專利名稱：一種抗蓖麻毒素的中和性單克隆抗體4c13,其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13，還涉及該單克隆抗體的制備方法以及在制備蓖麻毒素疫苗和蓖麻毒素檢測(cè)、診斷、治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蓖麻毒素(Ricin)是一種核糖體失活蛋白，它幾乎可以和所有真核細(xì)胞結(jié)合，呈細(xì)胞毒作用。一分子蓖麻毒素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，就足以使整個(gè)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成停止而死亡。其毒性是氰化物的6000倍。蓖麻毒素氣溶膠進(jìn)入體內(nèi)，可引起嚴(yán)重的肺泡炎癥和肺水腫，最后因肺阻塞缺氧而導(dǎo)致死亡(1.GriffithsGD，Lindsay CD，Allenby AC，et al.Protection against inhalation toxicity of ricinand abrin by immunisation.Hum Exp Toxicol 1995；14155-64.2.Brown RFR，White DE.Ultrastructure of rat lung following inhalation of ricin aerosol.Int JExp Pathol 1997；78267-76.)。靜脈給藥每公斤體重3-5微克即可致命。迄今為止，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有適用于人的、針對(duì)蓖麻毒素中毒的專用特效藥。蓖麻毒素生產(chǎn)原料蓖麻籽來(lái)源廣泛，提取制備方法簡(jiǎn)便，很容易被恐怖分子利用，因此研究其拮抗劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
抗體自19世紀(jì)末報(bào)道可以用來(lái)治療疾病以來(lái)，一直用于治療毒蛇、毒蝎咬傷，具有良好的療效。大量研究表明用蓖麻毒素的中和抗體治療突發(fā)性蓖麻毒素中毒效果良好。Furukawa-Stofferdeng等報(bào)道給小鼠腹腔注射含蓖麻毒素中和抗體的培養(yǎng)上清并同時(shí)注射0.5g蓖麻毒素(致死劑量)，可保護(hù)受試小鼠抵抗毒素攻擊(T.Furukawa-Stoffer，D.C.W.Mah，J.Cherwonogrodzky etal.A novel biological-based assay for the screening of neutralizing antibodies toricin.Hybridoma，1999，18(6)505-511)?？贵w治療的成敗依賴于蓖麻毒素被吸收的多少和進(jìn)入體內(nèi)的路徑(B.M.J.Foxwell，S.I.Detre，T.A.Donovan.et al.The useof anti-ricin antibotied to protect mice intoxicated with ricin.Toxicology，1985，3479-8834.)。在針對(duì)蓖麻毒素活性鏈的單克隆抗體與毒素的分子比為4∶1時(shí)，抗體在體外可中和蓖麻毒素對(duì)EL-4淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。甘露醇具有增加大分子物質(zhì)通過(guò)血腦屏障的功能，使用甘露醇后蓖麻毒素的毒性作用比靜脈注射增加兩倍，針對(duì)Ricin的神經(jīng)中毒，顱內(nèi)注射抗體后具有和靜脈注射同樣的保護(hù)效果。
目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)蓖麻毒素單克隆抗體的報(bào)道，主要為檢測(cè)用的單克隆抗體和具有中和活性的兩類。具有中和活性單克隆抗體的報(bào)道主要為抗蓖麻毒素A鏈、B鏈和A、B鏈三種形式(1.P.V.Lemley，P.Amanatides，D.C.Wright.Identification and characterization of a monoclonal antibody thatneutralizes ricin toxicity in vitro and in vivo.Hybridoma，1994，13(5)417-421.2.Maddaloni M，Cooke C，Wilkinson R，Stout AV，Eng L，Pincus SH.Immunological characteristics associated with the protective efficacy of antibodiesto ricin.J Immunol.2004，15；172(10)6221-8.)。我國(guó)對(duì)蓖麻毒素生物戰(zhàn)劑的偵檢和醫(yī)學(xué)防護(hù)等研究領(lǐng)域剛剛起步(1.宋云揚(yáng)，劉娟，應(yīng)天翼，等.夾心免疫PCR方法檢測(cè)蓖麻毒素.免疫學(xué)雜志，2002，18(3)229-231.2.郝蘭群，郭勝清，郭振泉，等.抗蓖麻毒素單克隆抗體的制備及應(yīng)用.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2003，19(5)517-518)，針對(duì)蓖麻毒素的恐怖襲擊尚無(wú)配套診斷試劑和有效免疫治療和防護(hù)手段，尚無(wú)針對(duì)蓖麻毒素的中和性單克隆抗體，因此迫切需要建立和發(fā)展具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的以抗體為基礎(chǔ)的檢測(cè)和防護(hù)用品。目前未見(jiàn)有同時(shí)識(shí)別蓖麻毒素A鏈和B鏈線性表位中和性單克隆抗體的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了提供一種蓖麻毒素中毒的檢測(cè)或治療手段，本發(fā)明公開(kāi)了一種抗蓖麻毒素的單克隆抗體4C13。
本發(fā)明公開(kāi)的抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13的輕、重鏈蛋白質(zhì)分子，其氨基酸序列分別如序列表中序列3、序列4所示，其編碼基因分別如序列表中序列1、序列2所示。該單克隆抗體的輕、重鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的氨基酸序列分別如序列表中序列5、序列6所示。該單克隆抗體的輕鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分別如序列表中序列7、序列8、序列9所示。該單克隆抗體的重鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分別如序列表中序列10、序列11、序列12所示。
