專利名稱：作為血栓溶解劑的靶向性纖溶酶原激活物融合蛋白的制作方法
專利說(shuō)明作為血栓溶解劑的靶向性纖溶酶原激活物融合蛋白 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及用作血栓溶解劑的新型融合蛋白，其包括可操作地連接至纖維蛋白-選擇性纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體的靶向性蛋白。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述靶向性蛋白結(jié)合活化的血小板或活化的內(nèi)皮細(xì)胞的表面。

背景技術(shù)：
動(dòng)脈血栓形成是每年影響數(shù)百萬(wàn)人的威脅生命的疾病，它由在受損的血管內(nèi)不受控制的血液凝固和血小板聚集引起。血管內(nèi)形成的過(guò)量纖維蛋白和血小板凝塊阻斷血流，引起重要的組織或器官的局部缺血性損傷。用于治療動(dòng)脈血栓形成例如心肌梗死的經(jīng)批準(zhǔn)的治療方法使用與抗血小板藥和抗凝劑相組合的纖溶酶原激活物。目前使用的纖溶酶原激活物包括組織型纖溶酶原激活物(“tPA”)、尿激酶(“uPA”)和鏈激酶。這些血栓溶解劑在閉塞性血栓情況下的施用增強(qiáng)了纖維蛋白降解的速率、恢復(fù)動(dòng)脈開(kāi)放和流向局部缺血組織的血流。冠狀動(dòng)脈血栓溶解療法已減少了急性心肌梗死患者中的死亡率(參見(jiàn)Collen，D.和Lijnen，H.R.，Blood(1991)，第78卷，第3114-3124頁(yè)；Topol，E.J.，Prog.Cardiovasc.Dis.(1991)，第34卷，第165-178頁(yè))；Verstraete，M.等人，Drugs(1995)，第50卷，第29-42頁(yè)；Verstraete，M.和Zoldhelyi，P.，Drugs(1995)，第49卷，第856-884頁(yè)；和Huber，K.和Maurer，G.，Semin.Thromb.Hemost.(1996)，第22卷，第15-26頁(yè))。目前的血栓溶解療法的主要局限性包括出血，最顯著的是顱內(nèi)出血，不能達(dá)到足夠的心肌再灌注，和冠狀動(dòng)脈再閉塞。然而，由于目前給藥方案(例如，前負(fù)載的tPA)的引入，已取得了進(jìn)一步改善冠狀動(dòng)脈血栓溶解速率和程度、或者減少出血危險(xiǎn)的少許進(jìn)展。如此，需要更新的試劑。
已開(kāi)發(fā)了具有改善的血栓溶解特性的纖溶酶原激活物。TNK-tPA是通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的tPA變體。TNK-tPA對(duì)于由纖溶酶原激活物抑制劑-1(“PAI-1”)所產(chǎn)生的抑制更有抗性，在循環(huán)中具有更長(zhǎng)的半衰期，并且可以作為單次快速濃射進(jìn)行施用(Collen，D.等人，Thromb.Haemost.(1994)，第72卷，第98-104頁(yè)；和Keyt，B.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)，第91卷，第3670-3674頁(yè))。瑞替普酶是僅由tPA的kringle 2和蛋白酶結(jié)構(gòu)域組成的未糖基化蛋白質(zhì)。瑞替普酶具有的血漿半衰期比tPA更長(zhǎng)，但纖維蛋白特異性比tPA低(Martin，U.等人，Thromb.Haemost.(1991)，第66卷，第569-574頁(yè))。目前，TNK-tPA和瑞替普酶已批準(zhǔn)用于臨床使用。
當(dāng)前血栓溶解療法的主要局限性之一是出血危險(xiǎn)(Rao，A.K.等人，J.Am.Coll.Cardiol.(1988)，第11卷，第1-11頁(yè)；和Arnold，A.E.等人，J.Am.Coll.Cardiol.(1989)，第14卷，第581-588頁(yè))。大約5-10％用血栓溶解療法治療的患者經(jīng)歷出血事件。在這些出血事件中，接近10％是顱內(nèi)出血，這可以是致命的(參見(jiàn)Chesebro，J.H.等人，Cardiol.Clin.(1988)，第6卷，第119-137頁(yè)；Topol，E.J.等人，J.Am.Coll.Cardiol.(1987a)，第9卷，第1205-1213頁(yè)；Topol，E.J.等人，J.Am.Coll.Cardiol.(1987b)，第9卷，第1214-1218頁(yè)；PRIMI Trial Study Group，Lancet(1989)，第1卷，第863-868頁(yè)；和ISIS Collaborative Group，Lancet(1992)，第339卷，第753-770頁(yè))。出血主要是由于纖維蛋白原的非特異性切割和外源性纖溶酶原激活物對(duì)于年老的(老的)止血纖維蛋白凝塊的過(guò)度蛋白水解。除了出血外，血栓溶解劑具有其他局限性。高達(dá)25％的急性心肌梗死患者對(duì)目前的血栓溶解方案具有抗性。在這些患者中，對(duì)于局部缺血的心臟沒(méi)有顯著的心肌再灌注。在另外30-40％的患者中，療法只在90分鐘內(nèi)達(dá)到部分再灌注，所述90分鐘是最小化在局部缺血組織中的細(xì)胞死亡的臨界時(shí)間窗(GUSTO AngiographicInvestigators，N.Engl.J.Med.(1993)，第329卷，第1615-1622頁(yè)；和Barbagelata，N.A.等人，Am.Heart J.(1997)，第133卷，第273-282頁(yè))。此外，大約30％的患者在血栓溶解療法后經(jīng)歷急性冠狀動(dòng)脈再閉塞。閉塞性血栓中正在進(jìn)行的血小板激活被認(rèn)為極大地促進(jìn)血栓溶解療法的失敗(Fay，W.P.等人，Blood(1994)，第83卷，第351-356頁(yè)；Stringer，H.A.等人，Arterioscler.Thromb.(1994)，第14卷，第1452-1458頁(yè)；Torr-Brown，S.R.和Sobel，B.E.，Thromb.Res.(1993)，第72卷，第413-421頁(yè)；Jang，I.K.等人，Circulation(1989)，第79卷，第920-928頁(yè)；和Kunitada，S.等人，Blood(1992)，第79卷，第1420-1427頁(yè))。在體外和體內(nèi)研究中，發(fā)現(xiàn)富含血小板的凝塊比富含纖維蛋白、缺少血小板的凝塊對(duì)血栓溶解更有抗性(Bode，C.等人，Circulation(1991)，第84卷，第805-813頁(yè)；和Coller，B.S.，N.Engl.J.Med.(1990)，第322卷，第33-42頁(yè))。
P-選擇素是～140kDa的糖蛋白，其主要貯藏于靜止血小板的α顆粒中。在血小板激活后，P-選擇素迅速移位至細(xì)胞表面，在那里它促進(jìn)在受損的血管壁中血小板和白細(xì)胞的相互作用。在活化的血小板上P-選擇素的細(xì)胞表面表達(dá)持續(xù)不超過(guò)數(shù)小時(shí)(McEver，R.P.，Thromb.Haemost.(1991)，第65卷，第223-228頁(yè)；McEver，R.P.，Curr.Opin.Immunol.(1994)，第6卷，第75-84頁(yè)；和Lasky，L.A.，Science(1992)，第258卷，第964-969頁(yè))。除了血小板外，P-選擇素還存在于正常內(nèi)皮細(xì)胞的懷布爾-帕拉德體中。在內(nèi)皮細(xì)胞被組胺和凝血酶激活后，P-選擇素迅速再分布至細(xì)胞表面?；罨难“迨切滦纬傻难▋?nèi)的主要細(xì)胞組分，并且活化的內(nèi)皮細(xì)胞在血管損傷部位附近很豐富。相反地，在年老的(老的)止血栓子中的主要組分是纖維蛋白分子。
4種tPA樣蛋白質(zhì)來(lái)源于吸血蝙蝠(Desmodus rotundus)的唾液DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ(Gardell，S.J.等人，Biol.Chem.(1989)，第264卷，第17947-17952頁(yè)；和Kratzschmar，J.等人，Gene(1991)，第105卷，第229-237頁(yè))。這些中，DSPAα1是最長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，并且在結(jié)構(gòu)上最類似于人tPA。與切割纖維蛋白原和纖維蛋白的其他纖溶酶原激活物不同，DSPAα1對(duì)于纖維蛋白是高度特異的(Bringmann，P.等人(1995)，第270卷，第25596-25603頁(yè))。DSPAα1具有的纖維蛋白特異性比tPA大幾百倍(Bringmann，P.等人(1995)，同上；參見(jiàn)Toschi，L.等人，Eur.J.Biochem.(1998)，第252卷，第108-112頁(yè)；Stewart，R.J.等人，Biol.Chem.(1998)，第273，第18292-18299頁(yè)；和Schleuning，W.D.等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.(1992)，第667卷，第395-403頁(yè)。在血栓溶解的動(dòng)物模型中，DSPAα1比tPA更有效(Gardell，S.J.等人，Circulation(1991)，第84卷，第244-253頁(yè)；Witt，W.等人，Blood(1992)，第79卷，第1213-1217頁(yè)；和Witt，W.等人，Circulation(1994)，第90卷，第421-426頁(yè))。DSPAα1(去氨普酶)處于用于治療中風(fēng)的臨床開(kāi)發(fā)中。
美國(guó)專利號(hào)6,008,019公開(kāi)了這4種DSPA蛋白質(zhì)，并要求保護(hù)DSPAα1作為血栓溶解劑的用途。美國(guó)專利號(hào)5,830,849公開(kāi)并要求保護(hù)DSPAα2作為血栓溶解劑的用途。
在結(jié)構(gòu)上，DSPAα1和DSPAα2由4個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成纖連蛋白樣指(“指”)結(jié)構(gòu)域、表皮生長(zhǎng)因子(“EGF”)結(jié)構(gòu)域、三環(huán)結(jié)構(gòu)域(kringle domain)和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域；DSPAβ由3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成EGF結(jié)構(gòu)域、三環(huán)結(jié)構(gòu)域和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域；和DSPAγ由2個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成三環(huán)結(jié)構(gòu)域和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上)。
結(jié)構(gòu)-功能分析證實(shí)，指結(jié)構(gòu)域有助于DSPAα1的纖維蛋白依賴性和選擇性(Bringmann，P.等人(1995)，同上)。DSPAα1相比tPA而言具有增加的纖維蛋白特異性似乎是由于DSPAα1具有1個(gè)三環(huán)結(jié)構(gòu)域，而tPA具有2個(gè)三環(huán)結(jié)構(gòu)域這一事實(shí)(Stewart，R.J.等人(1998)，同上)。其他結(jié)構(gòu)-功能分析提示了進(jìn)行天然t-PA氨基酸序列的不同修飾(例如在cymogene triade中)以便增加t-PA的纖維蛋白特異性(EP 1 308 166 A1)。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了充當(dāng)血栓溶解劑的新型融合蛋白，其包括可操作地連接至纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體的靶向性蛋白，其中所述靶向性蛋白結(jié)合血管損傷相關(guān)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明的“血管損傷相關(guān)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)”是其在量方面或在質(zhì)方面是血管損傷的指示的任何生物學(xué)分子或結(jié)構(gòu)。關(guān)于血管損傷相關(guān)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)的例子是血小板或內(nèi)皮細(xì)胞表面上的表面分子，其在血栓生成應(yīng)答(thrombogenic response)過(guò)程中已被激活(“刺激”)(例如通過(guò)凝血酶的刺激)。這些活化的細(xì)胞的表面通常顯示比未活化的血小板或內(nèi)皮細(xì)胞明顯更高的這些表面分子的表達(dá)水平。此類表面分子的一個(gè)具體例子是P-選擇素(CD62p)。活化的內(nèi)皮細(xì)胞或活化的血小板在血管損傷部位附近很豐富，因此P-選擇素代表了“血管損傷相關(guān)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)”。
本發(fā)明的血管損傷相關(guān)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)的其他例子是溶酶體締合性膜蛋白(CD63)(Joern A.Zeller等人，“Circulating plateletsshow increased activation in patients with acute cerebralischemia”Thromb Haemost.，第81卷，第373-377頁(yè)，1999)或CD40L(Patrick Andre等人，“CD40L stabilizes arterial thrombiby a beta3 integrin-dependent mechanism”Nature Medicine，第8卷，No.3，第247-252頁(yè)，March 2002)或糖蛋白1bα(JanetteBurgess等人“Physical Proximity and Functional Associationof Clycoprotein 1b alpha and Protein-disulfide Isomerase on thePlatelet Plasma Membrane”The Journal of Biological Chemistry，第275卷，No.13，第9758-9766頁(yè)，2000)或蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(Zaverio Ruggeri，“Platelets in atherothrombosis”NatureMedicine，第8卷，No.11，第1227-1234頁(yè)，November 2002)。
纖溶酶原激活物可以是任何類型的纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選使用具有相比天然t-PA而言增加的纖維蛋白特異性或具有kringle 2結(jié)構(gòu)域的修飾/刪除的纖溶酶原激活物。特別優(yōu)選使用最初來(lái)源于吸血蝙蝠的纖溶酶原激活物去氨普酶(DSPA)或其部分。優(yōu)選地，DSPA包括絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域和選自指結(jié)構(gòu)域、EGF結(jié)構(gòu)域和kringle結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)其他結(jié)構(gòu)域或其類似物、片段、衍生物或變體。
本發(fā)明的血栓溶解融合蛋白靶向并結(jié)合血管損傷相關(guān)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)，例如在急性動(dòng)脈血栓中活化的血小板的表面，隨之在新形成的血管損傷(例如富含血小板的血栓)位點(diǎn)處產(chǎn)生高局部濃度的纖溶酶原激活物，允許減少血栓溶解劑的全身劑量，從而最小化對(duì)更老的富含纖維蛋白的凝塊的溶解效應(yīng)并達(dá)到更廣泛的治療比率。所述融合蛋白可用于治療下列疾病動(dòng)脈血栓形成，急性冠狀動(dòng)脈綜合征，包括ST段升高型心肌梗死(ST-elevated myocardial infarction)、非ST段升高型心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛，導(dǎo)管誘導(dǎo)的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓和深部靜脈血栓形成，肺栓塞和急性缺血性中風(fēng)。
在另一方面，本發(fā)明提供了包括主題血栓溶解融合蛋白的藥物組合物。
在另一方面，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)患者中血栓溶解的方法，包括給所述患者施用治療有效量的所述血栓溶解融合蛋白。
在另一方面，本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防患者中的下列疾病的方法動(dòng)脈血栓形成，急性冠狀動(dòng)脈綜合征，包括ST段升高型心肌梗死、非ST段升高型心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛，導(dǎo)管誘導(dǎo)的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓和深部靜脈血栓形成，肺栓塞和急性缺血性中風(fēng)，包括給所述患者施用治療有效量的血栓溶解融合蛋白。
在另一方面，本發(fā)明涉及用于在中風(fēng)發(fā)作后超過(guò)3小時(shí)，優(yōu)選超過(guò)6小時(shí)或甚至超過(guò)9小時(shí)治療患者中的急性缺血性中風(fēng)的方法。
在另外一方面，本發(fā)明涉及包括靶向性蛋白的試劑盒，所述靶向性蛋白結(jié)合活化的血小板的表面，并可操作地連接至纖維蛋白選擇性纖溶酶原激活物。備選地，試劑盒可以包括編碼所述血栓溶解融合蛋白的組分的多核苷酸序列。
還公開(kāi)了重組和合成地制備本發(fā)明的血栓溶解融合蛋白的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1。HuSZ51-DSPAα1融合蛋白和表達(dá)質(zhì)粒的示意圖。(A)靶向P-選擇素的DSPA融合蛋白。HuSZ51-DSPAα1融合蛋白由2條Ig輕鏈和2條Ig重鏈組成。輕鏈的組成為SZ51輕鏈的可變區(qū)(VL)，隨后為人Igκ的恒定區(qū)。重鏈的組成為SZ51重鏈的可變區(qū)(VH)，隨后為人IgG1的恒定區(qū)CH1、CH2和CH3，以及成熟的分泌形式的DSPAα1。(B)HuSZ51-DSPAα1表達(dá)質(zhì)粒。輕鏈構(gòu)建體pLNOSZ51VK/Hygro-kappa是CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)質(zhì)粒，其包括選擇標(biāo)記潮霉素。重鏈構(gòu)建體pLNOSZ51VHDSPA/Neo是CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)質(zhì)粒，其包括選擇標(biāo)記新霉素。
圖2。HuSZ51-DSPAα1的氨基酸序列。(A)HuSZ51-VLCκ輕鏈(SEQID NO1)。HuSZ51-DSPAα1融合蛋白的輕鏈由信號(hào)肽(氨基酸1-19)、SZ51輕鏈的可變區(qū)(氨基酸20-128)和人Igκ的恒定區(qū)(氨基酸129-235)組成。(B)HuSZ51-VHCγ1-3-DSPAα1重鏈(SEQ ID NO2)。HuSZ51-DSPAα1融合蛋白的重鏈由信號(hào)肽(氨基酸1-19)、SZ51重鏈的可變區(qū)(氨基酸20-137)、人IgG1的恒定區(qū)CH1、CH2和CH3(氨基酸138-467)以及成熟的分泌形式的DSPAα1(氨基酸468-908)組成。
