專(zhuān)利名稱：激發(fā)機(jī)體抗雞球蟲(chóng)感染的融合基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及融合基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別是涉及一種激發(fā)機(jī)體抗雞球蟲(chóng)感染的融合基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雞球蟲(chóng)病是一種雞的寄生蟲(chóng)病。病原為艾美球蟲(chóng)，主要寄生于雞腸道上皮細(xì)胞內(nèi)。該病分布廣泛，各地普遍存在，且多在溫暖季節(jié)流行。主要侵害15-50日齡雛雞，常給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。球蟲(chóng)極易產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留等問(wèn)題，而球蟲(chóng)活苗存在毒力返強(qiáng)及免疫常常失敗等，這些問(wèn)題使研制安全高效的球蟲(chóng)基因工程疫苗成為新的發(fā)展方向。以往的基因工程疫苗多建立在一種抗原基因的基礎(chǔ)上，難以抵抗大劑量球蟲(chóng)的攻擊感染。
雞球蟲(chóng)3-1E、鈣調(diào)蛋白激酶基因(CDPK)、TA4基因、熱休克蛋白HSP70基因等是雞球蟲(chóng)的保護(hù)性抗原，IFN-γ、GM-CSF、IL、TGF-β4序列等是基因工程疫苗的良好的分子免疫佐劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種激發(fā)機(jī)體抗雞球蟲(chóng)感染的融合基因及其編碼蛋白。
本發(fā)明所提供的激發(fā)機(jī)體抗雞球蟲(chóng)感染的融合基因，是由雞球蟲(chóng)的3-1E基因、鈣調(diào)蛋白激酶基因(CDPK)、TA4基因、熱休克蛋白HSP70基因中的至少一種抗原基因與IFN-γ、GM-CSF、IL、TGF-β4中至少一種細(xì)胞因子基因組成。所述抗原基因優(yōu)選為3-1E基因與CDPK基因，所述細(xì)胞因子基因優(yōu)選為IFN-γ。
在該融合基因中可以是雞球蟲(chóng)的3-1E基因、CDPK基因、TA4基因、HSP70抗原基因處于5’端，細(xì)胞因子基因處于3’端，也可以是細(xì)胞因子基因處于5’端，抗原基因處于3’端。
所述融合基因，是下述DNA序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)序列表中的SEQ ID NO2；3)序列表中的SEQ ID NO3；4)序列表中的SEQ ID NO4；5)序列表中的SEQ ID NO5；
6)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO1或2或3或4或5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中SEQ ID NO1的DNA序列由1005個(gè)堿基組成，其開(kāi)放閱讀框架為自5’端第1到第1005位堿基；自5’端第1到第513位堿基為編碼雞球蟲(chóng)3-1E蛋白的序列，編碼171個(gè)氨基酸；自5’端第514到第1005位堿基為細(xì)胞因子IFN-γ的編碼序列，編碼164個(gè)氨基酸。
序列表中SEQ ID NO2的DNA序列由1962個(gè)堿基組成，其開(kāi)放閱讀框架為自5’端第1到第1962位堿基；自5’端第1到第1470位堿基為編碼雞球蟲(chóng)CDPK的序列，編碼490個(gè)氨基酸；自5’端第1471到第1962位堿基為細(xì)胞因子IFN-γ的編碼序列，編碼164個(gè)氨基酸。
序列表中SEQ ID NO3的DNA序列由2415個(gè)堿基組成，其開(kāi)放閱讀框架為自5’端第1到第2415位堿基；自5’端第1到第513位堿基為編碼雞球蟲(chóng)3-1E蛋白的序列，編碼171個(gè)氨基酸；自5’端第514到第1983位堿基為編碼雞球蟲(chóng)CDPK蛋白的序列，編碼490個(gè)氨基酸；自5’端第1984到第2415位堿基為細(xì)胞因子GM-CSF的編碼序列，編碼144個(gè)氨基酸。
序列表中SEQ ID NO4的DNA序列由945個(gè)堿基組成，其開(kāi)放閱讀框架為自5’端第1到第945位堿基；自5’端第1到第513位堿基為編碼雞球蟲(chóng)3-1E蛋白的序列，編碼171個(gè)氨基酸；自5’端第514到第945位堿基為細(xì)胞因子GM-CSF的編碼序列，編碼144個(gè)氨基酸。
序列表中SEQ ID NO5的DNA序列由1902個(gè)堿基組成，其開(kāi)放閱讀框架為自5’端第1到第1902位堿基；自5’端第1到第1470位堿基為編碼雞球蟲(chóng)CDPK蛋白的序列，編碼490個(gè)氨基酸；自5’端第1471到第1902位堿基為細(xì)胞因子GM-CSF的編碼序列，編碼144個(gè)氨基酸。
所述融合基因的編碼蛋白也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，它是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID NO6；2)序列表中的SEQ ID NO7；3)序列表中的SEQ ID NO8；4)序列表中的SEQ ID NO9；5)序列表中的SEQ ID NO10；
