專利名稱：一種重組牛腸激酶的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了一種高效生產(chǎn)重組牛腸激酶(Enterokinase or Enteropeptidase，EK)的生產(chǎn)方法，以及有關(guān)的工程細(xì)胞的構(gòu)建、重組牛腸激酶的表達(dá)和純化工藝。
背景技術(shù)：
目前，在生物學(xué)領(lǐng)域，很多時候要求切割蛋白，把靶蛋白和運(yùn)載蛋白切開，因此需要在靶蛋白和運(yùn)載蛋白的連接區(qū)設(shè)計特異的蛋白酶解位點(diǎn)，已經(jīng)有許多商業(yè)化載體在其多克隆位點(diǎn)前和編碼運(yùn)載蛋白序列之間加入了蛋白酶解位點(diǎn)的序列。常見的蛋白酶主要有Xa因子、凝血酶、腸激酶(Enterokinase orEnteropeptidase)等等。但值得指出的是，實(shí)際操作中這些酶在很多時候不能夠?qū)崿F(xiàn)完全切割。另外，蛋白酶的特異性也不是絕對的，如凝血酶的最佳切割位點(diǎn)有兩種，可見其在實(shí)際物系中發(fā)生非特異切割的可能性很大。
基于以上種種原因，在眾多備選的酶解方法中，腸激酶作為一種對(Asp)4-Lys序列表現(xiàn)出高度特異性的絲氨酸蛋白酶，因其反應(yīng)條件相對比較寬松，在pH4.5-9.5、溫度4℃-45℃之間完全保有活性；有無變性劑也均不影響酶切作用。反應(yīng)過程中底物蛋白質(zhì)其他無關(guān)部位發(fā)生斷裂的可能性低，并且其切割位點(diǎn)在全部識別序列之后，切出的目標(biāo)蛋白首位氨基酸可完全忠實(shí)于天然蛋白等特點(diǎn)，在基因工程制藥領(lǐng)域成為融合表達(dá)時下游純化的首選工具酶之一。
腸激酶是脊椎動物十二指腸壁粘膜分泌的一種司職食物消化的蛋白酶，近年于微生物、血液、昆蟲、海星中也發(fā)現(xiàn)有類似物。牛的腸激酶由大小兩個亞基組成，其中小亞基具有酶活中心的基本特征，因而被命名為催化亞基，由235個氨基酸組成，理論分子量26,262道爾頓，理論等電點(diǎn)(pI)5.1，其保有全酶的酶切活性與對底物的高度特異性，為牛腸激酶在基因工程制藥領(lǐng)域被廣泛研究與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
國外對重組牛腸激酶催化亞基(EKL)的表達(dá)研究始于1993年，由美國GI公司LaVallie等在哺乳動物細(xì)胞COS中進(jìn)行了功能性表達(dá)，隨后以人工合成的六肽底物Gly-(Asp)4-Lys-β-萘胺和天然底物胰蛋白酶原驗(yàn)證了這種由705bp編碼的重組蛋白亞基保持著全酶的活性，拉開了以基因工程的方法生產(chǎn)重組牛腸激酶催化亞基(rEKL)的序幕。1995年Lisa在大腸桿菌中融合表達(dá)rEKL，并在目標(biāo)蛋白編碼序列前引入腸激酶識別位點(diǎn)，融合蛋白經(jīng)自催化切割釋放出活性rEKL。重組蛋白酶活與在COS中的報道基本一致，但產(chǎn)率增至1mg/125mg濕菌。相較于用提純的方法獲得的天然牛腸激酶全酶(EKn)，rEKL對天然底物胰蛋白原的活性要低幾十倍，而相反對人工底物如白介11融合蛋白的酶切活性比EKn要高出上百倍。
1996年Laura等首次嘗試應(yīng)用酵母表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)rEKL，經(jīng)離子交換與親和層析純化后，目標(biāo)蛋白產(chǎn)量達(dá)6.3mg/L發(fā)酵液上清，其活性也明顯高于大腸桿菌和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。進(jìn)而，該產(chǎn)品被應(yīng)用于當(dāng)時美國正在新藥研發(fā)階段的重組人白細(xì)胞介素11的下游純化，取得了令人滿意的結(jié)果。隨后，研究小組所屬的Invitrogen公司將此重組酶制劑商品化，廣泛應(yīng)用于基因工程制藥領(lǐng)域和其他以EK為識別位點(diǎn)的融合蛋白。
2000年南斯拉夫的一個科研小組成功地將EKL在絲狀真菌(filamentousfungus Aspergillus niger)進(jìn)了高效分泌表達(dá)，活性蛋白收率1.9mg/L培養(yǎng)液上清。2001年韓國科學(xué)家Seong首次將組氨酸親和標(biāo)記引入rEKL的3’端，在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達(dá)并有效地分泌到培養(yǎng)基中。rEKL-(His)6產(chǎn)量為1mg/L發(fā)酵液上清，其活性與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)持平。
國內(nèi)目前對重組腸激酶的研究還很少，僅有的公開報道是2002年YUAN等運(yùn)用Trx-EKL融合表達(dá)體系對腸激酶催化亞基進(jìn)行了原核表達(dá)，純化后酶產(chǎn)量4.3mg/100mL發(fā)酵液，酶比活720U/mg蛋白。中國專利2004100148607采用畢赤氏酵母中表達(dá)了在末端添加了組氨酸標(biāo)簽的重組黃牛腸激酶催化亞基，得率5mg/L。
