專利名稱：一種牡丹胚離體培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)方法，具體地說涉及一種牡丹胚離體培養(yǎng)方法。
背景技術：
牡丹是原產于我國的傳統(tǒng)名花，目前為唯一的候選“國花”之望，不僅在國內花卉市場中占有重要地位，同時也是我國重要的出口花卉。但它的繁殖與育種都比較困難(Buchheim JAT et al，1992)，其中育種仍然以傳統(tǒng)的雜交方式進行，但牡丹種子胚軸都有休眠現象，自然狀態(tài)下僅種子萌發(fā)就要1～2年，且萌發(fā)率較低、變化大，很難獲得整齊一致的幼苗(Zilis MR et al，1976；Barton LV et al，1957)。GA3處理雖能打破部分牡丹種子上下胚軸的休眠，使萌發(fā)時間稍有縮短(景新明等，1995)，但處理苗多數有些畸形發(fā)育(BartonLV et al，1957)，各品種還需尋找較適宜的使用濃度。牡丹從雜交獲得種子，到種子萌發(fā)形成幼苗，最后開花選育出品種，至少需要10年以上的時間(成仿云等，2005)。因此，縮短育種周期已成為牡丹育種迫切需要解決的重要課題之一，離體胚培養(yǎng)技術提供了一條非常有價值的途徑。同時，我國的牡丹品種幾乎都是品種群內或品種群間的雜交選育出的，而牡丹遠緣雜交育種在國外已有一百多年的歷史，已發(fā)展成為今后牡丹品種改良的主要方向，我國要迎頭趕上，就必須設法攻克遠緣雜交敗育的難題，在這個問題上，胚離體培養(yǎng)技術顯示出巨大的應用前景。
目前，幼胚培養(yǎng)技術已在植物遠緣雜交、克服頑拗種子休眠及發(fā)育生物學和遺傳學等研究方面得以廣泛應用(Raghavan V.et al2003)，該技術對提高植物種子的萌發(fā)率、縮短萌發(fā)時間和及時進行雜種胚拯救、加速育種進程與快速擴繁都有重要意義。在各類作物、果樹、蔬菜及多種花卉育種中該技術的成功利用也預示了牡丹遠緣雜交種胚拯救的可能性，特別是未成熟的幼胚培養(yǎng)，培養(yǎng)時期越早對雜交敗育中的雜種胚拯救越有利。在牡丹中對合子胚、上胚軸及成熟種子等的離體培養(yǎng)已有一些報道(Demoise CF et al，1969，謝靜萱，1987，Wang Het al，2001)，但成苗率仍然都較低，技術路線尚不十分成熟。幼胚離體培養(yǎng)至今沒有報道，更缺少這一技術在育種中應用的研究。

發(fā)明內容
(一)、要解決的技術問題本發(fā)明的目的在于提供一種牡丹幼胚離體培養(yǎng)方法。
(二)、技術方案本發(fā)明為一種牡丹胚離體培養(yǎng)方法，包括以下步驟選擇外植體，清潔處理、消毒后接種到啟動培養(yǎng)基培養(yǎng)30-40天，移至繼代I培養(yǎng)基中培養(yǎng)35-45天，再繼代至繼代III培養(yǎng)基上，連續(xù)2-3次的繼代培養(yǎng)，溫室煉苗。
本發(fā)明所述的牡丹胚離體培養(yǎng)方法，包括將繼代II放入15±1℃左右黑暗條件下進行生根誘導15天，移至繼代I培養(yǎng)基培養(yǎng)30-40天后，繼代至繼代III培養(yǎng)基。
本發(fā)明所述的牡丹胚離體培養(yǎng)方法，包括將繼代III培養(yǎng)基上的生根幼苗放入冰箱4℃冷藏30-90天后，室溫煉苗。
本發(fā)明所述的牡丹胚離體培養(yǎng)方法中，外植體為幼胚或成熟胚。。
本發(fā)明所述的牡丹胚離體培養(yǎng)方法中，啟動培養(yǎng)基為1/2MS+BAP 0-0.2mg/L+IAA 0-2.0mg/L+IBA 0-1.0mg/L+GA30-1.0mg/L+Vc 0或100mg/L。
本發(fā)明所述的牡丹胚離體培養(yǎng)方法中，繼代I培養(yǎng)基為1/2MS+BAP 0-0.05mg/L+IAA 0-0.1mg/L+IBA 0-0.4mg/L。
本發(fā)明所述的牡丹胚離體培養(yǎng)方法中，繼代III培養(yǎng)基為1/2MS+BAP 0-0.2mg/L+IAA 0-0.2mg/L+IBA 0-0.2mg/L+Ac 0.05％。