6)將序列表中SEQ ID NO6或7或8或9或10的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有激發(fā)機(jī)體抗雞球蟲(chóng)感染的蛋白質(zhì)。
序列表中SEQ ID NO6的氨基酸殘基序列是由334個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，自氨基端第1-170位為雞球蟲(chóng)3-1E蛋白的氨基酸殘基序列，自氨基端第171-334位為細(xì)胞因子IFN-γ的氨基酸殘基序列，將具有序列表中SEQ ID NO6的氨基酸殘基序列的融合蛋白命名為3-1E/IFN-γ；序列表中SEQ ID NO7的氨基酸殘基序列是由654個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，自氨基端第1-490位為雞球蟲(chóng)CDPK蛋白的氨基酸殘基序列，自氨基端第491-654位為細(xì)胞因子IFN-γ的氨基酸殘基序列，將具有序列表中SEQ ID NO7的氨基酸殘基序列的融合蛋白命名為CDPK/IFN-γ；序列表中SEQ ID NO8的氨基酸殘基序列是由824個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，自氨基端第1-170位為雞球蟲(chóng)3-1E蛋白的氨基酸殘基序列，自氨基端第171-660位為雞球蟲(chóng)CDPK蛋白的氨基酸殘基序列，自氨基端第661-824位為細(xì)胞因子IFN-γ的氨基酸殘基序列，將具有序列表中SEQ ID NO8的氨基酸殘基序列的融合蛋白命名為3-1E/CDPK/IFN-γ；序列表中SEQ ID NO9的氨基酸殘基序列是由314個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，自氨基端第1-170位為雞球蟲(chóng)3-1E蛋白的氨基酸殘基序列，自氨基端第171-314位為細(xì)胞因子GM-CSF的氨基酸殘基序列，將具有序列表中SEQ ID NO9的氨基酸殘基序列的融合蛋白命名為3-1E/GM-CSF；序列表中SEQ ID NO10的氨基酸殘基序列是由634個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，自氨基端第1-490位為雞球蟲(chóng)CDPK蛋白的氨基酸殘基序列，自氨基端第491-634位為細(xì)胞因子GM-CSF的氨基酸殘基序列，將具有序列表中SEQ ID NO10的氨基酸殘基序列的融合蛋白命名為CDPK/GM-CSF。
含有所述激發(fā)機(jī)體抗雞球蟲(chóng)感染的融合蛋白編碼基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和工程菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)上述激發(fā)機(jī)體抗雞球蟲(chóng)感染的融合蛋白的方法。
本發(fā)明所提供的融合蛋白的表達(dá)方法，是構(gòu)建含有所述融合蛋白編碼基因的表達(dá)載體，再將構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞獲得重組菌株，培養(yǎng)該重組菌株，最后從培養(yǎng)物中分離出融合蛋白。
本發(fā)明的激發(fā)機(jī)體抗雞球蟲(chóng)感染的融合基因及其編碼蛋白可用于制備預(yù)防和/或治療性雞球蟲(chóng)疫苗。
本發(fā)明將雞球蟲(chóng)的3-1E基因、鈣調(diào)蛋白激酶基因(CDPK)、TA4基因、熱休克蛋白HSP70基因中的至少一種基因作為抗原基因與IFN-γ、GM-CSF、IL、TGF-β4中的至少一種細(xì)胞因子基因作為免疫佐劑基因形成的融合基因及其編碼蛋白，可激發(fā)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生雞球蟲(chóng)免疫防護(hù)作用，對(duì)雞球蟲(chóng)具有較好的免疫保護(hù)效果，可用于雞球蟲(chóng)病的預(yù)防和治療中。該融合蛋白穩(wěn)定、制備方法簡(jiǎn)便易行，可應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明在動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景和實(shí)際意義。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、含有融合基因3-1E/IFN-γ的重組質(zhì)粒的構(gòu)建一、3-1E基因和IFN-γ基因的克隆1、3-1E基因的克隆從孢子化卵囊中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA并以其為模板，在上游引物5’-CGAGTCTTCATTGTTTGTAGTTTC-3’和下游引物5’-TTTTTCCTTCTCATCAAGTGGTT-3’的引導(dǎo)下，用常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為先94℃5分鐘，94℃ 1分鐘，56℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，32個(gè)循環(huán)；再72℃ 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將513bp的3-1E基因的目的片段克隆入載體pGEM-T Easy(購(gòu)于北京新經(jīng)科公司)中，得到含有3-1E基因的克隆載體，命名為pGEM-T Easy/3-1E。