圖3。HuSZ51-DSPAα1的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析。(A)SDS-PAGE。純化的HuSZ51-DSPAα1融合蛋白、重組DSPAα1和人IgG1在非還原和還原條件下在4-10％的SDS-PAGE凝膠上分離，并隨后用考馬斯藍(lán)染色。(B)蛋白質(zhì)印跡法。在通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分離后，將HuSZ51-DSPAα1、DSPAα1和IgG1轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。DSPAα1通過(guò)用生物素化的抗-DSPA單克隆9B3并隨后用HRP-抗生物素蛋白進(jìn)行染色來(lái)檢測(cè)，并且IgG1通過(guò)用綴合有HRP的山羊抗人IgG Fc進(jìn)行染色來(lái)檢測(cè)。
圖4。HuSZ51-DSPAα1與P-選擇素的特異性結(jié)合。(A)硝化纖維膜結(jié)合測(cè)定法。所示量的重組P-選擇素通過(guò)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。與固定化的P-選擇素結(jié)合的HuSZ51-DSPAα1和HuSZ51通過(guò)用綴合有HRP的山羊抗人IgGFc進(jìn)行染色來(lái)檢測(cè)。(B)ELISA。將用重組P-選擇素包被的96孔板與所示濃度的HuSZ51-DSPAα1、IgG1或BSA一起孵育。與P-選擇素結(jié)合的抗體通過(guò)用綴合有HRP的蛋白L進(jìn)行染色來(lái)檢測(cè)，所述蛋白L結(jié)合Igκ輕鏈。
圖5。HuSZ51-DSPAα1與SZ51競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合P-選擇素?；贓LISA的競(jìng)爭(zhēng)性P-選擇素結(jié)合測(cè)定法用于比較SZ51和HuSZ51-DSPAα1的體外P-選擇素結(jié)合親和力。將用重組P-選擇素包被的96孔板與所示濃度的HuSZ51-DSPAα1或人IgG1一起孵育，還加上固定量的SZ51。SZ51與固定化的P-選擇素的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合通過(guò)與綴合有過(guò)氧化物酶的抗小鼠IgG一起孵育，隨后與TMB/E底物一起孵育來(lái)檢測(cè)，所述抗小鼠IgG結(jié)合SZ51但不結(jié)合HuSZ51-DSPAα1。
圖6。HuSZ51-DSPAα1與經(jīng)凝血酶激活的血小板的特異性結(jié)合。(A)人血小板。將用經(jīng)凝血酶激活的血小板包被的96孔板與所示濃度的HuSZ51-DSPAα1、SZ51或人IgG1一起孵育。與活化的血小板結(jié)合的抗體通過(guò)用綴合有HRP的蛋白L進(jìn)行染色來(lái)檢測(cè)，所述蛋白L結(jié)合Igκ輕鏈。(B)犬血小板。將用經(jīng)凝血酶激活的血小板包被的96孔板與所示濃度的HuSZ51-DSPAα1或人IgG1一起孵育。與活化的血小板結(jié)合的抗體通過(guò)用綴合有HRP的蛋白L進(jìn)行染色來(lái)檢測(cè)，所述蛋白L結(jié)合Igκ輕鏈。
圖7。HuSZ51-DSPAα1對(duì)生色底物的催化活性。S-2288(D-Ile-Pro-Arg-對(duì)硝基苯胺二鹽酸鹽)是大范圍絲氨酸蛋白酶的生色底物。S-2765(α-芐氧羰基-D-Arg-Gly-Arg-對(duì)硝基苯胺二鹽酸鹽)是絲氨酸蛋白酶因子X(jué)a的生色底物。HuSZ51-DSPAα1和DSPA對(duì)來(lái)自這些生色底物的對(duì)硝基苯胺的水解通過(guò)405nm處的吸光度的增加來(lái)檢測(cè)。
圖8。HuSZ51-DSPAα1在凝塊溶解測(cè)定法中的纖維蛋白溶解活性。纖溶酶原激活物例如DSPAα1將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，其反過(guò)來(lái)降解纖維蛋白。對(duì)于HuSZ51-DSPAα1(12.5、25和50nM)和對(duì)于等摩爾量的DSPAα1(25、50和100nM)，測(cè)定通過(guò)405nm處的吸光度監(jiān)測(cè)的纖維蛋白降解速度。在纖維蛋白凝塊溶解測(cè)定法(上圖)中，將纖維蛋白原和纖溶酶原與HuSZ51-DSPAα1或DSPAα1混合；然后將這些混合物加入至凝血酶。血漿凝塊溶解測(cè)定法(下圖)類似于纖維蛋白凝塊測(cè)定法，除了使用人血漿作為纖溶酶原和纖維蛋白的來(lái)源外。
圖9。HuSZ51-DSPAα1在缺少血小板和富含血小板的血漿凝塊溶解測(cè)定法中的血栓溶解活性。在使用缺少血小板(上圖)或富含血小板(下圖)的血漿的血漿凝塊溶解測(cè)定法中比較了HuSZ51-DSPAα1、DSPAα1和uPA的纖維蛋白溶解活性。
發(fā)明詳述 本發(fā)明的血栓溶解融合蛋白包括靶向性蛋白，其結(jié)合血管損傷相關(guān)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)，并可操作地連接至纖溶酶原激活物，或其類似物、片段、衍生物或變體。
定義 在本發(fā)明的描述中，下列術(shù)語(yǔ)如下文所示進(jìn)行定義。
“血管損傷相關(guān)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)”指通過(guò)其量或質(zhì)來(lái)指示血管損傷的所有生物學(xué)結(jié)構(gòu)。這種損傷優(yōu)選相當(dāng)新鮮的，即不老于數(shù)小時(shí)。在這個(gè)情況下，“結(jié)構(gòu)”指可以形成靶向性蛋白的結(jié)合配偶體的任何分子。因此，血管損傷相關(guān)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)是靶向性蛋白的“靶分子”。血管損傷相關(guān)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)的一個(gè)例子是P-選擇素，其在血栓生成應(yīng)答的過(guò)程中移位到活化的內(nèi)皮細(xì)胞或活化的血小板表面上。因?yàn)榛罨难“寤蚧罨膬?nèi)皮細(xì)胞在血管損傷附近很豐富，所以P-選擇素是血管損傷相關(guān)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)。
“重組蛋白質(zhì)或多肽”指通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽，即從用編碼所需蛋白質(zhì)或多肽的外源重組DNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽。在大多數(shù)細(xì)菌培養(yǎng)物中表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽將不含聚糖。在酵母中表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽可以具有不同于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的糖基化模式。取決于使用的表達(dá)系統(tǒng)，重組體的糖基化和/或N-末端加工相對(duì)于天然蛋白質(zhì)或多肽而言可能不同。
“天然的”或“天然發(fā)生的”蛋白質(zhì)或多肽指從自然界中存在的來(lái)源回收的蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語(yǔ)“天然的DSPA”將包括天然存在的DSPA及其片段，并且將包括DSPA及其片段的翻譯后修飾，包括但不限于乙?；?、羧化、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化、?；颓懈?。
“融合蛋白”是由至少2個(gè)可操作地連接的異源編碼序列的表達(dá)而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的融合蛋白包括結(jié)合血管損傷相關(guān)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)的靶向性蛋白，所述靶向性蛋白可操作地連接至纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體。
“靶向性蛋白”是結(jié)合另一種蛋白質(zhì)(多肽)或蛋白質(zhì)復(fù)合物或者結(jié)合任何其他靶分子的蛋白質(zhì)或肽或者任何其類似物、片段、衍生物或變體。本發(fā)明的靶向性蛋白優(yōu)選是結(jié)合活化的血小板表面上的P-選擇素的蛋白質(zhì)。例如抗P-選擇素抗體是本發(fā)明的靶向性蛋白。
DNA或多核苷酸“編碼序列”是當(dāng)置于合適的調(diào)節(jié)序列控制下時(shí)在宿主細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄成mRNA并被翻譯成多肽的DNA或多核苷酸序列。編碼序列的邊界由5′N-末端處的起始密碼子和3′C-末端處的翻譯終止密碼子來(lái)確定。編碼序列可以包括原核序列、來(lái)自真核mRNA的cDNA、來(lái)自真核DNA的基因組DNA序列、和合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3′。
“DNA或多核苷酸序列”是脫氧核糖核苷酸(堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶)的雜聚物。編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA或多核苷酸序列可以由衍生自合成的cDNA的DNA片段和短寡核苷酸連接體來(lái)裝配，以提供合成基因，其能夠在重組DNA表達(dá)載體中表達(dá)。在特定雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)的討論中，序列在本文中可以根據(jù)通常慣例進(jìn)行描述，即只給出在沿著cDNA非轉(zhuǎn)錄鏈的5′-3′方向上的序列。
“重組表達(dá)載體或質(zhì)?！笔强蓮?fù)制的DNA載體或質(zhì)粒構(gòu)建體，其用于擴(kuò)增或表達(dá)編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA。表達(dá)載體或質(zhì)粒包含DNA控制序列和編碼序列。DNA控制序列包括啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和增強(qiáng)子。如本文定義的，重組表達(dá)系統(tǒng)將在調(diào)節(jié)元件誘導(dǎo)下表達(dá)融合蛋白。
“轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞”指已用外源DNA轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。外源DNA可以整合或不整合(即共價(jià)連接)至構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體DNA。在原核生物和酵母中，例如，外源DNA可以維持在游離型元件例如質(zhì)粒上，或穩(wěn)定整合到染色體DNA中。就真核細(xì)胞而言，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是外源DNA已整合到染色體復(fù)制中的細(xì)胞。這種穩(wěn)定性通過(guò)真核細(xì)胞系或克隆產(chǎn)生包含所述外源DNA的子細(xì)胞群的能力來(lái)證實(shí)。
“纖溶酶原激活物”指將無(wú)活性的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為活性的纖溶酶的所有蛋白質(zhì)或多肽，或其類似物、片段、衍生物或變體。纖溶酶原激活物的例子是DSPA(去氨普酶)、t-PA或尿激酶(包括其任何部分或修飾)。基于t-PA、DSPA或尿激酶的所有經(jīng)修飾的纖溶酶原激活物分別概述為“t-PA衍生的纖溶酶原激活物”、“DSPA衍生的纖溶酶原激活物”或“尿激酶衍生的纖溶酶原激活物”。這些“衍生的”纖溶酶原激活物基本上分別對(duì)應(yīng)于天然形式的t-PA、DSPA和尿激酶，盡管它們可以攜帶涉及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或其部分的某些刪除以及氨基酸刪除或置換。
“DSPA”指來(lái)源于吸血蝙蝠的纖溶酶原激活物，其可以是分離的(和純化的)或者重組或合成產(chǎn)生的。DSPA包括成熟的、分泌的(經(jīng)加工的)形式的DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ，及其類似物、片段、衍生物和變體，以及所述類似物、衍生物和變體的片段。編碼天然DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ的基因已從吸血蝙蝠中分離并進(jìn)行了測(cè)序(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上；和美國(guó)專利號(hào)6,008,091和5,830,849，所有這些文獻(xiàn)引入本文作為參考)。所有4種形式的DSPA均包含36個(gè)氨基酸的信號(hào)序列，其被切掉以形成成熟的分泌型DSPA。在重組生產(chǎn)后并取決于所使用的表達(dá)系統(tǒng)，DSPA的N末端序列由于前導(dǎo)序列的不精確加工而可能不同。然而，生物學(xué)功能保持不變。
“DSPA結(jié)構(gòu)域”指不連續(xù)的氨基酸序列，其可以與DSPA的特定功能或特征相關(guān)聯(lián)，例如特征性的三級(jí)結(jié)構(gòu)單元。DSPA結(jié)構(gòu)域包括指結(jié)構(gòu)域、EGF結(jié)構(gòu)域、kringle結(jié)構(gòu)域和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上)。
成熟的DSPAα1是441個(gè)氨基酸的多肽，其被組織成4個(gè)不同結(jié)構(gòu)域指結(jié)構(gòu)域(氨基酸6-43)、EGF結(jié)構(gòu)域(氨基酸43-92)、kringle結(jié)構(gòu)域(氨基酸92-174)和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(氨基酸174-441)(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上)。
成熟的DSPAα2是441個(gè)氨基酸的多肽，其被組織成4個(gè)不同結(jié)構(gòu)域指結(jié)構(gòu)域(氨基酸6-43)、EGF結(jié)構(gòu)域(氨基酸43-92)、kringle結(jié)構(gòu)域(氨基酸92-174)和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(氨基酸174-441)(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上)。
成熟的DSPAβ是395個(gè)氨基酸的多肽，其被組織成3個(gè)不同結(jié)構(gòu)域EGF結(jié)構(gòu)域(氨基酸5-46)、kringle結(jié)構(gòu)域(氨基酸46-127)和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(氨基酸127-395)(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上)。
成熟的DSPAγ是358個(gè)氨基酸的多肽，其被組織成2個(gè)不同結(jié)構(gòu)域kringle結(jié)構(gòu)域(氨基酸9-90)和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(氨基酸90-358)(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上)。
當(dāng)涉及本發(fā)明的融合蛋白或者涉及靶向性蛋白、纖溶酶原激活物或結(jié)構(gòu)域時(shí)，術(shù)語(yǔ)“類似物”、“片段”、“衍生物”和“變體”指融合蛋白、靶向性蛋白、纖溶酶原激活物或結(jié)構(gòu)域的類似物、片段、衍生物和變體，其保留了基本上相同的生物學(xué)功能或活性，如下文進(jìn)一步描述的。
“類似物”包括在其內(nèi)包含本發(fā)明融合蛋白的氨基酸序列的多肽原。本發(fā)明的活性融合蛋白可以通過(guò)天然的體內(nèi)加工或通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的操作例如通過(guò)酶促或化學(xué)切割而從完成前融合蛋白(pro-fusion protein)分子的另外氨基酸上切割下來(lái)。例如，天然的DSPAα1天然地被表達(dá)為477個(gè)氨基酸的多肽原，其隨后進(jìn)行體內(nèi)加工以釋放441個(gè)氨基酸的活性成熟多肽。
“片段”是融合蛋白、靶向性蛋白或結(jié)構(gòu)域的部分，其保留了與所述融合蛋白、靶向性蛋白或結(jié)構(gòu)域基本上相似的功能活性，如在本文中公開(kāi)的體外測(cè)定法中所顯示的，這在下文中進(jìn)一步描述。
“衍生物”包括對(duì)于融合蛋白的所有修飾，其基本上保持了本文公開(kāi)的功能并包括另外的結(jié)構(gòu)和伴隨功能，例如，具有更長(zhǎng)半衰期的PEG化的融合蛋白、通過(guò)加入硫酸軟骨素進(jìn)行修飾的O-糖基化融合蛋白、和生物素化的融合蛋白，如下文進(jìn)一步描述的。
“基本上相似的功能活性”和“基本上相同的生物學(xué)功能或活性”各自表示，當(dāng)每種多肽的生物活性通過(guò)相同的操作程序或測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，生物活性程度在與之相比較的多肽所顯示的生物活性的約30％-100％或更多之內(nèi)。例如，具有與DSPAα1基本上相似的功能活性的融合蛋白或DSPA結(jié)構(gòu)域是，當(dāng)在分別于實(shí)施例5和6中所描述的催化或纖維蛋白溶解測(cè)定法中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，顯示出體外水解生色底物或溶解凝塊的能力的那些。具有與抗P-選擇素抗體SZ51基本上相似的功能活性的靶向性蛋白是，當(dāng)在如實(shí)施例2、3和4中描述的結(jié)合測(cè)定法中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，顯示出結(jié)合P-選擇素或活化的血小板或者與SZ51體外競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合P-選擇素的能力的那些。
兩個(gè)多肽之間的“相似性”通過(guò)將一種多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸置換與第二種多肽的序列進(jìn)行比較來(lái)測(cè)定。此類保守置換包括中在下列文獻(xiàn)中描述的那些Dayhoff，M.O.，ed.，The Atlas ofProtein Sequence and Structure 5，National Biomedical ResearchFoundation，Washington，D.C.(1978)，和Argos，P.，EMBO J.(1989)，第8卷，第779-785頁(yè)。例如，屬于下列組之一的氨基酸代表了保守改變 -Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr； -Cys、Ser、Tyr、Thr； -Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe； -Lys、Arg、His； -Phe、Tyr、Trp、His；和 -Asp、Glu。
“哺乳動(dòng)物”包括人和家養(yǎng)動(dòng)物，例如貓、狗、豬、牛、綿羊、山羊、馬、兔等。
