專(zhuān)利名稱(chēng)：纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體地說(shuō)，是一種纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法。
背景技術(shù)：
組織型纖溶酶原激活劑是一種絲氨酸蛋白酶，與纖維蛋白具有很高的親和性，在循環(huán)系統(tǒng)中與纖維蛋白結(jié)合后表現(xiàn)出活性，可激活纖溶酶原成為纖溶酶，溶解血栓。組織型纖溶酶原激活劑有天然形式，也有人工設(shè)計(jì)的部分結(jié)構(gòu)域缺失的形式，如缺失纖維蛋白指環(huán)區(qū)、表皮生長(zhǎng)因子(E)區(qū)和/或Kringle-1區(qū)的改構(gòu)形式，以延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期，加快擴(kuò)散入和溶解血液凝塊的速度。組織型纖溶酶原激活劑是高效溶血栓藥物，是美國(guó)市場(chǎng)上六大類(lèi)基因重組藥物之一。纖溶酶原激活劑常用的純化方法有離子交換層析，疏水層析，反相層析，以及金屬螯合，賴(lài)氨酸，苯脒等親和層析的方法。對(duì)于纖溶酶原激活劑純化來(lái)講，這些方法，專(zhuān)一性差，生產(chǎn)中需要多種方法組合，因此生產(chǎn)步驟多，生產(chǎn)成本高；利用天然大分子配體如蛋白酶抑制劑、抗體和凝集素的親和層析方法雖然克服了對(duì)纖溶酶原激活劑專(zhuān)一性差和效率低的缺點(diǎn)，但這些生物配體本身制備困難，成本昂貴、性質(zhì)不穩(wěn)定，不適合大規(guī)模生產(chǎn)用。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，Patel A在《層析期刊》上發(fā)表的《用過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物親和純化組織型纖溶酶原激活劑》(Affinity purification of tissueplasminogen activator using transition-state analogues J.Chromatogr.1990，51083-93.)。該論文通過(guò)在瓊脂糖上固相合成含精氨酸的三肽，用尿激酶和組織型纖溶酶原激活劑，發(fā)現(xiàn)D-Phe-D-Phe-Argal能夠有效純化組織型纖溶酶原激活劑。但該方法利用的D-Phe-D-Phe-Argal物質(zhì)需用固相多肽合成的方法合成，制備步驟繁瑣，成本高；此外D-Phe-D-Phe-Argal含多個(gè)多肽連接，性質(zhì)不穩(wěn)定，不能耐受在線清洗的苛刻條件。雖然可以使復(fù)雜的純化工藝簡(jiǎn)化，但是以上缺點(diǎn)限制了大規(guī)模應(yīng)用。因此，有必要開(kāi)發(fā)高效率、低成本、步驟簡(jiǎn)便的大規(guī)模生產(chǎn)天然或改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑的方法和材料，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)化步伐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，使其純化步驟少，成本低，效率高，快速、簡(jiǎn)便、低成本、大批量純化天然或改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑和尿型纖溶酶原激活劑。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明以基礎(chǔ)層析介質(zhì)為原料合成仿生親和分離材料，用制備的仿生親和分離材料純化天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑及片段。
所述的改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑，是指通過(guò)人工設(shè)計(jì)，保留催化結(jié)構(gòu)域、而纖維蛋白指環(huán)區(qū)、表皮生長(zhǎng)因子(E)區(qū)和/或Kringle-1區(qū)部分或全部缺失的組織型纖溶酶原激活劑形式。
本發(fā)明包括以下步驟(1)基礎(chǔ)層析介質(zhì)與三氯三氮嗪反應(yīng)活化后，與對(duì)氨基苯甲脒反應(yīng)，合成仿生親和分離材料；所述的步驟(1)，是指以帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)，與三氯三氮嗪反應(yīng)活化；或者用常規(guī)化學(xué)方法對(duì)不帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)進(jìn)行活化，與氨水或氨基化合物反應(yīng)生成氨基后，再與三氯三氮嗪反應(yīng)活化；所述的不帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)包括葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠和涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠、多孔玻璃與陶瓷。
所述的常規(guī)化學(xué)方法指C.R.Lowe在《親和色譜導(dǎo)論》(洛(C.R.Lowe)著；劉毓秀譯.科學(xué)出版社，1983年5月第1版，第61-84頁(yè))中提到的基質(zhì)活化與功能化方法，如多糖基及含羥基的其它基質(zhì)，可用鹵化氰、三嗪(均二氯三嗪或三氯三嗪)、高碘酸氧化，環(huán)氧乙烷(1，4-二羥基正丁烷雙縮水甘油醚)，環(huán)氧氯丙醇，環(huán)氧溴丙醇，雙氮丙啶，二乙烯砜，苯醌類(lèi)化合物如醌，溴乙酰溴進(jìn)行活化和功能化；聚丙烯酰胺基質(zhì)可用無(wú)水乙二胺，酰肼化后水解，直接堿水解進(jìn)行活化和功能化；硅膠、多孔玻璃與陶瓷可用硅烷化試劑進(jìn)行活化和功能化；從而在基礎(chǔ)層析介質(zhì)上介紹需要的基團(tuán)。
所述的仿生親和分離材料含有兩個(gè)4-氨基苯甲脒的結(jié)構(gòu)。
