5.9或12.12所產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
g)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
h)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-89的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
i)在競爭性結(jié)合試驗中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；
j)前項a)所述的單克隆抗體或前項c)-i)中任一項所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產(chǎn)生的；和
k)為前項a)-j)中任一項所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力；
所述抗體或其片段無明顯的激動活性，并且藉此當所述抗體或其片段結(jié)合所述B細胞上的所述CD40抗原時，所述B細胞的生長或分化受到抑制。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體或其片段以至少約10-6M-10-12M的親和力(KD)與所述人CD40抗原結(jié)合。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述片段選自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和單鏈Fv片段。
28.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述自身免疫疾病選自全身性紅斑狼瘡、自身免疫血小板減少性紫癜、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、強直性脊柱炎、重癥肌無力和尋常型天皰瘡。
29.一種治療特征為CD40表達的癌癥的方法，包括給予人患者有效量的選自以下的人抗-CD40單克隆抗體
a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12；
b)雜交瘤細胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；
c)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO6所示序列、SEQID NO7所示序列、SEQ ID NO8所示序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQID NO7所示序列和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示序列；
d)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQID NO4所示序列和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；
e)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示序列；
f)能與雜交瘤細胞系5.9或12.12所產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
g)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
h)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-89的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
i)在競爭性結(jié)合試驗中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；
j)前項a)所述的單克隆抗體或前項c)-i)中任一項所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產(chǎn)生；和
k)為前項a)-j)中任一項所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力；
所述抗體或其片段無明顯的激動活性，并且藉此當所述抗體或其片段結(jié)合所述B細胞上的所述CD40抗原時，所述B細胞的生長或分化受到抑制。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體或其片段以至少約10-6M-10-12M的親和力(KD)與所述人CD40抗原結(jié)合。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述片段選自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和單鏈Fv片段。
32.一種鑒定對CD40表達細胞具有拮抗活性的抗體的方法，包括用選自以下的單克隆抗體進行競爭性結(jié)合試驗
a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12；
b)雜交瘤細胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；
c)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO6所示序列、SEQID NO7所示序列、SEQ ID NO8所示序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQID NO7所示序列和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示序列；
d)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQID NO4所示序列和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；
e)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示序列；
f)能與雜交瘤細胞系5.9或12.12所產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
g)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
h)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-89的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
i)前項a)所述的單克隆抗體或前項c)-h)中任一項所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產(chǎn)生；和
j)為前項a)-i)所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力。
33.一種能特異性結(jié)合CD40的結(jié)構(gòu)域2的拮抗性抗-CD40單克隆抗體。
34.如權(quán)利要求33所述的單克隆抗體，其特征在于，所述抗體是人抗體。
35.如權(quán)利要求34所述的單克隆抗體，其特征在于所述抗體無明顯的激動活性。
36.如權(quán)利要求33所述的單克隆抗體，其特征在于，所述抗體具有選自由雜交瘤細胞系5.9產(chǎn)生的抗體和雜交瘤細胞系12.12產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性。
37.如權(quán)利要求33所述的單克隆抗體，其特征在于，所述抗體選自由ATCC以專利保藏號PTA-5542保藏的雜交瘤細胞系產(chǎn)生的抗體和由ATCC以專利保藏號PTA-5543保藏的雜交瘤細胞系產(chǎn)生的抗體。
38.如權(quán)利要求33所述的單克隆抗體，其特征在于，所述抗體具有單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9的結(jié)合特異性。
39.如權(quán)利要求33所述的單克隆抗體，其特征在于，所述抗體能與含有SEQID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位結(jié)合。
40.如權(quán)利要求33所述的單克隆抗體，其特征在于，所述抗體選自
a)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQID NO4所示序列和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；