因此目前重組牛腸激酶的生產(chǎn)存在工藝復(fù)雜，成本高，產(chǎn)物得率低，活性弱等問題。目前商品化的動物腸組織來源的腸激酶全酶活性不高，且常伴污染性絲氨酸蛋白酶的出現(xiàn)。而且因進(jìn)口酶制劑本身的高成本，使得采用此酶的融合表達(dá)一向被稱為是“一套昂貴的表達(dá)體系”。
隨著越來越多的基因工程產(chǎn)品采用融合表達(dá)策略，rEKL具有重要的市場利用價值，而且對進(jìn)一步促進(jìn)我國蛋白融合技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用也具有極其重要的意義。
本發(fā)明提供了一種高效生產(chǎn)重組牛腸激酶的生產(chǎn)方法，采用新型畢赤酵母表達(dá)體系分泌表達(dá)牛腸激酶催化亞基，通過優(yōu)化其基因序列，并優(yōu)化發(fā)酵與純化工藝，獲得快速、簡便、穩(wěn)定、活性高的一種牛腸激酶的生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效簡便的生產(chǎn)重組牛腸激酶的方法。
本發(fā)明的另一目的就是提供重組牛腸激酶的編碼序列和用于該方法的表達(dá)載體及工程細(xì)胞。
在本發(fā)明的第一方面，就是提供了一種編碼重組牛腸激酶的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區(qū)與SEQID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是pGAPZA/α-EKL。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種工程細(xì)胞，其特征在于，它整合有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的工程細(xì)胞是畢赤酵母。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)重組牛腸激酶的方法，該方法包括步驟a)在適合的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，從而分泌表達(dá)出重組牛腸激酶；b)分離純化分泌的重組牛腸激酶蛋白。


圖1是融合基因α-EKL的構(gòu)建示意圖。
圖2是重組質(zhì)粒pGAPZA/α-EKL構(gòu)建示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人通過深入而廣泛的研究，通過基因編碼序列的優(yōu)化設(shè)計，在胞外構(gòu)建了含有釀酒酵母α-因子前導(dǎo)肽序列的重組牛腸激酶融合蛋白基因，使其在畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)中高效分泌表達(dá)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
根據(jù)重組牛腸激酶催化亞基天然氨基酸序列，按密碼子偏愛性，在不改變氨基酸序列的條件下，全基因合成重組牛腸激酶催化亞基的目的基因序列，將該基因克隆到pUCl9中測序驗(yàn)證后，用分子生物學(xué)方法，體外構(gòu)建融合蛋白α-EKL的融合序列，然后克隆入表達(dá)載體pGAPZA。轉(zhuǎn)化、整合入P.pastoris宿主細(xì)胞染色體，通過施加不同濃度抗性，篩選抗性最強(qiáng)克隆，進(jìn)而篩選出高表達(dá)工程細(xì)胞。搖瓶試驗(yàn)表明，生長48小時后，表達(dá)水平5mg/L以上。
在獲得工程細(xì)胞后，便可在適合的條件下培養(yǎng)工程細(xì)胞。在本發(fā)明中，工程菌表達(dá)的重組牛腸激酶發(fā)酵條件沒有特別限制?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵條件。例如，合適的培養(yǎng)基包括(但不限于)以下組成(i)氮源含有機(jī)氮源和無機(jī)氮源，其中有機(jī)氮源如蛋白胨、酵母粉，或二者的混合物，總濃度0.1-3％；無機(jī)氮源如氨水或NH4Cl、(NH4)2SO4等銨鹽，濃度0-1.5％。
(ii)無機(jī)鹽包括磷酸鹽、枸鹽酸鹽、Mg2+鹽等。較佳地，磷酸鹽緩沖體系濃度20-200mM，pH5-8；Mg2+鹽0-5mM。
(iii)在培養(yǎng)基中添加維生素B1作為補(bǔ)充維生素，濃度1～1000PPM。
(iv)根據(jù)M9培養(yǎng)基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(v)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等。可以是單一碳源，也可以是混合碳源。較佳地，碳源選自下組甘油濃度為0.1-3％；乳糖濃度為0.1-3％；葡萄糖濃度為0.1-1.5％。
為大規(guī)模獲得重組牛腸激酶，需要在發(fā)酵罐中進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)。本發(fā)明研究了中試發(fā)酵工藝，優(yōu)化后的表達(dá)水平達(dá)到30mg/L。