本發(fā)明還公開(kāi)了上述單克隆抗體4C13的制備方法，主要內(nèi)容如下1.抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株4C13的構(gòu)建首先對(duì)蓖麻毒素用甲醛進(jìn)行減毒處理，然后免疫Balb/c小鼠，常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。用間接ELISA法篩選，陽(yáng)性細(xì)胞克隆再反復(fù)亞克隆，直到所有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)為100％陽(yáng)性。對(duì)雜交瘤細(xì)胞4C13進(jìn)行了染色體核型分析，雜交瘤細(xì)胞4C13染色體平均數(shù)目為102條，用雙相瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)證明4C13雜交瘤細(xì)胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgG1。
2.抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株4C13的篩選和鑒定用MTT法，就蓖麻毒素對(duì)小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行了細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果算出蓖麻毒素對(duì)Sp2/0細(xì)胞的半數(shù)致死劑量IC50＝0.31ng/ml。依照IC50，篩選出中和性抗體4C13，Western-blotting對(duì)特異性作了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示4C13為蓖麻毒素中和性抗體，可在體外實(shí)驗(yàn)中，中和蓖麻毒素對(duì)SP2/0細(xì)胞的毒性作用，中和性單克隆抗體4C13可特異性識(shí)別蓖麻毒素的A、B鏈線性表位。
3.單克隆抗體4C13對(duì)BALB/C小鼠的保護(hù)作用親和柱純化Balb/c小鼠雜交瘤細(xì)胞腹水，紫外分光光度計(jì)測(cè)量，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。給小鼠注射不同劑量蓖麻毒素，計(jì)算半數(shù)致死劑量LD50。給小鼠注射不同劑量蓖麻毒素，不同時(shí)間段后，注射中和性單克隆抗體4C13記錄生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示蓖麻毒素對(duì)小鼠的LD50為10.4μg/kg，蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13在小鼠注射10倍致死計(jì)量的蓖麻毒素30分鐘后仍對(duì)小鼠具有保護(hù)作用。
4.蓖麻毒素中和性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞4C13輕、重鏈基因的釣取取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中和性單克隆抗體4C13細(xì)胞，提取RNA，經(jīng)RT-PCR，用兩對(duì)特異性引物PHs1，PHs2；PLs1、PLs2釣取抗體的輕重鏈基因。常規(guī)法連接入載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒PCR鑒定后進(jìn)行DNA測(cè)序分析。通過(guò)本部分實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了含有蓖麻毒素中和抗體4C13輕、重鏈基因的載體，經(jīng)序列分析、比對(duì)，編碼序列為小鼠免疫球蛋白輕、重鏈基因(序列表中序列1和序列2)。
5.單克隆抗體4C13輕、重鏈可變區(qū)基因序列和氨基酸序列的確定用www.expasy.org在線軟件將編碼蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13輕、重鏈可變區(qū)核苷酸序列翻譯為其編碼的氨基酸序列，單克隆抗體4C13輕、重鏈氨基酸序列如序列表中序列3和序列4所示。根據(jù)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)(ElvinA.Kabat.《Sequences of Proteins of Immunological Interest》.1991)確定輕鏈可變區(qū)序列如序列表中序列5所示和重鏈可變區(qū)序列如序列表中序列6所示。根據(jù)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)確定輕鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3其氨基酸序列分別如序列表中序列7、序列8和序列9所示。重鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3其氨基酸序列分別如序列表中序列10、序列11和序列12所示。
6.基于蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13的蓖麻毒素快速檢測(cè)法用另一株蓖麻毒素單克隆抗體3D74包被ELISA板，與蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13-HRP配伍，建立了蓖麻毒素快速ELISA檢測(cè)法。并對(duì)檢測(cè)方法的回收率和重復(fù)性進(jìn)行了評(píng)價(jià)(圖9，圖10)。
本發(fā)明應(yīng)用一套設(shè)計(jì)的引物成功地從培養(yǎng)的蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13雜交瘤細(xì)胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。所得輕鏈和重鏈可變區(qū)基因可編碼正確的小鼠抗體可變區(qū)。本發(fā)明的單克隆抗體基于上述已克隆到的蓖麻毒素和中和性單克隆抗體4C13輕、重鏈可變區(qū)基因，可構(gòu)建和表達(dá)多種小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、單域抗體、嵌合抗體、Fab抗體、抗體融合蛋白等；基于上述基因所編碼的多肽或蛋白質(zhì)，可以交聯(lián)上多種生物活性分子，制備疫苗及用于蓖麻毒素檢測(cè)、蓖麻毒素和免疫毒素中毒的診斷或治療藥物，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為免疫用蓖麻毒素SDS-PAGE結(jié)果圖譜。其中泳道1為純化的非還原態(tài)蓖麻毒素；泳道2為經(jīng)甲醛脫毒處理的非還原態(tài)蓖麻毒素；泳道3為純化的還原態(tài)蓖麻毒素；泳道4為經(jīng)甲醛脫毒處理的還原態(tài)蓖麻毒素；泳道5為蛋白質(zhì)Marker。
圖2為雜交瘤細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果圖。
圖3為蓖麻毒素對(duì)Sp2/0細(xì)胞的細(xì)胞毒作用圖。其中橫坐標(biāo)為蓖麻毒素的濃度，縱坐標(biāo)為蓖麻毒素Sp2/0細(xì)胞的殺傷率，依照此結(jié)果算出蓖麻毒素對(duì)Sp2/0細(xì)胞的IC50＝0.31ng/mL。
