專利名稱：產(chǎn)d－泛解酸內(nèi)酯水解酶的微生物及其制備d－泛解酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物催化研究領(lǐng)域，涉及產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的微生物及其制備D-泛解酸的方法。
背景技術(shù)：
D-泛解酸(Pantothenic acid)是制造D-泛酸的重要手性中間體，D-泛酸是維生素B族物質(zhì)，輔酶A的組成部分，參與糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝，其產(chǎn)品多以D-泛酸鈣形式存在。D-泛酸鈣廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料工業(yè)中。
目前制備D-泛酸一般采用化學(xué)或生物拆分方法。傳統(tǒng)的化學(xué)拆分方法存在產(chǎn)生成本高、生產(chǎn)量小、產(chǎn)品光學(xué)純度差等弱點。生物拆分方法中，采用微生物酶法拆分DL-泛解酸內(nèi)酯，因具有環(huán)境污染和毒性少等特點而成為研究的一個重要方向。其中，微生物酶法拆分DL-泛解酸內(nèi)酯的一種方法是利用產(chǎn)L-泛解酸內(nèi)酯酶的微生物，分解DL-泛解酸內(nèi)酯中的L-泛解酸內(nèi)酯，得到未分解的D-構(gòu)型泛解酸內(nèi)酯(JPA 47-19745、JPA 57-152895)，此方法的缺點只有L-構(gòu)型的內(nèi)酯被水解得非常徹底才能得到高光學(xué)純度的D-泛解酸內(nèi)酯，反應(yīng)時間長，大約需要72小時，長時間的水解過程會導(dǎo)致一部分D-泛解酸內(nèi)酯水解，因此所得到的產(chǎn)物D-泛解酸內(nèi)酯收率不高。另一種方法是利用產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯酶的微生物，選擇性水解DL-泛解酸內(nèi)酯中的D-泛解酸內(nèi)酯，得到D-泛解酸，再將D-泛解酸進行內(nèi)酯化生成D-泛解酸內(nèi)酯。該方法水解時間短，雖然水解率不高(30％左右)，但未水解的L-泛解酸內(nèi)酯可消旋后再利用，產(chǎn)物的總收率高。該法已先后在日本第一制藥公司和中國浙江鑫生化股份有限公司用于工業(yè)生產(chǎn)，分別采用尖孢鐮孢Fusariumoxysporum IFO 000或串珠鐮孢霉菌Fusarium moniliforme CGMCC 0536。
在研究與生產(chǎn)實踐過程中發(fā)現(xiàn)，不同微生物產(chǎn)酶菌株的使用效果不同。例如尖孢鐮孢Fusarium oxysporum IFO5942，存在發(fā)酵培養(yǎng)時間長(7天)、只進行一次酶轉(zhuǎn)化、酶的利用率低等缺陷(US Patent 5275949，1994)；而串珠鐮孢霉菌Fusarium moniliforme SW-902(即CGMCC 0536)菌株，菌株發(fā)酵產(chǎn)酶時間短(2～3天)，對D-泛解酸內(nèi)酯選擇專一性高，產(chǎn)品光學(xué)純度高(99％e.e)(中國專利CN01104070.X，2001)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于研究更多的能高效生產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯的微生物菌珠。
本發(fā)明對產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯酶、具有水解D-泛解酸內(nèi)酯能力的絲狀真菌進行篩選，對其中選擇性高，產(chǎn)品光學(xué)純度高的微生物菌株進行培養(yǎng)，以其濕菌體或其用戊二醛交聯(lián)得到的固定化細胞為粗酶，選擇性拆分D-泛解酸內(nèi)酯生產(chǎn)D-泛解酸。
本發(fā)明的產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的微生物，是在D-泛解酸內(nèi)酯和溴百里酚藍的篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生變色圈的絲狀真菌鐮孢霉屬Fusariu、赤霉屬Gibberella、曲霉屬Aspergill、青霉屬Penicillium、根霉屬Rhizopu、粘帚霉屬Gliocladium或短梗霉屬Aureobasidium的菌株及其突變株，其特征在于將該微生物應(yīng)用于拆分DL-泛解酸內(nèi)酯生產(chǎn)D-泛解酸。