本文所使用的“治療比率”或“治療指數(shù)”指，將對(duì)于在哺乳動(dòng)物的疾病治療中產(chǎn)生一定功效所需的本發(fā)明融合蛋白的量(包括，例如，到達(dá)再灌注的時(shí)間、再灌注的持續(xù)時(shí)間或血栓形成的預(yù)防)除以對(duì)于在同一哺乳動(dòng)物中引起特定的不想要的不利效應(yīng)所需的融合蛋白的量(包括，例如，出血時(shí)間或疾病的替代標(biāo)記的表達(dá))。本發(fā)明融合蛋白的治療比率或指數(shù)為至少2，但優(yōu)選至少5，并更優(yōu)選10-20。本發(fā)明融合蛋白的治療比率或指數(shù)可以依靠其更佳的溶解效能、其更少的出血危險(xiǎn)或兩者而增加。
“治療有效量”指，當(dāng)施用給有此需要的人時(shí)，足以完成下列疾病的治療(如下文定義的)的本發(fā)明融合蛋白的量動(dòng)脈血栓形成，急性冠狀動(dòng)脈綜合征，包括ST段升高型心肌梗死、非ST段升高型心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛，導(dǎo)管誘導(dǎo)的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓和深部靜脈血栓形成，肺栓塞和急性缺血性中風(fēng)。構(gòu)成“治療有效量”的本發(fā)明融合蛋白的量將依融合蛋白，待治療的人的病狀及其嚴(yán)重度以及年齡而變，但可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)其自身知識(shí)和本公開(kāi)內(nèi)容常規(guī)地確定。
本文所使用的“治療”或“療法”涵蓋哺乳動(dòng)物優(yōu)選人中的疾病狀態(tài)的治療，所述疾病狀態(tài)的特征在于受損傷的血管內(nèi)不受控制的血液凝固和血小板聚集，其中過(guò)量的纖維蛋白和血小板凝塊在血管中形成并阻斷血流，引起重要的組織或器官的局部缺血性損傷，并且該術(shù)語(yǔ)包括 (i)預(yù)防所述病狀在人中發(fā)生，特別是當(dāng)此類人易患該病狀但仍未診斷為患有該病狀時(shí)； (ii)抑制所述病狀，即阻止其發(fā)展；或 (iii)減輕所述病狀，即引起所述病狀消退。
本文使用的所有其他技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常使用的相同的含義。
靶向性蛋白 本發(fā)明的靶向性蛋白是具有特異性地結(jié)合特定靶分子的能力的蛋白質(zhì)或多肽(或其部分)，其被定義為對(duì)于相當(dāng)新鮮的血管損傷來(lái)說(shuō)特有或特異的(參見(jiàn)上文)。根據(jù)本發(fā)明的靶向性蛋白的例子是P-選擇素。然后，靶向性蛋白用于將融合蛋白導(dǎo)向血管損傷部位，特別是靶結(jié)構(gòu)，例如帶有靶分子的細(xì)胞或組織。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，靶向性蛋白是可以結(jié)合P-選擇素的抗體。本文所使用的“抗體”包括完整的免疫球蛋白(“Ig”)分子及其片段，例如Fab、F(ab′)2和Fv，其能夠結(jié)合P-選擇素的表位。通常，需要至少6、9、10或12個(gè)連續(xù)氨基酸以形成表位。然而，涉及非連續(xù)氨基酸的表位可能需要更多，例如至少15、25或50個(gè)氨基酸。
通常，特異性地結(jié)合P-選擇素的抗體當(dāng)在免疫化學(xué)測(cè)定法中使用時(shí)所提供的檢測(cè)信號(hào)比與其他蛋白質(zhì)所提供的檢測(cè)信號(hào)高至少5、10或20倍。優(yōu)選地，特異性地結(jié)合P-選擇素的抗體在免疫化學(xué)測(cè)定法中不檢測(cè)其他蛋白質(zhì)，并且可以從溶液中免疫沉淀P-選擇素。
P-選擇素可以用于免疫接種哺乳動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴或人以產(chǎn)生多克隆抗體。需要時(shí)，P-選擇素可以綴合至載體蛋白，例如牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白和匙孔血藍(lán)蛋白。取決于宿主種類，可以使用各種佐劑以增加免疫應(yīng)答。此類佐劑包括但不限于，弗氏佐劑、礦物凝膠(例如氫氧化鋁)和表面活性物質(zhì)(例如溶血卵磷脂、pluronic polyols、聚陰離子、肽、油乳膠、匙孔血藍(lán)蛋白和二硝基苯酚)。在用于人中的佐劑之中，BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Cornybacterium parvum)特別有用。
特異性地結(jié)合P-選擇素的單克隆抗體可以使用任何技術(shù)來(lái)進(jìn)行制備，所述技術(shù)為通過(guò)培養(yǎng)中的連續(xù)細(xì)胞系來(lái)生產(chǎn)抗體分子作好了準(zhǔn)備。這些技術(shù)包括但不限于，雜交瘤技術(shù)(Kohler，G.和Milstein，C.，Nature(1985)，第256卷，第495-497頁(yè))，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor，D.等人，Immunology Today(1983)，第4卷，第72-79頁(yè))和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，S.P.C.等人，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，第77-96頁(yè)(eds.，Reisfeld，R.A和Sell，S.，Alan R.Liss，Inc.，New York，N.Y.，1985)。
此外，可以使用開(kāi)發(fā)用于產(chǎn)生“嵌合型抗體”即剪接小鼠抗體基因與人抗體基因以獲得具有合適的抗原特異性和生物活性的分子的技術(shù)(參見(jiàn)Morrison，S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)，第81卷，第6851-6855頁(yè)；Neuberger，M.S.等人，Nature(1984)，第312卷，第604-608頁(yè)；和Takeda，S.等人，Nature(1985)，第314卷，第452-454頁(yè))。單克隆和其他抗體還可以是“人源化的”以預(yù)防當(dāng)所述抗體在治療上使用時(shí)患者發(fā)動(dòng)針對(duì)所述抗體的免疫應(yīng)答。此類抗體在序列上可能足夠類似于在融合蛋白中直接使用的人抗體，或者可能需要改變少數(shù)關(guān)鍵殘基。嚙齒類動(dòng)物和人抗體之間的氨基酸序列差異可以通過(guò)如此來(lái)最小化經(jīng)過(guò)個(gè)別殘基的定點(diǎn)誘變用其人對(duì)應(yīng)物替代嚙齒類動(dòng)物序列，或者接枝整個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)。備選地，人源化抗體可以使用如GB2188638B中描述的重組方法來(lái)產(chǎn)生。如美國(guó)專利5,565,332中公開(kāi)的，特異性地結(jié)合P-選擇素的抗體可以包含部分或完全人源化的抗原結(jié)合部位。為了公開(kāi)P-選擇素特異性抗體的目的，這個(gè)專利完全引入作為參考。
備選地，可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)調(diào)整被描述用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)以產(chǎn)生特異性地結(jié)合P-選擇素的單鏈抗體。具有相關(guān)特異性但不同獨(dú)特型組成的抗體可以通過(guò)從隨機(jī)組合Ig文庫(kù)進(jìn)行鏈改組來(lái)產(chǎn)生(Kang，A.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)，第88卷，第11120-11123頁(yè))。
單鏈抗體還可使用DNA擴(kuò)增方法例如使用雜交瘤cDNA作為模板的PCR來(lái)構(gòu)建(Thirion，S.等人，Eur.J.Cancer Prev.(1996)，第5卷，第507-511頁(yè))。單鏈抗體還可以是單或雙特異性的，并且可以是二價(jià)或四價(jià)的。四價(jià)、雙特異性單鏈抗體的構(gòu)建在例如Coloma，M.J.和Morrison，S.L.，Natl.Biotechnol.(1991)，第15卷，第159-163頁(yè)中教導(dǎo)。雙價(jià)、雙特異性單鏈抗體的構(gòu)建在Mallender，W.D.和Voss，E.W.Jr.，J.Biol.Chem.(1994)，第269卷，第199-206頁(yè)中教導(dǎo)。
編碼單鏈抗體的核苷酸序列可以通過(guò)使用手工或自動(dòng)化核苷酸合成來(lái)構(gòu)建，使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA方法克隆到表達(dá)構(gòu)建體中，并導(dǎo)入細(xì)胞中以表達(dá)編碼序列。備選地，單鏈抗體可以直接使用例如絲狀噬菌體展示技術(shù)來(lái)產(chǎn)生(Verhaar，M.J.等人，Int.J.Cancer(1995)，第61卷，第497-501頁(yè)；和Nicholls，P.J.等人，J.Immunol.Meth.(1993)，第165卷，第81-91頁(yè))。
特異性地結(jié)合P-選擇素的抗體還可通過(guò)誘導(dǎo)在淋巴細(xì)胞群中體內(nèi)產(chǎn)生或者通過(guò)篩選Ig文庫(kù)或高度特異性的結(jié)合試劑的組(panels)來(lái)產(chǎn)生，如文獻(xiàn)中公開(kāi)的(Orlandi，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)，第86卷，第3833-3837頁(yè)；和Winter，G.和Milstein，C.，Nature(1991)，第349卷，第293-299頁(yè))。
包含對(duì)于P-選擇素的特異性結(jié)合部位的抗體片段可以通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，例如Fab片段可以通過(guò)還原F(ab′)2片段的二硫橋來(lái)產(chǎn)生。備選地，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)以允許快速且容易地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段(Huse，W.D.等人，Science(1989)，第246卷，第1275-1281頁(yè))。
本發(fā)明的靶向性蛋白(即抗體)可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法來(lái)表達(dá)和純化。例如，抗體可以通過(guò)經(jīng)過(guò)在其上結(jié)合了P-選擇素的柱來(lái)進(jìn)行親和力純化。結(jié)合的抗體隨后可以使用具有高鹽濃度的緩沖液從柱上洗脫。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶向性蛋白是嵌合型小鼠-人抗P-選擇素單克隆抗體HuSZ51，其來(lái)源于鼠類抗P-選擇素單克隆抗體SZ51，SZ51是在江蘇血液學(xué)研究所開(kāi)發(fā)的。在血小板結(jié)合和蛋白質(zhì)印跡中，SZ51特異性地識(shí)別在經(jīng)凝血酶激活但非靜止的血小板表面上存在的人P-選擇素。每個(gè)經(jīng)凝血酶激活的人血小板有～11,000個(gè)結(jié)合部位，并且抗體的親和力是～4nM(Wu，G.等人，Nouv.Rev.Fr.Hematol.(1990)，第32卷，第231-235頁(yè))。SZ51在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和人患者中的放射標(biāo)記成像研究之中檢測(cè)動(dòng)脈和靜脈血栓，這證實(shí)了其體內(nèi)特異性(Wu，J.等人，Nucl.Med.Commun.(1993)，第14卷，第1088-1092頁(yè))。
HuSZ51通過(guò)如下方式來(lái)產(chǎn)生構(gòu)建分別包含編碼SZ515′的VL和VH區(qū)的cDNA至編碼人Igκ輕鏈和IgGγ1重鏈恒定區(qū)的兩個(gè)表達(dá)質(zhì)粒(Gu，J.等人，Thromb.Haemost.(1997)，第77卷，第755-759頁(yè))。在血小板結(jié)合和免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，HuSZ51特異性地識(shí)別在經(jīng)凝血酶激活的血小板表面上的人P-選擇素(Gu，J.等人(1997)，同上)。
“抗P-選擇素”指結(jié)合P-選擇素的單克隆抗體。所述抗體可以干擾或不干擾P-選擇素的生物活性，所述生物活性包括但不限于，結(jié)合P-選擇素-糖蛋白-配體-1(PSGL-1)的能力、結(jié)合糖蛋白Ib-IX-V復(fù)合物的能力、或介導(dǎo)白細(xì)胞粘附的能力。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“特異性地結(jié)合”指抗體和靶多肽的相互作用，其中所述相互作用取決于多肽上的特定結(jié)構(gòu)(即抗原決定簇或表位)的存在；換言之，所述抗體識(shí)別并結(jié)合特殊多肽結(jié)構(gòu)而不是一般的蛋白質(zhì)。
纖溶酶原激活物 纖溶酶原激活物將無(wú)活性的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為活性的纖溶酶。盡管本發(fā)明的所有纖溶酶原激活物激活纖溶酶原，但纖溶酶原激活物的例子可以在其結(jié)構(gòu)組成和特定的生物學(xué)(和因此藥理學(xué))特性方面不同。對(duì)于具有與天然t-PA基本上相同的結(jié)構(gòu)特性(特別是結(jié)構(gòu)域/氨基酸序列)的所有纖溶酶原激活物，使用術(shù)語(yǔ)“t-PA衍生的”纖溶酶原激活物。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，纖溶酶原激活物用作融合蛋白的一部分，其特征在于增加的纖維蛋白特異性。優(yōu)選地，在纖維蛋白存在下這些纖溶酶原激活物激活纖溶酶的能力相比天然t-PA而言增強(qiáng)超過(guò)650倍。使得纖溶酶原激活物，特別是t-PA衍生的纖溶酶原激活物，具有更高的纖維蛋白特異性的氨基酸序列的修飾在EP 1 308 166A1中公開(kāi)，所述文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容完全引入作為參考。
增強(qiáng)t-PA的纖維蛋白特異性的優(yōu)選突變包括下列t-PA突變體t-PA/R275E；t-PA/R275E，F(xiàn)305H；t-PA/R275E，F(xiàn)305H，A292S。此外還可以使用這樣的t-PA變體，其攜帶Asp194或同源位置中的天冬氨酸的點(diǎn)突變，導(dǎo)致在纖維蛋白不存在下纖溶酶原激活因子的催化活性構(gòu)象的穩(wěn)定性降低。因此，Asp194可以用谷氨酸或天冬酰胺置換。在另一例子中，纖溶酶原激活物在其自溶環(huán)中包括至少一個(gè)突變，其減少了在纖維蛋白不存在下纖溶酶原和纖溶酶原激活因子之間的功能性相互作用。自溶環(huán)的有關(guān)突變例如在野生型t-PA的第420-423位氨基酸或同源位置中，其可以如下置換L420A、L420E、S421G、S421E、P422A、P422G、P422E、F423A和F423E。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，這些t-PA變體可以進(jìn)行修飾以便防止被纖溶酶切割/催化。這些突變(例如谷氨酸置換)可以定位在天然t-PA的第15或275位氨基酸處或者定位在與那些同源的位置處。
此外，來(lái)源于t-PA的纖溶酶原激活物可以應(yīng)用于本發(fā)明中，與天然t-PA相比所述纖溶酶原激活物在其kringle 2結(jié)構(gòu)域中被修飾。這些修飾包括氨基酸置換或甚至kringle 2或其部分的完全刪除。這些經(jīng)修飾的t-PA變體的賴氨酸結(jié)合部位優(yōu)選經(jīng)修飾，以便減少所述纖溶酶原激活物的賴氨酸結(jié)合能力。優(yōu)選的經(jīng)修飾的t-PA變體在WO2005/026341中公開(kāi)，其特此完全引入。優(yōu)選的氨基酸置換是D236N。
本發(fā)明的纖溶酶原激活物可以在纖溶酶活化部位具有LHST氨基酸序列。此外，在其余的kringle(在kringle 2完全刪除的情況下)和隨后的半胱氨酸橋之間的連接序列優(yōu)選是氨基酸序列SKAT。
特別優(yōu)選的本發(fā)明纖溶酶原激活物的氨基酸序列在圖10-15中給出(SEQ ID NO.3-SEQ ID No.8)。在本發(fā)明中還可以使用具有至少70％，優(yōu)選80-90％，特別優(yōu)選95％同一性的氨基酸序列的纖溶酶原激活物。
DSPA 如上文概述的，本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的纖溶酶原激活物是DSPA。全長(zhǎng)DSPA包括指結(jié)構(gòu)域、EGF結(jié)構(gòu)域、kringle結(jié)構(gòu)域和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，融合蛋白的DSPA部分包括至少絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選與一個(gè)或多個(gè)其他DSPA結(jié)構(gòu)域相組合。
編碼來(lái)自吸血蝙蝠的DSPA蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)DNA序列促進(jìn)基因制備，并用作構(gòu)建編碼DSPA肽的DNA序列、包含DSPA的融合蛋白、和DSPA的片段或肽的起始點(diǎn)。
DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ的全長(zhǎng)基因已從吸血蝙蝠中分離并進(jìn)行了測(cè)序(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上；和美國(guó)專利號(hào)6,008,091和5,830,849，所有這些文獻(xiàn)引入本文作為參考)。全長(zhǎng)DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ cDNAs可以通過(guò)幾種方法制備。對(duì)這些基因特異的寡核苷酸探針可以使用所公布的cDNA序列來(lái)合成。例如，從吸血蝙蝠的唾液腺制備的信使RNA為cDNA的制備提供了合適的起始材料。用于制備cDNA文庫(kù)和用寡核苷酸探針來(lái)篩選cDNA文庫(kù)的方法是眾所周知的(參見(jiàn)，例如Sambrook，J.E.等人，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，N.Y.，1989)。備選地，DSPA的全長(zhǎng)cDNA可以使用特異性引物和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從cDNA文庫(kù)進(jìn)行制備。通過(guò)PCR分離cDNA序列的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的。
融合蛋白 本發(fā)明的血栓溶解融合蛋白包括優(yōu)選結(jié)合活化的血小板表面的靶向性蛋白，所述靶向性蛋白可操作地連接至纖溶酶原激活物，或其類似物、片段、衍生物或變體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，纖溶酶原激活物來(lái)源于吸血蝙蝠，并包括絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域和選自指結(jié)構(gòu)域、EGF結(jié)構(gòu)域和kringle結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)其他結(jié)構(gòu)域或其類似物、片段、衍生物或變體。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的抗體或其片段，所述抗體或其片段可操作地連接至DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ或DSPAγ，或其類似物、片段、衍生物或變體。
