專利名稱：一種百合雜種胚的離體培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種百合雜種胚的離體培養(yǎng)方法，特別涉及一種特定胚齡的百合雜種 胚的剝離、離體培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)及生根培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
受精的雜種果實不能正常發(fā)育，而逐漸皺癟，逐漸枯黃。原因是由于胚和胚乳不親 和，胚乳敗育而導(dǎo)致胚敗育.必須在果實枯黃前進(jìn)行離體培養(yǎng)，即在雜種胚乳完全敗育的 情況下，通過人工配制的培養(yǎng)基提供雜種幼胚的營養(yǎng)，使之繼續(xù)生長發(fā)育直至成苗。子房切 片培養(yǎng)、胚珠和雜交胚培養(yǎng)以及胚乳看護(hù)培養(yǎng)是目前克服受精后障礙的有效方法，其中以 胚培養(yǎng)應(yīng)用最多。Asano 等(Asano. Y. Studies on Crosses between Distantly RelatedSpecies of Lilies New Hybrids Obtained through Embryo Culture. J. Japan Soc Rory Sci,1978, 47(3) :401-414.)從敗育的胚乳中摘取0. 8 1. 9mm大小的百合種間雜種胚培養(yǎng)成苗，胚 齡為40 70d。黃濟(jì)明等(黃濟(jì)明.百合遠(yuǎn)緣雜種“麝蘭”的育成[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報， 1985，1(1) :84-87.)在麝香百合X蘭州百合的雜交試驗中，第^d胚敗育，果枯黃，從中剝 出0.2 0.4mm長的幼胚離體培養(yǎng)成功，而在王百合X大衛(wèi)百合的雜交中(黃濟(jì)明.王百 合和大衛(wèi)百合種間遠(yuǎn)緣雜種的育成[J].園藝學(xué)報，1982，9[8]51-55)，果實在授粉后60 80d枯黃，從中剝出的雜種胚長0. 6mm經(jīng)過培養(yǎng)多數(shù)胚雖死亡，但通過小鱗莖狀突起和松散 的愈傷組織的形成，可進(jìn)一步促使其分化成苗。Asano (Asano Y. Studies on the Crosses between distantly relatedspecies of lilies \ The Culture of Immature Hybrid Embryos 013-114mmlong. J. Japan Soc Hort Sci, 1980,49(3) :11-18.)得出結(jié)論，含蔗糖2% 4%的培養(yǎng)基適合培養(yǎng)百合的不成 熟幼胚。Okazaki認(rèn)為培養(yǎng)基中生長素和細(xì)胞分裂素應(yīng)合理配合使用，高濃度的生長素、細(xì) 胞分裂素會導(dǎo)致畸形胚(Okazaki K, Asano Y, OosawaK. Interspecific hybrids between Lilium 'Oriental' hybrid and L. Asiatichybrid produced by embryo culture with revised media. BreedSci，1994，44 (1) :59-64)。淺野認(rèn)為在 MS 培養(yǎng)基中加入 l(T4-l(T2mg/ LNAA對不成熟胚直接發(fā)芽有效，加入6-BA在某種程度上誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。郭方其等(郭 方其，孫崇波，郁永明，向林，黎俠，丁曉瑜.影響百合試管鱗莖內(nèi)膨大和生長的因素.中國 球根花卉年會交流論文集.2009 :41-46)認(rèn)為在培養(yǎng)基上添加多效唑(PP333)對鱗莖的膨大 有明顯的促進(jìn)作用。高濃度的NAA促進(jìn)根的生長而抑制正常的莖生長。最適合的pH值為 5.8。