本發(fā)明所述的牡丹胚離體培養(yǎng)方法中，1/2MS培養(yǎng)基為大量元素減半、Ca2+加倍。
本發(fā)明所述的牡丹胚離體培養(yǎng)方法中，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照16～20h/d，光強1600～2000Lx。
外植體的獲得從健壯植株上采集心皮拿回實驗室，流水沖洗24h，洗滌靈(白貓牌)徹底刷洗清潔后剝出胚珠，拿到超凈臺上消毒。胚珠先用70％乙醇處理3min，滅菌蒸餾水洗3次后，再用0.2％NaClo處理15-20min，滅菌蒸餾水洗3次后，剝去種皮、破開胚乳、用解剖針挑出種胚接種。
培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照16-20h/d，光強1600-2000Lx。
(三)、有益效果本發(fā)明是提供一種有效的牡丹幼胚離體培養(yǎng)方法。它打破了牡丹種胚胚軸的休眠，使之很快萌發(fā)，在3個月內迅速培養(yǎng)成苗，不僅成苗率高，而且幼苗的發(fā)育速度遠遠高于實生苗，極有可能在田間栽培中提前開花。這就解決了常規(guī)播種選育過程中，牡丹種子萌發(fā)時間長、萌發(fā)率低、變化大，很難獲得整齊一致幼苗，以及幼苗生長緩慢等一系列問題。因此，本發(fā)明應用于牡丹雜交育種中，能夠大大縮短育種周期，同時在遠緣雜交中可用于雜種胚拯救、克服雜交敗育，從而能夠提高育種效率，加速育種進程，降低育種中人力物力的投入，同時也為研究牡丹發(fā)育生物學與進行遺傳學操作、控制等創(chuàng)造了條件。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
培養(yǎng)基見表1。
表1 培養(yǎng)基中生長調節(jié)劑組合

實施例1 外植體獲得從健壯植株上采得紫斑牡丹心皮拿回實驗室，流水沖洗24h，洗滌靈(白貓牌)徹底刷洗清潔后，剝出胚珠，拿到超凈臺上消毒。胚珠先用70％乙醇處理3min，滅菌蒸餾水洗3次后，再用0.2％NaClo處理20min，滅菌蒸餾水洗3次后，剝去種皮、破開胚乳、用解剖針挑出種胚接種。
實施例2(1)外植體啟動培養(yǎng)基Q-1上培養(yǎng)30天，然后完全繼代(I)至J-2上，培養(yǎng)42天，將J-2上真葉抽出、根長大于1.5cm的幼苗繼代(II)至J”-1上；將J-2上根短于1.5cm的幼苗繼代(II)至J”-2上；(2)將J”-1上幼苗4℃冷藏60天，溫室煉苗；將J”-2上的生根幼苗放入4℃冰箱冷藏90天，溫室煉苗；未生根幼苗棄掉。培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照20h/d，光強1600Lx。
實施例3(1)外植體在啟動培養(yǎng)基Q-2、3、4上培養(yǎng)40天后，均分成4份分別繼代(I)至J-1、3、4、5上；(2)將J-3、4、5上的幼苗立即放入黑暗條件下約15±1℃進行根誘導15天；(3)然后再將幼苗又全部繼代(II)至J-1上；30天后，再全部繼代(III)至J”-1；(4)J”-1上生長30天后，挑出根與葉生長良好的幼苗煉苗。培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照20h/d，光強2000Lx。
實施例4(1)外植體在啟動培養(yǎng)基Q-5上培養(yǎng)40天后，均分成6份，J-1、3、4、5上分別繼代(I)了1/2、1/6、1/6、1/6；(2)將J-3、4、5上的幼苗立即放入黑暗條件下15±1℃進行根誘導15天；(3)然后再將幼苗又全部繼代(II)至J-1上，40天后再全部繼代(III)至J”-1；(4)J”-1上幼苗生長35天后，挑出根與葉生長良好的幼苗在煉苗。培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照16h/d，光強1600Lx。
