一種制備重組牛腸激酶催化亞基的方法
【專利摘要】一種制備重組牛腸激酶催化亞基BEKL的基因工程制備方法，該方法將人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽基因3’末端與牛腸激酶催化亞基BEKL基因5’末端進(jìn)行基因融合，該融合基因克隆到醇氧化酶AOX啟動(dòng)子下游，由人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽介導(dǎo)牛腸激酶催化亞基BEKL在畢赤酵母Pichia.pastoris中的分泌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中，無需變性和復(fù)性即獲得正確的空間構(gòu)象和生物活性。由于在牛腸激酶催化亞基BEKL羧基末端添加了組氨酸標(biāo)簽6×His，表達(dá)產(chǎn)物可以通過Ni2+親和層析進(jìn)行分離純化。本發(fā)明對(duì)高效制備具有催化活性的重組牛腸激酶催化亞基BEKL具有重要應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種制備重組牛腸激酶催化亞基的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]腸激酶(Enterokinase，EK, EC3.4.21.9)是一種存在于哺乳動(dòng)物十二指腸內(nèi)的絲氨酸蛋白酶，它可以特異性識(shí)別胰蛋白酶原中的Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DDDDK)序列并切割其羧基末端的肽鍵，從而將胰蛋白酶原激活成胰蛋白酶。目前已從人、鼠、豬、牛等動(dòng)物體內(nèi)分離出天然腸激酶，其中以牛腸激酶的理化性質(zhì)研究得最為透徹。牛腸激酶分子量為150kDa，由一條115kDa的重鏈(結(jié)構(gòu)亞基)和一條35kDa的催化亞基(催化亞基)以一個(gè)二硫鍵連接而成(J Biol Chem.1979，254 (5): 1677-1683.)，在 ρΗ4.5 ~9.5 和溫度 4 ~45°C范圍內(nèi)可特異性識(shí)別胰蛋白酶原中DDDDK序列并在C端水解肽鏈，釋放出具有活性的胰蛋白酶。此外，1984年，Light A和Fonseca P證明牛腸激酶輕鏈即具有全酶所具有的特異性切割活性(J Biol Chem.，1984，259 (21): 13195-13198.)，因此，該鏈也被稱為催化亞基。
[0003]由于腸激酶對(duì)氨基酸序列DDDDK的特異性識(shí)別和切割特性，且切割后的目的蛋白N端沒有冗余的氨基酸殘基，因此在基因工程融合表達(dá)產(chǎn)物的切割加工方面具有很好的應(yīng)用價(jià)值。目前許多具有商業(yè)開發(fā)價(jià)值的藥物蛋白和多肽，如抗骨質(zhì)疏松藥物重組人甲狀旁腺素、腫瘤壞死因子-β、磷脂酶A2、白細(xì)胞介素-11等，均可采用融合方式進(jìn)行表達(dá)，然后采用蛋白酶切割融合蛋白， 釋放出目的蛋白，這方面的催化應(yīng)用為腸激酶提供了廣闊的市場(chǎng)空間。
[0004]由于從動(dòng)物組織提取腸激酶來源有限，純化困難，且容易污染有其他蛋白酶，給其實(shí)際應(yīng)用帶來了困難，因此采用基因工程方法制備高純度的腸激酶輕鏈(EKy催化亞基)已成為該領(lǐng)域的主要研究方向。然而，由于牛腸激酶催化亞基BEl具有4對(duì)分子內(nèi)二硫鍵，是一種結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的蛋白，需要建立有效的表達(dá)方式以保證其正確折疊才能得到具有活性的表達(dá)產(chǎn)物。
[0005]為了解決這一問題，目前采用的表達(dá)策略主要有兩種:
[0006]一、將可促進(jìn)二硫鍵形成的伴侶蛋白與牛腸激酶催化亞基BEl進(jìn)行融合表達(dá)，并在兩者之間設(shè)計(jì)一個(gè)含牛腸激酶催化亞基BEl特異性切割序列(Asp)4-Lys的連接肽，然后通過融合蛋白中牛腸激酶催化亞基BEl的自切割釋放出目的蛋白牛腸激酶催化亞基BEKp例如 Huang, L.等(Prep Biochem Biotechnol.2007 ；37 (3):205-17.)將牛腸激酶催化亞基BEl基因與二硫鍵氧化還原酶(DsbA)基因融合后在E.coli中進(jìn)行表達(dá)，融合蛋白分泌表達(dá)于細(xì)胞周質(zhì)后，通過自催化反應(yīng)釋放出BEKL，經(jīng)親和純化sBEKLC產(chǎn)量達(dá)到6.8mg / L。
