專(zhuān)利名稱(chēng)：一項(xiàng)以馬尾松離體成熟胚為外植體的組織培養(yǎng)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及木本植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域
二背景技術(shù)：
馬尾松原產(chǎn)我國(guó)，是秦嶺以南各省重要的荒山綠化、造紙?jiān)狭趾筒芍帧⒆匀伙L(fēng) 景林的重要樹(shù)種之一，是我國(guó)分布面積最廣的樹(shù)種。其生長(zhǎng)迅速，生產(chǎn)力高，適應(yīng)性強(qiáng)。力 學(xué)性質(zhì)好等特點(diǎn)，也廣泛被用于建筑、坑木、枕木、橋梁等工程，也可作為纖維板、刨花板、膠 合板工業(yè)的原料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前馬尾松良種主要以種子園和母樹(shù)林的有性繁 殖為主。然而，有性繁殖存在著分化的問(wèn)題，不能最大限度地提高遺傳改良增益，而無(wú)性繁 殖卻能克服有性繁殖的上述不足。但馬尾松的傳統(tǒng)無(wú)性繁殖技術(shù)(扦插和嫁接)目前仍難 滿足造林的需求，制約了馬尾松良種繁育的進(jìn)程。 采用組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖植物可以得到很高的繁殖效率，植物組織培養(yǎng)技術(shù)是利用 植物細(xì)胞全能性(即每個(gè)細(xì)胞具有該植物的全部遺傳信息，在一定培養(yǎng)條件下離體細(xì)胞具 有發(fā)育成完整植株的潛在能力)，采取植物體上的細(xì)胞團(tuán)、分生組織或營(yíng)養(yǎng)器官的微小部 分，通過(guò)人工配制不同營(yíng)養(yǎng)成分和激素調(diào)控，使這些組織細(xì)胞形成成千上萬(wàn)小植株并且保 存母體內(nèi)全部?jī)?yōu)良遺傳性狀，此種方法可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量試管苗，可在車(chē)間內(nèi)進(jìn)行，實(shí) 施工廠化生產(chǎn)，獲得的幼苗存放在人工控制的培養(yǎng)室內(nèi)，可一年四季進(jìn)行生產(chǎn)。而且在極少 的面積內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，因而不占用土地。如果利用組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖馬尾松，不僅為擴(kuò) 大繁殖馬尾松良種提供了一個(gè)新的途徑，也可為馬尾松分子設(shè)計(jì)育種創(chuàng)造條件，意義重大。
然而馬尾松組織培養(yǎng)較難，誘導(dǎo)產(chǎn)生的芽不易分化伸長(zhǎng)，且小苗生根率極低。黃健 秋、衛(wèi)志明等對(duì)馬尾松成熟胚進(jìn)行體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)并獲得再生植株，共誘導(dǎo)產(chǎn)生27個(gè)子葉 胚，最終只產(chǎn)生2株完整小植株，其余均只能稍伸長(zhǎng)或停止生長(zhǎng)，體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)換成小植株的 頻率僅為7. 4%;張宇對(duì)馬尾松進(jìn)行組織培養(yǎng)，有一定的芽誘導(dǎo)率，但生根率僅為70%，無(wú)法 滿足生產(chǎn)的要求。為此，本發(fā)明旨在研制適于馬尾松成熟胚作為外植體的高效繁殖技術(shù)。
三
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一項(xiàng)以馬尾松離體成熟胚為外植體的組織培養(yǎng)技術(shù)，包括以下幾個(gè) 步驟 1、不定芽誘導(dǎo) 將馬尾松胚從成熟種子中剝離出來(lái)，水平接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基成份 為DCR常規(guī)基本培養(yǎng)基、6-芐基嘌呤(6-BA) 0. 5_2. 0毫克/升，最佳濃度為0. 5_1. 0毫克/ 升、萘乙酸(NAA)O. 05-0. 15毫克/升或吲哚乙酸(IBA)O. 05-0. 15毫克/升，最佳濃度為萘 乙酸(NAA)0.05-0. 1毫克/升或噴哚乙酸(IBA)O. 1-0. 2毫克/升、蔗糖30克/升。培養(yǎng) 20天左右，待培養(yǎng)物誘導(dǎo)處芽原基后，即開(kāi)始下一階段。
2、芽的分化與伸長(zhǎng) 將第1步所得的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)基成份為DCR常規(guī)基本培養(yǎng)基、6-芐基嘌呤(6-BA) 0. 5毫克/升、吲哚乙酸(IBA) 0. 05毫克/升、蔗糖30克/升以及 瓊脂5. 6-6. 0克/升。培養(yǎng)數(shù)30天，待分化出小芽后，即可進(jìn)行芽的伸長(zhǎng)，芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基成 份為DCR常規(guī)基本培養(yǎng)基、萘乙酸(NAA)0.01-0. 1毫克/升或噴哚乙酸(IBA)0. 01-0. 1毫 克/升或活性炭0-2. 0克/升，最佳萘乙酸(NAA)濃度為0. 02毫克/升、最佳吲哚乙酸濃 度為0. 05毫克/升、最佳活性碳濃度為1. 0克/升，蔗糖30克/升。培養(yǎng)30-40天，待小 苗長(zhǎng)到常規(guī)生根程序所需高度時(shí)，進(jìn)入以下第3步。