圖4為蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13的篩選圖譜。其中橫坐標(biāo)為蓖麻毒素的濃度，縱坐標(biāo)為各種單克隆抗體作用后蓖麻毒素對(duì)Sp2/0細(xì)胞的殺傷率，依照此結(jié)果篩選到中和性單克隆抗體4C13。
圖5為中和性單克隆抗體4C13培養(yǎng)上清中和活性檢測(cè)圖譜。其中橫坐標(biāo)為中和性單克隆抗體4C13培養(yǎng)上清濃度，縱坐標(biāo)為中和性單克隆抗體4C13作用后蓖麻毒素對(duì)Sp2/0細(xì)胞的殺傷率，由此結(jié)果可以看到，隨著4C13培養(yǎng)上清濃度的逐漸下降，其中和作用逐漸下降。
圖6為中和性單克隆抗體4C13的結(jié)合特性鑒定圖譜，其中泳道1為蓖麻毒素的SDS-PAGE結(jié)果，上面的為B鏈，下面的為A鏈，泳道2為蛋白質(zhì)Marker，泳道3為中和性單克隆抗體4C13的Western-blot結(jié)果。結(jié)果顯示中和性單克隆抗體4C13可識(shí)別蓖麻毒素A、B鏈線性表位。
圖7為中和性單克隆抗體4C13經(jīng)Protein A純化的層析結(jié)果圖。其中，峰1為上樣峰，峰2為純化的抗體峰。
圖8為中和性單克隆抗體4C13經(jīng)Protein A純化后的SDS-PAGE結(jié)果圖譜，其中泳道1、2、3為經(jīng)Protein A純化的中和性單克隆抗體4C13，泳道4為蛋白質(zhì)Marker，A為重鏈，B為輕鏈。
圖9為蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13雜交瘤細(xì)胞RNA提取結(jié)果。
圖10為蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13雜交瘤細(xì)胞輕重鏈基因的PGR結(jié)果圖譜，其中泳道1為輕鏈基因；泳道2為DL2000；泳道3為重鏈基因?；虼笮〈蠹s為660bp。
圖11為蓖麻毒素的快速ELISA檢測(cè)結(jié)果圖，其中橫坐標(biāo)表示蓖麻毒素(ricin)濃度(μg/mL)，縱坐標(biāo)表示A450。以實(shí)驗(yàn)組的A值大于陰性對(duì)照A值的2.1倍作為判定陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)，快速ELISA對(duì)ricin的最低檢出濃度為175ng/L；目視比色對(duì)蓖麻毒素的最低檢出濃度為625ng/L。
圖12為快速ELISA的準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)圖，橫坐標(biāo)表示自來(lái)水中ricin添加濃度(μg/mL)，縱坐標(biāo)表示自來(lái)水中ricin測(cè)定濃度(μg/mL)。r＝0.996，F(xiàn)＝1172.2，P＜0.0001。曲線和直線分別表示回歸前、后自來(lái)水中ricin的實(shí)際添加濃度和測(cè)定濃度之間的關(guān)系。
具體實(shí)施例方式
通過(guò)參閱下述實(shí)施例可以更容易地了解本發(fā)明的內(nèi)容，這些實(shí)施例只是為進(jìn)一步說(shuō)明，并不意味著限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例一抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建一、材料福氏完全佐劑及不完全佐劑，TMB為Sigma公司產(chǎn)品，20％胎牛血清為北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，無(wú)血清RPMI 1640為Gibco公司產(chǎn)品，SP2/0細(xì)胞從ATCC引進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存，Balb/c小鼠、昆明小鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。其余試劑均為市購(gòu)。
二、方法結(jié)果1.蓖麻毒素的減毒處理在純化后的蓖麻毒素(Nicolson，G.L.，Blaustein，J.，1972.The interaction of Ricinus com-munis agglutininwith normal and tumor cell surfaces.Biochim.Biophys.Acta 266，543-547.)2mg/ml中加入終濃度為1％的甲醛，37℃處理72h，PH7.20.01M PBS透析72h，SDS-PAGE檢測(cè)(圖1)。
2.Balb/c小鼠免疫 選用4-6周齡的雌性Balb/c小鼠6只，用100μgricin腹股溝皮下免疫，第一針加福氏完全佐劑，第2針加福氏不完全佐劑，每3周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫后尾靜脈采血，間接ELISA檢測(cè)抗體產(chǎn)生情況，融合前3天，以100μg ricin腹腔加強(qiáng)免疫一次，第3天融合。
3.細(xì)胞融合將免疫的小鼠摘眼球后脫頸處死，無(wú)菌摘取小鼠脾細(xì)胞，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。具體方法①將免疫的小鼠摘眼球放血后脫頸處死，75％酒精浸泡3min，無(wú)菌取出脾臟，用200目鋼網(wǎng)研磨單個(gè)細(xì)胞懸液，無(wú)血清RPMI 1640洗兩次并記數(shù)；②收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞，用無(wú)血清RPMI1640洗兩次并記數(shù)；③按SP2/0細(xì)胞∶脾細(xì)胞＝1∶5的比例混合兩種細(xì)胞，用RPMI 1640洗1次，棄盡上清，輕輕將細(xì)胞打散；④在1min時(shí)間里緩慢加入1ml 50％PEG(MW 1500)溶液，置37℃水浴1min；⑤在1min、2min、2min、5min時(shí)間內(nèi)加無(wú)血清RPMI1640 1ml、5ml、10ml、10ml；⑥800r/min離心7min，棄上清，盡可能輕輕將細(xì)胞懸起；⑦加含20％FCS的HAT(Sigma)-RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，混勻后，滴加在鋪有滋養(yǎng)細(xì)胞(1×104細(xì)胞/孔)96孔培養(yǎng)板(Gibco)中，100μl/孔，37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)。
4.間接ELISA篩選抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞(1)用10μg/mlricin包被ELISA板，于4℃過(guò)夜并封閉。依次加入待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液(37℃1h，PBST洗板4次)，及1∶500稀釋的50μl HRP-GAM(37℃45min，PBST洗板4次)。以TMB底物顯色后，于450nm波長(zhǎng)測(cè)定A值。
