專利名稱：一種哺乳動物細胞無血清培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)、生物制藥領域，更具體地涉及哺乳動物細胞培養(yǎng)基成分。
背景技術：
重組DNA技術的發(fā)展已使蛋白質(zhì)藥物大規(guī)模生產(chǎn)、取代從生物原料提取成為可能；毫無疑問，隨著人類基因組學和蛋白組學研究的開展，會有更多的基因功能得到鑒別，與之相應的將是會有更多的蛋白質(zhì)藥物出現(xiàn)并用于臨床試驗和疾病治療。
蛋白質(zhì)藥物的生物合成有若干途徑可以選擇，包括哺乳動物細胞培養(yǎng)、微生物發(fā)酵、轉(zhuǎn)基因動物和轉(zhuǎn)基因植物。就目前來講，微生物發(fā)酵主要用于不需要修飾的蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)，而大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)主要用于翻譯后需要糖基化等修飾的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。雖然轉(zhuǎn)基因動物、植物在蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)方面有大幅度降低生產(chǎn)成本的可能，但技術研發(fā)過程復雜，技術市場取向目前尚不能同大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)相比。另外，蛋白質(zhì)修飾物種之間的差異也可以對影響藥物的功能和免疫反應程度造成影響。
經(jīng)典的蛋白質(zhì)藥物研發(fā)過程需要一個相對漫長的過程。在藥物結(jié)構和基本作用機理比較明確后，需要進一步對蛋白質(zhì)分子改構，以期在藥物代謝、毒性、抗原性等方面進一步改善。如果能夠在藥物研發(fā)的早期能夠?qū)Υ罅孔儤嬈贩N篩選，不但可以大幅度提高藥物研發(fā)速度，而且可以節(jié)省大量人力物力資源，也可能由于篩選范圍的擴大而篩選出最佳變構體。另外，蛋白組學研究領域也面臨多品種同時表達的通量瓶頸。
外源基因在動物細胞中的表達方式基本上有兩種，即穩(wěn)定表達和瞬時表達。在穩(wěn)定表達方式中，外源基因整合到宿主細胞的染色體成為細胞的遺傳特征的一部分，有絲分裂后在后代細胞中仍舊保留。由于高產(chǎn)穩(wěn)定表達細胞株的建立和篩選需要耗費大量的時間和人力物力，一般在蛋白質(zhì)藥物結(jié)構最終決定之后采用，以利于大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)的需要。在瞬時表達方式中，外源基因不需要整合到宿主細胞的染色體上，雖然后代細胞在有絲分裂后仍舊保留或自我合成外源基因表達目標蛋白質(zhì)。顯而易見，相對于穩(wěn)定表達來說，瞬時表達具有更好的靈活性，更適合藥物早期篩選階段的多品種制備。293細胞是轉(zhuǎn)染腺病毒E1A基因的人腎上皮細胞而得到的細胞系，適合外源蛋白質(zhì)的瞬時表達。原始的293細胞是通過貼壁生長的方式生長的，通過馴化293細胞已經(jīng)可以在懸浮環(huán)境中生長。
細胞培養(yǎng)基是細胞生長的關鍵原料。早期的培養(yǎng)基大多添加動物血清，利用其中的多種細胞因子刺激細胞分裂。動物血清的使用對蛋白質(zhì)表達有若干不利因素，如產(chǎn)物純化難度加大、來源限制、批次間生物活性差異(導致過程不穩(wěn)定性)、生物污染(如瘋牛病)等。因此，研究含已知成分的無血清培養(yǎng)基成為細胞培養(yǎng)領域中一項重要工作。一般來說，每一個細胞株都有其獨特的營養(yǎng)需求，沒有任何一種培養(yǎng)基會充分滿足所有細胞株的需要或發(fā)揮細胞的最大工作潛力，針對具體生產(chǎn)過程配置并優(yōu)化培養(yǎng)基成分是現(xiàn)代大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程研究的主要任務之一。
發(fā)明簡述因此，本發(fā)明提供了一種能夠適合哺乳動物懸浮生長的無血清培養(yǎng)基，可以用于外源蛋白質(zhì)基因的規(guī)?；磉_。