3、生根 將第2步所得的小苗齊根取下，轉(zhuǎn)至常規(guī)生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基的成份為DCR 常規(guī)基本培養(yǎng)基、萘乙酸(NAA)O. 2-2.0毫克/升或吲哚乙酸(IBA)O. 2-2.0毫克/升，最佳 萘乙酸(NAA)濃度為0.5毫克/升、最佳吲哚乙酸(IBA)濃度為1.5毫克/升，蔗糖30克 /升，培養(yǎng)28-35天，小苗根部開(kāi)始出現(xiàn)白色的短根，此時(shí)，培養(yǎng)基中添加適量活性炭有利于 根的伸長(zhǎng)。之后培養(yǎng)30天左右，即可移栽長(zhǎng)成正常的馬尾松植株。 本發(fā)明采用了兩種不同于其它針葉樹(shù)種組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，即誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化 培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素含量較高，易誘導(dǎo)培養(yǎng)物啟動(dòng)分化出芽原基，芽原基誘導(dǎo)出后， 不宜在高濃度激素水平的培養(yǎng)基上長(zhǎng)期培養(yǎng)，否則誘導(dǎo)出的芽宜愈傷化，如及時(shí)轉(zhuǎn)入激素 濃度降低的培養(yǎng)基中，有利于芽的分化和伸長(zhǎng)。生根階段，本發(fā)明也采用了不同于其它針葉 樹(shù)種生根的方法，首先，把伸長(zhǎng)到適合常規(guī)生根高度的小苗，先轉(zhuǎn)移到僅添加活性炭的DCR 基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，再轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，此舉可大大提高生根率。 待根長(zhǎng)出后，添加lg/L活性炭，有利于根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。因活性炭的添加可制造黑暗環(huán)境，使 根的生長(zhǎng)環(huán)境更接近于自然，所以有利于根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。 因此采用此發(fā)明的培養(yǎng)基有如下優(yōu)點(diǎn)芽原基啟動(dòng)快、芽分化系數(shù)高、苗伸長(zhǎng)快、 生長(zhǎng)一致且健壯、生根率高、根長(zhǎng)且壯、生長(zhǎng)周期短、基本無(wú)畸形苗。
四

圖1DCR+6-芐基嘌呤0. 5毫克/升+吲哚乙酸0. 05毫克/升+蔗糖30克/升培養(yǎng)基 中誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量叢生芽。
圖2DCR+活性炭1. 0克/升培養(yǎng)基中伸長(zhǎng)的芽 圖3DCR+NAA0. 5毫克/升培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生的根 圖4DCR+活性炭1. 0克/升培養(yǎng)基中伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的根
五具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例 1、取材取馬尾松成熟種子，浸泡過(guò)夜，并于流水下沖洗干凈，用鑷子剝?nèi)ネ夥N殼。
2、材料消毒方法去殼后在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%乙醇消毒30s，0. 1%升汞滅菌 10-15min，無(wú)菌水沖洗3-5次。 3、接種在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用常規(guī)無(wú)菌操作的方法，用解剖刀和鑷子把種胚剝離出 來(lái)，水平接種到培養(yǎng)基上，剝離種胚時(shí)要細(xì)致小心，盡量避免對(duì)種胚造成傷害。誘導(dǎo)培養(yǎng)基 組成為DCR+6-芐基嘌呤0. 5毫克/升+萘乙酸0. 05毫克/升+蔗糖30克/升
4
4、芽分化與伸長(zhǎng)將離體胚接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，15天后就可看到膨大的子葉上 產(chǎn)生的大量芽(圖l)，然后將其轉(zhuǎn)移到芽分化培養(yǎng)基上。分化培養(yǎng)基組成為DCR+6-芐基 嘌呤0. 5毫克/升+吲哚乙酸0. 05毫克/升+蔗糖30克/升。 為使馬尾松胚培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽進(jìn)一步生長(zhǎng)與伸長(zhǎng)，在培養(yǎng)基中添加適量活 性炭?；钚蕴磕芪綄?duì)芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)不利的次級(jí)代謝產(chǎn)物。但過(guò)量的活性炭對(duì)芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受 到抑制，這可能是由于活性炭在吸附有害物質(zhì)的同時(shí)也吸附了礦質(zhì)元素。芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的培 養(yǎng)基成分為DCR+活性炭1. 0克/升，此培養(yǎng)基促進(jìn)了芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)(圖2)。