5.雜交瘤細(xì)胞克隆化 間接ELISA法篩選為陽(yáng)性的細(xì)胞克隆再反復(fù)亞克隆，直到所有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)為100％陽(yáng)性。雜交瘤細(xì)胞的克隆化用有限稀釋法(1)在克隆化的當(dāng)天或前1天制備滋養(yǎng)細(xì)胞脫頸處理昆明小鼠，75％酒精浸泡消毒皮膚，無(wú)菌剝離腹部皮膚，注射器抽取5ml 1640培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，反復(fù)沖洗后吸出腹腔洗液，用20％胎牛血清1640培養(yǎng)液稀釋后滴入96孔板，每孔約0.1ml。(2)取少許待作克隆化的雜交瘤細(xì)胞移至另一無(wú)菌試管中，并準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。(3)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。(4)將培養(yǎng)板置于5％CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)，5天左右在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞克隆。適時(shí)換液，檢測(cè)，取陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，及時(shí)凍存細(xì)胞株。在第一批實(shí)驗(yàn)中，篩選到了4株針對(duì)蓖麻毒素的單克隆抗體細(xì)胞株。
6.雜交瘤細(xì)胞的染色體核型分析在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞中加入秋水仙素，終濃度為0.02μg/ml，在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后收集細(xì)胞，經(jīng)低滲裂解(加入預(yù)溫至37℃的0.075M KCL8ml，輕輕打勻，37℃30-40分鐘)、預(yù)固定(甲醇∶冰醋酸＝3∶1新鮮配制，輕輕打勻，離心棄上清)和3次固定(第1次固定加入6ml固定液，輕輕打勻，室溫30分鐘，離心棄上清；第2次固定加入6ml固定液，輕輕打勻，室溫15分鐘，離心棄上清；第3次固定加入6ml固定液，輕輕打勻，室溫15分鐘，離心棄上清)處理后用少量固定液制備細(xì)胞懸液，滴于冰水浸泡的玻片上，文火烘干后10％Giemsa染色15-20分鐘，水洗鏡檢(圖2)。結(jié)果顯示經(jīng)30個(gè)分裂相細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)平均值，雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目在85-112(n＝30)之間變動(dòng)，平均數(shù)目為102條，且有1-2個(gè)中部著絲粒染色體。已知Balb/c小鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)目為40條，Sp2/0細(xì)胞染色體數(shù)目為60-70條，融合后的雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目應(yīng)該為90-120條，由此提示所獲得的抗體分泌細(xì)胞為雜交瘤細(xì)胞。
7.雜交瘤細(xì)胞免疫球蛋白亞型的確定 用羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，就雜交瘤細(xì)胞濃縮后的培養(yǎng)上清作雙相瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，證明4C13雜交瘤細(xì)胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgG1。
通過(guò)本部分工作，篩選到蓖麻毒素單克隆抗體4C13。雜交瘤細(xì)胞4C13染色體數(shù)目平均為102條，所分泌的免疫球蛋白亞型為IgG1。
實(shí)施例二抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的篩選和鑒定一、材料同上。
二、方法結(jié)果1.ricin對(duì)小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0半數(shù)致死劑量(IC50)的確定用RPMI-1640稀釋ricin使其濃度分別為0ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.3125ng/mL、0.156ng/mL、0.078ng/mL，分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每一濃度3復(fù)孔，100μl/孔，調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105/ml，100μl/孔。37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h，每孔加入10μl MTT，37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)6h，2000r/min離心10min，棄上清，加100μl DMSO溶解結(jié)晶，于570nm波長(zhǎng)測(cè)定A值。按公式細(xì)胞死亡率％＝[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)]×100％評(píng)價(jià)細(xì)胞毒作用，并計(jì)算IC50(圖3)。用MTT法，就蓖麻毒素對(duì)小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行了細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果算出IC50＝0.31ng/ml。
2.蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13的篩選用RPMI-1640稀釋ricin使其濃度分別為40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.3125ng/mL、0.156ng/mL、0.078ng/mL，分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每一濃度3復(fù)孔，100μL/孔。依次分別加入4種待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液50μL/孔。調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml，50μL/孔。37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h，每孔加入10μL MTT，37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)6h，2000r/min離心10min，棄上清，加100μL DMSO溶解結(jié)晶，于570nm波長(zhǎng)測(cè)定A值。按公式細(xì)胞死亡率％＝[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)]×100％評(píng)價(jià)細(xì)胞毒作用(圖4)。