[0007]二、將牛腸激酶催化亞基BEl基因嵌合在信號(hào)肽基因下游，目的產(chǎn)物在信號(hào)肽介導(dǎo)下分泌至細(xì)胞外培養(yǎng)基中，分泌過程中信號(hào)肽被信號(hào)肽酶識(shí)別并切除，且表達(dá)產(chǎn)物直接形成具有正確天然構(gòu)象的活性蛋白，省卻了產(chǎn)物變性、切割、復(fù)性等復(fù)雜的產(chǎn)物后處理程序，給目的產(chǎn)物的分離純化帶來極人方便。例如，Svetina M.等(J.Biotechnol.2000, 76:245-251.)將插入了 KEX-2蛋白酶酶切位點(diǎn)的牛腸激酶催化亞基BEKl的cDNA融合在葡萄糖淀粉酶基因下游，在黑曲霉中進(jìn)行分泌表達(dá)，產(chǎn)量達(dá)到5mg / L0 LaVallie ER等(J.Biol.Chem.，1993,268:23311-23317.)以哺乳動(dòng)物絲氨酸蛋白酶PACE的前肽作為分泌引導(dǎo)序列融合到BEl的N末端，將此融合基因PACE-E&構(gòu)建到PMT3表達(dá)載體上然后轉(zhuǎn)染猴腎COS-1細(xì)胞進(jìn)行分泌表達(dá)獲得了具有活性的BEKl。Choi等(Biotechnol Bioeng.，2001，75 (6):718-724)將牛EKl cDNA克隆至載體pIL20Gh，構(gòu)建了 pIL20牛EKl分泌表達(dá)載體，在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中進(jìn)行分泌表達(dá),經(jīng)Ni柱親和層析分離純化后牛腸激酶催化亞基BEKl的產(chǎn)量約為Img / L0
[0008]此外，由于畢赤酵母Pichia.pastoris表達(dá)系統(tǒng)具有較強(qiáng)的翻譯后修飾功能以及培養(yǎng)成本低廉、容易實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)，目前已有多篇報(bào)道應(yīng)用該系統(tǒng)分泌表達(dá)牛腸激酶催化亞基 BEKl。例如，F(xiàn)ang L.等(Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2004,36(7) =513-517)利用釀酒酵母α配對(duì)因子信號(hào)肽序列在Pichia.pastoris GS115中分泌表達(dá)牛腸激酶催化亞基BEKy經(jīng)Ni金屬螯合層析對(duì)發(fā)酵液上清中的目的產(chǎn)物分離純化后，產(chǎn)量達(dá)至丨J 5.4mg / L0Fang Z.J.等(Bioinformatics and Biomedical Engineering, 2009.1CBBE2009.3rd International Conference)同樣利用分泌表達(dá)載體pPIC9中的釀酒酵母α配對(duì)因子信號(hào)肽序列將牛腸激酶催化亞基BEKlj在Pichia.pastoris GS115中進(jìn)行了分泌表達(dá)，分離純化后產(chǎn)率為10.9mg / L發(fā)酵液。由此可見，雖然釀酒酵母α配對(duì)因子信號(hào)肽序列可以有效引導(dǎo)牛腸激酶催化亞基BEK1j在畢赤酵母Pichia.pastoris中進(jìn)行有效分泌表達(dá),但表達(dá)水平較低。
[0009]綜上所述，由于牛腸激酶催化亞基BEl具有4對(duì)分子內(nèi)二硫鍵，是一種結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的蛋白，目前所采用的表達(dá)方法表達(dá)水平較低，因此建立有效的表達(dá)方式對(duì)BEl進(jìn)行高水平表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物可以 自動(dòng)正確折疊成具有催化活性的功能分子，這對(duì)其實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]本發(fā)明目的在于采用人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽序列構(gòu)建一種新的牛腸激酶催化亞基BEI^分泌表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌GSl 15后，可以實(shí)現(xiàn)牛腸激酶催化亞基BEKl在畢赤酵母Pichia.pastoris中的高效分泌表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物無需進(jìn)行下游的變性復(fù)性即具有生物催化活性。
[0011]本發(fā)明構(gòu)建的用于牛腸激酶催化亞基BEl在畢赤酵母中分泌表達(dá)的載體，其特征是應(yīng)用人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽介導(dǎo)牛腸激酶催化亞基BEl在畢赤酵母中的分泌表達(dá)。
[0012]本發(fā)明采用PCR技術(shù)將人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽與牛腸激酶催化亞基BEl進(jìn)行基因融合，然后將該融合基因克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K(Invitrogen公司)的AOX啟動(dòng)子下游，構(gòu)建得到由人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽介導(dǎo)牛腸激酶催化亞基BEl在畢赤酵母中分泌表達(dá)的新型載體。