孫曉梅等(孫曉梅，崔文山，王亞斌，年玉欣，羅鳳霞.百合雜交種培育研究.遼寧林 業(yè)科技.2005 (5) :16-17)認(rèn)為在高無機(jī)鹽濃度并附加高濃度6-BA和低濃度NAA的MS培養(yǎng) 基上適合百合雜交苗的繼代培養(yǎng)。在百合雜種胚的離體培養(yǎng)中，胚的適時剝離能有效地提高雜種胚的萌發(fā)率，促進(jìn) 雜種胚的提早萌發(fā)。但到目前為止，對百合最佳的取胚時間還沒有研究的非常明確。因此適宜胚齡的選擇是雜種胚離體培養(yǎng)成功的第一步。很多時候幼胚的成活率低是因為剝胚時 破壞了胚的結(jié)構(gòu)，使幼胚的完整性遭到破壞，因此剝胚技術(shù)是提高幼胚成活率的關(guān)鍵。很多 報道中雖然有幼胚成活的實例，但是往往鱗莖較小且膨大緩慢，根系容易呈現(xiàn)灰色或褐化 腐爛，將幼苗移栽之后成活率很低，因此增加雜交苗的生根數(shù)目，使根系更粗壯，鱗莖更健 壯是幼苗移栽成功的前提。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明提供一種百合雜種胚離體培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供的百合雜種胚離體培養(yǎng)方法，其步驟包括從受精膨大的子房中剝?nèi)‰s 種胚進(jìn)行離體萌發(fā)，將萌發(fā)的雜種苗進(jìn)行小鱗莖的增殖。根據(jù)本發(fā)明，百合雜種胚離體培養(yǎng)方法還可包括誘導(dǎo)增殖后的百合小鱗莖膨大。根據(jù)本發(fā)明，百合雜種胚離體培養(yǎng)方法還可包括將膨大的百合小鱗莖誘導(dǎo)生根。其中，所述的雜種胚的胚齡為授粉后60 70d。其中，所述的用于雜種胚離體萌發(fā)的培養(yǎng)基為MS+NAA0. 01 0. lmg/L+蔗糖3% + 瓊脂 0. 6%，pH 5. 8，優(yōu)選為 MS+NAAO. 01mg/L+蔗糖 3% + 瓊脂 0. 6%，pH 5.8。其中，所述的用于雜種苗小鱗莖增殖的培養(yǎng)基為MS+NAA0. 05 0. 5mg/ L+6-BA2. Omg/L+蔗糖 3% + 瓊脂 0. 6%,pH 5. 8，優(yōu)選為 MS+NAAO. lmg/L+6_BA2. Omg/L，蔗糖 3%，瓊脂0.6%，pH 5.8。其中，所述的用于誘導(dǎo)小鱗莖膨大的培養(yǎng)基為MS+PP3334 6mg/ L+ 活性炭 0. 3g/L+ 蔗糖 9% + 瓊脂 0.6%, pH 5. 8，優(yōu)選為 MS+PP3335mg/L+ 活性炭 0. 3g/L+ 蔗糖 9% + 瓊脂 0. 6%，pH = 5.8。其中，所述的用于誘導(dǎo)膨大后的小鱗莖生根的培養(yǎng)基為MS+NAA0. 5 1. 5mg/L+ 活性炭1.(^/1+蔗糖3(%+瓊脂0.6(%，？!1 5.8，優(yōu)選為1^+織41.011^/1+活性炭1.0g/L+蔗 糖 3% + 瓊脂 0. 6%，pH 5.8。根據(jù)本發(fā)明，所述的從未成熟的子房中剝?nèi)‰s種胚的步驟為1)將子房用流水沖洗30min以上，然后在無菌的條件下用75%酒精浸泡20 30s，無菌水沖洗3 5次，再用0. 1 %的升汞溶液浸泡10 20min，無菌水沖洗3 5次；2)無菌條件下在鋪有濾紙的盤子上用手術(shù)刀將子房沿著心皮線切開，選取其中 有胚的種子；用手術(shù)刀將種皮輕輕劃開一個小口，然后用解剖針挑出種胚，并保持胚的完整 性。本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明所述雜種胚最佳培養(yǎng)時間胚齡為60 70d，此時胚已接近成熟，胚乳呈 淀粉糊狀，不僅萌發(fā)率高，也易剝離，一個星期左右就可以萌發(fā)。(2)本發(fā)明采用的剝胚及雜種胚離體培養(yǎng)的方法，可促成幼胚直接成苗，能夠保證 幼胚的污染率為0，成活率達(dá)到100%。(3)本發(fā)明所采用的最適的小鱗莖增殖培養(yǎng)基，即MS+NAAO. lmg/L+6_BA2. Omg/L, 蔗糖3%，瓊脂0.6%，pH= 5. 8，可使幼苗增殖的鱗莖數(shù)目較多，能在短時間內(nèi)獲得大量雜 種苗，大大節(jié)約成本。(4)本發(fā)明所采用最適的小鱗莖膨大培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基的配方為MS+PP3335mg/L+ 活性炭0. 3g/L+蔗糖9% +瓊脂0. 6%，pH 5. 8，有利于百合鱗莖的膨大，可使鱗莖在短暫的
