專利名稱：采用土著pha合成菌回注法提高剩余活性污泥合成pha產(chǎn)率的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物法合成生物降解材料研究領(lǐng)域背景技術(shù)傳統(tǒng)塑料在自然環(huán)境中不能被降解，造成嚴(yán)重的“白色污染”。因此世界各國(guó)都對(duì)生物降解材料的研制和開(kāi)發(fā)給予高度重視。近年來(lái)通過(guò)化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法制備了許多新型生物降解材料。聚羥基脂肪酸酯(PHA)是許多原核微生物在生長(zhǎng)不平衡條件下，如氮或磷缺乏時(shí)，積累的胞內(nèi)碳源或能源儲(chǔ)藏物質(zhì)，由于PHA在自然環(huán)境中能被完全降解成二氧化碳和水，并具有熱塑性和生物相容性，已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。但是，由于純培養(yǎng)物發(fā)酵合成的PHA生產(chǎn)成本高，限制了其推廣和應(yīng)用。因此，迫切需要建立切實(shí)可行的降低PHA生產(chǎn)成本的方法。
1974年Wallen從活性污泥中分離得到PHA，為以后利用活性污泥合成PHA的研究奠定了基礎(chǔ)。在污水生物處理尤其是厭氧—好氧活性污泥法中PHA是一種重要的中間產(chǎn)物，扮演著能量轉(zhuǎn)化器的角色。在有氧階段聚磷菌吸收廢水中的磷，形成胞內(nèi)多聚磷酸鹽，同時(shí)有糖原形成，當(dāng)環(huán)境中無(wú)氧時(shí)，聚磷菌以體內(nèi)的多聚磷酸鹽和糖原為能量，吸收環(huán)境中的有機(jī)物，并在胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為PHA。在污水處理過(guò)程中，產(chǎn)生大量的剩余活性污泥，需要進(jìn)行適當(dāng)處理，否則會(huì)造成二次污染。利用剩余活性污泥經(jīng)馴化，發(fā)酵制備生物降解材料PHA，既能解決剩余活性污泥資源化的問(wèn)題，又能降低PHA合成成本。堪稱一箭雙雕。然而，利用剩余活性污泥合成PHA的產(chǎn)率不高，制約了該方法的推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的1是建立一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速提高活性污泥合成PHA產(chǎn)率的方法------“規(guī)制”馴化方向再進(jìn)行PHA發(fā)酵以提高活性污泥合成PHA產(chǎn)率的回注法。
本發(fā)明的目的2是提供一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度較高、造價(jià)低廉、易操作的活性污泥馴化裝置。
本發(fā)明提出一種回注土著PHA合成菌提高活性污泥生產(chǎn)率的方法，包括以下步驟a)采用Nile-Red熒光染色法從實(shí)驗(yàn)所用活性污泥中分離得到一株或數(shù)株P(guān)HA合成菌，選擇其中一株或幾株高產(chǎn)PHA菌作為回注菌株；b)采用自行設(shè)計(jì)的活性污泥馴化裝置，進(jìn)行活性污泥馴化；c)土著高產(chǎn)PHA合成菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)和離心收集菌體后，將一定量加入至含有活性污泥和馴化液的馴化反應(yīng)桶中，進(jìn)行馴化；d)整個(gè)馴化周期為10天，溫度25℃，每個(gè)循環(huán)包括2小時(shí)厭氧，4小時(shí)好氧，1.5小時(shí)沉淀，0.5小時(shí)排出1升上清液和加入1升新鮮馴化液；e)馴化結(jié)束后，排凈馴化液加入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行PHA發(fā)酵，溫度30℃；f)發(fā)酵結(jié)束，收集污泥沉淀，干燥，采用氯仿抽提PHA，計(jì)算產(chǎn)率。
所述的活性污泥馴化裝置，由空氣泵(1)、補(bǔ)充馴化液恒流泵(2)、馴化反應(yīng)桶(3)、排出上清液恒流泵(4)、微電腦時(shí)控開(kāi)關(guān)(5)、溫度計(jì)(6)、恒溫水浴攪拌裝置(7)、進(jìn)液孔(8)、出液孔(9)、排氣孔(10)、進(jìn)液桶(11)、排液桶(12)和排氣指示杯(13)等部分組成。