(2)用上述合成的親和分離材料制備成親和層析柱，將含天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑的樣品流過(guò)該親和層析柱，天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑吸附在親和層析柱上，沖洗親和層析柱，不吸附在親和層析柱上的雜蛋白被除去，然后變換緩沖液條件，再?zèng)_洗親和層析柱，將結(jié)合的天然或改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑洗脫下來(lái)，得到純化的天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑。
所述的步驟(2)中，親和分離材料吸附纖溶酶原激活劑的條件為pH5-8，離子強(qiáng)度為0.05-0.2M的緩沖液；洗脫條件為pH1.0-12，離子強(qiáng)度為0.05-0.5M的緩沖液。
本發(fā)明既克服了親和分離材料合成步驟多，操作復(fù)雜，成本高，性質(zhì)不穩(wěn)定，的缺點(diǎn)，又減少了纖溶酶原激活劑大規(guī)模純化的步驟，降低了生產(chǎn)成本，可快速、簡(jiǎn)便、低成本、大批量純化纖溶酶原激活劑。樣品比活力提高5倍以上，回收率80％以上。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一、制備分離材料取NH2-Sepharose(250ml)，用5倍體積的1M的NaCl洗滌，再用去離子水充分洗滌后，抽去水分，倒入反應(yīng)器皿中，加入200ml去離子水，放于冰鹽浴中預(yù)冷。待溫度降至5℃，開(kāi)始攪拌。用預(yù)冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反應(yīng)容器中。用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應(yīng)3h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，稱(chēng)取氨基苯甲脒(20g)用去離子水(150ml)溶解，與1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，置于溫度50℃中攪拌反應(yīng)24小時(shí)，然后升溫至95℃中攪拌再反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)物，然后用12倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇儲(chǔ)存待用。
二、用親和純化改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑(N-PA)將1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪親和分離材料(5ml)，裝入層析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH7.5)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH7.5)中的0.3g改構(gòu)組織型纖溶酶原激活劑酶的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH7.5)洗去未吸附的物質(zhì)后，用50ml 50mM醋酸銨緩沖液(pH5.0)洗結(jié)合的雜蛋白，之后用50ml 0.5M醋酸銨緩沖液(pH3.4)進(jìn)行洗脫，再用50ml 0.1M醋酸溶液洗脫，分步收集洗脫組分。用lowery法測(cè)定蛋白濃度，發(fā)色底物測(cè)定組織型纖溶酶原激活劑酶的活力，樣品比活力提高10倍，回收率100％。12％還原SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳分析純度，不含高分子量的雜蛋白。
實(shí)施例2一、制備分離材料取NH2-Sepharose(250ml)，用5倍體積的1M的NaCl洗滌，再用去離子水充分洗滌后，抽去水分，倒入反應(yīng)器皿中，加入200ml去離子水，放于冰鹽浴中預(yù)冷。待溫度降至5℃，開(kāi)始攪拌。用預(yù)冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反應(yīng)容器中。用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應(yīng)3h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，稱(chēng)取氨基苯甲脒(20g)用去離子水(150ml)溶解，與1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，置于溫度50℃中攪拌反應(yīng)24小時(shí)，然后升溫至95℃中攪拌再反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)物，然后用12倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇儲(chǔ)存待用。
二、親和純化組織型纖溶酶原激活劑酶將1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪親和分離材料(5ml)，裝入層析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.1M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.1M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)中的0.25克組織型纖溶酶原激活劑酶的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.1M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)洗去未吸附的物質(zhì)后，用50ml 50mM醋酸銨緩沖液(pH5.0)洗結(jié)合的雜蛋白，之后用50ml 0.5M醋酸銨緩沖液(pH2.0)進(jìn)行洗脫，分步收集洗脫組分。用lowery法測(cè)定蛋白濃度，發(fā)色底物測(cè)定組織型纖溶酶原激活劑酶的活力，樣品比活力提高5倍，回收率大于70％。