3.蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13中和活性測(cè)定 用RPMI-1640倍比稀釋中和性單克隆抗體4C13雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，每一濃度3復(fù)孔，100μL/孔。用RPMI-1640稀釋ricin使其濃度為1.25ng/mL(IC50＝0.3125ng/mL)，50μL/孔。加于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞濃度為1×106/ml，50μL/孔。37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h，每孔加入10μL MTT，37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)6h，2000r/min離心10min，棄上清，加100μL DMSO溶解結(jié)晶，于570nm波長(zhǎng)測(cè)定A值。按公式細(xì)胞死亡率％＝[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)]×100％評(píng)價(jià)中和性單克隆抗體4C13的作用(圖5)。
4.蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13特異性鑒定 將Ricin經(jīng)120g/L還原SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，滴加含5％奶粉的PBS于4℃封閉過(guò)夜，用含0.5ml/L Tween-20的PBS洗膜3次。將膜剪成相同寬度，依次滴加蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清(37℃結(jié)合1h，PBST洗膜3次，再用含0.5ml/L Tween-20的TBS洗滌3次)及HRP-GAM IgG(37℃結(jié)合1h，洗膜3次)以DAB顯色后，觀察結(jié)果(圖6)。結(jié)果顯示4C13為蓖麻毒素中和性抗體。
5.動(dòng)物體內(nèi)誘生單克隆抗體制備蓖麻毒素單克隆抗體4C13接種雜交瘤細(xì)胞前10天，先給Balb/c小鼠(♂，8～12周)腹腔注射0.5ml液體石臘油。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，1500r/min離心7min，棄上清，生理鹽水洗2次，最后將細(xì)胞濃度調(diào)整為4×106/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml。7～10天后，可見(jiàn)小鼠腹部明顯膨大，碘酒和酒精棉球消毒腹部皮膚，抽取腹水。將抽取的腹水3000r/min離心10min，收集上清，加等量甘油，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 通過(guò)本部分工作，獲得了命名為4C13的蓖麻毒素中和性單克隆抗體交瘤細(xì)胞，在體外實(shí)驗(yàn)中，4C13可中和蓖麻毒素對(duì)SP2/0細(xì)胞的毒性作用，中和性單克隆抗體4C13可特異性識(shí)別蓖麻毒素A、B鏈線性表位。
實(shí)施例三單克隆抗體4C13的Protein A純化及對(duì)BALB/C小鼠的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)一、材料Protein A Sepharose CL 4B柱蛋白柱北京本元正陽(yáng)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；余同上。
二、方法結(jié)果
1.在2毫升小鼠腹水中加入1毫升PH8.0，0.1moL/L磷酸緩沖液并用PH9.0，1moL/L TRIS-HCL調(diào)整PH為9。把小鼠腹水加入已經(jīng)用0.1moL/L磷酸緩沖液PH 8.0平衡好的Protein A Sepharose CL 4B柱蛋白柱中，用上述緩沖液洗柱子，直到流出液中測(cè)不到雜蛋白為止。用PH 3.0的檸檬酸緩沖液洗脫，收集流出液，并立即用1moL/L TRIS-HCL PH 8.5緩沖液中和，用PH7.2，0.01M PBS透析72h。取樣在紫外分光光度計(jì)上測(cè)OD260，OD280，計(jì)算蛋白質(zhì)含量，凍干-20℃保存(圖7，圖8)。
2.選用4-6周齡、體重為20g左右的Balb/c小鼠38只，分為4組，雌雄各半，按每公斤體重分別于左測(cè)腹腔注射0μg、10μg、20μg、40μg蓖麻毒素，正常飼養(yǎng)，每1h觀察一次，記錄生長(zhǎng)情況，觀察2周，計(jì)算半數(shù)致死劑量LD50，見(jiàn)表1。
3.選用4-6周齡、體重為20g左右的Balb/c小鼠，雌雄各半，分為抗體組、PBS組和正常對(duì)照3組，共計(jì)5批次。按每公斤體重分別于左測(cè)腹腔注射20μg、40μg、60μg、100μg、蓖麻毒素，分別于0min、10min、20min、30min后于右側(cè)腹腔注射純化的中和性單克隆抗體4C13 100μg，正常飼養(yǎng)，每1h觀察一次，記錄生長(zhǎng)情況，觀察2周，結(jié)果見(jiàn)表2。
結(jié)果顯示蓖麻毒素對(duì)小鼠的LD50為10.4μg/kg，蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13在小鼠注射10倍致死計(jì)量的蓖麻毒素30分鐘后仍對(duì)小鼠具有保護(hù)作用。
表1.蓖麻毒素對(duì)Balb/c鼠的半數(shù)致死量確定

從結(jié)果可以計(jì)算出LD50為10.4μg/kg表2.蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13對(duì)小鼠的保護(hù)作用

實(shí)施例四蓖麻毒素中和性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞4C13輕、重鏈基因的釣取一、材料引物PHs1見(jiàn)序列表中序列13；PHs2見(jiàn)序列表中序列14；PLs1見(jiàn)序列表中序列15；PLa1見(jiàn)序列表中序列16；PHa1見(jiàn)序列表中序列17。DNA片段純化試劑盒OMEGA生物科技公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶New EnglandBiolabs產(chǎn)品；載體PGEM TeasyPromega公司產(chǎn)品；TRIzolInvitrogen公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)菌JM109購(gòu)自Promega公司。余同上。
二、方法結(jié)果1.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中和性單克隆抗體4C13細(xì)胞5×106-107個(gè)，離心去除上清，將細(xì)胞均勻彈起。加1mlTRIzol反復(fù)吹打使細(xì)胞充分裂解，振蕩5分鐘后，加入0.2ml氯仿，振蕩15秒，室溫放置2-3分鐘，2-8℃12000r/min，離心15分鐘，取上清于另一新管中，加500μl異丙醇混勻后室溫放置10分鐘，2-8℃12000r/min離心10分鐘。75％乙醇洗滌沉淀，干燥后，用20μl無(wú)RNA酶的去離子水溶解沉淀(圖9)。