[0013]本發(fā)明構(gòu)建的分泌表達(dá)牛腸激酶催化亞基BE&的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌GS115后，經(jīng)篩選獲得陽(yáng)性克隆，其中牛腸激酶催化亞基BEl基因處于AOX啟動(dòng)子下游，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，牛腸激酶催化亞基BEl目的產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。
[0014]為方便表達(dá)產(chǎn)物的下游分離純化，本發(fā)明在目的蛋白牛腸激酶催化亞基BEl羧基端添加了 6XHis標(biāo)簽,這樣發(fā)酵液上清經(jīng)過Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析、Ni2+親和層析即可方便制得純的具有催化活性的牛腸激酶催化亞基BEl表達(dá)產(chǎn)物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1、本發(fā)明構(gòu)建的HSA signal-EKfHisji合基因序列?；疑糠种甘救搜灏椎鞍仔盘?hào)肽(HSA signal)序列，箭頭指示信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)[0016]圖2、本發(fā)明構(gòu)建的pPIC9K / HSA signal-EKL_His6重組表達(dá)質(zhì)粒圖譜
[0017]圖3、本發(fā)明構(gòu)建的牛腸激酶催化亞基BEI^工程菌高密度發(fā)酵上清Western-Blot分析檢測(cè)結(jié)果，一抗為抗組氨酸標(biāo)簽6 XHis tag抗體
[0018]泳道1:GS115宿主菌發(fā)酵液上清對(duì)照組
[0019]泳道2:牛腸激酶催化亞基BEKl工程菌發(fā)酵液上清Western-Blot分析檢測(cè)結(jié)果
[0020]圖4、本發(fā)明中牛腸激酶催化亞基BEI^蛋白純化產(chǎn)物SDS-PAGE分析
[0021]泳道1:分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，分子量分別為116.0，66.2，45.0，35.0，25.0，18.4，14.4 kDa(自上而下)
[0022]泳道2:工程菌發(fā)酵液上清
[0023]泳道3:發(fā)酵液上清經(jīng)Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析分離純化后表達(dá)產(chǎn)物
[0024]泳道4 =Ni2+柱親和層析純化后表達(dá)產(chǎn)物
[0025]圖5、本發(fā)明中牛腸激酶催化亞基BEI^分泌表達(dá)產(chǎn)物C-18柱RP-HPLC分析檢測(cè)
[0026](I)工程菌發(fā)酵液上清
[0027](2)發(fā)酵液上清經(jīng)Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析分離純化后表達(dá)產(chǎn)物
[0028](3) Ni2+柱親和層析純化后表達(dá)產(chǎn)物
[0029]圖6、本發(fā)明制備的牛腸激酶催化亞基BEl切割活性分析(底物為含腸激酶酶切位點(diǎn)DDDDK的水蛭素II1-露那辛融合蛋白HV3-Lunasin
[0030]M:分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，分子量分別為100，30，25，20，15，10，5，3.4kDa (自上到下)泳道1:10 ul濃度為0.1 μ g / μ I的水蛭素II1-露那辛融合蛋白HV3-Lunasin
[0031]泳道2-8:20μ I 底物(Iyg / μ I)中分別添加 0，0.1,0.15，0.2，0.5，1，2 μ g 牛腸激酶催化亞基BEKl，37°C切割16小時(shí)
【具體實(shí)施方式】
[0032]實(shí)施例1人白蛋白信號(hào)肽-牛腸激酶催化亞基BEl融合基因設(shè)計(jì)與克隆
[0033]根據(jù)人白蛋白信號(hào)肽氨基酸序列以及牛腸激酶催化亞基氨基酸序列，應(yīng)用密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)軟件 OPTIMIZER (http: / /genomes.urv.es / OPTIMIZER)及 GeneDesiRner (http: / / www.DNA20.com)設(shè)計(jì)了在畢赤酵母中表達(dá)的人白蛋白信號(hào)肽_牛腸激酶催化亞基融合基因序列(見附圖1)。此外，為了基因克隆需要在基因5’和3’端分別添加了 BamHI和EcoRI限制性酶切位點(diǎn)，同時(shí)為方便表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，在牛腸激酶催化亞基羧基末端添加了 6XHis表達(dá)標(biāo)簽。附圖1中陰影部分為人血清白蛋白信號(hào)肽序列，箭頭所指位置為信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)。[0034]將上述HSA Signal-BEKfHiS6基因用BamHI和EcoRI雙酶切后克隆到畢赤酵母分泌表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K (Invitrogen公司)中得到重組質(zhì)粒pPIC9K / HSA signal-EKL_His6 (圖2)。