2)IFN-γ基因的克隆提取雞抗凝血的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA并以其為模板，在上游引物5’-TCAGCCGCCAAGATGACTTGCCAGACTT-3’和下游引物5’-GGCTTAGCAATTGCATCTCCTCTGAGAC-3’的引導(dǎo)下，用常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為先98℃ 5分鐘，94℃ 1分鐘，60℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，5個(gè)循環(huán)；再94℃ 1分鐘，58℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，28個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將492bp的IFN-γ基因的目的片段克隆入載體pGEM-T Easy中，得到含有IFN-γ基因的克隆載體，命名為pGEM-T Easy/IFN-γ。
二、含3-1E/IFN-γ融合基因的重組質(zhì)粒的獲得1)以步驟一構(gòu)建的含3-1E基因的克隆載體pGEM-T Easy/3-1E為模板，在引物5’-AAGGATCCGCCGCCAAAATGGGTGAAGAGGCTG-3’和引物5’-AAGAATTCTTAGAAGCCGCCCTGGTACAGGTACTC-3’的引導(dǎo)下，用PCR的方法亞克隆3-1E基因；以步驟一構(gòu)建的含IFN-γ基因的克隆載體pGEM-T Easy/IFN-γ為模板，在引物5’-TCAAAGCTTGCCGCCAAGATGACTTGCCAGACTT-3’和引物5’-GGCCTCGAGTTAGCAATTGCATCTCCTCTGAGAC-3’的引導(dǎo)下，用PCR的方法亞克隆IFN-γ基因。
2)將3-1E基因用限制性內(nèi)切酶BamH I與EcoR I酶切，將IFN-γ基因用限制性內(nèi)切酶Hind III與Kpn I酶切，再用限制性內(nèi)切酶BamH I與EcoR I、Hind III與Kpn I對(duì)載體pcDNA3.1/Zeo(+)(購(gòu)于Invitrogen公司)酶切后，將三種酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，連接反應(yīng)時(shí)間為16小時(shí)。
3)將步驟2)的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取長(zhǎng)出的單菌落搖菌、提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH I與EcoR、Hind III與Kpn I進(jìn)行酶切鑒定，得到513bp和492bp酶切片段的為陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，再對(duì)該陽(yáng)性克隆質(zhì)粒用PCR的方法做進(jìn)一步的鑒定，所用的引物序列為5’-AAGGATCCGCCGCCAAAATGGGTGAAGAGGCTG-3’和5’-GGCCTCGAGTTAGCAATTGCATCTCCTCTGAGAC-3’，可擴(kuò)增出1005bp片段的為陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，再對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析，得到正確的含有3-1E/IFN-γ融合基因的重組質(zhì)粒，命名為pcDNA3.1-3-1E /IFN-γ。
實(shí)施例2、含有融合基因CDPK/IFN-γ的重組質(zhì)粒的構(gòu)建一、CDPK基因和IFN-γ基因的克隆1、CDPK基因的克隆從孢子化卵囊中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA并以其為模板，在上游引物5’-ATGCCGGCAGCGTCCAAGTCAG-3’和下游引物5’-CGCCGCGGTATCTCCGCACAAC-3’的引導(dǎo)下，用常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為先94℃ 5分鐘，94℃ 1分鐘，56℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，32個(gè)循環(huán)；再72℃ 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將1470bp的CDPK基因的目的片段克隆入載體pGEM-T Easy中，得到含有CDPK基因的克隆載體，命名為pGEM-T Easy/CDPK。
2、IFN-γ基因的克隆IFN-γ基因的克隆方法與實(shí)施例1相同。