在本發(fā)明的一個方面，公開了一種適合哺乳動物細胞生長的無血清培養(yǎng)基，包括氨基酸成分，包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺；維生素成分，包括生物素、氯化膽堿、D-泛酸鈣、葉酸、肌醇、煙酰胺、吡哆醇鹽酸鹽、核黃素、鹽酸硫氨、維生素B12、腐胺二鹽酸鹽、維生素C、維生素E；鹽類，包括碳酸氫鈉、氯化鈣、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈉磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、丙酮酸鈉；脂類，包括油酸、膽固醇、乙醇胺、亞油酸、硫辛酸、脂質(zhì)混合物；微量元素，包括氯化鈷、亞硒酸鈉、氯化鎳、氯化錳、乙二胺四乙酸鈉鹽、七鉬酸銨、氯化鋁、硫酸鉻鉀、硫酸銅、硝酸鐵、硫酸亞鐵、硫酸鋅；蛋白質(zhì)包括胰島素、牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白；和二巰基乙醇；Pluronic F68、D-葡萄糖。
在該方面的一個具體實施方式
中，哺乳動物細胞選自雜交瘤細胞、中國倉鼠卵巢細胞。優(yōu)選哺乳動物細胞是293細胞。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種馴化哺乳動物細胞的方法，包括在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動物細胞。在該方面的一個優(yōu)選實施例中，哺乳動物細胞選自雜交瘤細胞、中國倉鼠卵巢細胞。在另一個優(yōu)選例中，哺乳動物細胞是293細胞。
在該方面的另一個方面，還公開了一種配置該無血清培養(yǎng)基的方法。
附圖簡述

圖1.顯示了實施例1 293細胞在本無血清培養(yǎng)基中的馴化適應過程。
圖2.顯示了實施例2 293細胞在本無血清培養(yǎng)基中的生長動力學過程。
具體實施例方式
本發(fā)明利用細胞培養(yǎng)多孔板(如96孔板)作為細胞生長容器，以搖床作為傳動裝置實現(xiàn)流體混合，達到增加培養(yǎng)數(shù)量、實現(xiàn)高通量培養(yǎng)基成分優(yōu)化的目的。
本發(fā)明利用活細胞對刃天青的還原反應所導致的605nm光密度降低值來反應培養(yǎng)中活細胞密度，可以簡便地用于活細胞密度終點檢測，活細胞濃度檢測范圍在0.05-10×106細胞/ml之間。此外，由于刃天青的氧化還原反應不影響細胞的代謝，因此不象與核或細胞器結(jié)合的試劑那樣，測試后造成細胞死亡。
本文所述的高通量細胞培養(yǎng)方法和活細胞檢測方法可以高效率地應用于細胞培養(yǎng)基篩選和培養(yǎng)基成分優(yōu)化。常規(guī)的正交實驗需要進行大量的重復實驗，若采用常規(guī)實驗設備如轉(zhuǎn)瓶或發(fā)酵罐將受到實驗室規(guī)模等的限制，對大量濃度變量同時實驗是不可能的，而分批實驗也會由于細胞接種質(zhì)量和細胞計數(shù)差異等因素使批次結(jié)果間失去可比性。而本發(fā)明在一塊96孔板中就可進行幾組甚至幾十組實驗，而且培養(yǎng)規(guī)模小、速度快，結(jié)合簡便的細胞濃度檢測方法，大大節(jié)約了研究成本，對于細胞培養(yǎng)條件的研究是一個重要的進步。
下文提供了實施例進一步說明了本發(fā)明。這些例子不是為了限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1無血清培養(yǎng)基配置(1升)
根據(jù)下表1配制了培養(yǎng)基表1.動物細胞無血清培養(yǎng)基成分


1.氨基酸(谷氨酰胺除外)配制成10倍的濃縮水溶液；維生素(維他命C除外)配制成100倍的濃縮水溶液；微量元素配制成1000倍的濃縮水溶液；脂肪酸(脂質(zhì)混合物除外)配制成1000倍的濃縮水溶液；還原型谷胱甘肽配制成1000倍的濃縮水溶液；胸苷和次黃嘌呤配制成100倍的濃縮水溶液；谷氨酰胺配制成200mM的濃縮水溶液；胰島素配制成2mg/ml的濃縮液；轉(zhuǎn)鐵蛋白配制成10mg/ml的濃縮液；氯化鈣配制成9.24mM的濃縮水溶液。