[0035]實(shí)施例2重組表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性重組子篩選與鑒定
[0036]用SacI酶將重組質(zhì)粒pPIC9K / HSA signal-EKL-His6酶切線性化，然后采用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化Pichia.pastoris宿主菌GSl 15 (電轉(zhuǎn)化參數(shù):1.5KV、25 μ F和200 Ω，4ms)。電轉(zhuǎn)化后立即向電轉(zhuǎn)杯中加入ImL預(yù)冷的IM山梨醇，30°C溫育2小時(shí)后，取一定量(200 μ L)涂布于MD平板，30°C培養(yǎng)2-6天。[0037]G418抗性篩選，待克隆長(zhǎng)出后，將單菌落用2_4mlYPD液體培養(yǎng)基沖洗下來，測(cè)定OD6tltol, IOD6tltol相當(dāng)于細(xì)胞數(shù)為5父107個(gè)/ ml，之后再用YH)液體培養(yǎng)基稀釋至每200 μ I含細(xì)胞數(shù)量級(jí)為105，涂布于含不同濃度G418的YPD平板上，G418濃度梯度為0.5，1，2，4，6，8mg / ml，30°C培養(yǎng) 2-5 天。
[0038]選擇最高抗性G418-YPD平板上的單菌落，轉(zhuǎn)移到MM平板和MD平板上篩選Mut+和Muts型轉(zhuǎn)化子。并采用菌落PCR的方法篩選出陽(yáng)性克隆。
[0039]實(shí)施例3畢赤酵母分泌表達(dá)牛EKfHis6搖瓶篩選及產(chǎn)物鑒定
[0040]挑取陽(yáng)性克隆單菌落至50ml YH)液體培養(yǎng)基中，30°C，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18小時(shí)，以4%按種量轉(zhuǎn)接至50ml BMGY液體培養(yǎng)基，30°C，250rpm振蕩培養(yǎng)至至0^^2-6,5000rpm, 5min離心收獲菌體，轉(zhuǎn)接至30ml BMMY液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)。每隔24小時(shí)補(bǔ)加甲醇至終濃度I %，連續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)72h。取發(fā)酵液上清作SDS-PAGE分析，篩選高表達(dá)菌株。同時(shí)，采用抗組氨酸標(biāo)簽6XHis tag抗體為一抗作Western-Blot鑒定(圖3),結(jié)果顯示目的蛋白能與抗組氨酸標(biāo)簽的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，說明表達(dá)的蛋白正是目的蛋白牛EKl-His60
[0041]實(shí)施例4畢赤酵母工程菌高密度發(fā)酵表達(dá)牛EKfHis6
[0042]參考Invitrogen 公司.Pichia Fermentation Process Guidelines 進(jìn)行。
[0043]種子液培養(yǎng)階段:從高產(chǎn)菌株的平板上挑取單菌落接至50ml YH)液體培養(yǎng)基，30°C，250rpm培養(yǎng)24h，此為一級(jí)種液；從培養(yǎng)好的一級(jí)種液各取2ml轉(zhuǎn)按下另兩瓶200mlYI3D液體培養(yǎng)基(1% (V / V)接種量)，30°C，220rpm培養(yǎng)24h，此為二級(jí)種液；將培養(yǎng)好的二級(jí)種液共400ml,按轉(zhuǎn)接10% (V / V)接種量接至7L發(fā)酵罐(Bioengineering)中，其中含 4LFM21 培養(yǎng)基(FM21 培養(yǎng)基配方:1L 培養(yǎng)基中含 85% H3P0426.7ml ；CaSO4.2Η200.93g ；K2S0418.2g ；MgS04 *7H2014.9g ；K0H16.72g ;甘油 40g ^TM1I 0ml。加去離子水至 1L，氨水調(diào)節(jié) pH 至 5.5)。