實(shí)施例3一、制備分離材料取NH2-Sepharose(250ml)，用5倍體積的1M的NaCl洗滌，再用去離子水充分洗滌后，抽去水分，倒入反應(yīng)器皿中，加入200ml去離子水，放于冰鹽浴中預(yù)冷。待溫度降至5℃，開(kāi)始攪拌。用預(yù)冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反應(yīng)容器中。用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應(yīng)3h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，稱(chēng)取氨基苯甲脒(20g)用去離子水(150ml)溶解，與1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，置于溫度50℃中攪拌反應(yīng)24小時(shí)，然后升溫至95℃中攪拌再反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)物，然后用12倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇儲(chǔ)存待用。
二、親和純化組織型纖溶酶原激活劑酶將1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪親和分離材料(5ml)，裝入層析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，0.05％Tween-80，pH9.0)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，0.05％Tween-80，pH9.0)中的0.2g組織型纖溶酶原激活劑酶的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，0.05％Tween-80，pH9.0)洗去未吸附的物質(zhì)后，用50ml 50mM醋酸銨緩沖液(pH5.0)洗結(jié)合的雜蛋白，之后用50ml 0.5M醋酸銨緩沖液(pH2.4)進(jìn)行洗脫，分步收集洗脫組分。用lowery法測(cè)定蛋白濃度，發(fā)色底物測(cè)定組織型纖溶酶原激活劑酶的活力，樣品比活力提高7倍，回收率大于80％。
實(shí)施例4一、制備分離材料取NH2-Sepharose(250ml)，用5倍體積的1M的NaCl洗滌，再用去離子水充分洗滌后，抽去水分，倒入反應(yīng)器皿中，加入200ml去離子水，放于冰鹽浴中預(yù)冷。待溫度降至5℃，開(kāi)始攪拌。用預(yù)冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反應(yīng)容器中。用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應(yīng)3h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，稱(chēng)取氨基苯甲脒(20g)用去離子水(150ml)溶解，與1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，置于溫度50℃中攪拌反應(yīng)24小時(shí)，然后升溫至95℃中攪拌再反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)物，然后用12倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇儲(chǔ)存待用。
二、親和純化尿纖溶酶原激活劑(尿激酶)將1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪親和分離材料(5ml)，裝入層析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl 0.25M NaCl 0.05％Tween-80 pH7.5)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl 0.25M NaCl 0.05％Tween-80 pH7.5)中的尿激酶25,0000活力單位(約60mg)的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl 0.25M NaCl 0.05％Tween-80 pH7.5)洗去未吸附的物質(zhì)后，用50ml 50mM醋酸銨緩沖液(pH5.0)洗結(jié)合的雜蛋白，之后用50ml 0.5M醋酸銨緩沖液(pH3.4)洗脫尿激酶，分步收集洗脫組分。用lowery法測(cè)定蛋白濃度，發(fā)色底物測(cè)定尿激酶活力，樣品比活力提高7倍，回收率大于80％。電泳分析表明純化出了低分子量尿激酶(33KD)。尿激酶樣品比活力提高43倍，總活力回收率100％。
實(shí)施例5-、制備分離材料取NH2-Sepharose(250ml)，用5倍體積的1M的NaCl洗滌，再用去離子水充分洗滌后，抽去水分，倒入反應(yīng)器皿中，加入200ml去離子水，放于冰鹽浴中預(yù)冷。待溫度降至5℃，開(kāi)始攪拌。用預(yù)冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反應(yīng)容器中。用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應(yīng)3h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，稱(chēng)取氨基苯甲脒(20g)用去離子水(150ml)溶解，與1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，置于溫度50℃中攪拌反應(yīng)24小時(shí)，然后升溫至95℃中攪拌再反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)物，然后用12倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇儲(chǔ)存待用。
二、親和純化組織型纖溶酶原激活劑酶將1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪親和分離材料(5ml)，裝入層析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)中的0.3g改構(gòu)組織型纖溶酶原激活劑酶的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)洗去未吸附的物質(zhì)后，用50ml 50mM醋酸銨緩沖液(pH5.0)洗結(jié)合的雜蛋白，之后用50ml 0.5M甘氨酸-鹽酸(pH1.0)進(jìn)行洗脫，分步收集洗脫組分。用lowery法測(cè)定蛋白濃度，發(fā)色底物測(cè)定組織型纖溶酶原激活劑酶的活力，樣品比活力提高7.5倍，回收率80％。
實(shí)施例6