所述的活性污泥馴化裝置的特征在于微電腦時(shí)控開(kāi)關(guān)(5)能控制恒溫水浴攪拌裝置(7)、補(bǔ)充馴化液恒流泵(2)、排出上清液的恒流泵(4)和空氣泵(1)定時(shí)開(kāi)關(guān)，使整個(gè)馴化裝置成為一個(gè)整體，按照規(guī)定要求，自動(dòng)完成厭氧、好氧和沉淀馴化過(guò)程。補(bǔ)充馴化液的恒流泵(2)和排出上清液的恒流泵(4)能控制馴化反應(yīng)桶(3)中液體量恒定。馴化反應(yīng)桶(3)由4mm厚的有機(jī)玻璃制成(Φ＝150mm，h＝400mm)，內(nèi)置磁性轉(zhuǎn)子。馴化反應(yīng)桶(3)外加恒溫水浴攪拌裝置(7)，頂部有進(jìn)液孔(8)、出液孔(9)和排氣孔(10)。
回注菌是分離自實(shí)驗(yàn)所用活性污泥中的高產(chǎn)土著PHA合成菌。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是第一，在馴化初期回注少量高產(chǎn)土著PHA合成菌或菌群，能夠“規(guī)制”馴化方向，促使污泥中PHA合成菌成為優(yōu)勢(shì)菌，大量繁殖，從而抑制非PHA合成菌生長(zhǎng)，有效提高活性污泥合成PHA產(chǎn)率，降低PHA生產(chǎn)成本。第二，該裝置能自動(dòng)、準(zhǔn)確的完成活性污泥好氧-厭氧-沉淀-排上清液和補(bǔ)新鮮培養(yǎng)基的各個(gè)步驟。具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度較高、造價(jià)低廉、易操作等特點(diǎn)。


下面結(jié)合附圖和實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
圖1.本專利申請(qǐng)的活性污泥馴化裝置示意圖1.空氣泵、2.補(bǔ)充馴化液恒流泵、3.馴化反應(yīng)桶、4.排出上清液恒流泵、5.微電腦時(shí)控開(kāi)關(guān)、6.溫度計(jì)、7.恒溫水浴攪拌裝置、8.進(jìn)液孔、9.出液孔、10.排氣孔、11.進(jìn)液桶、12.排液桶和13.排氣指示杯。
圖2.單株高產(chǎn)土著PHA合成菌回注法與非回注法馴化過(guò)程中PHA合成菌數(shù)和總菌數(shù)的變化(回注菌分離自生活及少量工業(yè)廢水污水處理廠好氧池活性污泥)圖3.單株高產(chǎn)土著PHA合成菌回注法與非回注法馴化過(guò)程中葡萄糖利用率的變化(回注菌分離自生活及少量工業(yè)廢水污水處理廠好氧池活性污泥)圖4.混合高產(chǎn)土著PHA合成菌群回注法與非回注法馴化過(guò)程中PHA合成菌數(shù)和總菌數(shù)的變化(三株回注菌分離自生活及工業(yè)廢水污水處理廠好氧池活性污泥)圖5.混合高產(chǎn)土著PHA合成菌群回注法與非回注法馴化過(guò)程中葡萄糖利用率的變化(三株回注菌分離自生活及工業(yè)廢水污水處理廠好氧池活性污泥)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1采用回注單株高產(chǎn)土著PHA合成菌提高污泥(生活及少量工業(yè)廢水污水處理廠好氧池活性污泥)合成PHA產(chǎn)率。
1.試驗(yàn)儀器1.1生物反應(yīng)桶本試驗(yàn)使用一個(gè)3升的自制反應(yīng)桶作為生物反應(yīng)桶，反應(yīng)桶頂部有進(jìn)液孔、出液孔、排氣孔和溫度計(jì)孔，內(nèi)置磁力轉(zhuǎn)子，生物反應(yīng)桶置于具有磁力攪拌功能的恒溫水浴裝置內(nèi)，以確保反應(yīng)過(guò)程中溫度恒定。
1.2供氣系統(tǒng)本試驗(yàn)所使用的空氣泵能準(zhǔn)確地控制通入反應(yīng)桶中的量為1.2L/min。
1.3排液和補(bǔ)液恒流泵恒流泵能勻速吸取液體，排液恒流泵在15分鐘內(nèi)將1L上清液排出，補(bǔ)液恒流泵在后15分鐘內(nèi)加入1L新鮮馴化液，保證反應(yīng)器中活性污泥馴化需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
1.4微電腦時(shí)控開(kāi)關(guān)通過(guò)定時(shí)開(kāi)啟和關(guān)閉控制供氣系統(tǒng)、排液和補(bǔ)液恒流泵，使活性污泥馴化過(guò)程中厭氧、好氧和沉淀各個(gè)過(guò)程按要求進(jìn)行，在整個(gè)馴化周期中自動(dòng)完成各個(gè)馴化循環(huán)。
1.5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮PHA抽提液(氯仿)至5-10mL。