[0044]甘油批次培養(yǎng)階段:通過調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度來維持溶氧水平在30%以上，持續(xù)約27h后，溶氧DO值會(huì)在Imin之內(nèi)上升接近100 %，此時(shí)表明罐內(nèi)培養(yǎng)基甘油已耗盡，需要向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)加甘油。
[0045]甘油流加補(bǔ)料階段:甘油被消耗完全后，以18.15ml / h/L起始發(fā)酵培養(yǎng)基體積的速度補(bǔ)加50% (W / V)甘油(每升含12ml PTM1)，溶氧水平維持在30% -60%，此階段可維持大約5h左右，之后饑餓30min左右，以耗盡甘油等碳源。
[0046]甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段:此過程將培養(yǎng)溫度由30°C調(diào)整為25°C (Noseda D G，et al.Protein Expr Purif.,2013,92(2):235-244.；Li Z, et al.Protein ExprPurif., 2001,21(3):438-445.)，并流加無水甲醇(含 0.03 % Tween-20，1.2 % (V / V)PTM1)。添加初始期低速流加(約Iml / h / L起始發(fā)酵培養(yǎng)基體積)以使工程菌適應(yīng)甲醇，此過程約2小時(shí)。之后，根據(jù)溶氧變化，逐漸提高甲醇流加速度，約每30min提高10%左右，以維持溶氧水平在30%-60%，直至流加速度達(dá)到3ml/h / L起始發(fā)酵培養(yǎng)基體積。然后，以3ml / h / L起始發(fā)酵培養(yǎng)基體積的流加速度維持至發(fā)酵終點(diǎn)，整個(gè)甲醇誘導(dǎo)過程維持約70h。誘導(dǎo)表達(dá)中后期時(shí)，向發(fā)酵液中添加0.2L有機(jī)氮源溶液(含酵母粉200g / L，蛋白胨400g / L)。
[0047]實(shí)施例5發(fā)酵過程中表達(dá)產(chǎn)物濃度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)
[0048]米用高效液相標(biāo)準(zhǔn)曲線法(StuartA.Rosenfeld etal.，Protein Expr Purif.，1996(8):476-482)對(duì)發(fā)酵液上清中的表達(dá)產(chǎn)物的濃度進(jìn)行分析。[0049]標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:以本實(shí)驗(yàn)室分離純化得到的牛EKfHis6 (純度> 95% )為標(biāo)準(zhǔn)品，配制不同濃度的牛EKfHis6標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行RP-HPLC分析(日本島津LC-2010分析型HPLC ；Kromasi1-C18柱；A相為含0.1 % TFA的H2O ；B相為含0.1 % TFA的CH3CN ;沈脫程序?yàn)槭紫?0% B相等度洗脫2min，其次進(jìn)行30-60% B相梯度洗脫3min，流速為Iml / min)，以牛EKfHis6S準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)過回歸計(jì)算，峰面積與進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品濃度成正比線性關(guān)系，并且線性關(guān)系良好(R2=0.999)，可用于牛EKfHis6的定量分析。
[0050]發(fā)酵液上清中表達(dá)產(chǎn)物濃度分析:將發(fā)酵不同時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行相同的RP-HPLC分析，得到的目的蛋白的峰面積代入測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣就可以得到發(fā)酵過程中及最終發(fā)酵上清中牛EK^His6的含量，經(jīng)過代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，本發(fā)明發(fā)酵上清中牛EK^His6含量約為 123.7mg / L0
[0051 ] 實(shí)施例6表達(dá)產(chǎn)物分離純化
[0052]陰離子交換柱層析:取500ml發(fā)酵液13000rpm離心30min收集上清,采用0.22 μ m濾膜過濾除雜，之后選用截留分子量為30kDa的超濾膜組件對(duì)發(fā)酵液上清濃縮以及脫鹽，脫鹽緩沖液選用Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱平衡緩沖液(IOmM Tris-HCl,pH8.0, ImM EDTA)。Q Sepharose Fast Flow 陰離子交換柱(GE healthcare, 1.0cmX IOcm)平衡液平衡后以0.5ml / min流速上樣，上樣完成后靜置吸附4小時(shí)左右，以Iml / min流速平衡緩沖液洗雜蛋白，核酸蛋白儀檢測(cè)至基線。之后采用含O~0.5M NaCl的平衡緩沖液梯度洗脫，流速為Iml / min，15% SDS-PAGE分析后，合并含目的蛋白的收集液。