二、含CDPK/IFN-γ融合基因的重組質(zhì)粒的獲得1)以步驟一構(gòu)建的含CDPK基因的克隆載體pGEM-T Easy/CDPK為模板，在引物5’-TAGAATTCACCATGCCGGCAGCGTCCAAGTC-3’和引物5’-CCCTGCAGCTACGCCGCGGTATCTCGCACAAC-3’的引導(dǎo)下，用PCR的方法亞克隆CDPK基因；以步驟一構(gòu)建的含IFN-γ基因的克隆載體pGEM-T Easy/IFN-γ為模板，在引物5’-TCAAAGCTTGCCGCCAAGATGACTTGCCAGACTT-3’和引物5’-GGCCTCGAGTTAGCAATTGCATCTCCTCTGAGAC-3’的引導(dǎo)下，用PCR的方法亞克隆IFN-γ基因。
2)將CDPK基因用限制性內(nèi)切酶EcoR I與Pst I酶切，將IFN-γ基因用限制性內(nèi)切酶Hind III與Kpn I酶切，再用限制性內(nèi)切酶EcoR I與Pst I、Hind III與Kpn I對(duì)載體pcDNA3.1/Zeo(+)酶切后，將三種酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，連接反應(yīng)時(shí)間為16小時(shí)。
3)將步驟2)的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取長(zhǎng)出的單菌落搖菌、提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoR I與Pst I、Hind III與Kpn I進(jìn)行酶切鑒定，得到1470bp和492bp酶切片段的為陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，再對(duì)該陽(yáng)性克隆質(zhì)粒用PCR的方法做進(jìn)一步的鑒定，所用的引物序列為5’-TAGAATTCACCATGCCGGCAGCGTCCAAGTC-3’和5’-GGCCTCGAGTTAGCAATTGCATCTCCTCTGAGAC-3’，可擴(kuò)增出1962bp片段的為陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，再對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析，得到正確的含有3-1E/IFN-γ融合基因的重組質(zhì)粒，命名為pcDNA3.1-CDPK/IFN-γ。
實(shí)施例3、含有融合基因3-1E/CDPK/IFN-γ的重組質(zhì)粒的構(gòu)建一、融合基因3-1E、CDPK和IFN-γ的克隆1)3-1E基因的克隆3-1E基因的克隆方法與實(shí)施例1相同。
2)CDPK基因的克隆CDPK基因的克隆方法與實(shí)施例2相同。
3)IFN-γ基因的克隆IFN-γ基因的克隆方法與實(shí)施例1相同。
二、含3-1E/CDPK/IFN-γ融合基因的重組質(zhì)粒的獲得1)以步驟一構(gòu)建的含3-1E基因的克隆載體pGEM-T Easy/3-1E為模板，在引物5’-AAGGATCCGCCGCCAAAATGGGTGAAGAGGCTG-3’和引物5’-AAGAATTCTTAGAAGCCGCCCTGGTACAGGTACTC-3’的引導(dǎo)下，用PCR的方法亞克隆3-1E基因；以步驟一構(gòu)建的含CDPK基因的克隆載體pGEM-T Easy/CDPK為模板，在引物5’-TAGAATTCACCATGCCGGCAGCGTCCAAGTC-3’和引物5’-CCCTGCAGCTACGCCGCGGTATCTCGCACAAC-3’的引導(dǎo)下，用PCR的方法亞克隆CDPK基因；以步驟一構(gòu)建的含IFN-γ基因的克隆載體pGEM-T Easy/IFN-γ為模板，在引物5’-TCAAAGCTTGCCGCCAAGATGACTTGCCAGACTT-3’和引物5’-GGCCTCGAGTTAGCAATTGCATCTCCTCTGAGAC-3’的引導(dǎo)下，用PCR的方法亞克隆IFN-γ基因。
2)將3-1E基因用限制性內(nèi)切酶BamH I與EcoR I酶切，將CDPK基因用限制性內(nèi)切酶EcoR I與Pst I酶切，將IFN-γ基因用限制性內(nèi)切酶Hind III與Kpn I酶切，再用限制性內(nèi)切酶BamH I與EcoR I、EcoR I與Pst I、Hind III與Kpn I對(duì)載體pcDNA3.1/Zeo(+)酶切后，將酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，連接反應(yīng)時(shí)間為16小時(shí)。
3)將步驟2)的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取長(zhǎng)出的單菌落搖菌、提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH I與EcoR I、EcoR I與Pst I、Hind III與Kpn I進(jìn)行酶切鑒定，得到513bp、1470bp和492bp酶切片段的為陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，再對(duì)該陽(yáng)性克隆質(zhì)粒用PCR的方法做進(jìn)一步的鑒定，所用的引物序列為5’-AAGGATCCGCCGCCAAAATGGGTGAAGAGGCTG-3’和5’-GGCCTCGAGTTAGCAATTGCATCTCCTCTGAGAC-3’，可擴(kuò)增出2475bp片段的為陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，再對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析，得到正確的含有3-1E/CDPK/IFN-γ融合基因的重組質(zhì)粒，命名為pcDNA3.1-3-1E/CDPK/IFN-γ。