本發(fā)明的融合蛋白包括但不限于這樣的多肽，其中單鏈抗體的C-末端部分融合至纖溶酶原激活物(例如DSPA)或其類似物、片段、衍生物或變體的N-末端部分，IgG抗體的C-末端部分融合至纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體的N-末端部分，F(xiàn)ab抗體的C-末端部分融合至纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體的N-末端部分，單鏈抗體的N-末端部分融合至纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體的C-末端部分，IgG抗體的N-末端部分融合至纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體的C-末端部分，F(xiàn)ab抗體的N-末端部分融合至纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體的C-末端部分，超過(guò)一種單鏈抗體融合至纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體的N-末端和C-末端部分，超過(guò)一種IgG抗體融合至纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體的N-末端和C-末端部分，超過(guò)一種Fab抗體融合至纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體的N-末端和C-末端部分，超過(guò)一種纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體融合至單鏈抗體的N-末端和C-末端部分，超過(guò)一種纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體融合至IgG抗體的N-末端和C-末端部分，超過(guò)一種纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體融合至Fab抗體的N-末端和C-末端部分，一種或超過(guò)一種纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體融合至二聚單鏈抗體的N-末端和C-末端部分。
本發(fā)明的血栓溶解融合蛋白包括實(shí)施例1的融合蛋白(SEQ ID NO1和2)，以及在序列中與之相比具有非實(shí)質(zhì)性變化的那些融合蛋白。“非實(shí)質(zhì)性變化”將包括任何序列、置換或刪除變體，其基本上保持了本發(fā)明多肽的至少一種生物學(xué)功能，優(yōu)選纖維蛋白選擇性纖溶酶原激活活性。這些功能等價(jià)物可以優(yōu)選包括與SEQ ID NO1和2的融合蛋白具有至少約90％同一性，更優(yōu)選與SEQ ID NO1和2的融合蛋白具有至少95％同一性，更加優(yōu)選與SEQ ID NO1和2的融合蛋白具有至少97％同一性的融合蛋白，并且還包括具有基本上相同的生物活性的此類融合蛋白的部分。然而，在本發(fā)明的描述中包括了在來(lái)自SEQ ID NO1和2的融合蛋白的氨基酸序列中具有非實(shí)質(zhì)性變化的任何融合蛋白，其顯示出功能等價(jià)性，如本文進(jìn)一步描述的。
類似物、片段、衍生物和變體 本發(fā)明的融合蛋白以及靶向性蛋白或纖溶酶原激活物的類似物、片段、衍生物或變體可以是下列的那些(i)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基用保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基)置換，并且此類被置換的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基；或(ii)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包括取代基；或(iii)其中成熟的融合蛋白與另一種化合物融合，例如增加融合蛋白的半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)；或(iv)其中將另外的氨基酸融合至成熟的融合蛋白，例如前導(dǎo)或分泌序列或用于純化成熟的融合蛋白的序列；或(v)其中多肽序列與較大的多肽即人白蛋白、抗體或Fc融合，以用于增加效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間。由于本文的教導(dǎo)，此類類似物、片段、衍生物或變體被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍內(nèi)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的衍生物將包含在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的，優(yōu)選非必需的氨基酸殘基處進(jìn)行的保守氨基酸置換(下文進(jìn)一步定義)?！胺潜匦璧摹卑被釟埢强梢詮牡鞍踪|(zhì)野生型序列中進(jìn)行改變而不改變生物活性的殘基，而“必需的”氨基酸殘基是生物活性所需要的?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是其中氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代的氨基酸置換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域中已定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。對(duì)于保守氨基酸殘基或?qū)τ谖挥诒Ｊ氐鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸殘基將不進(jìn)行非保守置換。片段或生物活性部分包括適合于用作藥物，用作研究反應(yīng)物等的多肽片段。片段包括包含十分類似或來(lái)源于本發(fā)明融合蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列并顯示出那種多肽的至少一種活性的肽，但其包括比本文公開(kāi)的全長(zhǎng)多肽更少的氨基酸。通常，生物活性部分包括具有所述多肽的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。多肽的生物活性部分可以是長(zhǎng)度例如為5個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽。此類生物活性部分可以合成地或通過(guò)重組技術(shù)來(lái)制備，并且可以通過(guò)本文公開(kāi)的和/或本領(lǐng)域眾所周知的方法就本發(fā)明多肽的一種或多種功能活性來(lái)進(jìn)行評(píng)估。
此外，優(yōu)選的本發(fā)明衍生物包括成熟的融合蛋白，其已與另一種化合物融合，例如增加多肽的半衰期和/或減少多肽的潛在免疫原性的化合物(例如聚乙二醇，“PEG”)。PEG可以用于賦予水溶性、大小、慢的腎清除率、和減少的對(duì)于融合蛋白的免疫原性。參見(jiàn)例如美國(guó)專利6,214,966。在PEG化的情況下，融合蛋白與PEG的融合可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，PEG化可以通過(guò)下列方式來(lái)實(shí)現(xiàn)首先將半胱氨酸突變引入融合蛋白內(nèi)，隨后進(jìn)行使用PEG-馬來(lái)酰亞胺的位點(diǎn)特異性衍生化?？梢詫腚装彼峒尤胫岭牡腃-末端。參見(jiàn)，例如Tsutsumi，Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，第97卷，第8548-8553頁(yè)?？梢詫?duì)融合蛋白進(jìn)行的另一種修飾涉及生物素化。在某些情況下，使融合蛋白生物素化可能是有用的，從而使得它可容易地與鏈霉抗生物素蛋白反應(yīng)。用于蛋白質(zhì)的生物素化的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。另外，可以將硫酸軟骨素與融合蛋白連接。
本發(fā)明的融合蛋白、靶向性蛋白和纖溶酶原激活物的變體包括具有與原始融合蛋白、靶向性蛋白和纖溶酶原激活物的氨基酸序列十分類似的氨基酸序列的多肽。術(shù)語(yǔ)“十分類似的”指相對(duì)于第二種氨基酸序列來(lái)說(shuō)包含充分或最小數(shù)目的相同或等價(jià)氨基酸殘基的第一種氨基酸序列，從而使得第一種和第二種氨基酸序列具有共同的結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域和/或共同的功能活性。例如，包含至少約45％，優(yōu)選約75％-98％相同的共同結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在本文中定義為十分類似的。優(yōu)選地，變體將與本發(fā)明的優(yōu)選融合蛋白的氨基酸序列十分類似。變體包括由多核苷酸編碼的融合蛋白的變體，所述多核苷酸在嚴(yán)緊條件下與本發(fā)明的多核苷酸或其互補(bǔ)物雜交。此類變體一般保留了本發(fā)明融合蛋白的功能活性。多核苷酸片段文庫(kù)可以用于產(chǎn)生多樣化的片段群用于篩選和后續(xù)選擇。例如，片段文庫(kù)可以通過(guò)下列方法產(chǎn)生在每個(gè)分子只出現(xiàn)大約一次切口的條件下用核酸酶處理多核苷酸的雙鏈PCR片段，使雙鏈DNA變性，使DNA復(fù)性以形成可以包括來(lái)自不同帶切口的產(chǎn)物的有義/反義對(duì)的雙鏈DNA，通過(guò)用S1核酸酶處理從再形成的雙鏈體中去除單鏈部分，并將所得到的片段文庫(kù)連接到表達(dá)載體中。通過(guò)這種方法，可以得到表達(dá)文庫(kù)，其編碼本發(fā)明融合蛋白的各種大小的N-末端和內(nèi)部片段。
變體包括由于誘變而在氨基酸序列方面不同的融合蛋白，以及靶向性蛋白和纖溶酶原激活物。具有纖溶酶原激活活性(其優(yōu)選是纖維蛋白選擇性的)的變體可以通過(guò)使用分別在實(shí)施例5和6中描述的催化和纖維蛋白溶解測(cè)定法篩選本發(fā)明融合蛋白或纖溶酶原激活物的突變體例如截短或點(diǎn)突變體的組合文庫(kù)來(lái)鑒定。具有P-選擇素結(jié)合活性的變體可以通過(guò)使用在實(shí)施例2、3和4中描述的P-選擇素結(jié)合測(cè)定法篩選本發(fā)明融合蛋白或靶向性蛋白的突變體例如截短或點(diǎn)突變體的組合文庫(kù)來(lái)鑒定。
變體的多樣化文庫(kù)可以通過(guò)核酸水平上的組合誘變來(lái)產(chǎn)生，并由多樣化基因文庫(kù)編碼。變體的多樣化文庫(kù)例如可以通過(guò)下列方式來(lái)產(chǎn)生將合成的寡核苷酸的混合物酶促連接到基因序列中，從而使得潛在變體氨基酸序列的簡(jiǎn)并組可表達(dá)為單獨(dú)的多肽，或備選地表達(dá)為在其中包含序列組的更大融合蛋白的組(例如對(duì)于噬菌體展示)。存在可以用于由簡(jiǎn)并的寡核苷酸序列生產(chǎn)潛在變體文庫(kù)的各種方法。簡(jiǎn)并的基因序列的化學(xué)合成可以在DNA自動(dòng)合成儀中進(jìn)行，并且然后將合成的基因連接到合適的表達(dá)載體中?；虻暮?jiǎn)并組的使用允許在一種混合物中供應(yīng)編碼所需的潛在變體序列組的所有序列。用于合成簡(jiǎn)并寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)，例如Narang，S.A.，Tetrahedron(1983)，第39卷，第3頁(yè)；Itakura，K.等人，Annu.Rev.Biochem.(1984a)，第53卷，第323-356頁(yè)；Itakura，K.等人，Science(1984b)，第98卷，第1056-1063頁(yè)，和Ike，Y.等人，Nucleic Acid Res.(1983)，第11卷，第477-488頁(yè))。
用于篩選通過(guò)點(diǎn)突變或截短制備的組合文庫(kù)的基因產(chǎn)物，以及用于在cDNA文庫(kù)中篩選具有所選擇的特性的基因產(chǎn)物的幾種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。此類技術(shù)可進(jìn)行調(diào)整以適合于在通過(guò)融合蛋白以及靶向性蛋白和纖溶酶原激活物的組合誘變而產(chǎn)生的基因文庫(kù)中快速篩選纖維蛋白選擇性纖溶酶原激活活性或P-選擇素結(jié)合活性。順應(yīng)于用于篩選大基因文庫(kù)的高流通量分析的最廣泛使用的技術(shù)通常包括，將基因文庫(kù)克隆到可復(fù)制的表達(dá)載體中，用所得到的載體文庫(kù)轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，并在所需活性的檢測(cè)有助于分離載體(所述載體編碼其產(chǎn)物被檢測(cè)的基因)的條件下表達(dá)所述組合基因。循環(huán)整體誘變(recursiveensemble mutagenesis，REM)是一種增加文庫(kù)中功能性突變體的頻率的技術(shù)，其可以與篩選測(cè)定法組合使用以鑒定所需變體。
融合蛋白的產(chǎn)生 本發(fā)明的融合蛋白通過(guò)下列方式來(lái)產(chǎn)生根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法將靶向性蛋白融合至，或者將其結(jié)合至纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體。這兩種組分可以通過(guò)各種眾所周知的化學(xué)操作中的任何一種而化學(xué)鍵合在一起。例如，這種連接可以經(jīng)由異雙功能交聯(lián)劑，例如SPDP、碳化二亞胺、戊二醛等。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶向性蛋白可以通過(guò)重組方法例如經(jīng)由使用重組DNA技術(shù)融合至DSPA結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生編碼所述靶向性蛋白和所述編碼纖溶酶原激活物的多肽兩者的核酸，并在宿主細(xì)胞例如大腸桿菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)DNA序列。編碼融合蛋白的DNA可以以cDNA形式通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何克隆程序進(jìn)行克隆。參見(jiàn)，例如Sambrook，J.E.等人(1989)，同上。
在靶向性蛋白是單鏈抗體的情況下，一旦已鑒定出編碼在表達(dá)時(shí)顯示特異性結(jié)合活性的Fv區(qū)的DNA序列，包括那個(gè)Fv區(qū)的融合蛋白就可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行制備。因此，例如，Chaudhary，V.K.等人，Nature(1989)，第339卷，第394-397頁(yè)；Batra，J.K.等人，J.Biol.Chem.(1990)，第265卷，第15198-15202頁(yè)；Batra，J.K.等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA(1989)，第86卷，第8545-8549頁(yè)；和Chaudhary，V.K.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)，第87卷，第1066-1070頁(yè)(全部引入作為參考)，描述了各種單鏈抗體融合蛋白的制備。Fv區(qū)可以直接融合至纖溶酶原激活物或者可以經(jīng)由連接體序列進(jìn)行連接。連接體序列的存在可以只提供靶向性部分和纖溶酶原激活物之間的間隔，或者促進(jìn)這些區(qū)域之間的可移動(dòng)性以使得它們各自能夠達(dá)到其最佳構(gòu)象。包括連接子的DNA序列還可提供序列(例如引物或限制性位點(diǎn))以有助于克隆，或者可以在編碼靶向性部分的序列和編碼纖溶酶原激活物的序列之間保留閱讀框。此類連接子肽的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
在本發(fā)明中，連接體序列可以用于將抗P-選擇素抗體或其類似物、片段、衍生物或變體連接至纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體。連接體序列還可用于連接單鏈抗體的重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域。很明顯，可以使用0-15個(gè)氨基酸的連接體序列。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，以使用許多不同的連接體序列而仍產(chǎn)生保留了纖維蛋白溶解活性、纖維蛋白選擇性、P-選擇素結(jié)合活性和活化的血小板結(jié)合活性的融合蛋白。連接體序列的修飾可以旨在使纖維蛋白溶解活性、纖維蛋白選擇性、P-選擇素結(jié)合活性和/或活化的血小板結(jié)合活性的增強(qiáng)最大化。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗P-選擇素DSPAα1融合蛋白通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體來(lái)產(chǎn)生，在所述表達(dá)載體中將編碼成熟的DSPAα1的cDNA插入SZ51-VH-人IgG1 CH3區(qū)的3′(Gu，J.等人，(1997)，同上)。所得到的表達(dá)質(zhì)粒與編碼SZ51-VL-人Igκ嵌合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生HuSZ51-DSPAα1。所得到的融合蛋白以及輕鏈和重鏈表達(dá)質(zhì)粒的示意圖描繪在圖1中。HuSZ51-DSPAα1分子包含2條Ig輕鏈和2條Ig重鏈。輕鏈由SZ51的VL區(qū)和人IgGκ的恒定區(qū)組成。重鏈由SZ51的VH區(qū)、人IgG1的恒定區(qū)1-3和全長(zhǎng)DSPAα1組成。HuSZ51-DSPAα1的2個(gè)多肽鏈的氨基酸序列描繪在圖2中(SEQ ID NO1和2)。
使用全長(zhǎng)人uPA cDNA來(lái)制備相似的構(gòu)建體，以產(chǎn)生融合蛋白HuSZ51-uPA(Wan，H.等人，Thromb.Res.(2000)，第97卷，第133-141頁(yè))。在這種情況下，親和力純化的HuSZ51-uPA抑制親本鼠類單克隆抗體SZ51與經(jīng)凝血酶激活的人血小板的結(jié)合，這證實(shí)抗P-選擇素-纖溶酶原激活物融合蛋白可以保留體外血小板結(jié)合活性(Wan，H.等人(2000)，同上)。