[0053]Ni2+ 柱親和層析(High Affinity N1-NTA Resin, Genscript 公司產(chǎn)品，1.8cmX2.5cm):將陰離子柱洗脫的含目的蛋白收集液用Ni2+柱平衡液(50mM NaH2PO4,300mM NaCl, pH8.0)透析過夜，然后上Ni2+親和層析柱，柱體積為6ml。以0.5ml / min流速上樣，然后用50mM NaH2PO4(含300mM NaCl，4mM咪唑，pH8.0)洗至基線，之后用50mMNaH2PO4 (含300mM NaCI，20mM咪唑，pH8.0)進(jìn)行沈脫。15% SDS-PAGE分析并收集含目的蛋白的收集液。通過15% SDS-PAGE及RP-HPLC分析(圖4，圖5)，結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物純度達(dá)95%以上。
[0054]表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱及Ni2+柱親和層析等步驟純化后，最終產(chǎn)物得率為58.2mg / L，回收率為47%
[0055]實(shí)施例7表達(dá)產(chǎn)物活性鑒定[0056]參考 Invitrogen 公司產(chǎn)品 EnterokinaseMax?(EKMaxTM)活性分析方法(http: / / tools.lifetechnologies.com / content / sfs / manuals / ekmax_man.pdf)，以本實(shí)驗(yàn)室制備的水蛭素II1-露那辛融合蛋白(HV3-Lunasin，兩者間由含腸激酶酶切位點(diǎn)的連接肽GGGDDDDK連接)為底物，對(duì)純化的腸激酶催化亞基EKfHis6表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行切割活性分析。設(shè)立以下反應(yīng)體系:每管含底物HV3-Lunasin融合蛋白20 μ I (濃度Slug/ μ I)，然后分別加入0，0.1,0.15,0.2,0.5,1,2μ I純化的表達(dá)產(chǎn)物腸激酶催化亞基 EKfHis6 (濃度為 Iyg/ μ I),反應(yīng)緩沖液為 50mMTri s-HCl (ρΗ8.0,含 ImM CaCl2,0.1% Tween-20)，37°C酶切反應(yīng) 16hr 后，采用 16.5% Tricine-SDS-PAGE 對(duì)酶切結(jié)果進(jìn)行分析(圖6)。結(jié)果顯示，當(dāng)酶與底物之比為1: 100時(shí)，底物即可完全切割(切割效率>90%)。如果酶量加人，會(huì)出現(xiàn)非特異性切割，這與Choi (Biotechnol Bioeng.,2001,75(6):718-724)等文獻(xiàn)報(bào)道一致。[0001]
序列表
110>中國(guó)藥科大學(xué)
120一種制備重組牛腸激酶催化亞基的方法
<130>FI140034
<160>I
<-170>PatcnLln version 3.3
<210>I
<211>792
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>BamH I限制性酶切位點(diǎn)
<222>(1)..(6)
<220> <221>人血清白蛋白信號(hào)肽基因
<222>(7)..(60)
<220>
[0002]
【權(quán)利要求】
1.一種制備重組牛腸激酶催化亞基BEl的方法，其特征是:應(yīng)用人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽介導(dǎo)牛腸激酶催化亞基BEKlj在畢赤酵母Pichia.pastoris中的分泌表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛腸激酶催化亞基BEl的基因工程制備方法，其特征在于:將人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽基因3’末端與牛腸激酶催化亞基BEl基因5’末端進(jìn)行基因融合，該融合基因克隆到醇氧化酶AOX啟動(dòng)子下游，在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述牛腸激酶催化亞基BEl羧基末端添加了組氨酸標(biāo)簽6X Hi s，其特征是表達(dá)產(chǎn)物可以通過Ni2+親和層析進(jìn)行分離純化。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK103834630SQ201410021195
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】譚樹華, 徐振雷, 張萍 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)