專利名稱：一種用鹵蟲孵化液生產(chǎn)鹵蟲孵化酶的方法
技術領域：
本發(fā)明屬海洋生物技術領域，涉及一種用鹵蟲孵化液生產(chǎn)鹵蟲孵化酶的方法。
背景技術：
鹵蟲初孵無節(jié)幼體是水產(chǎn)苗種生產(chǎn)中極為重要的動物性活餌料，鹵蟲成蟲體內(nèi)內(nèi)含有較高的蛋白質(50％～60％)、一定量的脂肪和高級不飽和脂肪酸、礦物質和維生素等，是許多水產(chǎn)動物苗種后期幼體和水族寵物的適口餌料，投喂鹵蟲后期幼體對提高河蟹育苗成活率、改善水族寵物的體色十分有利。目前，國際上85％的海產(chǎn)經(jīng)濟動物以鹵蟲作為鮮活開口餌料。據(jù)有關專家對鹵蟲、鮭、對蝦、扇貝等24種主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的生長特性、養(yǎng)殖方法、市場價格和市場潛力等14項指標的綜合測評，鹵蟲增養(yǎng)殖的可行性評價僅次于鮭魚位居第二。
但是其在水產(chǎn)育苗和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用還遠遠不能夠滿足要求。這主要是由于成蟲質量不穩(wěn)定，某些鹵蟲品系的孵化率太低而影響了其應用價值。目前在中國和前蘇聯(lián)一些國家，低孵化率鹵蟲卵(某些品系鹵蟲的孵化率只有30-50％)的儲量相當可觀。如果能將這一資源利用在某些品種的水產(chǎn)育苗上，部分或全部替代價格昂貴的高質量鹵蟲卵，將在一定程度上緩解鹵蟲卵緊張的矛盾，降低育苗成本，避免資源的浪費。但是目前還沒有相關技術能夠解決鹵蟲孵化率低這個問題。而鹵蟲孵化酶將有助于提高鹵蟲的孵化率，解決低孵化率鹵蟲卵的品質問題。另外，孵化酶的研究對控制動物的孵化率和孵化進程、進而控制其種苗養(yǎng)成率也具有十分重要的指導價值。進而，孵化率的控制又可為瀕危物種的保護、有益動物的增養(yǎng)殖以及有害動物的數(shù)量控制等研究提供一條有廣闊應用前景的技術路線。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為克服現(xiàn)有鹵蟲孵化技術的不足，提供一種用鹵蟲孵化液生產(chǎn)鹵蟲孵化酶的方法。
本發(fā)明的提取鹵蟲孵化酶的方法或工藝先將鹵蟲卵培養(yǎng)于海水中，待90％以上的鹵蟲完成孵化時，經(jīng)濾網(wǎng)收集濾液-孵化液；然后將硫酸銨加入其內(nèi)，并攪拌使硫酸銨的飽和度為50-70％；再放入4℃冰箱中過夜沉淀，進而離心沉淀，并用緩沖液將沉淀完全溶解后，再在4℃下以蒸餾水在透析袋中進行透析脫鹽，將上述透析液進行冷凍干燥，至樣品達到恒重，將干粉取出后密封包裝即的得到鹵蟲孵化酶粗品。
在此基礎上，為了對鹵蟲孵化酶進行更深入的研究，本發(fā)明對鹵蟲孵化酶粗品作了進一步純化將上述鹵蟲孵化酶粗品用緩沖液溶解后上樣于陰離子交換柱層析，進行梯度洗脫，洗脫出的樣品用樣品自動收樣器收集，選取酶活性值最高的洗脫樣品作為陰離子交換柱層析樣品；再將上述陰離子交換柱層析樣品用濃縮離心管進行濃縮，經(jīng)凝膠過濾柱進行進一步純化。選取酶活性值最高的洗脫樣品即為鹵蟲孵化酶純品。為了長期保存鹵蟲孵化酶純品，將上述的溶液狀態(tài)的鹵蟲孵化酶純品進行冷凍干燥，最將取出密封包裝即獲得鹵蟲孵化酶純品。