本發(fā)明包括以下步驟(1)權(quán)利要求1所述的微生物的篩選及培養(yǎng)；(2)利用權(quán)利要求1所述的微生物對DL-泛解酸內(nèi)酯進行選擇性拆分；其中，初篩培養(yǎng)基組成為甘油0.5％～1％、蛋白胨0.5％～1％、酵母膏0.5％～1％、玉米漿0.5％～1％、pH值6.0～7.5、瓊脂1.5％～2.5％，并加入1％～3％ D-泛解酸內(nèi)酯和0.001％～0.01％的溴百里酚藍。溫度25～30℃，培養(yǎng)時間5～8天。挑取產(chǎn)生黃色變色圈大的菌珠，接種到馬鈴薯浸汁斜面培養(yǎng)。
復(fù)篩培養(yǎng)基組成為甘油1％～8％、蛋白胨0.5％～3％、酵母膏0.5％～3％、玉米漿0.2％～3％、pH值6.0～8.0、500mL三角瓶裝液量50～200-mL、搖瓶轉(zhuǎn)速100～200r/min、溫度25～35℃、培養(yǎng)時間2～7天，收集菌體測定其D-泛解酸內(nèi)酯酶粗酶活力。
微生物的培養(yǎng)是按常規(guī)的絲狀真菌培養(yǎng)方法進行發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)酶培養(yǎng)基為甘油0.1％～10％、蛋白胨0.1％～5％、酵母膏0.1％～5％、玉米漿0.1％～5％、pH值5.0～9.0，搖瓶發(fā)酵條件為20～35℃、100～200r/min、500mL三角瓶裝液量50～200mL、發(fā)酵培養(yǎng)2～7天，發(fā)酵液過濾得到粗酶液或濕菌體。
選擇性拆分方法如下將DL-泛解酸內(nèi)酯配制成10％～70％水溶液，加入10～50mmol/L CaCl2，用NaOH或HCl溶液調(diào)pH為7.0～7.5，作為酶催化反應(yīng)底物，在發(fā)酵液過濾得到的粗酶液或濕菌體或經(jīng)戊二醛交聯(lián)固定化的菌體中加入該底物溶液，加入的量為每100ml底物溶液加入0.1g～10g濕菌體，并控制pH為6.0～9.0，20～55℃，120～200r/min，反應(yīng)時間8～16小時。
所述的鐮孢霉屬Fusariu為串珠鐮孢、尖鐮孢、球莖狀鐮孢、尖孢鐮刀菌豌豆專化型、尖喙鑣草鐮孢、燕麥鐮孢、草燕麥鐮孢、鏈狀鐮刀菌、黃色鐮孢、大刀鐮孢、雙胞鐮孢、雙孢鐮刀菌、木賊鐮孢、禾本科鐮孢、禾谷鐮孢、磚紅鐮刀菌、節(jié)孢鐮刀菌木菠蘿變種、幼角鐮孢、雪腐鐮孢、早熟禾鐮孢、早熟鐮刀菌、多枝鐮孢、接骨木鐮孢、鑣草鐮孢、腐皮鐮孢、馬特腐皮鐮孢、茄病鐮刀菌嗜石油變種、球孢鐮刀菌、膠孢鐮孢、腹?fàn)铉犳摺⑽g脈鐮孢。
赤霉屬Gibberella為藤倉赤霉、小麥赤霉、玉蜀黍赤霉；曲霉屬Aspergill為黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、土曲霉；青霉屬Penicillium為產(chǎn)黃青霉；根霉屬Rhizopu為米根霉、華根霉、日本根霉；粘帚霉屬Gliocladium為鏈孢粘帚霉；短梗霉屬為Aureobasidium出芽短梗霉，具體包括以下之一鐮孢霉屬Fusarium串珠鐮孢Fusarium moniliforme AS3.296，AS3.349，AS3.0752，AS3.1526，AS3.2835(GIM3.64)，AS3.2879(GIM3.65)，AS3.2962，AS3.2974，AS3.2989，AS3.2992，AS3.3489，AS3.4269(GIM3.398)，AS3.4722，AS3.4723，AS3.4759，AF93314，ACCC30133，ACCC30174，ACCC30175，ACCC30217，ACCC30325，ACCC30331，ACCC30334，ACCC31034，SW05HFusarium moniliforme var.intermedium AS3.2966Fusarium moniliforme Sheldon AS3.752(GIM3.63)，AF 93271，AF 93241，AF93242尖鐮孢Fusarium oxysporum AS3.283，AS3.1785，AS3.1786，AS3.179，AS3.1793，AS3.1795，AS3.1796，AS3.1799，AS3.3633，AS3.3638，AS3.4743，AS3.2830(GIM3.392)球莖狀鐮孢Fusarium oxysporum AS 3.3633Fusarium oxysporum SchlechtendalAS3.1789 ()GIM3.390，AS3.731(GIM3.391)