1.6酸度計(jì)測(cè)定馴化液和每個(gè)循環(huán)流出液pH值。
2.程序2.1馴化液的配制C6H12O60.150～0.300g/L，MgSO40.050～0.100g/L，(NH4)2SO40.010～0.100g/L，CaCl20.010～0.020g/L，KCl 0.050～0.100g/L，K2HPO40.050～0.100g/L，蛋白胨0.100～0.200g/L，酵母0.010～0.100g/L，pH 7.02.2發(fā)酵液配制C6H12O65～10g/L，MgSO40.100～0.500/LL，CaCl20.010～0.050g/L微量元素1mL/L(成分見(jiàn)表1)，pH 7.0表1微量元素成分表

2.3PHA合成菌分離和計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的配制牛肉膏5～15g/L，蛋白胨5～15g/L，NaCl 3～7g/L，葡萄糖15～25g/L，瓊脂粉1.5～2.5g/100mL，尼爾紅(Nile red)0.1～0.3mL/100mL，pH 7.02.4總菌數(shù)計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的配制牛肉膏5～15g/L，蛋白胨5～15g/L，NaCl 3～7g/L，瓊脂粉1.5～2.5g/100mL，pH 7.02.5采用Nile-Red法分離高產(chǎn)土著PHA合成菌將污泥按比例稀釋為10-1～10-7，10-3～10-7每個(gè)稀釋度取0.1mL涂布PHA合成菌平板，培養(yǎng)4-5天后在312nm紫外燈下觀察，發(fā)桔黃色熒光的菌落即為PHA合成菌，保存PHA合成菌，并進(jìn)行發(fā)酵合成PHA實(shí)驗(yàn)，篩選到高產(chǎn)PHA菌株，用于活性污泥回注法。
2.6高產(chǎn)土著PHA合成菌的鑒定篩選所得的一株P(guān)HA高產(chǎn)菌株經(jīng)BIOLOG-System系統(tǒng)鑒定為Pseudomonas bathycetes。
2.7接種a.對(duì)照組活性污泥經(jīng)9000rpm離心15min，收集沉淀部分，取濕重75.00g加入3L反應(yīng)器中。
b.試驗(yàn)組活性污泥經(jīng)9000rpm離心15min，收集沉淀部分，取濕重75.00g加入3L反應(yīng)器中。高產(chǎn)土著PHA合成菌培養(yǎng)液經(jīng)9000rpm離心，取0.1g～0.25g濕菌體加入至3L反應(yīng)器中。
2.8活性污泥馴化對(duì)照組和試驗(yàn)組馴化方式相同2小時(shí)厭氧，4小時(shí)好氧，1.5小時(shí)沉淀，0.5小時(shí)排出1升上清液和加入1升新鮮馴化培養(yǎng)基，每個(gè)馴化循環(huán)8小時(shí)，每天實(shí)施3個(gè)循環(huán)，整個(gè)馴化周期為10天。
2.9馴化過(guò)程中的參數(shù)分析a.馴化液中總菌數(shù)計(jì)數(shù)方法每間隔48小時(shí)取馴化液1mL(好氧期末)，第一次取樣在馴化46小時(shí)實(shí)施。采用傾注平皿法計(jì)數(shù)總菌數(shù)取10支無(wú)菌試管，每管加入9mL無(wú)菌生理鹽水，吸取1mL馴化液加入到試管1中，混勻，樣品稀釋倍數(shù)即為101，從試管1中取1mL加入至試管2中，樣品稀釋倍數(shù)即為102，以此類推，稀釋至108。取103到108各稀釋度0.5mL，加至無(wú)菌平板中。同時(shí)，倒入熔化的計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(45～50℃)，混勻，30℃培養(yǎng)，24～48小時(shí)后計(jì)數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算總菌數(shù)。
b.馴化液中PHA合成菌數(shù)計(jì)數(shù)方法取樣方法同上述a。采用Nile-Red熒光染色法計(jì)數(shù)PHA合成菌數(shù)。取10支無(wú)菌試管，每管加入9mL無(wú)菌生理鹽水，吸取1mL馴化液加入到試管1中，混勻，樣品稀釋倍數(shù)即為101，從試管1中取1mL加入到試管2中，樣品稀釋倍數(shù)即為102，以此類推，稀釋至108。取103到108各個(gè)稀釋度0.5mL，加至無(wú)菌平板中，同時(shí)，倒入熔化的PHA合成菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(45～50℃)，混勻，30℃培養(yǎng)，4-5天后，在312nm下計(jì)數(shù)發(fā)桔黃色熒光的菌落數(shù)目，計(jì)算PHA合成菌數(shù)。
