制備重組牛腸激酶催化亞基蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域重組蛋白的制備方法，具體是一種制備重組牛腸激酶催化亞基蛋白的方法，其步驟為：⑴在牛腸激酶催化亞基的基因EKL上構(gòu)建突變體EKLM，突變體EKLM的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；⑵替換掉突變體EKLM中存在的大腸桿菌不利表達的密碼子從而獲得優(yōu)化的基因序列EKLMO，EKLMO的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。利用本發(fā)明所述制備重組牛腸激酶催化亞基蛋白的方法，可以有效保持牛腸激酶催化亞基的活性，具有很高的蛋白得率，而且本發(fā)明所述的方法生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。提純后的蛋白可以用于生物工程或藥物生產(chǎn)等多個目的，具有顯著的應(yīng)用價值。
【專利說明】制備重組牛腸激酶催化亞基蛋白的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域重組蛋白的制備方法，具體是一種制備重組牛腸激酶催 化亞基蛋白的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 腸激酶（Enterokinase，簡寫為EK)是存在于哺乳動物十二指腸內(nèi)的一種異源二 聚體絲氨酸蛋白酶。其天然蛋白分子量為150kDa，由一條115kDa的重鏈和一條35kDa的輕 鏈組成，在pH值4. 5-9. 5和溫度4-45°C之間均可以特異性的水解蛋白底物。腸激酶識別 底物蛋白的序列為DDDDK，它可以在賴氨酸殘基的C端進行切割。這樣的酶切優(yōu)勢使其成為 了融合蛋白表達體系中理想的工具酶。天然提取的腸激酶很容易混有其它種類蛋白酶，限 制了其在基因工程中的廣泛應(yīng)用。因此利用基因工程重組制備腸激酶逐漸成為大家選擇的 方向。
[0003] 腸激酶由一條重鏈和一條輕鏈組成，重鏈又稱結(jié)構(gòu)亞基，輕鏈又稱催化亞基，二者 通過分子間二硫鍵結(jié)合。結(jié)構(gòu)亞基負責將腸激酶定位到小腸的刷狀緣膜上，催化亞基行使 催化活性，將胰蛋白酶原激活成為胰蛋白酶。為了高效獲得制備腸激酶催化亞基蛋白，有必 要開發(fā)基因工程重組腸激酶催化亞基。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為了解決然提取的腸激酶很容易混有其它種類蛋白酶，限制了其在基因工 程中的廣泛應(yīng)用，提供了一種制備重組牛腸激酶催化亞基蛋白的方法。
[0005] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：制備重組牛腸激酶催化亞基蛋白的方法，其 步驟為： ⑴在牛腸激酶催化亞基的基因 EKL上構(gòu)建突變體EKLM，突變體EKLM的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示； ⑵替換掉突變體EKLM中存在的大腸桿菌不利表達的密碼子從而獲得優(yōu)化的基因序列 EKLMO, EKLM0的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示； ⑶在EKLM0的5'末端加入牛腸激酶自身的酶切位點序列，在EKLM0的3'末端加入標 簽序列，得到完整的表達基因片段； ⑷將上述表達基因片段克隆進入載體，構(gòu)建得到高效表達載體，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21，用IPTG誘導重組基因的表達； (5)收集菌體，提純目的蛋白。
[0006] 本發(fā)明步驟⑴在牛腸激酶催化亞基的基因 EKL上構(gòu)建突變體EKLM，目的在于提高 重組蛋白的活性和穩(wěn)定性，突變位點包括C112S，S121P，Y175R。步驟⑵中為了便于在大腸桿 菌中的表達，替換掉不利表達的密碼子從而獲得優(yōu)化的基因序列EKLM0。步驟⑶中在EKLM0 的5'末端加入牛腸激酶自身的酶切位點序列DDDDK，便于重組蛋白自酶切。
[0007] 進一步，所述步驟⑶中標簽序列為四個連續(xù)的組氨酸標簽序列HIS4。所述的標簽 序列除了采用本發(fā)明提到的四個連續(xù)的組氨酸標簽序列his4，還可采用本領(lǐng)域常用的其它 標簽序列，例如Flag標簽，HA標簽，GST標簽等等。
[0008] 進一步，所述步驟(5)中提純目的蛋白采用的是包涵體變復(fù)性方法。