尖孢鐮刀菌豌豆專化型ACCC31037尖喙鑣草鐮孢Fusarium acuminatum AS3.4277，AS3.4603Fusarium anthophilum AS3.4712，AS3.4742Fusarium annulatum AS3.4728燕麥鐮孢Fusarium avenaceum AS3.0709，AS3.1809，AS3.3628，AS3.4594草燕麥鐮孢Fusarium avenaceum var.herbarum AS3.3641Fusarium avenaceum subsp.herbarum〖WT〗(Corda)SaccardoAF 93248Fusarium avenaceum(Corda ex Fries)Saccardo AF 93243鏈狀鐮刀菌Fusarium catenulatum AS3.4704Fusarium chlamydosporum AS3.3642黃色鐮孢Fusarium culmorum AS3.4734大刀鐮孢Fusarium culmorum AS3.4283，AS3.4595Fusarium dlaminii AS3.1768，A83.4737雙胞鐮孢Fusarium dimerum AS3.1831雙孢鐮刀菌Fusarium dimerum AS3.4596Fusarium dimerum Penz.AF 93237木賊鐮孢Fusarium equiseti AS3.1806，AS3.1812，AS3.1813，AS3.1815，AS3.1832，AS3.3658，AS3.4597Fusarium equiseti(Corda)Saccardo AF 93245，AF 93235Fusarium fujikuroi AS3.4716，AS3.4729禾本科鐮孢Fusarium graminearum AS3.349，AS3.3489，AS3.3631，AS3.4521，AS3.4522禾谷鐮孢Fusarium graminearum AS3.0712，AS3.4733，AS3.4598Fusarium graminearum Schw.AF 97003磚紅鐮刀菌Fusarium lateritium AS3.4599節(jié)孢鐮刀菌木菠蘿變種Fusarium merismoides var.artocarpum AS3.4491Fusarium napiforme AS3.4735幼角鐮孢Fusarium neoceras AS3.1818，AS3.1819，AS3.4736Fusarium neoceras Wollenw et Reink AF 93236
雪腐鐮刀菌Fusarium nivale AS3.46雪腐鐮孢Fusarium nivale AS3.1852Fusarium nygamai AS3.0713，AS3.4732Fusarium oxysporum Schlechtendal AF 93327Fusarium oxysporum Schlechtendal AF 93247早熟禾鐮孢Fusarium poae AS3.3805早熟鐮刀菌Fusarium poae AS3.4601Fusarium proliferatum AS3.471，AS3.1777，AS3.4709，AS3.4724Fusarium proliferatum var.minus AS3.4726Fusarium proliferatum var.proliferatum AS3.474，AS3.3635，AS3.4738，AS3.4739，AS3.4741，F(xiàn)usarium redolens AS3.2626多枝鐮孢Fusarium reticulatum AS3.0708，AS3.0721Fusarium roseum Link AF 93274接骨木鐮孢Fusarium sambucinum AS3.1837，AS3.1844，AS3.1846，AS3.4602Fusarium sacchari var.elongatum AS3.4727Fusarium sambucinum Fuckel AF 93238，AF 93337Fusarium semitectum AS3.0719鑣草鐮孢Fusarium scirpi