本發(fā)明是以高孵化率品系鹵蟲為材料進行孵化酶的提取與純化，其方法及詳細步驟如下1.鹵蟲卵的培養(yǎng)和孵化液的收集為了簡化操作流程，在工廠化運作中鹵蟲卵通常培養(yǎng)于自然海水中。考慮到天然海水中含有一定量的鈣鎂離子，容易與后續(xù)的硫酸銨產(chǎn)生難溶性沉淀，所以在本發(fā)明中采用人工海水培養(yǎng)鹵蟲卵。人工海水的配方為30g氯化鈉溶解在1000ml的蒸餾水中。將人工配制的海水在室溫下用充氣泵充氣半小時后加入鹵蟲卵，在31℃、光照的條件下培養(yǎng)鹵蟲卵。培養(yǎng)至90％以上的胚胎完成孵化時(約培養(yǎng)24h)，用濾網(wǎng)將人工海水過濾，得到的濾液即為孵化液。
2.鹵蟲孵化酶粗品的制備將上述孵化液中加入固體硫酸銨，使硫酸銨的飽和度為50-70％，在加入硫酸銨的同時攪拌溶液以避免溶液中局部硫酸銨的濃度升高而導致蛋白質變性。然后，將此液體放在4℃冰箱中過夜沉淀，再用冷凍離心機以5000g離心30min(4℃)。將離心管中的上清液輕輕傾掉，離心管底部的沉淀用緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH7.5)完全溶解后，在4℃下以蒸餾水在透析袋中透析12h以脫鹽；將得到的透析液首先在-20℃冷凍后再用冷凍干燥儀冷凍干燥，冷凍條件為真空度達到80Pa，進行凍干，至樣品達到恒重。將干粉取出后密封包裝即為鹵蟲孵化酶粗品。鹵蟲孵化酶粗品即可以應用于養(yǎng)殖業(yè)以提高低孵化率品系鹵蟲的孵化率。
但是，鹵蟲孵化酶粗品不能滿足氨基酸序列分析研究內(nèi)容的要求。因此，本發(fā)明對鹵蟲孵化酶的粗品進行了進一步的純化，以便進一步為鹵蟲孵化酶的深入研究提供基礎。以下步驟在粗酶的基礎上進行了純化。
3.陰離子交換柱層析將鹵蟲孵化酶粗品用緩沖液溶解后上樣于陰離子交換柱層析，分別用含有0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl的緩沖液(pH7.5)進行梯度洗脫，洗脫出的樣品用樣品自動收樣器收集，用紫外分光光度計測定在波長280nm處的各洗脫樣品的酶活性，該酶活性的大小用酶裂解酪蛋白而引起的光吸收(簡稱0D280)的大小來表示。具體操作步驟為取20μl酪蛋白溶液(5mg/ml)于1ml離心管中，加入20μl洗脫樣品，于35℃水浴中反應30min后，加入500μl三氯乙酸以終止反應。4℃靜置30min后，用冷凍離心機于4℃、5000g離心30min。吸出上清液用紫外分光光度計測定各洗脫樣品的0D280值，該值為此洗脫樣品的實驗值；對照組僅將上述的各洗脫樣品用50μl上述緩沖液替代，再測定對照組的0D280值，該值為對照值。將每個洗脫樣品的酶活性用“實驗值-對照值”表示；以洗脫樣品的順序為橫坐標，以每個洗脫樣品的酶活性值為縱坐標繪制酶活性曲線，選取酶活性曲線上酶活性值最高的洗脫樣品作為陰離子交換柱層析樣品。