c.葡萄糖利用率每間隔48小時(shí)取排出馴化液1mL，第一次取樣在47.5小時(shí)左右實(shí)施。采用葡萄糖試劑盒[國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字，2004第3400196號(hào)]進(jìn)行測(cè)定。配制一定體積的工作液[R1(葡萄糖氧化酶加過(guò)氧化氫酶)與R2(磷酸緩沖液)以9比1的比例混合]。分別給空白對(duì)照管，標(biāo)準(zhǔn)樣品管和樣品測(cè)定管中加入3mL工作液。再依次加入20μL蒸餾水，20μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為5.55×10-3moL/L)和20μL待測(cè)樣品。于37℃放置15分鐘，505nm比色，得到A標(biāo)準(zhǔn)和A樣品。
樣品中葡萄糖量＝(A樣品/A標(biāo)準(zhǔn))×標(biāo)準(zhǔn)濃度×體積×葡萄糖分子量葡萄糖利用率＝[(初始葡萄糖量-樣品中葡萄糖量)/初始葡萄糖量]×100％2.10馴化后污泥合成PHA排凈馴化液，加入發(fā)酵培養(yǎng)基，好氧發(fā)酵48小時(shí)。
2.11PHA提取發(fā)酵結(jié)束，離心收集污泥沉淀，干燥至恒重。氯仿抽提，抽提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5-10mL，40-80倍冷甲醇中沉淀析出PHA。
2.12對(duì)照組(非回注法)和試驗(yàn)組(回注法)馴化過(guò)程中，PHA合成菌數(shù)與總菌數(shù)的變化情況見(jiàn)圖2。對(duì)照組(非回注法)和試驗(yàn)組(回注法)馴化過(guò)程中，葡萄糖利用率變化情況見(jiàn)圖3所示。
3.實(shí)施例1結(jié)果通過(guò)計(jì)算PHA產(chǎn)率[產(chǎn)率＝(PHA干重/污泥干重)×100％]，回注法比非回注法合成PHA產(chǎn)率提高了51.91％。結(jié)果說(shuō)明，回注單株高產(chǎn)土著PHA合成菌的方法能夠有效提高活性污泥合成PHA的產(chǎn)率。
實(shí)施例2采用回注混合高產(chǎn)土著PHA合成菌群提高污泥(生活及工業(yè)廢水污水處理廠好氧池活性污泥)合成PHA產(chǎn)率。
1.試驗(yàn)儀器同實(shí)施例12.程序2.1馴化液的配制同實(shí)施例12.2發(fā)酵液配制同實(shí)施例12.3PHA合成菌分離和計(jì)數(shù)培養(yǎng)基配制同實(shí)施例12.4總菌數(shù)計(jì)數(shù)培養(yǎng)基配制同實(shí)施例12.5采用Nile-Red法分離得到三株高產(chǎn)土著PHA合成菌方法同實(shí)施例12.6高產(chǎn)土著PHA合成菌的鑒定分離所得的三株高產(chǎn)土著PHA合成菌未進(jìn)行分類鑒定；2.7接種a.對(duì)照組同實(shí)施例1b.回注組活性污泥的收集，加入量與實(shí)施例1同。三株高產(chǎn)土著PHA合成菌分別經(jīng)9000rpm離心，各取0.033g～0.083g濕菌體加入至3L反應(yīng)器中。
2.8活性污泥馴化同實(shí)施例12.9馴化過(guò)程中的參數(shù)分析方法同實(shí)施例12.10馴化后污泥合成PHA同實(shí)施例12.11PHA提取同實(shí)施例12.12對(duì)照組(非回注法)和試驗(yàn)組(回注法)馴化過(guò)程中，PHA合成菌數(shù)與總菌數(shù)的變化情況見(jiàn)圖4。對(duì)照組(非回注法)和試驗(yàn)組(回注法)馴化過(guò)程中，葡萄糖利用率變化情況見(jiàn)圖5所示。
3.實(shí)施例2結(jié)果通過(guò)計(jì)算PHA產(chǎn)率[產(chǎn)率＝(PHA重量/污泥干重)×100％]，回注法比非回注法合成PHA產(chǎn)率提高了39.45％。結(jié)果說(shuō)明，回注混合高產(chǎn)土著PHA合成菌的方法能有效提高活性污泥合成PHA的產(chǎn)率。
權(quán)利要求