2.取含1μg總RNA的溶液，依次加入AMV 5×緩沖液4μl，0ligo(dT)(500ng/μl)0.5μl，2.5mmol/L dNTP2μl，Rnasin(50U/μl)0.5μl，去離子水補(bǔ)至20μl、反轉(zhuǎn)錄酶2-5U，42℃延伸1小時(shí)。95℃變性5分鐘，置冰浴中，產(chǎn)物為cDNA第一鏈。用2對(duì)特異性引物PHs1、PHa1和PLs1、PLa1，在20μl PCR反應(yīng)體系中，分別加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl，Taq酶10×buffer 2μl，上下游引物各1μl，2.5mmol/L dNTP 1μl，加Taq酶1-2U，去離子水補(bǔ)至20μl。95℃變性2分鐘，循環(huán)參數(shù)為94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10分鐘(圖10)。
3.用分離出欲回收的DNA片段，在長(zhǎng)波紫外光下切下含目的DNA片段的膠塊，放入離心管中，加入三倍膠體積的化膠液，55℃水浴完全溶解膠塊。用DNA片段純化試劑盒回收DNA片段并將純化的DNA片段在水溶液里，將回收的PCR產(chǎn)物在T4 DNA連接酶緩沖液中按2∶1的比例(摩爾比)和載體PGEMTeasy混合后，加入0.5U的T4 DNA連接酶于16℃連接過(guò)夜，連接反應(yīng)的總體積為10μL。
4.取連接液10μl，加入200μl感受態(tài)細(xì)菌JM109中并輕柔混勻，冰浴30分鐘，42℃水浴熱休克90秒，迅速轉(zhuǎn)入冰浴2分鐘，加800μl LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入37℃恒溫?fù)u床，以150轉(zhuǎn)/分鐘的速度搖動(dòng)45分鐘，4000r/min離心1分鐘，棄去800μl上清，取沉淀涂布于含Amp(終濃度為100μg/ml)的固體LB平板，將平板倒置于37℃孵箱12～18小時(shí)。
5.在上述平板中挑取單個(gè)克隆，接種于含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基中。37℃恒溫?fù)u床170rpm，震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取3ml菌液加入1.5mlEppendorf管中，10000rpm離心1min，棄上清。將沉淀菌體重懸于100μL溶液I中，加新鮮配制的溶液II 200μL，輕緩地上下顛倒數(shù)次，至液體變清澈為止。隨后，再加入150μL溶液III，輕柔地上下顛倒數(shù)次使液體混勻，此時(shí)出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀。4℃，12000rpm離心5min，取上清加至另一Eppendorf管中，加入等體積的Tris-HCl飽和酚，劇烈震蕩后，12000rpm離心5min，將上層水相移至一新管中。再加入500μL氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上層水相，移至一新管中，加2倍體積的無(wú)水乙醇混勻，于-20℃放置3h。4℃，12000rpm離心10min，棄上清，用70％乙醇洗沉淀2次，室溫干燥20min，以40μL無(wú)菌雙蒸水溶解，進(jìn)行PCR鑒定及DNA測(cè)序分析。
構(gòu)建了含有蓖麻毒素中和抗體4C13輕、重鏈基因的載體，經(jīng)測(cè)序分析、序列比對(duì)為小鼠免疫球蛋白輕、重鏈基因(序列表中序列1、序列2)。
實(shí)施例六基于蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13的蓖麻毒素快速檢測(cè)法一、材料mAb 3D74本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的另一株蓖麻毒素中和性單克隆抗體，識(shí)別蓖麻毒素的空間表位。余同上。
二、方法結(jié)果用10μg/mL mAb 3D74包被ELISA板，于4℃過(guò)夜并封閉。同時(shí)加入PBS稀釋的不同濃度的ricin和50μL 1∶1 600 4C13-HRP(37℃30min，PBST洗板4次)，以TMB底物顯色后，于波長(zhǎng)450nm測(cè)定A值(圖11)。
通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論為快速ELISA對(duì)ricin的最低檢出濃度為175ng/L；目視比色對(duì)蓖麻毒素的最低檢出濃度為625ng/L。在準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)中，測(cè)得自來(lái)水中ricin的實(shí)際添加濃度和測(cè)定濃度之間的相關(guān)系數(shù)r＝0.996，F(xiàn)＝1172.2，P＜0.0001，實(shí)際添加濃度和測(cè)定濃度之間有非常顯著的相關(guān)性。自來(lái)水中ricin的添加濃度分別為312.5ng/L、625ng/L、1.25μg/L、2.5μg/L和5μg/L時(shí)，回收率依次為5.5％、21.6％、31.8％、36.4％和34.5％。在重復(fù)性評(píng)價(jià)中，用快速夾心ELISA檢測(cè)ricin濃度分別為125μg/L、1mg/L和5mg/L時(shí)的批內(nèi)變異系數(shù)，依次為13.78％、6.8％和3.5％。
序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>一種抗蓖麻毒素的中和性單克隆抗體4C13，其制備方法和用途<130>
<160>17<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>638<212>DNA<213>
<400>
ccagatgacc cagtctccag caatcatgtc tacatctcca ggggagaagg tcaccataac 60ctgcagtgcc agttcaagtg taaattacat acactggttc cagcagaagc caggctcttc120tcccaaactc tggatttata tcacatccaa cctggcttct ggagtccctg atcgcttcag180tggcagtgga tctgggacct cttactctct cacaatcagc cgaatggagg ctgcagatgc240tgccacttat tactgccagc aaaggagtag ttatccgctc acgttcggtg ctgggaccaa300gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc atcttcccac catccagtga360gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg aacaacttct accccaaaga420catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa aatggcgtcc tgaacagttg480gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc agcaccctca cgttgaccaa540ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc actcacaaga catcaacttc600acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttaat638<210>2<211>690<212>DNA<213>