在發(fā)酵表達(dá)重組牛腸激酶后，對表達(dá)的rEKL進(jìn)行分離。
通常，發(fā)酵樣品先以離心、過濾等方式獲得發(fā)酵液上清，去除菌體。發(fā)酵液上清可通過鹽析、超濾等方法進(jìn)行初步純化后再進(jìn)行層析純化，也可直接進(jìn)行層析純化。
適用于本發(fā)明的層析技術(shù)包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
經(jīng)過2-3步純化，可得到rEKL純品，純化得率40％以上，純度95％以上，純品得率約12mg/L發(fā)酵液。
純化后rEKL的酶活活性用融合蛋白底物法測定，經(jīng)測定，其比活約為2.5×106IU/mg。
在本發(fā)明的一個實(shí)例中，提供了重組牛腸激酶融合蛋白基因的獲得及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，優(yōu)化后的基因使得表達(dá)重組牛腸激酶的表達(dá)量提高。
在本發(fā)明的另一個實(shí)例中，通過篩選獲得了高表達(dá)重組牛腸激酶的菌株，提高了重組牛腸激酶的表達(dá)量。
在本發(fā)明的另一個實(shí)例中，通過不同啟動子之間的比較，選擇合適的表達(dá)載體表達(dá)重組牛腸激酶蛋白。
在本發(fā)明的另一個實(shí)例中，經(jīng)過發(fā)酵工藝的優(yōu)化，進(jìn)一步提高了重組牛腸激酶的表達(dá)量。
在本發(fā)明的另一個實(shí)例中，經(jīng)過純化工藝優(yōu)化，可得到純品12mg/L。
中試研究表明，產(chǎn)品制造工藝穩(wěn)定，操作簡單，周期短，成本低，每升發(fā)酵液可獲得重組牛腸激酶純品12mg。適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)優(yōu)化了牛腸激酶催化亞基基因序列，并在該序列前導(dǎo)入了釀酒酵母α-因子前導(dǎo)肽序列，該融合蛋白基因非常適合在畢赤酵母中分泌表達(dá)，具有高表達(dá)、高穩(wěn)定的特點(diǎn)。
(2)表達(dá)工藝簡單，表達(dá)載體含有不需要甲醇誘導(dǎo)的啟動子，能組成型的高效表達(dá)牛腸激酶，在發(fā)酵過程中無需更換培養(yǎng)基或添加誘導(dǎo)劑，簡化了操作工藝，比甲醇作為誘導(dǎo)劑的表達(dá)菌具有更高的安全性，有利于規(guī)模化生產(chǎn)。
(3)通過控制關(guān)鍵的發(fā)酵工藝條件，使表達(dá)水平進(jìn)一步提高。
(4)純化工藝簡便，回收率高。由于是分泌蛋白，因此簡化了純化工序，使純化回收率大大提高，使大規(guī)模生產(chǎn)重組牛腸激酶成為可能。
(5)采用畢赤酵母為工程細(xì)胞，很好地保持了重組牛腸激酶的活性。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 融合基因的獲得及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)牛腸激酶催化亞基的氨基酸序列，考慮畢赤酵母的密碼子偏愛性，全基因合成編碼重組牛腸激酶催化亞基的目的基因序列，將該基因序列克隆到pUC19中并測序驗(yàn)證。融合蛋白α-EKL的構(gòu)建見圖1，以含有rEKL編碼序列的質(zhì)粒pUC19/rEKL為模板，通過PCR擴(kuò)增得到可與釀酒酵母α-因子前導(dǎo)肽序列以正確的框架進(jìn)行融合的EKL基因。同時，以含有釀酒酵母α-因子前導(dǎo)肽編碼序列的質(zhì)粒pPIC9K(購自Invitrogen公司)為模板，PCR擴(kuò)增得到α-因子前導(dǎo)肽序列。把純化后的上述兩種PCR產(chǎn)物分別用限制酶XhoI進(jìn)行消化，對兩種酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接。以連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到可用于分泌表達(dá)的融合基因α-EKL。
重組質(zhì)粒構(gòu)建線路如圖2所示，將人工合成的α-EKL基因用EcoRI進(jìn)行酶切處理后，瓊脂糖凝膠電泳回收約1kb片段；同時將質(zhì)粒pGAPZA(購自Invitrogen公司)用EcoRI進(jìn)行酶切，回收大片段。將兩個片段用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α(購自Promega公司)。小量制備質(zhì)粒，通過酶切鑒定含α-EKL的陽性克隆。pGAPZA接入外源基因后可以將其多拷貝整合到宿主菌的染色體上進(jìn)行高效表達(dá)，同時本身攜帶有一個Zeocin抗性基因，可以用于轉(zhuǎn)化子的篩選。載體pGAPZA多克隆位點(diǎn)前有組成性表達(dá)的GAP啟動子，不需誘導(dǎo)劑即可在宿主菌GS115中高效表達(dá)外源基因。