2.按以下順序依次溶于500ml純水碳酸氫鈉、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、D-葡萄糖、丙酮酸鈉、肝素鈉、Pluronic F68、肝素鈉、?；撬帷⒙然}濃縮液、氨基酸濃縮液、胸苷和次黃嘌呤濃縮液、微量元素濃縮液、還原型谷胱甘肽濃縮液、二巰基乙醇、脂肪酸濃縮液、脂質(zhì)混合物、維生素濃縮液、維生素C、牛血清白蛋白、胰島素溶液、轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液、谷氨酰胺濃縮液。
3.用1M HCl將pH調(diào)至7.1，定容至1升后2.2μm濾膜過濾，4℃儲存。
實施例2293細胞在無血清培養(yǎng)基中的馴化復蘇293細胞于原始培養(yǎng)基，置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱攪拌培養(yǎng)。在細胞傳代三次后將細胞以2×105/mL密度接種到本無血清培養(yǎng)基中開始馴化。每24小時取樣，臺盼藍法計數(shù)細胞密度。培養(yǎng)約72小時后離心傳代，接種密度均為2×105/mL。結(jié)果表明，在初期經(jīng)歷了一段適應期后，細胞逐漸適應了本無血清培養(yǎng)基，細胞生長能力逐漸增加，傳代7次后細胞基本上完全適應。結(jié)果顯示于圖1。
實施例3293細胞在無血清培養(yǎng)基中的生長馴化后的293細胞以2×105/mL的密度接種于本無血清培養(yǎng)基中，置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱攪拌培養(yǎng)。每24小時取樣，臺盼藍法計數(shù)細胞密度。培養(yǎng)基中的葡萄糖和乳酸濃度用YSI 2003 STAT plus測定，銨離子濃度酶電極法測定。結(jié)果表明，在培養(yǎng)6天之后活細胞密度達到最高，2×106/mL。在葡萄糖濃度較高階段(前3天)乳酸形成速度比較快，但在葡萄糖濃度降低到5mM后乳酸濃度基本上保持。結(jié)果顯示于圖2。
權利要求
1.一種適合哺乳動物細胞生長的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，該無血清培養(yǎng)基包括氨基酸成分，包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺；維生素成分，包括生物素、氯化膽堿、D-泛酸鈣、葉酸、肌醇、煙酰胺、吡哆醇鹽酸鹽、核黃素、鹽酸硫氨、維生素B12、腐胺二鹽酸鹽、維生素C、維生素E；鹽類，包括碳酸氫鈉、氯化鈣、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈉磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、丙酮酸鈉；脂類，包括油酸、膽固醇、乙醇胺、亞油酸、硫辛酸、脂質(zhì)混合物；微量元素，包括氯化鈷、亞硒酸鈉、氯化鎳、氯化錳、乙二胺四乙酸鈉鹽、七鉬酸銨、氯化鋁、硫酸鉻鉀、硫酸銅、硝酸鐵、硫酸亞鐵、硫酸鋅；蛋白質(zhì)包括胰島素、牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白；和二巰基乙醇；Pluronic F68、D-葡萄糖。
2.如權利要求1所述的無血清培養(yǎng)基，所述哺乳動物細胞選自雜交瘤細胞、中國倉鼠卵巢細胞。
3.如權利要求2所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述哺乳動物細胞是293細胞。
4.一種馴化哺乳動物細胞的方法，其特征在于，在權利要求1所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動物細胞。
5.如權利要求4所述的方法，所述哺乳動物細胞選自雜交瘤細胞、中國倉鼠卵巢細胞。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物細胞是293細胞。
全文摘要
公開了一種適合哺乳動物細胞，包括雜交瘤細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，尤其293細胞，生長的無血清培養(yǎng)基。還公開了馴化該培養(yǎng)基的方法。
文檔編號C12N5/071GK1962857SQ20051011030
公開日2007年5月16日 申請日期2005年11月11日 優(yōu)先權日2005年11月11日
發(fā)明者沈秉謙, 楊勝利, 方強毅 申請人:上海中科伍佰豪生物工程有限公司