AS3.3656腐皮鐮孢Fusarium solani AS3.183，AS3.584，AS3.1791，AS3.1828，AS3.2189，AS3.2889，AS3.4604馬特腐皮鐮孢Fusarium solani var.martii AS3.3639茄病鐮刀菌嗜石油變種Fusarium solani var.petroliphilum AS3.4489Fusarium solani(Martius)Appel et Wollenweber AF 93239，AF 93250，AF93249球孢鐮刀菌Fusarium sphaerosporum AS3.4488膠孢鐮孢Fusarium subglutinans AS3.473，AS3.4711，AS3.4725Fusarium tricinctum AS3.4731Fusarium tricinctum(Corda)Sacc.AF 93240
腹?fàn)铉犳逨usarium ventricosum AS3.4610蝕脈鐮孢Fusarium vasinfectum AS3.1854，AS3.4305赤霉屬Gibberella藤倉赤霉Gibberella fujikuroi AS3.1756，AS3.1763，AS3.1764，AS3.1765，AS3.1775，AS3.4663，AF 93164藤倉赤霉串珠變種Gibberella fujikuroi var.moniliforme AS3.4714，AS3.4715，AS3.4746，AS3.4747藤倉赤霉藤倉變種Gibberella fujikuroi var.fujikuroi AS3.4748，AS3.4749藤倉赤霉間型變種Gibberella fujikuroi var.intermedia AS3.4717，AS3.4718，AS3.4719，AS3.4750藤倉赤霉膠孢變種Gibberella fujikuroi var.subglutinans AS3.4744，AS3.4745Gibberella fujikuroi(Saw.)Wollenw.AF 9201，AF 92016小麥赤霉Gibberella saubinetii AS3.4267，AS3.4288玉蜀黍赤霉Gibberella zeae AS3.2873，ACCC31053，ACCC31054，ACCC31055，ACCC31056，ACCC31057，ACCC31058，ACCC31059，ACCC31060曲霉屬Aspergillus黑曲霉Aspergillus niger JIMS3013，JIM3024，SW SW33，SW13-1，SW Zzq-19米曲霉Aspergillus oryzae JIM3008，JIM3009，SIM 206泡盛曲霉Aspergillus awamori AS3.0078，AS3.0079，AS3.0324，AS3.0327，AS3.0344土曲霉Aspergillus terrus SW 3.19土曲霉Aspergillus terrus SW 3.20青霉屬Penicillium產(chǎn)黃青霉Penicillium chrysogenum AF 93097，AF 93073，AF93098根霉屬Rhizopus米根霉Rhizopus oryzae AF 93277，AF 93156，GIM3.207，GIM3.208，JIM 3054華根霉Rhizopus chinesis AS3.0817，AS3.0947，AS3.0948日本根霉Rhizopus japonesis AS3.0237，AS3.0820，AS3.0821，JIM 3053
黑根霉Rhizopus niger AS3.0031，AS3.0038，AS3.0039粘帚霉屬Gliocladium鏈孢粘帚霉Gliocladium catenulatum AS3.3655短梗霉屬Aureobasidium出芽短梗霉Aureobasidium pullulans CGMCC 1244本發(fā)明詳細的過程如下1、產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯酶的菌種篩選產(chǎn)D～泛解酸內(nèi)酯水解酶的微生物菌株主要有鐮孢霉屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)、粘帚霉屬(Gliocladium)以及短梗霉屬(Aureobasidium)等屬的相關(guān)絲狀真菌。收集各種絲狀真菌進行篩選，特別是將選擇性高，產(chǎn)品光學(xué)純度高的鐮孢霉菌屬、赤霉菌屬的各種菌株接種到馬鈴薯浸汁斜面培養(yǎng)基，其配方為10％～20％馬鈴薯浸汁、葡萄糖1％～2％、瓊脂1.5％～2.5％、pH自然、28℃、培養(yǎng)時間4～5天。