實(shí)施例4、免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)分別將實(shí)施例1、2、3獲得的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-3-1E/IFN-γ、pcDNA3.1-CDPK/IFN-γ、pcDNA3.1-3-1E/CDPK/IFN-γ經(jīng)胸肌多點(diǎn)注射免疫雞，以非免疫雞為對(duì)照，每次免疫劑量為50μg/只，7日齡雞只為首免，14日齡雞只為二免，21日齡后經(jīng)口感染雞球蟲(chóng)，每只雞感染5-6×104個(gè)卵囊，28日齡剖殺稱重。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，最高可達(dá)到0.7854；取盲腸內(nèi)容物搗碎混勻后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并換算成卵囊值，結(jié)果表明免疫后的雞存活率達(dá)100％，卵囊減少率達(dá)78％，病變減少率為50-60％，相對(duì)增重率為90-98％，綜合抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)達(dá)171、抗體滴度等免疫學(xué)指標(biāo)明顯高于感染不給苗組，表明經(jīng)免疫的雞對(duì)雞球蟲(chóng)的免疫力顯著提高。
序列表<160>10<210>1<211>1005<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ATGGGTGAAG AGGCTGATAC TCAGGCGTGG GATACCTCAG TGAAGGAATG GCTCGTGGAT 60ACGGGGAAGG TATACGCCGG CGGCATTGCT AGCATTGCAG ATGGGTGCCG CCTGTTTGGC120GCTGCAATAG ACAATGGGGA GGATGCGTGG AGTCAGTTGG TGAAGACAGG ATATCAGATT180GAAGTGCTTC AAGAGGACGG CTCTTCAACT CAAGAGGACT GCGATGAAGC GGAAACCCTG240CGGCAAGCAA TTGTTGACGG CCGTGCCCCA AACGGTGTTT ATATTGGAGG AATTAAATAT300AAACTCGCAG AAGTTAAACG TGATTTCACC TATAACGACC AGAACTACGA CGTGGCGATT360TTGGGGAAGA ACAAGGGTGG CGGTTTCCTG ATTAAGACTC CGAACGACAA TGTGGTGATT420GCTCTTTATG ACGAGGAGAA AGAGCAGAAC AAAGCAGATG CGCTGACAAC GGCACTTGCC480TTCGCTGAGT ACCTGTACCA GGGCGGCTTC TAAATGACTT GCCAGACTTA CAACTTGTTT540GTTCTGTCTG TCATCATGAT TTATTATGGA CATACTGCAA GTAGTCTAAA TCTTGTTCAA600CTTCAAGATG ATATAGACAA ACTGAAAGCT GACTTTAACT CAAGTCATTC AGATGTAGCT660GACGGTGGAC CTATTATTGT AGAGAAACTG AAGAACTGGA CAGAGAGAAA TGAGAAAAGG720ATCATACTGA GCCAGATTGT TTCGATGTAC TTGGAAATGC TTGAAAACAC TGACAAGTCA780AAGCCGCACA TCAAACACAT ATCTGAGGAG CTCTATACTC TGAAAAACAA CCTTCCTGAT840GGCGTGAAGA AGGTGAAAGA TATCATGGAC CTGGCCAAGC TCCCGATGAA CGACTTGAGA900ATCCAGCGCA AAGCCGCGAA TGAACTCTTC AGCATCTTAC AGAAGCTGGT GGATCCTCCG960AGTTTCAAAA GGAAAAGGAG CCAGTCTCAG AGGAGATGCA ATTGC 1005<210>2<211>1962
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
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<400>10Met Pro Ala Ala Ser Lys Ser Asp Lys Leu Ala Ala Thr Pro Gly Met1 5 10 15