b)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示序列；
c)能與雜交瘤細胞系12.12所產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
d)能與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87表位相結(jié)合的單克隆抗體；
e)在競爭性結(jié)合試驗中與單克隆抗體CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；
f)為CHIR-12.12單克隆抗體或前項a)-e)所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力。
41.一種抑制人CD40表達細胞中的CD40配體介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的方法，所述方法包括使所述細胞與有效量的選自以下的人抗-CD40單克隆抗體接觸
a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12；
b)雜交瘤細胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；
c)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO6所示序列、SEQID NO7所示序列、SEQ ID NO8所示序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQID NO7所示序列和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示序列；
d)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQID NO4所示序列和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；
e)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示序列；
f)能與雜交瘤細胞系5.9或12.12所產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
g)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
h)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-89的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
i)在競爭性結(jié)合試驗中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；
j)前項a)所述的單克隆抗體或前項c)-i)中任一項所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產(chǎn)生的；和
k)為前項a)-j)中任一項所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體或其片段以至少約10-6M-10-12M的親和力(KD)與所述人CD40抗原結(jié)合。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述片段選自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和單鏈Fv片段。
44.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述人CD40表達細胞是正常人B細胞或惡性人B細胞，所述CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是B細胞存活。
45.一種含有能特異性結(jié)合表達在人CD40表達細胞表面的人CD40抗原的人單克隆抗體的藥物組合物，所述單克隆抗體無明顯的激動活性，其中所述抗體選自
a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12；
b)雜交瘤細胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；
c)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO6所示序列、SEQID NO7所示序列、SEQ ID NO8所示序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQID NO7所示序列和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示序列；
d)含有選自以下氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQID NO4所示序列和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；
e)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示序列；
f)能與雜交瘤細胞系5.9或12.12所產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
g)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
h)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-89的表位相結(jié)合的單克隆抗體；
i)在競爭性結(jié)合試驗中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；
j)前項a)所述的單克隆抗體或前項c)-i)中任一項所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產(chǎn)生的；和
k)為前項a)-j)中任一項所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力。
46.如權(quán)利要求45所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物是含有緩沖液的液體藥物制劑，所述緩沖液的量可維持制劑的pH在約pH5.0-pH7.0。
47.如權(quán)利要求46所述的藥物組合物，其特征在于，所述制劑還含有等滲劑，其量可使同一組合物接近等滲。
48.如權(quán)利要求47所述的藥物組合物，其特征在于，所述等滲劑是氯化鈉，所述制劑中存在濃度約為50mM-300mM的所述氯化鈉。
49.如權(quán)利要求48所述的藥物組合物，其特征在于，所述制劑中的所述氯化鈉濃度約為150mM。
50.如權(quán)利要求46-49中任一項所述的藥物組合物，其特征在于，所述緩沖液選自琥珀酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸鹽緩沖液。
51.如權(quán)利要求50所述的藥物組合物，其特征在于，所述制劑含有濃度約為1mM-50mM的緩沖液。
52.如權(quán)利要求51所述的藥物組合物，其特征在于，所述緩沖液是濃度約為5mM-15mM的琥珀酸鈉或檸檬酸鈉。
53.如權(quán)利要求46-52中任一項所述的藥物組合物，其特征在于，所述制劑還含有其量約為0.001％-1.0％的表面活性劑。
54.如權(quán)利要求53所述的藥物組合物，其特征在于，所述表面活性劑是聚山梨酸酯80，其在所述制劑中的存在量約為0.001％-0.5％。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活的CD40表達細胞所介導(dǎo)的疾病的治療方法。所述方法包括將治療有效量的拮抗性抗－CD40抗體或其抗原結(jié)合片段給予需要它的患者。當所述拮抗性抗－CD40抗體結(jié)合人CD40表達細胞上的CD40抗原時，所述抗體或其抗原結(jié)合片段無明顯的激動活性，但顯示拮抗活性?？梗瑿D40抗體或其抗原結(jié)合片段的拮抗活性有利于抑制人CD40表達細胞，例如B細胞的增殖和/或分化。
文檔編號C12N5/20GK1905897SQ20048003904
公開日2007年1月31日 申請日期2004年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月4日
發(fā)明者L·隆, M·盧克曼, A·亞巴娜發(fā), I·扎羅, B·-L·陳, X·陸, S·H·李, D·赫斯特 申請人:希龍公司