從生長好的斜面上挑取一小塊菌體，在有玻璃小珠的無菌三角瓶中，用無菌水制成孢子懸液，稀釋至每毫升約10-4～10-6個孢子，涂布于初篩平板培養(yǎng)基上，進行產(chǎn)酶菌株的初篩。初篩培養(yǎng)基組成為甘油0.5％～1％、蛋白胨0.5％～1％、酵母膏0.5％～1％、玉米漿0.5％～1％、pH值6.0～7.5、瓊脂1.5％～2.5％，并加入1％～3％D-泛解酸內(nèi)酯和0.001％～0.01％的溴百里酚藍。溫度25～30℃，培養(yǎng)時間5～8天。挑取產(chǎn)生黃色變色圈大的菌珠，接種到馬鈴薯浸汁斜面培養(yǎng)。
將在斜面上生長好的菌體轉(zhuǎn)接到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，進行產(chǎn)酶菌株的復(fù)篩。產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為甘油1％～8％、蛋白胨0.5％～3％、酵母膏0.5％～3％、玉米漿0.2％～3％、pH值6.0～8.0、500mL三角瓶裝液量50～200-mL、搖瓶轉(zhuǎn)速100～200r/min、控制溫度25～35℃、培養(yǎng)2～7d后收集菌體，測定其D-泛解酸內(nèi)酯酶粗酶活力。
酶活力單位的測定與定義取10mL發(fā)酵液，濾出菌絲體，與酶反應(yīng)底物(2.5mL 2％泛解酸內(nèi)酯溶液和2.5mL含50mol CaCl2的pH7.5、0.2mol/L Tris(三羥甲基氨基甲烷)-HCl緩沖液)混合，在28℃搖床150r/min反應(yīng)30分鐘，抽濾除去菌體，用HPLC分析測定D-泛解酸。在上述條件下，每分鐘水解D-泛解酸內(nèi)酯生成1μmol D-泛解酸的酶量定義為1個酶活力單位(U)。
D-泛解酸的HPLC測定色譜柱型ZORBAX SB C18 5μM 250×4.6mm，流動相為乙腈0.02mol/L KH2PO4＝1∶9，用HCl調(diào)pH為3，流速1mL/min，紫外檢測波長215nm，溫度25℃。
D-泛解酸內(nèi)酯水解生成D-泛解酸后，其旋光發(fā)生了反轉(zhuǎn)，由D-(-)-泛解酸內(nèi)酯的左旋轉(zhuǎn)變?yōu)镈-(+)-泛解酸的右旋。酶水解液中剩下未反應(yīng)的L-(+)-泛解酸內(nèi)酯也是右旋的，因此酶水解反應(yīng)液應(yīng)是富右旋的。酶的水解效果越好，酶水解液旋光值越高，呈右旋。測定酶反應(yīng)濾清液中的旋光大小，以表示酶水解反應(yīng)程度。具體方法可參見專著《生物催化工藝學(xué)》(孫志浩主編，化工出版社，2004年)2，產(chǎn)酶培養(yǎng)對上述篩選所得到的黃色變色圈大的各種絲狀真菌菌株，特別是其中復(fù)篩得到的選擇性高，產(chǎn)物光學(xué)純度高的各種菌株，如串珠鐮孢Fusarium moniliformeAS3.3489，F(xiàn).moniliforme AS3.349，尖鐮孢F.oxysporum AS3.1785，F(xiàn).oxysporum AS3.1786，雙胞鐮孢F.dimerum AS3.1831，藤倉赤霉Gibberellafujikuroi AS3.4663，G.fujikuroi AS3.1756，藤倉赤霉串珠變種G.fujikuroivar.moniliformis AS3.4746，藤倉赤霉藤倉變種G.fujikuroi var.fujikuroiAS3.4748，玉蜀黍赤霉G.zeae ACCC31053，米曲霉Asp.oryzae SIM206，泡盛曲霉Asp.awamori，華根霉R.chinesis，米根霉R.oryzae GIM3.207，出芽短梗霉Aureobasidium pullulans CGMCC 1244等等菌株，進行產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)，其斜面培養(yǎng)方法同以上所述，用馬鈴薯浸汁斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)。上述菌株編號中，AS中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心編號；AF中國典培養(yǎng)物保藏中心編號；CGMCC中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存號；ACCC中國農(nóng)業(yè)菌種保藏中心菌種保藏編號；JIM江蘇省微生物研究所菌種保藏編號；GIM廣東省微生物研究所菌種保藏編號；SIM上海市工業(yè)微生物研究所菌種保藏編號；SW江南大學(xué)生物催化研究室菌種保藏編號。