[0009] 本發(fā)明提到的包涵體變復(fù)性方法可以有多種實現(xiàn)方法，但是通過發(fā)明人常識多種 方法之后，篩選得到了高產(chǎn)率的變復(fù)性方法，該方法相對于其他一般的包涵體變復(fù)性方法 其產(chǎn)率至少可以提高500%。所述的包涵體變復(fù)性方法的步驟為 ： ① 按照每l〇g菌體加入30ml比例加入到溶液A中重懸，破碎細胞，高速離心獲得包涵 體；所述溶液A為50mM Tris，pH 7. 0 ; ② 利用溶液B清洗包涵體兩次；溶液B為50mM Tris，pH 7. 0,500mM NaCl，20mM EDTA， 2% Triton X-100 ; ③ 向包涵體中加入20倍包涵體質(zhì)量的溶液C，溶解24h ;溶液C為7. 5M鹽酸胍，pH 9. 0， 50mM Tris，100mM 疏基乙醇； ④ 溶解24h后將溶液pH調(diào)整至3. 5,采用溶液D進行透析；透析完成后，高速離心去 掉沉淀，上清逐漸滴加到10倍上清體積的復(fù)性溶液E中；所述溶液D為7. 5M鹽酸胍，50mM Tris，pH 4. 0 ;所述復(fù)性溶液E為0. 7M精氨酸，pH 8. 6, 2mM還原性谷胱甘肽，ImM EDTA ; ⑤ 復(fù)性72h后，采用溶液F對添加有上清的復(fù)性溶液E進行透析，透析完成后，高速離 心去掉沉淀，獲得目的蛋白溶液；溶液F為20mM Tris，PH7. 6,20mM NaCl，lmM CaCl2。
[0010] 通過包涵體變復(fù)性提純獲得目的蛋白溶液后采用鎳離子親和柱快速純化目的蛋 白。通過該純化處理產(chǎn)物濃度可以得到有效地提高，SDS-PAGE分析純化處理后的目的蛋白 純度在95%以上，濃度超過lmg/ml。 toon] 利用本發(fā)明所述制備重組牛腸激酶催化亞基蛋白的方法，可以有效保持牛腸激酶 催化亞基的活性，具有很高的蛋白得率，而且本發(fā)明所述的方法生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn) 定。提純后的蛋白可以用于生物工程或藥物生產(chǎn)等多個目的，具有顯著的應(yīng)用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖 1 為 pET-26b-DDDDK-EKLM0-HIS4 的質(zhì)粒構(gòu)建圖譜。
[0013] 圖2為SDS-PAGE實驗顯示提純產(chǎn)物中EKLM0蛋白的濃度和純度。
[0014] 圖3 :SDS-PAGE實驗顯示EKLM0蛋白的酶切活性，圖中Marker右邊的A為待酶切 蛋白，B為待酶切蛋白加入對照EKL酶的酶切效果，C為待酶切蛋白加入本發(fā)明制備的EKLM0 蛋白的酶切效果，加入酶的量均為1/1000質(zhì)量比，酶切時間為2小時。

【具體實施方式】
[0015] 制備重組牛腸激酶催化亞基蛋白的方法，其步驟為： ⑴為了提高重組蛋白的活性和穩(wěn)定性，基于牛腸激酶的晶體結(jié)構(gòu)，以牛腸激酶催化亞 基的基因 EKL為模板，設(shè)計突變體蛋白EKLM，突變位點包括C112S，S121P和Y175R。突變后 的EKLM的全長核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0016] ⑵為了提高蛋白產(chǎn)量，替換掉突變體EKLM中存在的大腸桿菌不利表達的密碼子 從而獲得優(yōu)化的基因序列EKLMO, EKLM0的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0017] ⑶為了后續(xù)提純方便，在EKLM0的5'末端加入牛腸激酶自身的酶切位點序列 DDDDK，在EKLMO的3'末端加入四個連續(xù)的組氨酸標簽序列HIS4，得到完整的表達基因片段 ddddk-eklmo-his4。
[0018] ⑷設(shè)計引物P1和P2如下所示： P1 ： GGGAATTCCATATGGGTCCGATCGATGACGACGACAAGATCGTGGGCGGTAGCGACAG P2 ： CCGCTCGAGTTAATGATGATGATGGTGCAGGAAGCTCTGTATCCACTCG 引物稀釋成50ρπι〇1/μ 1，然后進行PCR步驟。瓊脂糖凝膠電泳檢測DDDDK-EKLM0-HIS4 條帶位于750bp左右，膠回收目的基因，用ΜΜ和通ο I將基因酶切成粘性末端，同樣處理 pET-26b載體，加入T4 DNA連接酶，4°C連接12小時，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。用硫酸卡那霉 素-LB平板篩選挑出白斑克隆，利用分子克隆的堿裂解法或者煮沸法提取質(zhì)粒，利用酶切 和PCR的方法鑒定正確，然后核苷酸序序列分析含有正確的基因序列閱讀框架，構(gòu)建成功 pET-26b- DDDDK-EKLM0-HIS4載體。將EKLM0的表達載體轉(zhuǎn)化BL21菌，常規(guī)擴增培養(yǎng)，加入 0. 5mM IPTG進行誘導，37度誘導4小時，此時表達出的蛋白為DDDDK-EKLM0-HIS4蛋白，即 可以收集菌體。