4六個月培養(yǎng)時間內(nèi)達(dá)到質(zhì)量2. Og/粒，從而增加了移栽后成活率。(5)本發(fā)明采用的最適的生根培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基的配方為MS+NAA1. Omg/L+活性炭 1.0g/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%，pH 5. 8，有利于幼苗生根且生根數(shù)目多，根多呈現(xiàn)白色，平 均生根數(shù)目在5條以上，從而增加了雜種百合鱗莖的成活率。


圖1所示為子房滅菌后沿心皮切開的子房和雜種胚。圖2所示為胚齡為60d的雜種胚接種7天后的萌發(fā)情況。圖3所示為雜種胚在MS+0. Olmg/LNAA培養(yǎng)基上的離體培養(yǎng)情況。圖4所示為繼代培養(yǎng)中雜種幼苗的鱗莖增殖情況。圖5所示為小鱗莖經(jīng)誘導(dǎo)后鱗莖膨大情況。圖6所示為膨大后的鱗莖的生根情況。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例11)摘取授粉60d后膨大的‘西伯利亞’ X ‘生日快樂’的雜交得到子房，用流水沖 洗40min左右，然后在無菌的條件下用75 %酒精浸泡30s，無菌水沖洗3次，再用0. 1 %的升 汞溶液浸泡15min，無菌水沖洗3次，每次5min ； (2)無菌條件下在鋪有濾紙的盤子上用手 術(shù)刀將子房沿著心皮線切開(圖1)，選取其中有胚的種子；(3)用手術(shù)刀將種皮輕輕劃開一 個小口，然后用解剖針挑出種胚，注意保持胚的完整性。2)將剝離的雜種胚接種到最適離體萌發(fā)培養(yǎng)基上，其具體步驟為(1)配制培養(yǎng) 基。離體萌發(fā)培養(yǎng)基的配方為MS+NAA 0. 01mg/L+蔗糖3% +瓊脂0. 6%，pH= 5. 8，用150ml 錐形瓶盛裝，每個錐形瓶中培養(yǎng)基的體積大約為30ml ;(幻在無菌條件下用鑷子將剝離的 雜種胚水平接種到培養(yǎng)基上，每個錐形瓶中接種3 4個雜種胚，置于22°C，光照條件下培 養(yǎng)，光照強(qiáng)度1500Lx，光照時間12h ^cT1tj培養(yǎng)期間每隔2個月更換一次培養(yǎng)基。7天后， 雜種胚開始萌發(fā)(圖2)。1個月后，雜種幼苗長至2. Ocm左右(圖3)。結(jié)果表明，‘西伯利亞，X ‘生日快樂，的幼胚污染率為0，成活率達(dá)到100%。實施例21)摘取授粉70d后膨大的‘柏尼尼’ X ‘萊奧多’和‘萊奧多’ X ‘西伯利亞’的 雜交得到的子房，用流水沖洗50min左右，然后在無菌的條件下用75%酒精浸泡20s，無菌 水沖洗5次，再用0. 1 %的升汞溶液浸泡lOmin，無菌水沖洗5次，每次5min ； (2)無菌條件 下在鋪有濾紙的盤子上用手術(shù)刀將子房沿著心皮線切開，選取其中有胚的種子；(3)用手 術(shù)刀將種皮輕輕劃開一個小口，然后用解剖針挑出種胚，注意保持胚的完整性。2)將剝離的雜種胚接種到最適離體萌發(fā)培養(yǎng)基上，其具體步驟為(1)配制培養(yǎng) 基。離體萌發(fā)培養(yǎng)基的配方為MS+NAA 0. lmg/L+蔗糖3% +瓊脂0.6%，pH 5.8，用150ml 錐形瓶盛裝，每個錐形瓶中培養(yǎng)基的體積大約為30ml ;(幻在無菌條件下用鑷子將剝離的 雜種胚水平接種到培養(yǎng)基上，每個錐形瓶中接種3 4個雜種胚，置于22°C，光照條件下培 養(yǎng)，光照強(qiáng)度1500Lx，光照時間12h · cT1。培養(yǎng)期間每隔2個月更換一次培養(yǎng)基。