產(chǎn)酶發(fā)酵條件為培養(yǎng)基組成甘油0.1％～10％、蛋白胨0.1％～5％、酵母膏0.1％～5％、玉米漿0.1％～5％、pH值5.0～9.0、500mL三角瓶裝液量50～200mL、搖瓶轉(zhuǎn)速100～200r/min、控制溫度25～35℃、培養(yǎng)2～7天。適合于產(chǎn)酶的碳源有葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、可溶性淀粉、豆油、油酸鈉、菜籽油、丙二醇、乙醇等，其中甘油為最佳碳源。適合于產(chǎn)酶的氮源有硝酸鈉、氯化銨、硫酸銨、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、豆餅粉、玉米漿、酪蛋白等，其中以酵母膏、蛋白胨、豆餅粉為較佳氮源。
3，微生物酶水解拆分將用常規(guī)方法合成的工業(yè)級DL-泛解酸內(nèi)酯溶解，配制成10％～70％水溶液，加入10～50mmol/L CaCl2，用NaOH或HCl溶液調(diào)pH為7.0～7.5，作為酶催化反應(yīng)底物。將發(fā)酵后的粗酶液、濕菌體或其用戊二醛交聯(lián)得到的固定化細胞作為酶源，粗酶液或固定化細胞(均以濕菌體計)與底物溶液的比例為每100ml底物液加入0.1g～10g濕菌體。控制反應(yīng)溫度20～55℃，其中25～35℃之間較為適宜?？刂品磻?yīng)pH6.0～9.0，其中pH7.0～8.0時最佳。酶反應(yīng)在較短的時間內(nèi)(例如10小時內(nèi))完成時，底物濃度以10％～20％為較適宜，酶水解率為20％～30％。酶反應(yīng)液中酶濃度越高，D-泛解酸的生成量就越多，即酶水解率越高，較適宜的酶濃度為5％～10％。
通過實驗，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)鐮孢霉屬Fusariu、赤霉屬Gibberella、曲霉屬Aspergill、青霉屬Penicillium、根霉屬Rhizopu、粘帚霉屬Gliocladium或短梗霉屬Aureobasidium的菌株及其突變株，對選擇性拆分DL-泛解酸內(nèi)酯生產(chǎn)D-泛解酸有效。
以下是說明本項發(fā)明的實施例，但本項發(fā)明決不僅限以下的實施例。
具體實施例方式
實施例1產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯酶的菌種的初篩針對96株鐮孢霉屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)、粘帚霉屬(Gliocladium)以及短梗霉屬(Aureobasidium)等屬的絲狀真菌菌株進行初篩。
配制含甘油1％、蛋白胨0.5％、酵母膏0.5％、玉米漿0.5％、pH值7.0、瓊脂1.5％的培養(yǎng)基，滅菌后冷卻到50℃，加入1.5％ D-泛解酸內(nèi)酯和0.01％的溴百里酚藍，混勻到平板。收集各種絲狀真菌進行篩選，涂布于平板上，在25～30℃培養(yǎng)5～8天。觀察菌落周圍的變色圈，明顯產(chǎn)黃色變色圈的微生物菌株如表1，主要有鐮孢霉屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)、粘帚霉屬(Gliocladium)以及短梗霉屬(Aureobasidium)等屬的絲狀真菌菌株，具體黃色變色圈大的有串珠鐮孢F.moniliforme AS3.349、AS 3.2835，AS 3.2989、AS3.3489，SW05H、尖鐮孢F.oxysporum AS3.1785、AS3.1786、AS 3.2830，AS 3.4743、球莖狀鐮Fusarium oxysporum AS 3.3633、Fusarium anthophilum AS 3.4712、雙胞鐮孢F.dimerum AS3.1831、Fusarium napiforme AS 3.4735、幼角鐮孢Fusariumneoceras AS 3.1818、Fusarium