HuSZ51-DSPAα1通過(guò)首先將編碼SZ51的VL和VH區(qū)的cDNA分別插入包含人Igκ輕鏈恒定區(qū)和IgG1重鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中來(lái)產(chǎn)生。輕鏈構(gòu)建體pLNOSZ51VK/Hygro是由病毒CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)質(zhì)粒，其包括選擇標(biāo)記潮霉素。為了構(gòu)建這種質(zhì)粒，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)產(chǎn)生在側(cè)翼具有BsmI和BsiWI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的、編碼SZ51的VL區(qū)的DNA片段，用BsmI和BsiWI消化，并插入質(zhì)粒pLNO/Kappa/潮霉素的BsmI和BsiWI位點(diǎn)之間(Norderhaug，L.等人，J.Immunol.Meth.(1997)，第204卷，第77-87頁(yè))。所得到的由SZ51-VL區(qū)和人Igκ恒定區(qū)組成的輕鏈構(gòu)建體描繪在圖1B中。重鏈構(gòu)建體pLNOSZ51VH/Neo是病毒CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體，其包括選擇標(biāo)記新霉素。為了構(gòu)建這種質(zhì)粒，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)產(chǎn)生在側(cè)翼具有BsmI和BsiWI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的、包含SZ51的VH區(qū)的DNA片段，用BsmI和BsiWI消化，并插入質(zhì)粒pLNOH/IgG1/Neo的BsmI和BsiWI位點(diǎn)之間(Norderhaug，L.等人(1997)，同上)。接下來(lái)，通過(guò)重疊PCR產(chǎn)生包含IgG1 CH3結(jié)構(gòu)域的DNA片段，所述IgG1 CH3結(jié)構(gòu)域直接融合至成熟的分泌形式的DSPAα1(在側(cè)翼具有BamHI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn))。所得到的PCR片段用NsiI和BamHI消化，隨后插入至質(zhì)粒pLNOSZ51VH/Neo的NsiI和BamHI位點(diǎn)之間。所得到的嵌合型重鏈-DSPA融合構(gòu)建體pLNOSZ51VHDSPA/Neo由SZ51-VH區(qū)、人IgG1恒定區(qū)和成熟的分泌形式的DSPAα1組成，其描繪在圖1B中。
使用這些方法產(chǎn)生了其他抗P-選擇素-DSPAα1融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒，包括HuSZ51Fab′-DSPAα1，其缺乏HuSZ51-DSPAα1中的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域；和scFvSZ51-DSPAα1，其為(從N-至C-末端)包含SZ51-VL區(qū)、隨后為SZ51-VH區(qū)和成熟的分泌形式的DSPAα1的單鏈抗體。類似方法用于產(chǎn)生本發(fā)明的其他融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。
融合蛋白的表達(dá)和純化 存在幾種體外表達(dá)重組融合蛋白的方法，包括大腸桿菌、桿狀病毒、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或其他表達(dá)系統(tǒng)。用于在細(xì)菌中表達(dá)克隆的基因的方法是眾所周知的。為了在原核系統(tǒng)中獲得克隆的基因的高水平表達(dá)，必需構(gòu)建表達(dá)載體，其最少包含強(qiáng)啟動(dòng)子以指導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄終止。適合于這個(gè)目的的調(diào)節(jié)區(qū)的例子是大腸桿菌β-葡糖苷酶基因、大腸桿菌色氨酸生物合成途徑的啟動(dòng)子和操縱子區(qū)，或來(lái)自噬菌體λ的左側(cè)(leftward)啟動(dòng)子。在轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中的DNA質(zhì)粒中包含選擇標(biāo)記是有用的。此類標(biāo)記的例子包括給予對(duì)于氨芐青霉素、四環(huán)素或氯霉素的抗性的基因。
從可用于表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的高等真核細(xì)胞系統(tǒng)中可以選擇出眾多細(xì)胞系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的說(shuō)明性例子包括但不限于RPMI7932、VERO和HeLa細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(“CHO”)細(xì)胞系、WI38、BHK、COS-7、C127或MDCK細(xì)胞系。適合在本發(fā)明中使用的細(xì)胞從ATCC商購(gòu)可得。舉例說(shuō)明性的非哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞系包括但不限于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和家蠶(Bombyx mori)。
翻譯后修飾例如糖基化在原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌中不發(fā)生。此外，具有復(fù)雜的二硫化物模式的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)常常是錯(cuò)折疊的。使用原核系統(tǒng)，表達(dá)的蛋白質(zhì)以不溶形式即所謂的內(nèi)含體(可在裂解細(xì)胞后在可溶部分中發(fā)現(xiàn))存在于細(xì)胞質(zhì)中，或者通過(guò)添加合適的分泌信號(hào)序列而導(dǎo)向周質(zhì)中。如果所表達(dá)的蛋白質(zhì)是不溶性內(nèi)含體，那么通常需要進(jìn)行內(nèi)含體的溶解和后續(xù)的重折疊。
許多原核表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且是商購(gòu)可得的，例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)、pKK233-2(Clontech，Palo Alto，CA，USA)和pGEM1(PromegaBiotech，Madison，WI，USA)。
在重組微生物表達(dá)系統(tǒng)中常用的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang，A.C.等人，Nature(1978)，第275卷，第617-624頁(yè)；和Goeddel，D.V.等人，Nature(1979)，第281卷，第544-548頁(yè))、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel，D.V.等人，Nucl.Acids Res.(1980)，第8卷，第4057-4074頁(yè))和tac啟動(dòng)子(Sambrook，J.E.等人，(1989)，同上)。另一種有用的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)采用λ噬菌體pL啟動(dòng)子和cIts857溫度誘導(dǎo)型阻抑物(Bernard，H.U.等人，Gene(1979)，第5卷，第59-76頁(yè)；和Love，C.A.等人，Gene(1996)，第176卷，第49-53頁(yè))。重組融合蛋白還可在酵母宿主例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達(dá)。它通常提供進(jìn)行各種翻譯后修飾的能力。表達(dá)出的融合蛋白可以分泌到培養(yǎng)物上清液中，在那里沒(méi)有許多其他蛋白質(zhì)，有利于純化。用于在本發(fā)明中表達(dá)融合蛋白的酵母載體包含某些必要特征。載體的元件一般來(lái)源于酵母和細(xì)菌以允許質(zhì)粒在兩者中增殖。細(xì)菌元件包括復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記。酵母元件包括復(fù)制起點(diǎn)序列、選擇標(biāo)記、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子。
在酵母載體中用于表達(dá)的合適啟動(dòng)子包括TRP1基因、ADH1或ADHII基因、酸性磷酸酶(PH03或PH05)基因、異細(xì)胞色素(isocytochrome)基因的啟動(dòng)子，或參與糖酵解途徑的啟動(dòng)子，例如烯醇化酶、丙酮酸激酶、己糖激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙糖磷酸異構(gòu)酶和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子(Hitzeman，R.A.等人，J.Biol.Chem.(1980)，第255卷，第12073-12080頁(yè)；Hess，B.等人，J.Adv.Enzyme Reg.(1968)，第7卷，第149-167頁(yè)；和Holland，M.J.和Holland，J.P.，Biochemistry(1978)，第17卷，第4900-4907頁(yè))。
商購(gòu)可得的酵母載體包括pYES2、pPIC9(Invitrogen，San Diego，CA)、Yepc-pADH2a、pYcDE-1(Washington Research，Seattle，WA)、pBC102-K22(ATCC#67255)和YpGX265GAL4(ATCC#67233)。包括但不限于COS-7、L細(xì)胞、C127、3T3、CHO、HeLa、BHK、CHL-1、NSO和HEK293的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可以用于在本發(fā)明中表達(dá)重組融合蛋白。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì)通常是可溶的和糖基化的，并且具有真正的N-末端。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可以包含不轉(zhuǎn)錄的元件，例如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及5′或3′非翻譯序列例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)、接納體位點(diǎn)和剪接供體、和轉(zhuǎn)錄終止序列。在哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中使用的啟動(dòng)子通常是，例如病毒啟動(dòng)子例如多瘤病毒、腺病毒、HTLV、猿猴病毒40(“SV 40”)和人巨細(xì)胞病毒(“CMV”)。
取決于所選擇的表達(dá)系統(tǒng)和宿主，均質(zhì)的重組融合蛋白可以通過(guò)使用用于蛋白質(zhì)純化的常規(guī)色譜法的各種組合來(lái)獲得。這些包括免疫親和色譜法、反相色譜法、陽(yáng)離子交換色譜法、陰離子交換色譜法、疏水相互作用色譜法、凝膠過(guò)濾色譜法和HPLC。如果表達(dá)系統(tǒng)將融合蛋白分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，那么蛋白質(zhì)可以直接從培養(yǎng)基中純化。如果融合蛋白不分泌，那么將它從細(xì)胞裂解物中分離。細(xì)胞破碎可以通過(guò)任何常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行，包括冷凍-融化循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎或使用細(xì)胞裂解劑。
使用標(biāo)準(zhǔn)的哺乳動(dòng)物基因表達(dá)和純化技術(shù)來(lái)表達(dá)和純化本發(fā)明的抗P-選擇素-DSPA融合蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將哺乳動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。當(dāng)使用CHO細(xì)胞時(shí)，可以包括新霉素或潮霉素作為真核選擇標(biāo)記。
使用脂質(zhì)體介導(dǎo)(Lipofectin 2000)的方法將嵌合型輕鏈構(gòu)建體pLNOSZ51VK/Hygro和嵌合型重鏈-DSPA融合構(gòu)建體pLNOSZ51VHDSPA/Neo共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞使用500μg/ml新霉素和600μg/ml潮霉素在HAMS/F-12培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。挑選出112個(gè)抗生素抗性CHO克隆，并使用ELISA就HuSZ51-DSPAα1融合蛋白的表達(dá)進(jìn)行篩選。這112個(gè)克隆中有6個(gè)在3mg/L-6mg/L的水平上表達(dá)蛋白質(zhì)，并且表達(dá)水平維持超過(guò)10次細(xì)胞傳代。3個(gè)克隆即#62、#70和#87用于按比例擴(kuò)大的細(xì)胞培養(yǎng)(細(xì)胞工廠)以產(chǎn)生用于蛋白質(zhì)純化的條件培養(yǎng)基。
來(lái)自分泌HuSZ51-DSPAα1的CHO克隆的條件培養(yǎng)基首先通過(guò)0.22μm過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，隨后使用10kDa分子量截止膜(在Ultrafiltration Prep System上的2個(gè)Millipore PelliconMembranes)濃縮10-20倍。然后將濃縮的材料上載到用50mM檸檬酸鈉(6.5)、300mM NaCl平衡的A蛋白柱上。當(dāng)完全上載時(shí)，柱用10個(gè)柱體積的相同緩沖液洗滌，并且用50mM檸檬酸鈉(pH2.7)、300mM NaCl洗脫蛋白質(zhì)。洗脫液用1M Tris-HCl(pH8.0)中和，并且將洗脫液的pH維持在pH5.0-7.0。為了消除少量的污染性牛IgG，將A蛋白柱洗脫液上載到用20mM乙酸鈉(pH5.0)，100mM NaCl平衡的陽(yáng)離子交換SP-Fractogel柱上，隨后采用至0.9M NaCl的線性梯度以3mL/分鐘的流速洗脫20分鐘。收集包含HuSZ51-DSPAα1融合蛋白的第二個(gè)洗脫峰。對(duì)SP-Fractogel柱洗脫液實(shí)施通過(guò)Sephacryl-300HR凝膠過(guò)濾柱的進(jìn)一步蛋白質(zhì)純化以消除任何蛋白質(zhì)聚集體。
使用這些方法，表達(dá)并純化了其他抗P-選擇素-DSPAα1融合蛋白，包括HuSZ51Fab′-DSPAα1，其缺乏HuSZ51-DSPAα1中的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域；和scFvSZ51-DSPAα1，其為(從N-至C-末端)包含SZ51-VL區(qū)、隨后為SZ51-VH區(qū)和成熟的分泌形式的DSPAα1的單鏈抗體。類似方法用于表達(dá)和純化本發(fā)明的其他融合蛋白。
藥物組合物 本發(fā)明還提供了藥物組合物，其可以施用給患者以達(dá)到治療效果?？梢酝ㄟ^(guò)將具有所需純度和藥學(xué)有效量的融合蛋白與生理學(xué)上可接受的載體相組合來(lái)制備本發(fā)明的藥物組合物以用于施用。
本發(fā)明的融合蛋白可以在用于靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或鞘內(nèi)施用的藥物組合物中使用。因此，上述多肽優(yōu)選將與可接受的無(wú)菌藥學(xué)載體組合，例如5％的葡萄糖、乳酸林格氏液、生理鹽水、無(wú)菌水或設(shè)計(jì)用于靜脈內(nèi)輸注的任何其他商業(yè)制備的生理學(xué)緩沖溶液。應(yīng)當(dāng)理解，載體溶液的選擇，以及組合物的劑量和施用，將依受試者和特定臨床情況而變，并且將通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)程序來(lái)控制。
依照本發(fā)明的方法，這些藥物組合物可以以對(duì)于抑制與受試者血管中過(guò)量的纖維蛋白和血小板凝塊相關(guān)聯(lián)的病理學(xué)結(jié)果來(lái)說(shuō)有效的量進(jìn)行施用。
融合蛋白的施用可以通過(guò)靜脈內(nèi)快速濃注、通過(guò)持續(xù)的靜脈內(nèi)輸注、或通過(guò)兩種途徑的組合來(lái)進(jìn)行。備選地，或者另外地，與合適的賦形劑相混合的融合蛋白可以經(jīng)由肌內(nèi)位點(diǎn)而帶入循環(huán)中。
本發(fā)明的重組融合蛋白和藥物組合物可用于腸胃外、局部、靜脈內(nèi)、口服或局域施用。取決于施用方法，藥物組合物可以以各種單位劑型進(jìn)行施用。例如，單位劑型可以以包括但不限于片劑、膠囊、粉劑、溶液和乳狀液的形式進(jìn)行施用。
本發(fā)明的重組融合蛋白和藥物組合物特別可用于靜脈內(nèi)施用。用于施用的組合物將通常包括溶解在藥學(xué)上可接受的載體中，優(yōu)選溶解在水性載體中的融合蛋白溶液?？梢允褂酶鞣N水性載體，例如緩沖鹽水等。這些溶液是無(wú)菌的并且一般不含不希望的物質(zhì)。組合物可以通過(guò)常規(guī)的、眾所周知的滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌。
用于靜脈內(nèi)施用的典型藥物組合物可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地決定。施用的量很明顯是蛋白質(zhì)特異的，并且取決于其效力和藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性。用于制備腸胃外可施用的組合物的現(xiàn)行方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或顯而易見(jiàn)的，并且在諸如Remington’sPharmaceutical Science，第18版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1990)的出版物中更詳細(xì)地描述。
包含本融合蛋白或其混合物(即與其他蛋白質(zhì)一起)的組合物可以在治療性處理中進(jìn)行施用。在治療應(yīng)用中，組合物可以以足以治愈或至少部分地阻止所述病癥的量施用給患有動(dòng)脈血栓形成的患者。足夠?qū)崿F(xiàn)這點(diǎn)的量被定義為“治療有效劑量”。對(duì)于這個(gè)用途來(lái)說(shuō)有效的量將取決于疾病的嚴(yán)重度和患者健康的一般狀態(tài)。
組合物的單一或多重施用可以取決于患者所需要和耐受的劑量和頻率進(jìn)行施用。無(wú)論如何，組合物應(yīng)當(dāng)提供足夠量的本發(fā)明蛋白質(zhì)以有效地治療患者。一般地，取決于所期望的施用模式，藥學(xué)上可接受的組合物將包含約1％-約99重量％的本發(fā)明融合蛋白，和99％-1重量％的合適的藥學(xué)賦形劑或載體。優(yōu)選地，組合物將具有約5％-75重量％的本發(fā)明融合蛋白，其余的是合適的藥學(xué)賦形劑或載體。
本發(fā)明的融合蛋白，或其藥學(xué)上可接受的組合物以治療有效量進(jìn)行施用，所述治療有效量將依各種因素而變，包括所采用的特定融合蛋白的活性；所述融合蛋白的代謝穩(wěn)定性和作用時(shí)間長(zhǎng)短；患者的年齡、體重、一般健康狀態(tài)、性別和飲食；施用方式和時(shí)間；排泄速度；藥物組合；特定疾病狀態(tài)的嚴(yán)重度；和宿主正在經(jīng)歷的療法。一般地，治療有效日劑量是約0.14mg-約14.3mg本發(fā)明融合蛋白/kg體重/天，優(yōu)選地，約0.7mg-約10mg/kg體重/天，并且最優(yōu)選地，約1.4mg-約7.2mg/kg體重/天。例如，對(duì)于給70kg的人施用，劑量范圍將是約10mg-約1.0g本發(fā)明融合蛋白/天，優(yōu)選約50mg-約700mg/天，并且最優(yōu)選約100mg-約500mg/天。