<400>2tcaggaactg caggtgtcct ctctgaggtc cagctgcaac agtctggacc tgaggtggcg 60aagcctgggg cttcagtgaa gatatcctgc aagacttctg gttacgcatt cattggctac120tacatgcact gggtgaagca aagccatgta aagagtcttg agtggattgg acgtattaat180cccaataatg gtgctactag tcacaaccag attttcaagg acaaggccag cttgactgta240gacatgtcct ccaatacagt ctacatggag ctccacagcc tgacatctga ggactctgca300gtctattact gtgcaagaga ggaggctaac tgggacgaac ggtttgcttt ctggggccaa360gggactctgg tcactgtctc tgcagccaaa acgacacccc catctgtcta tccactggcc420cctggatctg ctgcccaaac taactccatg gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat480ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc540ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc600
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<400>3Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Thr Ser Pro Gly Glu Lys1 5 10 15Val Thr lle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile His Trp20 25 30Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ile Thr35 40 45Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Ala Asp Ala65 70 75 80Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly85 90 95Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val100 105 110Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser115 120 125Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys130 135 140Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp145 150 155 160Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu165 170 175Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu180 185 190Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg195 200 205Asn Glu Cys210
<210>4<211>230<212>PRT<213>
<400> 4Ser Gly Thr Ala Gly Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly1 5 10 15Pro Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr20 25 30Ser Gly Tyr Ala Phe Ile Gly Tyr Tyr Mer His Trp Val Lys Gln Ser35 40 45His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly50 55 60Ala Thr Ser His Asn Gln Ile Phe Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val65 70 75 80Asp Met Ser Ser Asn Thr Val Tyr Mer Glu Leu His Ser Leu Thr Ser85 90 95Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Glu Ala Asn Trp Asp100 105 110Glu Arg Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115 120 125Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala130 135 140Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr145 150 155 160Phe Pro Glu Pro Val Thr ValThr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser165170 175Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu180 185 190Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val195 200 205Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys210 215 220Ile Val Pro Arg Asp Cys225 230
<210>5<211>106<212>PRT<213>
<400>5Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Thr Ser Pro Gly Glu Lys1 5 10 15Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile His Trp20 25 30Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ile Thr35 40 45Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Ala Asp Ala65 70 75 80Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly85 90 95Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala100 105<210>6<211>118<212>PRT<213>