neoceras AS 3.4736、雪腐鐮孢FusariumnivaleAS 3.1852、Fusarium nygamai AS 3.713、腐皮鐮孢菌Fusariu msolaniAS 3.2889、Fusarium proliferatum var.minus AS 3.4726、Fusariumproliferatum var.proliferatum AS 3.4738、Fusarium redolens AS 3.2626、鑣草鐮孢Fusarium scirpi AS 3.3656、馬特腐皮鐮孢Fusarium solani var.martii AS 3.3639、茄病鐮刀菌嗜石油變種Fusarium solani var.petroliphilumAS 3.4489、蝕脈鐮孢Fusarium vasinfectum AS 3.1854、AS 3.4305、腹?fàn)铉犳逨usarium ventricosum AS 3.4610、藤倉赤霉G.fujikuroi AS 3.1756、AS3.4663、藤倉赤霉藤倉變種Gibberella fujikuroi var.fujikuroi AS3.4748、藤倉赤霉串珠變種Gibberella fujikuroi var.moniliformis3.4746、藤倉赤霉膠孢變種Gibberella fujikuroi var.subglutinans AS3.4744、玉蜀黍赤霉G.zeae ACCC31053等菌株。另外產(chǎn)黃色變色圈的微生物菌株還有泡盛曲霉Asp.awamori AS3.0078、黑曲霉Asp.nigerSW33、SW13-1、米曲霉Asp.oryzae SIM206、產(chǎn)黃青霉P.chrysogenum AF 93097、米根霉R.oryzae GIM3.207，華根霉R.chinesis AS3.0817、日本根霉R.japonesis JIM 3053、鏈孢粘帚霉Gliocladium catenulatum AS33655，出芽短梗霉Aureobasidium pullulansCGMCC 1244等菌株。
表1初篩平板呈變色圈的菌株




注++表示變色圈大；+表示有變色圈；-表示無變色圈實施例2產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯酶的菌種的復(fù)篩將有變色反應(yīng)且黃色變色圈大的上述鐮孢霉屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)、粘帚霉屬(Gliocladium)以及短梗霉屬(Aureobasidium)等屬的菌株，接種到以下組分的滅菌產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中甘油2％、蛋白胨1％、酵母膏0.5％、玉米漿0.2％、pH值6.5、三角瓶裝液量100mL/500mL、搖瓶轉(zhuǎn)速120r/min、控制溫度28℃、培養(yǎng)5d后抽濾，收集濕菌絲體。取1g濕菌絲體，置于500ml三角瓶中，加入反應(yīng)底物50ml A液和50ml B液(A液20％DL-泛解酸內(nèi)酯溶液，B液1mol/L Tris-HCl緩沖液，pH為7.5)。30℃搖床150r/min條件下反應(yīng)60分鐘，濾除菌絲體，測定水解液旋光值，結(jié)果見表2。
表2產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯酶菌種的酶水解試驗



實施例3～20微生物的培養(yǎng)及選擇性酶水解拆分配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基為甘油2％、蛋白胨1％、酵母膏0.5％、玉米漿0.2％、pH值6.5、分裝于三角瓶裝液量100mL/500mL中，用滅菌鍋熱滅菌20分鐘，溫度為121℃。將表1、表2中列出的濕菌體變色圈大、旋光值高的菌株串珠鐮孢F.moniliformeAS3.349、F.moniliforme AS3.3489、F.moniliforme SW-05H、尖鐮孢F.oxysporumAS3.1785、F.oxysporum AS3.1786、F.oxysporum AF93327、雙胞鐮孢F.dimerumAS 3.1831、F.dimerum Penz.AF 93237、F.nygamai AS 3.713、F.proliferatumvar.minusAS 3.4726、F.proliferatum var.proliferatumAS 3.4738、F.redolensAS 3.2626、茄病鐮刀菌嗜石油變種F.solani var.petroliphilumAS3.4489、藤倉赤霉G.fujikuroi AS3.1756、G.fujikuroi AS3.4663、藤倉赤霉串珠變種G.fujikuroi var.moniliformis AS3.4746、藤倉赤霉藤倉變種G.fujikuroi var.fujikuroi AS3.4748等菌株，分別接種到培養(yǎng)基中，在28℃搖瓶培養(yǎng)5天。