結(jié)果表明，‘柏尼尼’ X ‘萊奧多’和‘萊奧多’ X ‘西伯利亞’的幼胚污染率均為 0%，成活率均達(dá)到100%。實施例3將實施例2和實施例3離體培養(yǎng)4個月后獲得雜種幼苗轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，其 具體步驟為(1)配制培養(yǎng)基。增殖培養(yǎng)基的配方為MS+NAAO. lmg/L+6-BA2. Omg/L,蔗糖 3%，瓊脂0. 6%, pH 5. 8。用250ml蘭花瓶盛裝，每個蘭花瓶中培養(yǎng)基的體積大約為60ml ； (2)在無菌條件下，將幼苗剪掉葉片后接種到增殖培養(yǎng)基上，每個蘭花瓶中接種4 5個小 鱗莖，置于22°C，光照條件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1500Lx，光照時間1 ΜΛ培養(yǎng)期間每隔3個 月更換一次培養(yǎng)基。結(jié)果表明，‘柏尼尼，X ‘萊奧多’、‘萊奧多，X ‘西伯利亞’和‘西伯利亞，X ‘生 日快樂’雜種幼苗的增殖率均在5倍以上(圖4)。實施例4按照實施例3增殖培養(yǎng)6個月得到的百合小鱗莖轉(zhuǎn)接到最適鱗莖膨大培養(yǎng)基上， 其具體步驟為(1)配制培養(yǎng)基。最適鱗莖膨大培養(yǎng)基配方為MS+PP3335mg/L+活性炭0. 3g/ L+蔗糖9% +瓊脂0. 6%,pH = 5. 8,250ml蘭花瓶盛裝，每個蘭花瓶中培養(yǎng)基的體積大約為 60ml ； (2)在無菌條件下，將雜種幼苗剪掉葉片及根系后接種到鱗莖膨大培養(yǎng)基上，每個蘭 花瓶中接種4個小鱗莖，置于22°C，黑暗條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每隔3個月更換一次培養(yǎng) 基。結(jié)果表明，‘柏尼尼，X ‘萊奧多’、‘萊奧多，X ‘西伯利亞’和‘西伯利亞，X ‘生 日快樂’雜種幼苗的小鱗莖周徑增大3 4倍，質(zhì)量增加5 6倍(圖5)。實施例5將實施例4膨大培養(yǎng)6個月左右得到的幼苗轉(zhuǎn)接到最適生根培養(yǎng)基上，其具體步 驟為⑴配制培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)基的配方為MS+NAA1. Omg/L+活性炭1. Og/L+蔗糖3% + 瓊脂0. 6%，pH = 5. 8,250ml蘭花瓶盛裝，每個蘭花瓶中培養(yǎng)基的體積大約為60ml ； (2)在 無菌條件下，將幼苗剪掉葉片后接種到生根培養(yǎng)基上，每個蘭花瓶中接種3 4個鱗莖，置 于22°C，光照條件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1500Lx，光照時間12h · d—1。培養(yǎng)期間每隔3個月更換 一次培養(yǎng)基。結(jié)果表明，‘柏尼尼，X ‘萊奧多’、‘萊奧多，X ‘西伯利亞’和‘西伯利亞，X ‘生 日快樂’雜種幼苗的小鱗莖生根率為100%，平均生根條數(shù)為5. 2條(圖6)。注實施例中‘西伯利亞’、‘萊奧多’、‘柏尼尼’和‘生日快樂’四個品種均購自北
京潤博球根花卉有限公司。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種百合雜種胚離體培養(yǎng)方法，其特征在于，其步驟包括從受精膨大的子房中剝?nèi)?雜種胚進(jìn)行離體萌發(fā)，將萌發(fā)的雜種苗進(jìn)行小鱗莖的增殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離體培養(yǎng)方法，其特征在于，還包括誘導(dǎo)增殖后的百合小鱗 莖膨大。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的離體培養(yǎng)方法，其特征在于，還包括將膨大的百合小鱗莖誘 導(dǎo)生根。