細(xì)胞和基因療法 本發(fā)明的融合蛋白可以依照本發(fā)明，通過(guò)根據(jù)稱為“細(xì)胞療法”的方法體內(nèi)表達(dá)此類融合蛋白來(lái)使用。因此，例如，細(xì)胞可以用編碼所述融合蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)進(jìn)行離體改造，然后將經(jīng)改造的細(xì)胞提供給待用該融合蛋白進(jìn)行治療的患者。此類方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的程序通過(guò)使用包含編碼本發(fā)明融合蛋白的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒進(jìn)行改造。
本發(fā)明的融合蛋白還可依照本發(fā)明，通過(guò)根據(jù)稱為“基因療法”的方法體內(nèi)表達(dá)此類融合蛋白來(lái)使用。因此，例如，病毒可以用編碼所述融合蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)進(jìn)行改造，然后將經(jīng)改造的病毒提供給待用該融合蛋白進(jìn)行治療的患者。此類方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，重組腺病毒可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的程序進(jìn)行改造以包含編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA。
使用細(xì)胞或基因療法來(lái)局部遞送本發(fā)明的融合蛋白可以向靶區(qū)域即內(nèi)襯在血管中的內(nèi)皮細(xì)胞提供治療劑。
體外和體內(nèi)的細(xì)胞和基因療法方法均是被考慮的。用于將潛在治療基因轉(zhuǎn)移至指定細(xì)胞群的幾種方法是已知的。參見(jiàn)，例如Mulligan，R.C.，Science(1993)，第260卷，第926-932頁(yè)。這些方法包括直接基因轉(zhuǎn)移(參見(jiàn)，例如Wolff，J.A.等人，Science(1990)，第247卷，第1465-1468頁(yè))；脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移(參見(jiàn)，例如Caplen，N.J.等人，Nature Med.(1995)，第3卷，第39-46頁(yè)；Crystal，R.G.，Nature Med.(1995)，第1卷，第15-17頁(yè)；Gao，X.和Huang，L.，Biochem.Biophys.Res.Comm.(1991)，第79卷，第280-285頁(yè))；逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移(參見(jiàn)，例如Kay，M.A.等人，Science(1993)，第262卷，第117-119頁(yè)；Anderson，W.F.，Science(1992)，第256卷，第808-813頁(yè))；和DNA病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。此類DNA病毒包括腺病毒(優(yōu)選基于Ad2或Ad5的載體)、皰疹病毒(優(yōu)選基于單純皰疹病毒的載體)和細(xì)小病毒(優(yōu)選基于“有缺陷的”或非自主性細(xì)小病毒的載體，更優(yōu)選基于腺伴隨病毒的載體，最優(yōu)選基于AAV-2的載體)。參見(jiàn)，例如Ali，M.等人，Gene Therapy(1994)，第1卷，第367-384頁(yè)；美國(guó)專利4,797,368，引入本文作為參考；和美國(guó)專利5,139,941，引入本文作為參考。
用于轉(zhuǎn)移目的基因的特定載體系統(tǒng)的選擇將取決于各種因素。一個(gè)重要因素是靶細(xì)胞群的性質(zhì)。盡管逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已被廣泛研究并用于眾多基因療法應(yīng)用中，但這些載體一般不適合于感染非分裂性細(xì)胞。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒具有致癌可能。然而，慢病毒載體領(lǐng)域中的近期進(jìn)展可以避開(kāi)這些局限性中的一些。參見(jiàn)Naldini，L.等人，Science(1996)，第272卷，第263-267頁(yè)。
上文提及的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體所來(lái)源于的逆轉(zhuǎn)錄病毒可以包括，但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒、脾壞死病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒例如勞斯肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽類白血病病毒、長(zhǎng)臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺腫瘤病毒。
腺病毒具有下列優(yōu)點(diǎn)具有廣的宿主范圍，可以感染靜止的或終末分化的細(xì)胞例如神經(jīng)元或肝細(xì)胞，并且似乎基本上不致癌。參見(jiàn)，例如Ali，M.等人(1994)，同上。腺病毒似乎不整合到宿主基因組中。因?yàn)樗鼈兇嬖谟谌旧w外，所以插入性誘變的危險(xiǎn)將極大地減少。Ali，M.等人(1994)，同上。
腺伴隨病毒呈現(xiàn)出與基于腺病毒的載體類似的優(yōu)點(diǎn)。然而，AAVs顯示出在人染色體19上的位點(diǎn)特異性整合(Ali，M.等人(1994)，同上)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA在細(xì)胞或基因療法中用于心血管疾病，包括但不限于，動(dòng)脈血栓形成，急性冠狀動(dòng)脈綜合征，包括ST段升高型心肌梗死、非ST段升高型心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛，導(dǎo)管誘導(dǎo)的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓，深部靜脈血栓形成，肺栓塞和急性缺血性中風(fēng)。
根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，使用編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA的細(xì)胞或基因療法與診斷同時(shí)或緊在其后提供給有此需要的患者。
技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，包含編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA或編碼本發(fā)明融合蛋白的類似物、片段、衍生物或變體的DNA的任何合適的基因療法載體可以依照這個(gè)實(shí)施方案進(jìn)行使用。用于構(gòu)建此類載體的技術(shù)是已知的。參見(jiàn)，例如Anderson，W.F.，Nature(1998)，第392卷，第25-30頁(yè)；和Verma，I.M.和Somia，N.，Nature(1998)，第389卷，第239-242頁(yè)。包含融合蛋白DNA的載體向靶位點(diǎn)的引入可以使用已知技術(shù)來(lái)完成。
細(xì)胞或基因療法載體包括一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子?？梢圆捎玫暮线m的啟動(dòng)子包括但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR；SV40啟動(dòng)子；和在Miller，A.D和Rosman，G.J.，Biotechniques(1989)，第7卷，第980-990頁(yè)中描述的人CMV啟動(dòng)子，或者任何其他啟動(dòng)子(例如，細(xì)胞啟動(dòng)子例如真核細(xì)胞啟動(dòng)子，包括但不限于，組蛋白、pol III和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。可以采用的其他病毒啟動(dòng)子包括但不限于，腺病毒啟動(dòng)子、胸苷激酶(“TK”)啟動(dòng)子和B19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。由于本文包含的教導(dǎo)，合適啟動(dòng)子的選擇對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。
編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸序列置于合適啟動(dòng)子的控制下。可以采用的合適啟動(dòng)子包括但不限于，腺病毒啟動(dòng)子，例如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子；或異源啟動(dòng)子，例如CMV啟動(dòng)子；呼吸道合胞病毒啟動(dòng)子；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如MMT啟動(dòng)子，金屬硫蛋白啟動(dòng)子；熱休克啟動(dòng)子；白蛋白啟動(dòng)子；ApoAl啟動(dòng)子；人珠蛋白啟動(dòng)子；病毒胸苷激酶啟動(dòng)子，例如單純皰疹病毒TK啟動(dòng)子；逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs(包括上文描述的經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs)；β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；和人生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子。
逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體用于轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以形成生產(chǎn)細(xì)胞系?？梢员晦D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的例子包括但不限于，PE501，PA317，psi-2，psi-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，psiCRE，psiCRIP，GP+#-86，GP+envAm12和DAN細(xì)胞系，其在整體引入本文作為參考的Miller，A.D.，Hum.Gene Ther.(1990)，第1卷，第5-14頁(yè)中描述。載體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。此類方法包括但不限于，電穿孔、使用脂質(zhì)體和CaPO4沉淀。在一種備選方法中，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以包囊到脂質(zhì)體中或偶聯(lián)至脂質(zhì)，并隨后施用給宿主。生產(chǎn)細(xì)胞株產(chǎn)生具有感染性的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，其包括編碼所述多肽的核酸序列。此類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒隨后可以用于體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼所述多肽的核酸序列?？梢员晦D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于，胚胎干細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞以及造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
與基因療法不同的一種方法是“轉(zhuǎn)核療法(transkaryotictherapy)”，其中對(duì)患者細(xì)胞進(jìn)行離體處理以誘導(dǎo)休眠的染色體基因在被重新引入患者后產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)核療法假定個(gè)體具有對(duì)于激活來(lái)說(shuō)所需的基因的正常補(bǔ)足物(complement)。轉(zhuǎn)核療法涉及將啟動(dòng)子或能夠激活新生基因的其他外源調(diào)節(jié)序列離體導(dǎo)入患者細(xì)胞的染色體DNA中，培養(yǎng)并選擇產(chǎn)生活性蛋白質(zhì)的細(xì)胞，然后將活化的細(xì)胞重新導(dǎo)入患者中，目的是它們隨后變得完全建立。然后，“基因活化的”細(xì)胞制造目的蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)一定的顯著量的時(shí)間，可能長(zhǎng)達(dá)患者一生。美國(guó)專利號(hào)5,641,670和5,733,761詳細(xì)公開(kāi)了這個(gè)構(gòu)思，并被特此整體引入作為參考。
試劑盒 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于研究或診斷目的的試劑盒。試劑盒通常包括包含本發(fā)明融合蛋白的一個(gè)或多個(gè)容器。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，試劑盒包括包含以適合于用第二種分子進(jìn)行衍生化的形式存在的融合蛋白的容器。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒包括包含SEQ ID NO.1和2的融合蛋白的容器。進(jìn)一步提供了包括游離形式或藥學(xué)上可接受的形式的本發(fā)明組合物的試劑盒。試劑盒可以包括關(guān)于其施用的說(shuō)明書。本發(fā)明的試劑盒可以在本發(fā)明的任何方法中使用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可以包含編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列。優(yōu)選地，編碼這些融合蛋白的DNA序列在適合于轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中并由所述宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)的質(zhì)粒中提供。所述質(zhì)?？梢园瑔?dòng)子(通常是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)以調(diào)節(jié)所述DNA在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。所述質(zhì)粒還可包含合適的限制性位點(diǎn)以有助于將其他DNA序列導(dǎo)入質(zhì)粒中，以產(chǎn)生各種融合蛋白。所述質(zhì)粒還可包含眾多的其他元件以有助于所編碼的蛋白質(zhì)的克隆和表達(dá)。此類元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且包括例如選擇標(biāo)記、起始密碼子、終止密碼子等。
治療適應(yīng)癥 其中血栓形成起著重要的病因?qū)W作用的疾病、病癥或病狀包括動(dòng)脈血栓形成，急性冠狀動(dòng)脈綜合征，包括ST段升高型心肌梗死、非ST段升高型心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛，導(dǎo)管誘導(dǎo)的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓，深部靜脈血栓形成，肺栓塞和急性缺血性中風(fēng)。本發(fā)明的融合蛋白可用于在其中血栓形成是病理狀態(tài)的所有這些疾病、病癥或病狀?！翱捎糜凇笔侵溉诤系鞍讓?duì)于進(jìn)行治療以預(yù)防疾病或防止其進(jìn)展至更嚴(yán)重狀態(tài)來(lái)說(shuō)有用。
進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案 如上文在本發(fā)明概述中所述的本發(fā)明融合蛋白之中，幾組融合蛋白是特別優(yōu)選的。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至DSPAα1或其類似物、片段、衍生物或變體。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至以其任何組合的DSPAα1指、EGF和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，或其類似物、片段、衍生物或變體。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至以其任何組合的DSPAα1指、kringle和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，或其類似物、片段、衍生物或變體。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至以其任何組合的DSPAα1指和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，或其類似物、片段、衍生物或變體。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的單克隆抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述單克隆抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至DSPAα1或其類似物、片段、衍生物或變體。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的嵌合型單克隆抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述嵌合型單克隆抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至DSPAα1或其類似物、片段、衍生物或變體。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的Fab二聚體抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述Fab二聚體抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至DSPAα1或其類似物、片段、衍生物或變體。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的單鏈抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述單鏈抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至DSPAα1或其類似物、片段、衍生物或變體。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的HuSZ51或其類似物、片段、衍生物或變體，所述HuSZ51或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至DSPAα1或其類似物、片段、衍生物或變體。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的HuSZ51或其類似物、片段、衍生物或變體，所述HuSZ51或其類似物、片段、衍生物或變體經(jīng)由重鏈而可操作地連接至DSPAα1或其類似物、片段、衍生物或變體。