一、制備分離材料取NH2-Sepharose(250ml)，用5倍體積的1M的NaCl洗滌，再用去離子水充分洗滌后，抽去水分，倒入反應(yīng)器皿中，加入200ml去離子水，放于冰鹽浴中預(yù)冷。待溫度降至5℃，開(kāi)始攪拌。用預(yù)冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反應(yīng)容器中。用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應(yīng)3h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，稱(chēng)取氨基苯甲脒(20g)用去離子水(150ml)溶解，與1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，置于溫度50℃中攪拌反應(yīng)24小時(shí)，然后升溫至95℃中攪拌再反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)物，然后用12倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇儲(chǔ)存待用。
二、親和純化組織型纖溶酶原激活劑酶將1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪親和分離材料(5ml)，裝入層析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH8.0)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH8.0)中的0.3g改構(gòu)組織型纖溶酶原激活劑酶的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH8.0)洗去未吸附的物質(zhì)后，用50ml 0.05M甘氨酸-氫氧化鈉(pH12.0)進(jìn)行洗脫，分步收集洗脫組分。用lowery法測(cè)定蛋白濃度，發(fā)色底物測(cè)定組織型纖溶酶原激活劑酶的活力，樣品比活力提高8.5倍，回收率85％。
權(quán)利要求
1.一種纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，其特征在于，以基礎(chǔ)層析介質(zhì)為原料合成仿生親和分離材料，用制備的仿生親和分離材料純化天然或改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑及片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，其特征是，包括以下步驟(1)基礎(chǔ)層析介質(zhì)與三氯三氮嗪反應(yīng)活化后，與對(duì)氨基苯甲脒反應(yīng)，合成仿生親和分離材料；(2)用上述合成的親和分離材料制備成親和層析柱，將含天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑的樣品流過(guò)該親和層析柱，天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑吸附在親和層析柱上，沖洗親和層析柱，不吸附在親和層析柱上的雜蛋白被除去，然后變換緩沖液條件，再?zèng)_洗親和層析柱，將結(jié)合的天然或改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑洗脫下來(lái)，得到純化的天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，其特征是，所述的步驟(1)中，以帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)，與三氯三氮嗪反應(yīng)活化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，其特征是，所述的步驟(1)中，用常規(guī)化學(xué)方法對(duì)不帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)進(jìn)行活化，與氨水或氨基化合物反應(yīng)生成氨基后，再與三氯三氮嗪反應(yīng)活化；所述的不帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)包括葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠和涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠、多孔玻璃與陶瓷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，其特征是，所述的仿生親和分離材料含有兩個(gè)4-氨基苯甲脒的結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，其特征是，所述的步驟(2)中，親和分離材料吸附纖溶酶原激活劑的條件為pH5-8，離子強(qiáng)度為0.05-0.2M的緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，其特征是，所述的步驟(2)中，洗脫條件為pH1.0-12，離子強(qiáng)度為0.05-0.5M的緩沖液。
全文摘要
一種纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括以下步驟(1)基礎(chǔ)層析介質(zhì)與三氯三氮嗪反應(yīng)活化后，與對(duì)氨基苯甲脒反應(yīng)，合成仿生親和分離材料；(2)用上述合成的親和分離材料制備成親和層析柱，將含天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑的樣品流過(guò)該親和層析柱，天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑吸附在親和層析柱上，沖洗親和層析柱，然后變換緩沖液條件，再?zèng)_洗親和層析柱，將結(jié)合的天然或改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑洗脫下來(lái)，得到純化的天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑。本發(fā)明純化步驟少，成本低，效率高，快速、簡(jiǎn)便、低成本、大批量純化天然或改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑和尿型纖溶酶原激活劑。
文檔編號(hào)C12N9/50GK1786161SQ20051003065
公開(kāi)日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者李榮秀, 吳方, 龐艷萍 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)