實施例5(1)外植體在啟動培養(yǎng)基Q-6上培養(yǎng)30天后，完全繼代(I)至J-1上，45天后再全部繼代(II)至J”-1上；(2)在J”-1上生長35天后，將生根幼苗在4℃冷藏30天后煉苗；將未生根幼苗又繼代(III)至J”-1上，培養(yǎng)35天挑出生根苗煉苗。培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照16h/d，光強2000Lx。
表2 紫斑牡丹幼胚培養(yǎng)成苗統(tǒng)計

表3繼代(II)培養(yǎng)后30天幼苗各項生長指標分析(Duncan法)

權利要求
1.一種牡丹胚離體培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟選擇外植體，清潔處理、消毒后接種到啟動培養(yǎng)基培養(yǎng)30-40天，移至繼代I培養(yǎng)基中培養(yǎng)35-45天，再繼代至繼代III培養(yǎng)基上，連續(xù)2-3次的繼代培養(yǎng)，溫室煉苗。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于還包括將繼代II放入15±1℃黑暗條件下進行生根誘導15天，移至繼代I培養(yǎng)基培養(yǎng)30-40天后，繼代至繼代III培養(yǎng)基。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于還包括將繼代III培養(yǎng)基上的生根幼苗放入冰箱4℃冷藏30-90天后，室溫煉苗。
4.如權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述的外植體為幼胚或成熟胚。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的啟動培養(yǎng)基為1/2MS+BAP 0-0.2mg/L+IAA 0-2.0mg/L+IBA 0-1.0mg/L+GA30-1.0mg/L+Vc 0或100mg/L。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的繼代I培養(yǎng)基為1/2MS+BAP 0-0.05mg/L+IAA 0-0.1mg/L+IBA 0-0.4mg/L。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的繼代III培養(yǎng)基為1/2MS+BAP 0-0.2mg/L+IAA 0-0.5mg/L+IBA 0-0.5mg/L+GA30-0.5mg/L+Ac 0.05％。
8.如權利要求5-7任一所述的方法，其特征在于所述的1/2MS培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基大量元素減半、Ca2+加倍。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25±1℃，光照16-20h/d，光強1600-2000Lx。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牡丹胚離體培養(yǎng)的方法外植體消毒后接種到啟動培養(yǎng)基培養(yǎng)30－40天，移至繼代I培養(yǎng)基中培養(yǎng)35－45天，再繼代至繼代III培養(yǎng)基上，連續(xù)2－3次的繼代培養(yǎng)，溫室煉苗。本發(fā)明提供了一種有效的牡丹幼胚離體培養(yǎng)方法，克服了牡丹播種繁育中種子萌發(fā)慢、萌發(fā)率低、變化大，很難獲得整齊一致的幼苗以及幼苗生長緩慢等問題。
文檔編號C12N5/04GK1778168SQ20051008659
公開日2006年5月31日 申請日期2005年10月12日 優(yōu)先權日2005年10月12日
發(fā)明者成仿云, 何貴梅 申請人:北京林業(yè)大學