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于治療動(dòng)脈血栓形成，急性冠狀動(dòng)脈綜合征，包括ST段升高型心肌梗死、非ST段升高型心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛，導(dǎo)管誘導(dǎo)的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓和深部靜脈血栓形成，肺栓塞和急性缺血性中風(fēng)的方法，所述方法包括給有此需要的人施用治療有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的HuSZ51或其類似物、片段、衍生物或變體，所述HuSZ51或其類似物、片段、衍生物或變體經(jīng)由重鏈而可操作地連接至DSPAα1或其類似物、片段、衍生物或變體。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于預(yù)防動(dòng)脈血栓形成，急性冠狀動(dòng)脈綜合征，包括ST段升高型心肌梗死、非ST段升高型心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛，導(dǎo)管誘導(dǎo)的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓和深部靜脈血栓形成，肺栓塞和急性缺血性中風(fēng)的方法，所述方法包括給有此需要的人施用治療有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的HuSZ51或其類似物、片段、衍生物或變體，所述HuSZ51或其類似物、片段、衍生物或變體經(jīng)由重鏈而可操作地連接至DSPAα1或其類似物、片段、衍生物或變體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，融合蛋白在中風(fēng)發(fā)作后超過(guò)3小時(shí)施用給患有急性缺血性中風(fēng)的患者。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合活化的血小板的抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至選自DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ的纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至選自DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ的纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至DSPAα2或其類似物、片段、衍生物或變體。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至DSPAβ或其類似物、片段、衍生物或變體。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至DSPAγ或其類似物、片段、衍生物或變體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的選自單克隆抗體、嵌合型單克隆抗體、人源化單克隆抗體、人單克隆抗體、Fab二聚體抗體、Fab單體抗體、IgG抗體、IgG抗體類似物和單鏈抗體的抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至選自DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ的纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至選自DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ的纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體，其中所述融合蛋白通過(guò)添加其他分子進(jìn)行修飾，所述其他分子包括但不限于聚乙二醇、生物素和硫酸軟骨素。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括結(jié)合P-選擇素的抗體或其類似物、片段、衍生物或變體，所述抗體或其類似物、片段、衍生物或變體可操作地連接至選自DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ的纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體，其中所述抗體不與P-選擇素-糖蛋白-配體-1(PSGL-1)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合P-選擇素，不與糖蛋白Ib-IX-V復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合P-選擇素，或不抑制白細(xì)胞與活化的血小板的粘附。
本發(fā)明的融合蛋白的制備 使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA、哺乳動(dòng)物基因表達(dá)和蛋白質(zhì)純化技術(shù)產(chǎn)生了根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的融合蛋白。圖1A描述了一種此類融合蛋白的例子，HuSZ51-DSPAα1，其包括由融合至人Igκ恒定區(qū)的抗P-選擇素抗體VL區(qū)組成的兩條輕鏈，和由融合至人IgGγ1恒定區(qū)和成熟的分泌形式的吸血蝙蝠纖溶酶原激活物DSPAα1的抗P-選擇素抗體VH區(qū)組成的兩條重鏈?？筆-選擇素-DSPAα1融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，以及抗P-選擇素-DSPAα1融合蛋白的表達(dá)和產(chǎn)生在上文描述。
特異性地結(jié)合P-選擇素的小鼠單克隆抗體SZ51從江蘇血液學(xué)研究所獲得。SZ51的IgGγ1重鏈和Igκ輕鏈基因的可變區(qū)DNA序列存放于GenBank中(登錄號(hào)分別為gi4099282和gi4099284)。如上文詳細(xì)描述和圖1B中描繪的，將編碼SZ51的VH區(qū)的cDNA以位于編碼人Igκ恒定區(qū)的cDNA的5′端的方式克隆到表達(dá)質(zhì)粒中，并且將編碼SZ51的VH區(qū)的cDNA以位于編碼人IgGγ1恒定區(qū)的基因組DNA的5′端的方式克隆到表達(dá)質(zhì)粒中。將編碼成熟的分泌形式的DSPAα1的cDNA插入IgGγ1的CH3結(jié)構(gòu)域的3′端。
對(duì)這些表達(dá)質(zhì)粒實(shí)施DNA測(cè)序以確認(rèn)所述融合蛋白的上述構(gòu)建體和氨基酸序列。嵌合型SZ51-VL-人Igκ輕鏈(SEQ ID NO1)和嵌合型SZ51-VH-人IgGγ1-DSPAα1重鏈(SEQ ID NO2)的氨基酸序列分別顯示于圖2A和圖2B中。
如上所述，將輕鏈和重鏈表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，并鑒定出表達(dá)抗P-選擇素-DSPA融合蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體，并隨后從所選擇的陽(yáng)性CHO克隆的條件培養(yǎng)基中純化出HuSZ51-DSPAα1。如實(shí)施例1中所述，HuSZ51-DSPAα1通過(guò)SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行分析，其結(jié)果顯示于圖3中。如預(yù)期的，純化的HuSZ51-DSPAα1融合蛋白具有～250kDa的表觀Mr.，并且由～108kDa和～23kDa的兩個(gè)亞基組成，所述兩個(gè)亞基分別對(duì)應(yīng)于HuSZ51-VHCγ1-3-DSPAα1和HuSZ51-VLCκ。如通過(guò)分別在圖3A和3B中所示的考馬斯藍(lán)染色和蛋白質(zhì)印跡法所判斷的，在純化的HuSZ51-DSPAα1材料中沒(méi)有明顯的降解產(chǎn)物或雜質(zhì)。
使用本文中對(duì)于HuSZ51-DSPAα1所例示的上述方法，對(duì)本發(fā)明融合蛋白進(jìn)行克隆、表達(dá)、純化并分析其純度和完整性。使用這些方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠?qū)⒉煌贵w片段與纖溶酶原激活物片段相組合以產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白。
本發(fā)明的融合蛋白的測(cè)試 使用如本文在上文中描述的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA、哺乳動(dòng)物基因表達(dá)和蛋白質(zhì)純化技術(shù)來(lái)產(chǎn)生通過(guò)HuSZ51-DSPAα1所例示的本發(fā)明的融合蛋白，并隨后如實(shí)施例1中所描述的分析其純度和完整性，其結(jié)果顯示于圖3中。本發(fā)明的融合蛋白在各種體外測(cè)定法中進(jìn)行測(cè)試以證實(shí)其功用，即本發(fā)明的融合蛋白保留了結(jié)合活化的血小板、降解纖維蛋白、和誘導(dǎo)血栓溶解的能力。這些測(cè)定法在下文的實(shí)施例2-7中詳細(xì)描述，其結(jié)果顯示于圖4-9中。
純化的HuSZ51-DSPAα1在體外結(jié)合P-選擇素的能力以3種方式來(lái)證實(shí)(1)通過(guò)硝化纖維素濾紙結(jié)合測(cè)定法，其測(cè)量HuSZ51-DSPAα1結(jié)合固定在濾膜上的重組P-選擇素的能力；(2)通過(guò)ELISA，其測(cè)量HuSZ51-DSPAα1結(jié)合固定在塑料上的P-選擇素的能力；和(3)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA，其測(cè)量HuSZ51-DSPAα1與親本單克隆抗體SZ51競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固定在塑料上的重組P-選擇素的能力。這些測(cè)定法在實(shí)施例2和3中描述。圖4A顯示，HuSZ51-DSPAα1和HuSZ51在其結(jié)合固定在硝化纖維素上的P-選擇素的能力方面是相當(dāng)?shù)?，和圖4B顯示，HuSZ51-DSPAα1以劑量依賴性方式結(jié)合固定在塑料上的P-選擇素。圖5顯示，HuSZ51-DSPAα1以劑量依賴性方式與SZ51競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合P-選擇素。這些結(jié)果證實(shí)，DSPAα1連接至HuSZ51重鏈的C-末端不會(huì)不利地影響抗P-選擇素抗體在體外結(jié)合P-選擇素的能力。
純化的HuSZ51-DSPAα1在體外結(jié)合活化的血小板的能力通過(guò)ELISA來(lái)證實(shí)，所述ELISA測(cè)量HuSZ51-DSPAα1結(jié)合包被在塑料上的經(jīng)凝血酶激活的血小板的能力。這個(gè)測(cè)定法在下文描述于實(shí)施例4中。圖6A顯示，HuSZ51-DSPAα1和SZ51以無(wú)差別的方式結(jié)合人的經(jīng)凝血酶激活的血小板，和圖6B顯示，HuSZ51-DSPAα1以劑量依賴性方式結(jié)合犬的經(jīng)凝血酶激活的血小板。這些結(jié)果證實(shí)，DSPAα1連接至HuSZ51重鏈的C-末端不會(huì)不利地影響抗P-選擇素抗體在體外結(jié)合活化的血小板的能力。
純化的HuSZ51-DSPAα1的體外催化活性以2種方式來(lái)證實(shí)(1)生色測(cè)定法，其測(cè)量HuSZ51-DSPAα1催化絲氨酸蛋白酶底物水解的能力；和(2)凝塊溶解測(cè)定法，其測(cè)量HuSZ51-DSPAα1降解纖維蛋白的能力。這些測(cè)定法在實(shí)施例5、6和7中描述。圖7顯示，HuSZ51-DSPAα1和DSPAα1展示出相當(dāng)?shù)膶?duì)于兩種絲氨酸蛋白酶底物的催化活性。圖8(上圖)顯示，在體積摩爾濃度的基礎(chǔ)上，在纖維蛋白凝塊溶解測(cè)定法中，HuSZ51-DSPAα1和DSPAα1在其降解纖維蛋白能力方面是無(wú)差別的，和圖8(下圖)顯示，在血漿凝塊溶解測(cè)定法中，HuSZ51-DSPAα1和DSPAα1在其降解纖維蛋白能力方面是相當(dāng)?shù)?。圖9顯示，HuSZ51-DSPAα1和DSPAα1在使用缺少血小板(上圖)或富含血小板(下圖)的血漿的血漿凝塊溶解測(cè)定法中優(yōu)于uPA。這些結(jié)果證實(shí)，DSPAα1連接至HuSZ51重鏈的C-末端不會(huì)不利地影響DSPAα1催化靶底物水解的能力，以及HuSZ51-DSPAα1在體外作為血栓溶解劑優(yōu)于uPA。
本發(fā)明的融合蛋白在體內(nèi)測(cè)定法中進(jìn)行測(cè)試以證實(shí)其功用，即本發(fā)明的融合蛋白是有效的血栓溶解劑，其具有比單獨(dú)的相應(yīng)的纖溶酶原激活物更低的出血危險(xiǎn)。這個(gè)測(cè)定法在實(shí)施例8中描述。
提供下列具體實(shí)施例作為幫助實(shí)踐本發(fā)明的指導(dǎo)，而不希望作為對(duì)于本發(fā)明范圍的限制。應(yīng)當(dāng)理解，在下列制備和實(shí)施例中，抗體片段和纖溶酶原激活物片段的組合只有當(dāng)此類組成導(dǎo)致穩(wěn)定的融合蛋白時(shí)是允許的。
實(shí)施例1 抗P-選擇素-DSPA融合蛋白的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析 純化的HuSZ51-DSPAα1融合蛋白通過(guò)SDS-PAGE和通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)表明，純化的HuSZ51-DSPAα1是完整的并且不含可檢測(cè)的污染性材料。
1.通過(guò)SDS-PAGE來(lái)分析HuSZ51-DSPAα1。純化的HuSZ51-DSPAα1、重組DSPAα1和人IgG1在4-10％梯度SDS-PAGE凝膠上在非還原和還原條件下分離，并用考馬斯藍(lán)染色。結(jié)果顯示于圖3A中。在非還原條件下，HuSZ51-DSPAα1具有～250kDa的表觀Mr.，和在還原條件下，HuSZ51-DSPAα1由～108kDa和～23kDa的兩個(gè)亞基組成，所述兩個(gè)亞基分別對(duì)應(yīng)于HuSZ51-VHCγ1-3-DSPAα1和HuSZ51-VLCκ。在純化的HuSZ51-DSPAα1材料中沒(méi)有明顯的降解產(chǎn)物或雜質(zhì)。
2.通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法來(lái)分析HuSZ51-DSPAα1。純化的HuSZ51-DSPAα1、重組DSPAα1和人IgG1在4-10％梯度SDS-PAGE凝膠上在非還原和還原條件下分離。電泳后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到Hybond ECL硝化纖維素膜(Amersham)上。將膜與ECL封閉劑(Amersham)一起在室溫下孵育1小時(shí)，隨后用PBST洗滌3次。然后將膜與生物素化的抗-DSPA單克隆9B3(抗-DSPA，1∶4000)一起孵育并隨后與HRP-抗生物素蛋白(1∶5000)進(jìn)一步孵育，或者與綴合有HRP的山羊抗人IgG Fc(GAH-IgG，1∶7500)一起孵育。ECL蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)試劑(Amersham)的添加導(dǎo)致在標(biāo)準(zhǔn)X射線膠片上捕獲到化學(xué)發(fā)光信號(hào)。這些結(jié)果顯示于圖3B中?？笵SPA在非還原條件下檢測(cè)到HuSZ51-DSPAα1為單一種類。GAH-IgG在非還原條件下檢測(cè)到HuSZ51-DSPAα1為單一種類，和在還原條件下檢測(cè)到HuSZ51-DSPAα1為兩個(gè)種類(HuSZ51-VHCγ1-3-DSPAα1和HuSZ51-VLCκ)。在純化的HuSZ51-DSPAα1材料中沒(méi)有明顯的降解產(chǎn)物或雜質(zhì)。
使用這些方法，分析了其他抗P-選擇素-DSPAα1融合蛋白的純度和完整性，包括HuSZ51Fab′-DSPAα1，其缺乏HuSZ51-DSPAα1中的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域；和scFvSZ51-DSPAα1，其為(從N-至C-末端)包含SZ51-VL區(qū)、隨后為SZ51-VH區(qū)和成熟的分泌形式的DSPAα1的單鏈抗體。類似方法用于分析本發(fā)明的其他融合蛋白的純度和完整性。
實(shí)施例2 抗P-選擇素-DSPAα1融合蛋白的特異性P-選擇素結(jié)合活性 純化的HuSZ51-DSPAα1在體外特異性地結(jié)合P-選擇素的能力使用硝化纖維素結(jié)合測(cè)定法和通過(guò)ELISA來(lái)進(jìn)行研究。數(shù)據(jù)表明，HuSZ51-DSPAα1保留了原始的抗P-選擇素單克隆抗體SZ51的P-選擇素結(jié)合活性。
1.HuSZ51-DSPAα1與硝化纖維素膜上的P-選擇素的結(jié)合。將指定量(0、5、10、20或40ng)的重組可溶性P-選擇素(R&D systems)連同10ng人IgG1一起在SDS-PAGE凝膠上分離，并隨后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。一張膜與HuSZ51一起孵育，和第二張膜與HuSZ51-DSPAα1一起孵育。洗滌后，結(jié)合的HuSZ51或HuSZ51-DSPAα1通過(guò)綴合有HRP的山羊抗人Fc進(jìn)行檢測(cè)。將還通過(guò)綴合有HRP的山羊抗人Fc進(jìn)行檢測(cè)的人IgG1泳道的強(qiáng)度用作標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照。圖4A顯示，HuSZ51和HuSZ51-DSPAα1在其結(jié)合固定在硝化纖維素膜上的P-選擇素的能力方面是無(wú)差別的。
2.HuSZ51-DSPAα1在ELISA中與P-選擇素的結(jié)合。96孔板用每孔100μl的重組人P-選擇素(R&D Systems)以2μg/ml的終濃度(在PBS中重構(gòu))進(jìn)行包被，并于4℃孵育過(guò)夜。經(jīng)包被的平板在洗滌溶液(PBS，pH7.4加上0.05％Tween-20)中洗滌一次，隨后用每孔200μl封閉溶液(在PBS中制備的5％牛奶)于37℃孵育2小時(shí)。在封閉后，平板用洗滌溶液洗滌3次，隨后用包含各種量的HuSZ51-DSPAα1、人IgG1或BSA的100μl洗滌溶液于37℃孵育1小時(shí)。平板用洗滌溶液洗滌3次，隨后與綴合有過(guò)氧化物酶的蛋白L(Pierce)一起于37℃孵育1小時(shí)。平板用洗滌溶液洗滌4次，隨后與100μl TMB/E底物(ZYMED)一起在室溫下孵育5分鐘。過(guò)氧化物酶反應(yīng)通過(guò)加100μl 1N HCl來(lái)中止，并且將平板在5分鐘內(nèi)于450nm處讀取吸光度。圖4B顯示，HuSZ51-DSPAα1而不是人IgG1能夠結(jié)合固定在塑料上的P-選擇素。
實(shí)施例3 抗P-選擇素-DSPA融合蛋白對(duì)于P-選擇素的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 設(shè)計(jì)基于ELISA的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定法以比較親本P-選擇素抗體SZ51與抗P-選擇素-DSPA融合蛋白HuSZ51-DSPAα1的P-選擇素結(jié)合親和力。96孔板用每孔100μl重組人P-選擇素(R&D Systems)以2μg/ml的終濃度進(jìn)行包被，并于4℃孵育過(guò)夜。經(jīng)包被的平板用洗滌溶液(PBS，pH7.4加上0.05％Tween-20)洗滌1次，隨后用每孔200μl封閉溶液(在PBS中制備的5％牛奶)于37℃孵育2小時(shí)。