1.一種回注土著PHA合成菌提高活性污泥生產(chǎn)率的方法，包括以下步驟a)采用Nile-Red熒光染色法從實(shí)驗(yàn)所用活性污泥中分離得到一株或數(shù)株P(guān)HA合成菌，選擇其中一株或幾株土著高產(chǎn)PHA合成菌作為回注菌株；b)采用自行設(shè)計(jì)的活性污泥馴化裝置，進(jìn)行活性污泥馴化；c)土著高產(chǎn)PHA合成菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)和離心收集菌體后，將一定量加入至含有活性污泥和馴化液的馴化反應(yīng)桶中，進(jìn)行馴化；d)整個(gè)馴化周期為10天，溫度25℃，每個(gè)循環(huán)包括2小時(shí)厭氧，4小時(shí)好氧，1.5小時(shí)沉淀，0.5小時(shí)排出1升上清液和加入1升新鮮馴化液；e)馴化結(jié)束后，排凈馴化液加入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行PHA發(fā)酵，溫度30℃；f)發(fā)酵結(jié)束，收集污泥沉淀，干燥，采用氯仿抽提PHA，計(jì)算產(chǎn)率。
2.權(quán)力要求1所述的在活性污泥馴化開(kāi)始前，向馴化體系中加入少量土著高產(chǎn)PHA合成菌”規(guī)制”馴化方向，繼而進(jìn)行PHA發(fā)酵以提高活性污泥合成PHA產(chǎn)率的回注法。
3.權(quán)利要求1所述的活性污泥馴化的裝置，由空氣泵(1)、補(bǔ)充馴化液恒流泵(2)、馴化反應(yīng)桶(3)、排出上清液恒流泵(4)、微電腦時(shí)控開(kāi)關(guān)(5)、溫度計(jì)(6)和恒溫水浴攪拌裝置(7)、進(jìn)液孔(8)、出液孔(9)、排氣孔(10)、進(jìn)液桶(11)、排液桶(12)和排氣指示杯(13)等部分組成。
4.如權(quán)利要求2所述的活性污泥馴化裝置的特征在于微電腦時(shí)控開(kāi)關(guān)(5)能控制恒溫水浴攪拌裝置(7)、補(bǔ)充馴化液恒流泵(2)、排出上清液的恒流泵(4)和空氣泵(1)定時(shí)開(kāi)關(guān)，使整個(gè)馴化裝置成為一個(gè)整體，按照規(guī)定要求，自動(dòng)完成厭氧、好氧和沉淀馴化過(guò)程。補(bǔ)充馴化液的恒流泵(2)和排出上清液的恒流泵(4)能控制馴化反應(yīng)桶(3)中液體量恒定。馴化反應(yīng)桶(3)由4mm厚的有機(jī)玻璃制成(Φ＝150mm，h＝400mm)，內(nèi)置磁性轉(zhuǎn)子。馴化反應(yīng)桶(3)外加恒溫水浴攪拌裝置(7)，頂部有進(jìn)液孔(8)、出液孔(9)和排氣孔(10)。
5.權(quán)力要求2所述的單株回注菌和混合回注菌群是分離自實(shí)驗(yàn)所用活性污泥中高產(chǎn)土著PHA合成菌。
全文摘要
本發(fā)明采用回注少量土著PHA高產(chǎn)合成菌，“規(guī)制”馴化初期活性污泥的馴化方向，促使活性污泥中PHA合成菌成為優(yōu)勢(shì)菌群，提高活性污泥合成PHA產(chǎn)率。本發(fā)明的目的是建立一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速提高活性污泥合成PHA產(chǎn)率的方法－－土著PHA高產(chǎn)合成菌回注法；提供一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度較高、造價(jià)低廉、易操作的活性污泥馴化裝置。其操作步驟如下采用Nile－Red熒光染色法從試驗(yàn)所用活性污泥中分離得到PHA合成菌，篩選PHA高產(chǎn)菌作為回注用菌；將0.1－0.25g的回注菌(單株)或回注菌群(數(shù)株)接種于活性污泥馴化初期的反應(yīng)桶中，完成馴化周期；排凈馴化液，加入發(fā)酵培養(yǎng)基和微量元素液進(jìn)行PHA發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束收集污泥沉淀，干燥，使用氯仿抽提PHA；抽提液經(jīng)濃縮于冷甲醇中沉淀析出PHA。該方法能夠有效地提高活性污泥合成PHA的產(chǎn)率三成至五成。摘要附圖是本發(fā)明的活性污泥馴化裝置。
文檔編號(hào)C12P7/64GK1786147SQ20051001548
公開(kāi)日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2005年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日
發(fā)明者宋存江, 曾猛, 陶劍, 鄭承剛, 金映虹, 鄧飛, 王淑芳, 孫亞民 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)