<400>6Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala Ser Val1 5 10 15Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ile Gly Tyr Tyr Met20 25 30His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Arg35 40 45Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ala Thr Ser His Asn Gln Ile Phe Lys Asp50 55 60Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Met Ser Ser Asn Thr Val Tyr Met Glu65 70 75 80Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg85 90 95
Glu Glu Ala Asn Trp Asp Glu Arg Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ala115<210>7<211>10<212>PRT<213>
<400>7Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile His1 5 10<210>8<211>7<212>PRT<213>
<400>8Ile Thr Ser Asn Leu Ala Ser1 5<210>9<211>9<212>PRT<213>
<400>9Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr1 5<210>10<211>10<212>PRT<213>
<400>10Gly Tyr Ala Phe Ile Gly Tyr Tyr Met His1 5 10<210>11<211>17<212>PRT<213>
<400>11Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ala Thr Ser His Asn Gln Ile Phe Lys1 5 10 15Asp
<210>12<211>11<212>PRT<213>
<400>12Glu Glu Ala Asn Trp Asp Glu Arg Phe Ala Phe1 5 10<210>13<211>22<212>DNA<213>
<400>13aggtccagct tctcgagtca gg22<210>14<211>22<212>DNA<213>
<400>14aggtccaact gctcgagtct gg 22<210>15<211>32<212>DNA<213>
<400>15ccagttccga gctccagatg acccagtctc ca 32<210>16<211>34<212>DNA<213>
<400>16gcgccgtcta gaattaacac tcattcctgt tgaa 34<210>17<211>30<212>DNA<213>
<400>17aggcttacta gtacaatccc tgggcacaat30
權(quán)利要求
1.一種抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13，其特征在于輕、重鏈蛋白質(zhì)分子分別具有如序列表中序列3、序列4所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述單克隆抗體4C13的輕、重鏈蛋白質(zhì)分子編碼基因，其特征在于分別具有如序列表中序列1、序列2所示的核甘酸序列。
3.權(quán)利要求1所述單克隆抗體4C13的輕、重鏈蛋白質(zhì)分子中的可變區(qū)，其特征在于分別具有如序列表中序列5、序列6所示的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3所述的單克隆抗體4C13的輕鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3，其特征在于分別具有如序列表中序列7、序列8、序列9所示的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求3所述的單克隆抗體4C13的重鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3，其特征在于分別具有如序列表中序列10、序列11、序列12所示的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1所述抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13的制備方法，包括如下步驟(1)抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建；(2)抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的篩選和鑒定；(3)單克隆抗體4C13對(duì)小鼠的保護(hù)作用；(4)雜交瘤細(xì)胞4C13輕、重鏈基因的釣??；(5)單克隆抗體4C13輕、重鏈可變區(qū)基因序列和氨基酸序列的確定。
7.權(quán)利要求1所述抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13，在制備蓖麻毒素檢測(cè)、疫苗以及蓖麻毒素和免疫毒素中毒的診斷或治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13，該單克隆抗體的制備方法及其在制備蓖麻毒素檢測(cè)試劑、疫苗以及診斷和治療蓖麻毒素或免疫毒素中毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明從制備的蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13雜交瘤細(xì)胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，所得輕鏈和重鏈可變區(qū)基因可編碼正確的小鼠抗體可變區(qū)。基于上述單克隆抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因，可構(gòu)建和表達(dá)多種小分子基因工程抗體，基于上述基因所編碼的多肽或蛋白質(zhì)，可以交聯(lián)上多種生物活性分子，制備疫苗及用于蓖麻毒素檢測(cè)、蓖麻毒素和免疫毒素中毒的診斷或治療藥物，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N5/18GK1982338SQ20061008326
公開(kāi)日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2006年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月24日
發(fā)明者郭建巍, 沈倍奮 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所