4.凝膠過濾柱層析再將上述陰離子交換柱層析樣品用濃縮離心管進行濃縮，經(jīng)凝膠過濾柱進行進一步純化。將濃縮的陰離子交換柱層析樣品上柱后，用20mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7.5)進行洗脫，洗脫出的組分用樣品自動收樣器收集，再用紫外分光光度計測定在280nm處各洗脫樣品的酶活性。具體操作與陰離子交換柱層析中所描述的步驟相同。選取酶活性曲線上酶活性值最高的洗脫樣品即為鹵蟲孵化酶純品。
為了將鹵蟲孵化酶純品長期保存，將上述的溶液狀態(tài)的鹵蟲孵化酶純品進行冷凍干燥，冷凍干燥條件溫度下降到-54℃、真空度達到80Pa，進行冷凍干燥，至樣品達到恒重，取出密封包裝即為鹵蟲孵化酶純品。
上述所選用的鹵蟲品系，要求其孵化率在70％-90％的范圍；鹵蟲品系的孵化率越高，鹵蟲孵化酶的得率越高。
為了進一步說明以上方法，以產(chǎn)地渤海灣的鹵蟲品系(孵化率90％以上)作為實施例將人工配制的海水在室溫下用充氣泵充氣半小時后加入50g產(chǎn)地渤海灣的鹵蟲卵，在31℃、光照的條件下培養(yǎng)鹵蟲卵。培養(yǎng)至90％以上的胚胎完成孵化時，用濾網(wǎng)過濾人工海水，得到的濾液即為孵化液；上述孵化液中加入固體硫酸銨，使硫酸銨的終飽和度為67％，然后，將此液體放在4℃冰箱中過夜沉淀，再用冷凍離心機以5000g離心30min(4℃)，收集沉淀；用緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH7.5)完全溶解沉淀后，在4℃下以蒸餾水在透析袋中透析12h以脫鹽，將得到的透析液首先在-20℃冷凍后再用冷凍干燥儀冷凍干燥，冷凍條件為真空度達到80Pa，進行凍干，至樣品達到恒重。將干粉取出后密封包裝即為鹵蟲孵化酶粗品。
將鹵蟲孵化酶粗品用pH7.5的20mmol/L Tris-HCl緩沖液溶解后上樣于DEAE-sepharose Fast Flow(1cm×20cm)陰離子交換柱層析，用含有0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L NaCl的20mmol/L的緩沖液(pH7.5)進行梯度洗脫，洗脫速度20ml/h，每個洗脫樣品的收集體積為2ml。用紫外分光光度計測定在280nm處各洗脫樣品的酶活性。最后繪制酶活性曲線，選取酶活性曲線上酶活性值最高的洗脫樣品作為陰離子交換柱層析樣品。
離子交換柱樣品經(jīng)過濃縮后上樣于Sephacryl凝膠過濾柱(1cm×50cm)進行進一步純化；用20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)進行洗脫，流速為15ml/h，每個洗脫樣品的收集體積為2ml。用紫外分光光度計測定在280nm處的酶活性。繪制酶活性曲線后選取酶活性曲線上酶活性值最高的洗脫樣品作為凝膠過濾柱層析樣品。凝膠過濾柱樣品冷凍干燥，冷凍干燥條件真空度達到80Pa時，進行冷凍干燥，至樣品達到恒重，取出密封包裝即為鹵蟲孵化酶純品。