以0-200nM的終濃度將50μl系列稀釋的競(jìng)爭(zhēng)者(HuSZ51-DSPAα1，或作為負(fù)對(duì)照的人IgG1)加入至單個(gè)孔中，隨后除了空白對(duì)照外向每個(gè)孔中加入50μl SZ51(1.6nM的終濃度)，然后將平板于37℃孵育1小時(shí)。將平板用洗滌溶液洗滌3次，隨后與二抗即綴合有過(guò)氧化物酶的抗小鼠IgG(SANTA CRUZ，#S-2031)一起于37℃孵育1小時(shí)。將平板用洗滌溶液洗滌4次，隨后與100μl TMB/E底物(ZYMED)一起在室溫下孵育5分鐘。過(guò)氧化物酶反應(yīng)通過(guò)加入100μl 1N HCl來(lái)中止，并且將平板在5分鐘內(nèi)于450nm處讀取吸光度。圖5中顯示的結(jié)果表明，HuSZ51-DSPAα1能夠以劑量依賴性方式抑制SZ51與P-選擇素的結(jié)合，這證實(shí)抗P-選擇素-DSPA融合蛋白保留了與抗P-選擇素小鼠單克隆抗體相同或相似的P-選擇素結(jié)合活性。
實(shí)施例4 抗P-選擇素-DSPA融合蛋白的結(jié)合活化的血小板的活性 通過(guò)ELISA來(lái)研究純化的HuSZ51-DSPAα1在體外特異性地結(jié)合經(jīng)人或犬凝血酶激活的血小板的能力。96孔板用每孔100μl包含1×106個(gè)經(jīng)凝血酶激活的人或犬血小板的溶液包被，并于4℃孵育過(guò)夜。經(jīng)包被的平板用洗滌溶液(PBS，pH7.4加上0.05％Tween-20)洗滌1次，隨后用每孔200μl封閉溶液(在PBS中制備的5％牛奶)于37℃孵育2小時(shí)。經(jīng)封閉的平板用洗滌溶液洗滌3次，隨后用包含各種量的HuSZ51-DSPAα1、SZ51或人IgG1的100μl洗滌溶液于37℃孵育1小時(shí)。平板用洗滌溶液洗滌3次，隨后與綴合有過(guò)氧化物酶的蛋白L(Pierce)一起于37℃孵育1小時(shí)。平板用洗滌溶液洗滌4次，隨后與100μl TMB/E底物(ZYMED)一起在室溫下孵育5分鐘。過(guò)氧化物酶反應(yīng)通過(guò)加入100μl 1N HCl來(lái)中止，并且將平板在5分鐘內(nèi)于450nm處讀取吸光度。圖6A顯示，HuSZ51-DSPAα1和SZ51在其于體外特異性地結(jié)合人的經(jīng)凝血酶激活的血小板的能力方面是無(wú)差別的。圖6B顯示，HuSZ51-DSPAα1在體外能夠特異性地結(jié)合犬的經(jīng)凝血酶激活的血小板。
實(shí)施例5 抗P-選擇素-DSPA融合蛋白的催化活性 使用生色測(cè)定法(Bringmann，P.等人(1995)，同上)來(lái)比較抗P-選擇素-DSPA融合蛋白HuSZ51-DSPAα1與重組DSPAα1的的催化活性。S-2288(D-Ile-Pro-Arg-對(duì)硝基苯胺二鹽酸鹽)是大范圍絲氨酸蛋白酶的生色底物。S-2765(α-芐氧羰基-D-Arg-Gly-Arg-對(duì)硝基苯胺二鹽酸鹽)是因子X(jué)a的生色底物。纖溶酶原激活物如DSPAα1從這些生色底物上切割下對(duì)硝基苯胺(“pNA”)基團(tuán)。反應(yīng)混合物在96孔板中以每孔150μl的體積制備，包含10nM HuSZ51-DSPAα1或20nM DSPAα1(等摩爾量，因?yàn)槊總€(gè)HuSZ51-DSPAα1包含2個(gè)DSPAα1分子)，以及0.1-0.8mM S-2288或S-2765，在碳酸鹽緩沖液(0.05M Na2CO3和0.1％Tween 80)，pH9.5中。允許水解反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，并使用微量滴定板閱讀器通過(guò)405nm處吸光度值的改變來(lái)測(cè)量反應(yīng)速度。所得到的值使用標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)化為[pNA]，并將數(shù)據(jù)對(duì)S-2288或S-2765濃度進(jìn)行作圖。動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Kcat和Km/Kcat根據(jù)米-曼二氏方程用計(jì)算機(jī)化程序(KaleidaGraph 3.0)來(lái)計(jì)算。圖7中顯示的結(jié)果證實(shí)，HuSZ51-DSPAα1和DSPAα1具有類似的體外催化活性。
實(shí)施例6 抗P-選擇素-DSPA融合蛋白的纖維蛋白溶解活性 纖溶酶原激活物例如DSPAα1將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，所述纖溶酶反過(guò)來(lái)降解纖維蛋白。纖維蛋白降解速率可以通過(guò)405nm處的吸光度值來(lái)監(jiān)控(降解伴隨吸光度值的減少而進(jìn)行)。體外纖維蛋白溶解活性以兩種凝塊溶解測(cè)定法形式進(jìn)行測(cè)量(A)分別使用纖溶酶原和纖維蛋白原作為酶和底物；和(B)使用血漿作為酶和底物的來(lái)源。(A)在纖維蛋白凝塊溶解測(cè)定法中，反應(yīng)混合物如下在96孔板中進(jìn)行制備將20μl HuSZ51-DSPAα1(12.5、25和50nM)或等摩爾量的DSPAα1、10μl纖維蛋白原(20mg/ml)、1μl纖溶酶原(1U/ml)、2μl 1M CaCl2、60μl 0.04M HEPES(pH7.0)、0.15M NaCl和0.01％Tween 80(v/v)混合。立即將混合物加入至包含4μl凝血酶的另一孔中(75U/ml)?；旌衔锏目傮w積用水補(bǔ)足至120μl?；旌虾螅?05nm處的吸光度于37℃每分鐘進(jìn)行監(jiān)控，共60分鐘。數(shù)據(jù)通過(guò)KaleidaGraph 3.0進(jìn)行分析。(B)血漿凝塊溶解測(cè)定法如(A)中一樣進(jìn)行準(zhǔn)備，除了使用30μl重構(gòu)的人血漿(51mg/ml，Sigma)代替纖維蛋白原和纖溶酶原。如圖8所示，HuSZ51-DSPAα1和DSPAα1的體外纖維蛋白溶解活性在纖維蛋白凝塊溶解測(cè)定法中是無(wú)差別的(上圖)，和在血漿凝塊溶解測(cè)定法中是相當(dāng)?shù)?下圖)。
實(shí)施例7 抗P-選擇素-DSPA融合蛋白的體外血栓溶解活性 HuSZ51-DSPAα1的血栓溶解活性在凝塊溶解測(cè)定法中使用缺少血小板(上圖)或富含血小板(下圖)的血漿進(jìn)行評(píng)估。測(cè)定法基本上如實(shí)施例6中所述進(jìn)行。缺少血小板的血漿包含大約2×104個(gè)血小板/μl，和富含血小板的血漿包含大約2×105個(gè)血小板/μl。HuSZ51-DSPAα1、DSPAα1和uPA(Sigma)的纖維蛋白溶解活性在血漿凝塊溶解測(cè)定法中使用缺少血小板(上圖)或富含血小板(下圖)的血漿進(jìn)行比較。HuSZ51-DSPAα1、DSPAα1或uPA在1ml重構(gòu)的人血漿中與I125-標(biāo)記的凝塊一起孵育3小時(shí)，并取出100μl上清液以測(cè)量可溶放射性。溶解百分比是可溶放射性/總放射性×100％。使用缺少血小板或富含血小板的血漿，HuSZ51-DSPAα1的體外血栓溶解活性與DSPAα1相當(dāng)并且優(yōu)于uPA。
實(shí)施例8 抗P-選擇素-DSPA融合蛋白的體內(nèi)血栓溶解活性 犬股動(dòng)脈血栓溶解模型 將雄性畢爾格獵犬(beagle dog)(8-12kg)用異氟烷(2-3％)麻醉并插入氣管套管。分離右和左股動(dòng)脈并圍繞動(dòng)脈放置超聲流量探針(2.5SB)。將充滿鹽水的導(dǎo)管插入左和右頸靜脈用于血液取樣并用于施用HuSZ51-DSPAα1、DSPAα1或媒介物(vehicle)。為了測(cè)量血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)，將Miller壓力傳感器導(dǎo)管(2Fr.)插入右肱動(dòng)脈。切口用創(chuàng)緣夾閉合。
在實(shí)驗(yàn)整個(gè)過(guò)程中監(jiān)控血壓、心率和股動(dòng)脈流量，并通過(guò)NOTOCORD數(shù)據(jù)獲得系統(tǒng)進(jìn)行加工。通過(guò)視覺(jué)來(lái)監(jiān)控呼吸模式。從股血流量測(cè)量中獲得功效參數(shù)，例如FeCl2應(yīng)用后到達(dá)閉塞的時(shí)間、藥物施用后到達(dá)再灌注的時(shí)間和再灌注的持續(xù)時(shí)間。對(duì)于其血管在藥物施用后沒(méi)有復(fù)通的動(dòng)物，再灌注時(shí)間記錄為240分鐘(整個(gè)觀察期)，和再灌注持續(xù)時(shí)間為0分鐘。藥物施用后灌注到股血管床中的總血流量通過(guò)計(jì)算曲線下面積(AUC)來(lái)測(cè)定，并且表達(dá)為基線值的百分比。對(duì)于預(yù)防血管，計(jì)算到達(dá)閉塞的時(shí)間、再灌注的總持續(xù)時(shí)間和曲線下面積作為功效的量度。
將左前爪的4個(gè)趾甲中的每一個(gè)分派用于出血時(shí)間測(cè)定。出血通過(guò)使用趾甲修剪器修剪指甲表皮(從末端～3mm)來(lái)誘導(dǎo)。將傷口停止出血的時(shí)間記錄為初期出血時(shí)間。對(duì)于先前已凝結(jié)的那些指甲，監(jiān)控并記錄再出血時(shí)間。
離體α2-抗纖溶酶和DSPA活性通過(guò)比色測(cè)定法來(lái)測(cè)定。內(nèi)源α2-抗纖溶酶活性通過(guò)使用D-Val-Leu-Lys-對(duì)硝基苯胺作為底物進(jìn)行測(cè)定，并且于405nm處測(cè)量活性動(dòng)力學(xué)。
在血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)穩(wěn)定后，獲取血液(4ml)樣品并測(cè)量基礎(chǔ)出血時(shí)間。將在10％FeCl2中浸透的濾紙(5×6mm)應(yīng)用于分離的股動(dòng)脈上10分鐘以局部地化學(xué)損傷內(nèi)皮。這導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成性閉塞的逐步形成，并且完全閉塞了股動(dòng)脈(血流量＝0)。保持40分鐘的時(shí)間段以允許血栓在開(kāi)始DSPA施用前成熟。第二個(gè)血液樣品在閉塞后25分鐘收集。從閉塞后40分鐘開(kāi)始，將DSPAα1(0.1、0.3和1.0mg/kg)、HuSZ51-DSPAα1(0.3和0.75mg/kg)或媒介物(1-2ml/kg)以快速濃注形式注射到頸靜脈中。伴隨著藥物輸注，將FeCl2應(yīng)用于第二條股動(dòng)脈以評(píng)估HuSZ51-DSPAα1或DSPAα1防止血栓形成的效應(yīng)。進(jìn)行出血時(shí)間測(cè)定，并在下列時(shí)間點(diǎn)上收集血液樣品以用于離體α2-抗纖溶酶和DSPA活性的測(cè)量基線，藥物施用后5、30、60、120、180和240分鐘。
使用這種測(cè)定法，與DSPAα1相比較，本發(fā)明的融合蛋白顯示出更好的血栓溶解活性，并具有較低的出血危險(xiǎn)。
實(shí)施例9 這個(gè)實(shí)施例舉例說(shuō)明了包含本發(fā)明化合物的、用于口服施用的代表性藥物組合物的制備 A.成分％重量/重量 本發(fā)明的融合蛋白 20.0％ 乳糖 79.5％ 硬脂酸鎂 0.5％ 將上述成分混合并分配到各自包含100mg的硬殼明膠膠囊中，一個(gè)膠囊約等于每日總劑量。
B.成分 ％重量/重量 本發(fā)明的融合蛋白 20.0％ 硬脂酸鎂 0.9％ 淀粉 8.6％ 乳糖 69.6％ PVP(聚乙烯吡咯烷)0.9％ 將除了硬脂酸鎂以外的上述成分組合，并使用水作為造粒液進(jìn)行粒化。隨后將制劑干燥，與硬脂酸鎂混合，并使用合適的壓片機(jī)形成片劑。
C.成分 本發(fā)明的融合蛋白 0.1g 丙二醇 20.0g 聚乙二醇400 20.0g 聚山梨醇酯80 1.0g 水 足量至100mL 將本發(fā)明的融合蛋白溶解在丙二醇、聚乙二醇400和聚山梨醇酯80中。然后，在攪拌情況下加入足夠量的水以提供100mL的溶液，將該溶液過(guò)濾并裝瓶。
D.成分％重量/重量 本發(fā)明的融合蛋白 20.0％ 花生油78.0％ 司盤602.0％ 將上述成分熔化，混合，并填充到軟彈性膠囊中。
E.成分 ％重量/重量 本發(fā)明的融合蛋白 1.0％ 甲基或羧甲基纖維素 2.0％ 0.9％鹽水 足量至100mL 將本發(fā)明的融合蛋白溶解在纖維素/鹽水溶液中，過(guò)濾，并裝瓶以用于使用。
實(shí)施例10 這個(gè)實(shí)施例舉例說(shuō)明了包含本發(fā)明融合蛋白的、用于腸胃外施用的代表性藥學(xué)制劑的制備 成分 本發(fā)明的融合蛋白0.02g 丙二醇 20.0g 聚乙二醇400 20.0g 聚山梨醇酯801.0g 0.9％鹽水溶液 足量至100mL 將本發(fā)明的融合蛋白溶解在丙二醇、聚乙二醇400和聚山梨醇酯80中。然后，在攪拌情況下加入足夠量的0.9％鹽水溶液以提供100mL的靜脈內(nèi)注射溶液，將該溶液經(jīng)過(guò)0.2m膜過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾并在無(wú)菌條件下進(jìn)行包裝。
實(shí)施例11 這個(gè)實(shí)施例舉例說(shuō)明了包含本發(fā)明融合蛋白的、以栓劑形式的代表性藥物組合物的制備 成分 ％重量/重量 本發(fā)明的融合蛋白 1.0％ 聚乙二醇1000 74.5％ 聚乙二醇4000 24.5％ 將所述成分熔化在一起，并在蒸氣浴中混合，并且傾入包含2.5g總重量的模子中。
實(shí)施例12 這個(gè)實(shí)施例舉例說(shuō)明了包含本發(fā)明融合蛋白的、用于吹入的代表性藥學(xué)制劑的制備 成分 ％重量/重量 微?；谋景l(fā)明的融合蛋白 1.0％ 微?；娜樘? 99.0％ 將所述成分碾磨，混合，并包裝在裝備有定量給藥泵的吹入器中。
實(shí)施例13 這個(gè)實(shí)施例舉例說(shuō)明了包含本發(fā)明融合蛋白的、以噴霧形式的代表性藥學(xué)制劑的制備 成分 ％重量/重量 本發(fā)明的融合蛋白 0.005％ 水 89.995％ 乙醇 10.000％ 將本發(fā)明的融合蛋白溶解在乙醇中，并摻和入水。然后，將制劑包裝在裝備有定量給藥泵的噴霧器中。
實(shí)施例14 這個(gè)實(shí)施例舉例說(shuō)明了包含本發(fā)明融合蛋白的、以氣霧劑形式的代表性藥學(xué)制劑的制備 成分 ％重量/重量 本發(fā)明的融合蛋白 0.10％ 推進(jìn)劑11/1298.90％ 油酸 1.00％ 將本發(fā)明的融合蛋白分散在油酸和推進(jìn)劑中。然后，將所得到的混合物傾入配備有計(jì)量閥的氣霧劑容器中。
上文說(shuō)明書中提及的所有出版物和專利引入本文作為參考。盡管本發(fā)明已參照其具體的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以進(jìn)行各種改變并且可以替代以等價(jià)物而不背離本發(fā)明的真正精神和范圍。此外，可以進(jìn)行許多修改以使具體情況、材料、物質(zhì)組成、方法、方法步驟適應(yīng)本發(fā)明的目標(biāo)、精神和范圍。希望所有此類修飾位于在此所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.血栓溶解融合蛋白，其包括結(jié)合血管損傷相關(guān)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)的靶向性蛋白，所述靶向性蛋白可操作地連接至纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述纖溶酶原激活物選自t-PA衍生的纖溶酶原激活物、DSPA衍生的纖溶酶原激活物、尿激酶衍生的纖溶酶原激活物或其類似物、片段、衍生物或變體。
3.權(quán)利要求1或2的融合蛋白，其中所述纖溶酶原激活物選自DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ。
4.上述權(quán)利要求之一的融合蛋白，其中所述靶向性蛋白結(jié)合在活化的血小板或活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面上的P-選擇素、CD40L、CD63、糖蛋白1ba或蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。
5.上述權(quán)利要求之一的融合蛋白，其中所述靶向性蛋白是抗體。
6.權(quán)利要求5的融合蛋白，其中所述抗體不與P-選擇素-糖蛋白-配體-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合P-選擇素。
7.權(quán)利要求5的融合蛋白，其中所述抗體不與糖蛋白1b-IX-V競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合P-選擇素。
8.權(quán)利要求5的融合蛋白，其中所述抗體不抑制白細(xì)胞與活化的血小板的粘附。
9.權(quán)利要求5的融合蛋白，其中所述抗體是單克隆抗體。
10.權(quán)利要求9的融合蛋白，其中所述單克隆抗體是單鏈抗體、Fab二聚體抗體或IgG抗體。
11.權(quán)利要求3-10之一的融合蛋白，其中所述纖溶酶原激活物是DSPAα1，或其類似物、片段、衍生物或變體。
12.權(quán)利要求3-10之一的融合蛋白，其中所述纖溶酶原激活物是DSPAα2，或其類似物、片段、衍生物或變體。
13.權(quán)利要求3-10中之一的融合蛋白，其中所述纖溶酶原激活物是DSPAβ，或其類似物、片段、衍生物或變體。
14.權(quán)利要求3-10之一的融合蛋白，其中所述纖溶酶原激活物是DSPAγ，或其類似物、片段、衍生物或變體。
15.權(quán)利要求1的融合蛋白，其包括包含選自SEQ ID NO.3-SEQID NO.8的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或者具有與其有著至少70％同一性的氨基酸序列并具有基本上相同的生物活性的任何蛋白質(zhì)。
16.藥物組合物，其包括上述權(quán)利要求之一的融合蛋白，所述組合物包括藥學(xué)上可接受的賦形劑和治療有效量的所述融合蛋白。
17.用于誘導(dǎo)血栓溶解的方法，其包括給有此需要的患者施用治療有效量的上述權(quán)利要求之一的融合蛋白。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述方法用于治療動(dòng)脈血栓形成，急性冠狀動(dòng)脈綜合征，包括ST段升高型心肌梗死、非ST段升高型心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛，導(dǎo)管誘導(dǎo)的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓和深部靜脈血栓形成，肺栓塞或急性缺血性中風(fēng)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述融合蛋白在中風(fēng)發(fā)作后超過(guò)3小時(shí)施用給患有急性缺血性中風(fēng)的患者。
20.試劑盒，其包括上述權(quán)利要求1-15之一的融合蛋白。
21.試劑盒，其包括編碼上述權(quán)利要求1-15之一的融合蛋白組分的DNA序列。
22.基因療法組合物，其包括與治療有效量的基因療法載體相組合的、編碼由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的氨基酸序列組成的融合蛋白的DNA。
23.血栓溶解融合蛋白，其包括結(jié)合P-選擇素的靶向性蛋白，其中所述靶向性蛋白是嵌合型小鼠-人單克隆抗體，所述抗體可操作地連接至DSPAα1或其類似物、片段、衍生物或變體。
24.權(quán)利要求23的融合蛋白，其中所述嵌合型小鼠-人單克隆抗體是HuSZ51。
25.權(quán)利要求24的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型融合蛋白，其包括靶向性蛋白和纖溶酶原激活物，優(yōu)選結(jié)合P-選擇素并可操作地連接至纖溶酶原激活物DSPAα1或其類似物、片段、衍生物或變體的抗體，其用作血栓溶解劑。本文還描述了包含這些融合蛋白的藥物組合物，使用這些融合蛋白作為血栓溶解劑的方法，以及用于合成這些融合蛋白的方法。
文檔編號(hào)C12N9/72GK101155916SQ200580049371
公開(kāi)日2008年4月2日 申請(qǐng)日期2005年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月4日
發(fā)明者J·潘, Q·吳, A·許特勒 申請(qǐng)人:帕昂德國(guó)有限公司