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的離體培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的雜種胚的胚齡 為授粉后60 70d。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的離體培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的用于雜種胚離 體萌發(fā)的培養(yǎng)基為MS+NAA 0. 05 0. 5mg/L+蔗糖3% +瓊脂0. 6%，pH 5. 8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的離體培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的用于雜種苗小 鱗莖增殖的培養(yǎng)基為 MS+NAA0. 5 1. 5mg/L+6-BA2. Omg/L+ 蔗糖 3% + 瓊脂 0.6%,pH 5. 8。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的離體培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的用于誘導(dǎo)小鱗莖膨大 的培養(yǎng)基為:MS+PP3334 6mg/L+活性炭0. 3g/L+蔗糖9% +瓊脂0. 6%，pH 5. 8。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的離體培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的用于誘導(dǎo)膨大后的小鱗 莖生根的培養(yǎng)基為MS+NAA0. 5 1. Omg/L+活性炭1. Og/L+蔗糖3% +瓊脂0. 6%，pH 5. 8。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的離體培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的從未成熟的子 房中剝?nèi)‰s種胚的步驟為1)將子房用流水沖洗30min以上，然后在無菌的條件下用75%酒精浸泡20 30s，無 菌水沖洗3 5次，再用0. 1 %的升汞溶液浸泡10 20min，無菌水沖洗3 5次；2)無菌條件下在鋪有濾紙的盤子上用手術(shù)刀將子房沿著心皮線切開，選取其中有胚的 種子；用手術(shù)刀將種皮輕輕劃開一個小口，然后用解剖針挑出種胚，并保持胚的完整性。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的離體培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的雜種胚的離體培養(yǎng)、小 鱗莖的增殖培養(yǎng)和膨大后的小鱗莖的生根培養(yǎng)為光照培養(yǎng)；所述的小鱗莖的膨大培養(yǎng)為黑 暗培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種百合雜種胚的離體培養(yǎng)方法，其步驟包括從受精膨大的子房中剝?nèi)‰s種胚進(jìn)行離體萌發(fā)，將萌發(fā)的雜種苗進(jìn)行小鱗莖的增殖，還可包括誘導(dǎo)增殖后的百合小鱗莖膨大并誘導(dǎo)生根。其中，所述的雜種胚的胚齡為授粉后60～70d。本發(fā)明提供的百合雜種胚的離體培養(yǎng)方法兼具幼胚污染率低、成活率高，幼苗增殖鱗莖數(shù)目多，鱗莖膨大速度快和幼苗生根數(shù)目多的特征，可用于百合雜種胚的高效離體培養(yǎng)。
文檔編號A01H4/00GK102124956SQ20111003865
公開日2011年7月20日 申請日期2011年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月15日
發(fā)明者劉文娟, 呂英民, 吳沙沙, 吳錦娣, 張啟翔, 焦雪輝, 程堂仁 申請人:北京林業(yè)大學(xué)