Phe Val Gln His Ser Thr Ala Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Lys Gly Gln20 25 30Arg Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Glu Val Ile Leu Cys Lys Asp35 40 45Lys Val Thr Gly Gln Glu Tyr Ala Val Lys Val Ile Ser Lys Arg Gln50 55 60Val Lys Gln Lys Thr Asp Lys Glu Leu Leu Leu Lys Glu Val Glu Leu65 70 75 80Leu Lys Lys Leu Asp His Pro Asn Ile Met Lys Leu Tyr Glu Phe Phe85 90 95Glu Asp Lys Gly Tyr Phe Tyr Leu Val Thr Glu Val Tyr Thr Gly Gly100 105 110Glu Leu Phe Asp Glu Ile Ile Ser Arg Lys Arg Phe Ser Glu Val Asp115 120 125Ala Ala Arg Ile Ile Arg Gln Val Leu Ser Gly Ile Thr Tyr Met His130 135 140Lys Asn Lys Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu145 150 155 160Glu Asn Lys Arg Lys Asp Ala Asn Ile Arg Ile Ile Asp Phe Gly Leu165 170 175Ser Thr His Phe Glu Ser Thr Lys Lys Met Lys Asp Lys Ile Gly Thr180 185 190Ala Tyr Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu His Gly Thr Tyr Asp Glu Lys195 200 205Cys Asp Val Trp Ser Thr Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu Ser Gly210 215 220Cys Pro Pro Phe Asn Gly Ala Asn Glu Phe Asp Ile Leu Lys Lys Val225 230 235 240Glu Lys Gly Lys Phe Thr Phe Asp Leu Pro Gln Trp Lys Lys Val Ser245 250 255Glu Pro Ala Lys Asp Leu Ile Arg Lys Met Leu Ala Tyr Val Pro Thr260 265 270
Met Arg Ile Ser Ala Arg Asp Ala Leu Glu His Glu Trp Leu Lys Thr275 280 285Thr Asp Ala Ala Thr Asp Ser Ile Asp Val Pro Ser Leu Glu Ser Thr290 295 300Ile Leu Asn Ile Arg Gln Phe Gln Gly Thr Gln Lys Leu Ala Ala Ala305 310 315 320Ala Leu Leu Tyr Met Gly Ser Lys Leu Thr Thr Asn Glu Glu Thr Val325 330 335Glu Leu Asn Lys Ile Phe Gln Arg Met Asp Lys Asn Gly Asp Gly Gln340 345 350Leu Asp Lys Gln Glu Leu Met Glu Gly Tyr Val Glu Leu Met Lys Leu355 360 365Lys Gly Glu Asp Val Ser Ala Leu Asp Gln Ser Ala Ile Glu Phe Glu370 375 380Val Glu Gln Val Leu Asp Ala Val Ala Phe Asp Lys Asn Gly Phe Ile385 390 395 400Glu Tyr Ser Glu Phe Val Thr Val Ala Met Asp Arg Lys Thr Leu Leu405 410 415Ser Arg Gln Arg Leu Glu Arg Ala Phe Gly Met Phe Asp Ala Asp Gly420 425 430Ser Gly Lys Ile Ser Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Phe Gly Val Ser435 440 445Glu Val Asp Ser Glu Thr Trp Arg Arg Val Leu Ala Glu Val Asp Arg450 455 460Asn Asn Asp Gly Glu Val Asp Phe Glu Glu Phe Arg Gln Met Leu Leu465 470 475 480Lys Leu Cys Glu Ile Pro Arg Arg Asn Ser Met Leu Ala Gln Leu Thr485 490 495Ile Leu Leu Ala Leu Gly Val Leu Cys Ser Pro Ala Pro Thr Thr Thr500 505 510Tyr Ser Cys Cys Tyr Lys Val Tyr Thr Ile Leu Glu Glu Ile Thr Ser515 520 525