[0019] (5)收集菌體，提純目的蛋白： ① 按照每l〇g菌體加入30ml比例加入到溶液A中重懸，破碎細胞，高速離心獲得包涵 體；所述溶液A為50mM Tris，pH 7. 0 ; ② 利用溶液B清洗包涵體兩次；溶液B為50mM Tris，pH 7. 0,500mM NaCl，20mM EDTA， 2% Triton X-100 ; ③ 向包涵體中加入20倍包涵體質(zhì)量的溶液C，溶解24h ;溶液C為7. 5M鹽酸胍，pH 9. 0， 50mM Tris，100mM 疏基乙醇； ④ 溶解24h后將溶液pH調(diào)整至3. 5,采用溶液D進行透析；透析完成后，高速離心去 掉沉淀，上清逐漸滴加到10倍上清體積的復(fù)性溶液E中；所述溶液D為7. 5M鹽酸胍，50mM Tris，pH 4. 0 ;所述復(fù)性溶液E為0. 7M精氨酸，pH 8. 6, 2mM還原性谷胱甘肽，ImM EDTA ; ⑤ 復(fù)性72h后，采用溶液F對添加有上清的復(fù)性溶液E進行透析，透析完成后，高速離 心去掉沉淀，獲得目的蛋白溶液；溶液F為20mM Tris，PH7. 6,20mM NaCl，lmM CaCl2。包涵 體變復(fù)性處理過程中發(fā)生了自酶切反應(yīng)獲得目的蛋白eklmo-his4。
[0020] (6)通過包涵體變復(fù)性提純獲得目的蛋白溶液后采用鎳離子親和柱快速純化目的 蛋白，利用SDS-PAGE鑒定分析純度和活性，其實驗結(jié)果見圖2和圖3。 〈110>楊霞 〈120>制備重組牛腸激酶催化亞基蛋白的方法 <160>2 <210>1 <211>705 <212>DNA <213> Bos indicus 〈400> attgtcggag gaagtgactc cagagaagga gcctggcctt gggtcgttgc 50 tctgtatttc gacgatcaac aggtctgcgg agcttctctg gtgagcaggg 100 attggctggt gtcggccgcc cactgcgtgt acgggagaaa tatggagccg 150 tctaagtgga aagcagtgct aggcctgcat atggcatcaa atctgacttc 200 tcctcagata gaaactaggt tgattgacca aattgtcata aacccacact 250 acaataaacg gagaaagaac aatgacattg ccatgatgca tcttgaaatg 300 aaagtgaact acacagatta tatacagcct atttcattac cagaagaaaa 350 tcaagttttt cccccaggaa gaatttgttc tattgctggc tggggggcac 400 ttatatatca aggttctact gcagacgtac tgcaagaagc tgacgttccc 450 cttctatcaa atgagaaatg tcaacaacag atgccagaat ataacattac 500 ggaaaatatg gtgtgtgcag gcagagaagc aggaggggta gattcttgtc 550 agggggattc aggcggacca ctcatgtgcc aagaaaacaa cagatggctc 600 ctggctggcg tgacatcatt tggatatcaa tgtgcactgc ctaatcgccc 650 aggggtgtat gcccgggtgc caaggttcac agagtggata caaagttttc 700 tacat 705 <210>2 <211>705 <212>DNA <213> Bos indicus 〈400〉 atcgtgggcg gtagcgacag tcgtgaaggc gcatggcctt gggtggtggc 50 cctgtacttc gacgaccaac aggtgtgtgg cgcaagcctg gttagtcgcg 100 actggctggt tagcgccgcc cactgtgtgt acggccgtaa catggagccg 150 agcaagtgga aagccgtgct gggcctgcac atggccagca acctgaccag 