5、生根當(dāng)分化出的叢生芽長(zhǎng)到常規(guī)生根所需高度時(shí)，用剪刀單個(gè)剪下，接種到生 根培養(yǎng)基中。生根培養(yǎng)基的為DCR+NAA0. 5毫克/升，此培養(yǎng)基有利于誘導(dǎo)生根(圖3)。
為使誘導(dǎo)出的根能更好地伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，將生根小苗轉(zhuǎn)移到根伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，根伸長(zhǎng) 培養(yǎng)基的成份為DCR+活性炭1. 0克/升，在此培養(yǎng)基中根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)明顯(圖4)。
培養(yǎng)溫度及光照條件溫度為25±rC ;光照為2000勒克斯，16小時(shí)/天。
6、移栽生根小苗生長(zhǎng)35天左右后，根系比較發(fā)達(dá)，一般會(huì)長(zhǎng)出4-5條主根，主根 上會(huì)有須根的產(chǎn)生，此時(shí)可進(jìn)行移栽。 移栽的方法是先把封口膜打開(kāi)，在培養(yǎng)室內(nèi)煉苗1周左右，取出小苗，洗凈小苗 根部的瓊脂，移栽到蛭石和礱糠灰混合的基質(zhì)里(基質(zhì)使用前已高壓滅菌)，澆足水后放到 培養(yǎng)室，覆蓋塑料薄膜，24小時(shí)后打開(kāi)薄膜，換氣兩次，以后每天延長(zhǎng)打開(kāi)時(shí)間，直到完全不 覆蓋為止。選擇生長(zhǎng)旺盛，莖干較粗，外形好的小苗移栽，成活率可大大提高。
權(quán)利要求
一項(xiàng)以馬尾松離體成熟胚為外植體的組織培養(yǎng)技術(shù)，其特征在于以下三個(gè)部分組成(1)不定芽誘導(dǎo)將馬尾松成熟離體胚，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基成份為DCR常規(guī)基本培養(yǎng)基、6-芐基嘌呤0.5-2毫克/升、萘乙酸0.05-0.15毫克/升或吲哚乙酸0.05-0.15毫克/升、蔗糖30克/升。培養(yǎng)20天左右，待培養(yǎng)物誘導(dǎo)處芽原基后，即開(kāi)始下一階段；(2)芽的分化與伸長(zhǎng)將第1步所得的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)基成份為DCR常規(guī)基本培養(yǎng)基、6-芐基嘌呤0.5毫克/升、吲哚乙酸0.05毫克/升、蔗糖30克/升以及瓊脂5.6-6.0克/升。培養(yǎng)數(shù)天，待分化出小芽后，即可進(jìn)行芽的伸長(zhǎng)，芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基的成份為DCR常規(guī)基本培養(yǎng)基、萘乙酸0.01-0.1毫克/升或吲哚乙酸0.01-0.1毫克/升或活性炭0-2.0克/升、蔗糖30克/升。培養(yǎng)30-40天，待小苗長(zhǎng)到常規(guī)生根程序所需高度時(shí)，進(jìn)入以下第3步；(3)生根將第2步所得的小苗齊根取下，轉(zhuǎn)至常規(guī)生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基的成份為DCR常規(guī)基本培養(yǎng)基、萘乙酸0.2-2.0毫克/升或吲哚乙酸0.2-2.0毫克/升、蔗糖30克/升，培養(yǎng)28-35天，小苗根部開(kāi)始出現(xiàn)白色的短根，此時(shí)，培養(yǎng)基中添加適量活性炭有利于根的伸長(zhǎng)。之后培養(yǎng)30天左右，即可移栽長(zhǎng)成正常的馬尾松植株。
2. 按權(quán)利要求1所述的馬馬尾松離體胚叢生芽誘導(dǎo)及植株再生，其特征在于所述的 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-芐基嘌呤0. 5-2. 0毫克/升、萘乙酸0. 05-0. 15毫克/升或吲哚乙酸 0. 05-0. 15毫克/升、蔗糖30克/升。
3. 按權(quán)利要求1所述的馬尾松離體胚叢生芽誘導(dǎo)及植株再生，其特征在于所述的伸長(zhǎng) 培養(yǎng)基中萘乙酸0. 01-0. 1毫克/升或吲哚乙酸0. 01-0. 1毫克/升或活性炭0-2. 0克/升、 蔗糖30克/升。
4. 按權(quán)利要求1所述的馬尾松離體胚叢生芽誘導(dǎo)及植株再生，其特征在于所述的生根 培養(yǎng)基中萘乙酸0. 2-2. 0毫克/升或吲哚乙酸0. 2-2毫克/升、蔗糖30克/升。
全文摘要
一項(xiàng)以馬尾松離體成熟胚為外植體的組織培養(yǎng)技術(shù)，發(fā)明人季孔庶、王金玲以馬尾松成熟胚為外植體建立起了一項(xiàng)包括叢生芽誘導(dǎo)、伸長(zhǎng)和生根的植株再生技術(shù)。叢生芽誘導(dǎo)以DCR+6-BA1.0毫克/升+NAA 0.1毫克/升效果最佳，誘導(dǎo)率高達(dá)90.63％；DCR+AC1.0克/升的培養(yǎng)基能促進(jìn)叢生芽伸長(zhǎng)，且效果最佳；生根培養(yǎng)以DCR+NAA0.5毫克/升的誘導(dǎo)效果最佳，生根率達(dá)92.5％；培養(yǎng)基中添加1.0克/升活性炭有利于根的進(jìn)一步伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101785430SQ20091023425
公開(kāi)日2010年7月28日 申請(qǐng)日期2009年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者季孔庶, 王金玲 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)