由于本發(fā)明采用了孵化率較高的鹵蟲品系制備孵化酶，提高了酶的產(chǎn)量，而不同品系鹵蟲間孵化酶的同源性很高，從高孵化率鹵蟲品系制備的孵化酶完全可以應用于低孵化率鹵蟲品系。方法中又以人工海水培養(yǎng)鹵蟲，避免了天然海水中鈣鎂等重金屬離子與硫酸鹽產(chǎn)生的沉淀，同時也排除了天然海水中其他不明組分對孵化酶活性的影響。在此基礎上獲得的孵化液中其他蛋白質的種類與含量均極少，因此簡化了孵化酶的提取過程。本方法又采用了冷凍干燥工藝，使本發(fā)明的整個提取工藝簡單規(guī)范，可操作性強，得率高，而且能夠長期保存；通過本發(fā)明獲得的鹵蟲孵化酶可以大大提高低品質鹵蟲的孵化率，充分利用鹵蟲資源，大幅度降低海水養(yǎng)殖業(yè)的育苗成本，緩解生產(chǎn)需求中鹵蟲供應的緊張局面。
權利要求
1.一種用鹵蟲孵化液生產(chǎn)鹵蟲孵化酶的方法，其特征是先將鹵蟲卵培養(yǎng)于海水中，待90％以上的鹵蟲完成孵化時，經(jīng)濾網(wǎng)收集濾液--孵化液；然后將硫酸銨加入其內(nèi)，并攪拌使硫酸銨的飽和度為50-70％；再放入4℃冰箱中過夜沉淀，進而離心沉淀，并用緩沖液將沉淀完全溶解后，再在4℃下以蒸餾水在透析袋中進行透析脫鹽，將上述透析液進行冷凍干燥，至樣品達到恒重，將干粉取出后密封包裝即為鹵蟲孵化酶粗品。
2.如權利1要求所述的一種用鹵蟲孵化液生產(chǎn)鹵蟲孵化酶的方法，其特征是將上述鹵蟲孵化酶粗品用緩沖液溶解后上樣于陰離子交換柱層析，進行梯度洗脫，洗脫出的樣品用樣品自動收樣器收集，選取酶活性值最高的洗脫樣品作為陰離子交換柱層析樣品，再將上述陰離子交換柱層析樣品用濃縮離心管進行濃縮，經(jīng)凝膠過濾柱進行進一步純化，選取酶活性值最高的洗脫樣品即為鹵蟲孵化酶純品。
3.如權利2要求所述的一種用鹵蟲孵化液生產(chǎn)鹵蟲孵化酶的方法，其特征是將上述的鹵蟲孵化酶純品進行冷凍干燥，取出密封包裝得到能夠長期保存的鹵蟲孵化酶純品。
4.如權利1要求所述的一種用鹵蟲孵化液生產(chǎn)鹵蟲孵化酶的方法，其特征是所述海水為人工海水，其NaCl濃度為30‰。
5.如權利要求1所述的一種用鹵蟲孵化液生產(chǎn)鹵蟲孵化酶的方法，其特征是所采用的緩沖液為20mmol/L Tris-HCl，pH7.5。
6.如權利3要求所述的一種用鹵蟲孵化液生產(chǎn)鹵蟲孵化酶的方法，其特征是冷凍干燥條件溫度下降到-54℃、真空度達到80Pa，進行冷凍干燥至樣品達到恒重。
全文摘要
一種用鹵蟲孵化液生產(chǎn)鹵蟲孵化酶的方法。先將鹵蟲卵培養(yǎng)于人工海水中，待90％以上的鹵蟲完成孵化時，經(jīng)濾網(wǎng)收集濾液一孵化液；然后將硫酸銨加入其內(nèi)，并攪拌使硫酸銨的飽和度為50－70％；再放入4℃冰箱中過夜沉淀，進而離心沉淀，并用緩沖液將沉淀完全溶解后，再在4℃下以蒸餾水在透析袋中進行透析脫鹽，將上述透析液進行冷凍干燥，至樣品達到恒重，即為鹵蟲孵化酶粗品。再經(jīng)過陰離子交換柱層析和凝膠過濾柱層析純化得到鹵蟲孵化酶純品。該發(fā)明采用冷凍干燥技術，工藝簡單合理，且能充分利用廢棄的鹵蟲孵化液為原材料，制成的鹵蟲孵化酶可溶性好，成本低，且能夠長期保存，可應用于提高低孵化率鹵蟲品系的孵化率，降低海水養(yǎng)殖業(yè)的育苗成本。
文檔編號C12N9/00GK1699561SQ20051004346
公開日2005年11月23日 申請日期2005年5月5日 優(yōu)先權日2005年5月5日
發(fā)明者史振平, 叢日山, 樊廷俊 申請人:中國海洋大學