200 ccctcaaatc gagacccgcc tgatcgacca gatcgttatc aacccgcact 250 ataacaagcg ccgcaagaac aacgacatcg ccatgatgca cctggagatg 300 aaagtgaatt acaccgatta catccaacct attagtctgc cggaggagaa 350 ccaggtgttc ccgccgggtc gtatctgcag tatcgccggc tggggcgcac 400 tgatttacca aggcagcacc gccgacgtgc tgcaggaagc agacgtgccg 450 ctgctgagca acgagaagtg ccagcagcag atgccggagt acaatatcac 500 cgagaatatg gtgtgtgccg gccgtgaagc aggcggtgtg gatagttgcc 550 agggtgatag cggcggcccg ctgatgtgcc aggagaacaa ccgctggctg 600 ctggcaggcg tgaccagttt tggctatcaa tgcgccctgc cgaaccgtcc 650 gggtgtgtat gcacgcgttc cgcgtttcac cgagtggata cagagcttcc 700 tgcac 705
【權(quán)利要求】
1. 制備重組牛腸激酶催化亞基蛋白的方法，其特征在于，其步驟為： ⑴在牛腸激酶催化亞基的基因 EKL上構(gòu)建突變體EKLM，突變體EKLM的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示； ⑵替換掉突變體EKLM中存在的大腸桿菌不利表達的密碼子從而獲得優(yōu)化的基因序列 EKLMO, EKLM0的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示； ⑶在EKLM0的5'末端加入牛腸激酶自身的酶切位點序列，在EKLM0的3'末端加入標 簽序列，得到完整的表達基因片段； ⑷將上述表達基因片段克隆進入載體，構(gòu)建得到高效表達載體，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21，用IPTG誘導重組基因的表達； (5)收集菌體，提純目的蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備重組牛腸激酶催化亞基蛋白的方法，其特征在于，所述 步驟⑶中標簽序列為四個連續(xù)的組氨酸標簽序列HIS 4。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備重組牛腸激酶催化亞基蛋白的方法，其特征在于，所 述步驟(5)中提純目的蛋白采用的是包涵體變復(fù)性方法。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備重組牛腸激酶催化亞基蛋白的方法，其特征在于，所述 包涵體變復(fù)性方法的步驟為： ① 按照每l〇g菌體加入30ml比例加入到溶液A中重懸，破碎細胞，高速離心獲得包涵 體；所述溶液A為50mM Tris，pH 7. 0 ; ② 利用溶液B清洗包涵體兩次；溶液B為50mM Tris，pH 7. 0,500mM NaCl，20mM EDTA， 2% Triton X-100 ; ③ 向包涵體中加入20倍包涵體質(zhì)量的溶液C，溶解24h ;溶液C為7. 5M鹽酸胍，pH 9. 0， 50mM Tris，100mM 疏基乙醇； ④ 溶解24h后將溶液pH調(diào)整至3. 5,采用溶液D進行透析；透析完成后，高速離心去 掉沉淀，上清逐漸滴加到10倍上清體積的復(fù)性溶液E中；所述溶液D為7. 5M鹽酸胍，50mM Tris，pH 4. 0 ;所述復(fù)性溶液E為0. 7M精氨酸，pH 8. 6, 2mM還原性谷胱甘肽，ImM EDTA ; ⑤ 復(fù)性72h后，采用溶液F對添加有上清的復(fù)性溶液E進行透析，透析完成后，高速離 心去掉沉淀，獲得目的蛋白溶液；溶液F為20mM Tris，PH7. 6,20mM NaCl，lmM CaCl2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備重組牛腸激酶催化亞基蛋白的方法，其特征在于，通過 包涵體變復(fù)性提純獲得目的蛋白溶液后采用鎳離子親和柱快速純化目的蛋白。
【文檔編號】C12N15/70GK104059896SQ201410309168
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】楊霞 申請人:楊霞