實(shí)施例2 高表達(dá)重組牛腸激酶工程菌株的篩選將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pGAPZA/α-EKL大量制備，線性化，電穿孔轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞P.pastorisGS115，涂布含有不同濃度抗生素Zeocin的YPDS平板篩選高抗的陽性克隆，并進(jìn)行小搖表達(dá)實(shí)驗(yàn)篩選得到重組牛腸激酶高表達(dá)的工程酵母菌株(含α-EKL)。
實(shí)施例3 選擇合適的表達(dá)載體在構(gòu)建重組質(zhì)粒pGAPZA/α-EKL時，我們同時構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPIC9K/rEKL，通過與實(shí)施例2相似的過程，我們獲得了重組牛腸激酶高表達(dá)的工程酵母菌株(含rEKL)。將這兩個工程酵母菌株在表達(dá)環(huán)境、表達(dá)時間等一致的前提下的表達(dá)量做了一個比較，發(fā)現(xiàn)含α-EKL工程酵母菌株中牛腸激酶的表達(dá)量明顯高于含rEKL的工程酵母菌株。根據(jù)結(jié)果，我們選擇GAP作為表達(dá)腸激酶的首選啟動子。

實(shí)施例4 添加不同蛋白保護(hù)劑對表達(dá)水平的影響取單克隆，接種到BMGY一級種子液中，培養(yǎng)17-20hr；按1∶10的比例二級接種于250ml BMGY的1L三角燒瓶中，培養(yǎng)4~8hr左右，上罐發(fā)酵，pH 5.0、溫度20℃、DO＞35％，待溶氧上升后流加50％甘油內(nèi)含10％CA，或10％Peptone或10％Tryptone的培養(yǎng)液，36hr后取樣。樣品檢測SDS-PAGE和蛋白含量以確定誘導(dǎo)階段的最佳蛋白保護(hù)劑。
實(shí)施例5 重組腸激酶純化對發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮，將發(fā)酵液的緩沖體系替換為磷酸鹽溶液PB。超濾濃縮及更換緩沖液使用Millipore超濾器，超濾膜截流分子量為10KD，超濾時留取濃縮液(作用是去除小分子雜質(zhì)和鹽類)。發(fā)酵液上清超濾至體積剩下500ml左右，加入PB，繼續(xù)超濾；反復(fù)此程序，直至樣品的電導(dǎo)水平和PB緩沖液的電導(dǎo)水平接近。
層析1(陰離子交換層析)層析介質(zhì)Q Sepharose FF緩沖液溶液APB溶液BPB+1M NaCl上樣將超濾濃縮的hK5溶液上樣。
清洗上樣后用6CV的溶液A清洗層析柱。
梯度清洗后用10CV將溶液B從0％升至100％。
收集收集EKL樣品峰。
層析2(疏水層析)層析介質(zhì)phenyl Sepharose FF緩沖液溶液APB+1M NaCl溶液BPB上樣將層析1的樣品峰上樣。
清洗上樣后用6CV的溶液A清洗層析柱。
梯度清洗后用10CV將溶液B從0％升至100％。
收集收集EKL樣品峰。
層析3(分子篩層析)層析介質(zhì)Sephadex 75緩沖液PB上樣層析1收集的樣品主分。
樣品經(jīng)過此三步純化，即陰離子交換層析、疏水層析、分子篩層析以后，純度提高至95％以上，可得蛋白純品12mg/L。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海新生源醫(yī)藥研究有限公司<120>一種重組牛腸激酶的生產(chǎn)方法<160>2<210>1<211>705<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)…(705)<223>優(yōu)化的重組牛腸激酶序列<400>1attgtcggag gaagtgactc cagagaagga gcctggcctt gggtcgttgc tctgtatttc 60gacgatcaac aggtctgcgg agcttctctg gtgagcaggg attggctggt gtcggccgcc 120cactgcgtgt acgggagaaa tatggagccg tctaagtgga aagcagtgct aggcctgcat 180atggcatcaa atctgacttc tcctcagata gaaactaggt tgattgacca aattgtcata 240aacccacact acaataaacg gagaaagaac aatgacattg ccatgatgca tcttgaaatg 300aaagtgaact acacagatta tatacagcct atttgtttac cagaagaaaa tcaagttttt 360cccccaggaa gaatttgttc tattgctggc tggggggcac ttatatatca aggttctact 420gcagacgtac tgcaagaagc tgacgttccc cttctatcaa atgagaaatg tcaacaacag 480atgccagaat ataacattac ggaaaatatg gtgtgtgcag gctatgaagc aggaggggta 540gattcttgtc agggggattc aggcggacca ctcatgtgcc aagaaaacaa cagatggctc 600ctggctggcg tgacgtcatt tggatatcaa tgtgcactgc ctaatcgccc aggggtgtat 660gcccgggtcc caaggttcac agagtggata caaagttttc tacat 705