His Leu Glu Ser Thr Ala Ala Thr Ala Gly Leu Ser Ser Val Pro Met530 535 540Asp Ile Arg Asp Lys Thr Cys Leu Arg Asn Asn Leu Lys Thr Phe Ile545 550 555 560Glu Ser Leu Lys Thr Asn Gly Thr Glu Glu Glu Ser Gly Ile Val Phe565 570 575Gln Leu Asn Arg Val His Glu Cys Glu Arg Leu Phe Ser Asn Ile Thr580 585 590Pro Thr Pro Gln Val Pro Asp Lys Glu Cys Arg Thr Ala Gln Val Ser595 600 605Arg Glu Lys Phe Lys Glu Ala Leu Lys Thr Phe Phe Ile Tyr Leu Ser610 615 620Asp Val Leu Pro Glu Glu Lys Asp Cys Ile625 630
權(quán)利要求
1.一種激發(fā)機(jī)體抗雞球蟲(chóng)感染的融合基因，是由雞球蟲(chóng)的3-1E基因、鈣調(diào)蛋白激酶基因、TA4基因、熱休克蛋白HSP70基因中的至少一種抗原基因與IFN-γ、GM-CSF、IL、TGF-β4中至少一種細(xì)胞因子基因組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合基因，其特征在于所述抗原基因?yàn)?-1E與CDPK，細(xì)胞因子基因?yàn)镮FN-γ。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合基因，其特征在于所述融合基因是下述DNA序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)序列表中的SEQ ID NO2；3)序列表中的SEQ ID NO3；4)序列表中的SEQ ID NO4；5)序列表中的SEQ ID NO5；6)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO1或2或3或4或5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1所述的融合基因的編碼蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID NO6；2)序列表中的SEQ ID NO7；3)序列表中的SEQ ID NO8；4)序列表中的SEQ ID NO9；5)序列表中的SEQ ID NO10；6)將序列表中SEQ ID NO6或7或8或9或10的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有激發(fā)機(jī)體抗雞球蟲(chóng)感染的蛋白質(zhì)。
5.含有權(quán)利要求1所述融合基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求1所述融合基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7.含有權(quán)利要求1所述融合基因的工程菌。
8.一種表達(dá)權(quán)利要求4所述激發(fā)機(jī)體抗雞球蟲(chóng)感染的融合蛋白的方法，是構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述融合基因的表達(dá)載體，再將構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞獲得重組菌株，培養(yǎng)該重組菌株，最后從培養(yǎng)物中分離出融合蛋白。
9.權(quán)利要求1所述激發(fā)機(jī)體抗雞球蟲(chóng)感染的融合基因在制備預(yù)防和/或治療性雞球蟲(chóng)疫苗中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求4所述激發(fā)機(jī)體抗雞球蟲(chóng)感染的蛋白在制備預(yù)防和/或治療性雞球蟲(chóng)疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種激發(fā)機(jī)體抗雞球蟲(chóng)感染的融合基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。該融合基因，是由雞球蟲(chóng)的3－1E基因、鈣調(diào)蛋白激酶基因、TA4基因、熱休克蛋白HSP70基因中的至少一種抗原基因與IFN－γ、GM－CSF、IL、TGF－β4中至少一種細(xì)胞因子基因中至少一種細(xì)胞因子基因組成。它是下述DNA序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)序列表中的SEQ ID №2；3)序列表中的SEQ ID №3；4)序列表中的SEQID №4；5)序列表中的SEQ ID №5；6)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1或2或3或4或5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1778930SQ20051010834
公開(kāi)日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2005年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月12日
發(fā)明者汪明, 周建民, 徐守振, 吳紹強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)