<210>2<211>235<212>PRT<213>智人<400>2Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val1 510 15Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser20 25 30Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met35 40 45Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn50 55 60Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile Asn65 70 75 80Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met His85 90 95Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys Leu100 105 110Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile Ala115 120 125Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu Gln130 135 140 145Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln Met150 155 160Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu Ala165 170 175Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Cys180 185 190Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly Tyr195 200 205Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro Arg210 215 220 225Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His230 23權(quán)利要求
1.一種編碼牛腸激酶催化亞基蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區(qū)與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
2.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于，它是含有GAP啟動子。
4.一種工程細(xì)胞，其特征在于，它整合有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求4所述的工程細(xì)胞，其特征在于，它是畢赤酵母。
6.一種牛腸激酶的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)在適合的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求5所述的工程細(xì)胞，從而分泌表達(dá)出牛腸激酶蛋白；(b)分離純化出表達(dá)的牛腸激酶蛋白。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(a)所示的表達(dá)條件為誘導(dǎo)時間為12-120小時，較佳的為24-100小時；誘導(dǎo)pH為3-9，較佳的為5-7。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(b)所示的表達(dá)條件為(1).發(fā)酵液通過簡單離心或超濾獲得含有目的蛋白的上清液；(2).通過簡單的離子交換層析、疏水層析等簡單步驟，即可獲得純度在95％以上的純品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組牛腸激酶的核苷酸序列，高效生產(chǎn)重組牛腸激酶的生產(chǎn)方法，以及有關(guān)的表達(dá)載體與工程細(xì)胞構(gòu)建、表達(dá)和純化的工藝。優(yōu)化后的重組牛腸激酶蛋白基因非常適合在畢赤酵母中組成型分泌表達(dá)，同時通過發(fā)酵與純化工藝優(yōu)化，提高了表達(dá)量和純化得率，具有表達(dá)高、穩(wěn)定性好、活性高、生產(chǎn)工藝簡便的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明可高效、簡便、低成本的獲得重組牛腸激酶純品。
文檔編號C12N9/64GK1869236SQ20051002613
公開日2006年11月29日 申請日期2005年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月24日
發(fā)明者孫九如, 任軍, 黃陽濱, 杜碧金, 沈麗麗 申請人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司