培養(yǎng)結(jié)束后過濾收集菌體。配制含0.05mol/L CaCl2、pH為7.0的10％DL-泛解酸內(nèi)酯溶液，在100ml DL-泛解酸內(nèi)酯溶液中加入4g濕菌體進行水解反應(yīng)，控制溫度30℃、攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，氨水自動流加調(diào)節(jié)pH7.0，水解10小時后測定水解率和產(chǎn)物光學(xué)純度(對映體過量值％e.e.)，結(jié)果見表3。
表3產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯酶菌種的選擇性酶水解試驗


實施例21～35為了考察產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯酶穩(wěn)定性，按實施例3～20的方法，對以下菌株進行DL-泛解酸內(nèi)酯的選擇性拆分之游離細胞酶反復(fù)分批酶水解試驗，水解10小時后測定水解率，并過濾收集菌體，過濾的菌體再用于水解反應(yīng)，反復(fù)3次。試驗結(jié)果如表4。
選擇的菌株為串珠鐮孢F.moniliforme AS3.349、F.moniliforme AF93271、F.moniliforme SW-05H、尖鐮孢F.oxysporum AS3.1785、F.oxysporumAS3.1786、F.oxysporum AF93327、雙胞鐮孢F.dimerum AS 3.1831、F.dimerumPenz.AF 93237、F.proliferatum var.proliferatumAS 3.4738、茄病鐮刀菌嗜石油變種F.solani var.petroliphilumAS 3.4489、藤倉赤霉G.fujikuroiAS3.1756、G.fujikuroi AS3.4663、藤倉赤霉串珠變種G.fujikuroi var.moniliformis AS3.4746、藤倉赤霉藤倉變種G.fujikuroi var.fujikuroiAS3.4748等菌株。
表4產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯酶菌種的游離細胞反復(fù)分批酶水解試驗


實施例36～42為了進一步考察產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯酶穩(wěn)定性，對部分菌株進行固定化細胞反復(fù)分批酶水解試驗。
稱取按實例1培養(yǎng)的F.moniliforme AS3.349、SW05H、AS3.4738、AS3.4489、F.oxysporum AF93327、G.fujikuroi AS3.1756菌絲體，用去離子水配制成菌懸液，加入一定量的戊二醛溶液，用機械攪拌器攪拌均勻后于室溫下靜置2小時，抽濾，用去離子水充分洗滌，去除未作用的戊二醛，得到交聯(lián)固定化細胞。將上述不同菌株的交聯(lián)固定化細胞，用于反復(fù)分批水解拆分，反復(fù)3次，結(jié)果如表5。
表5產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯酶菌種的固定化細胞反復(fù)分批酶水解試驗

通過以上實施例得出結(jié)論所選的鐮孢霉屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)、粘帚霉屬(Gliocladium)以及短梗霉屬(Aureobasidium)等屬菌株及其突變株，對生產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯均有效，無論是其光學(xué)純度，還是選擇性水解率，乃至游離細胞、固定化細胞反復(fù)水解試驗也得出較好的結(jié)果。因此這些菌株可用于選擇性拆分DL-泛解酸內(nèi)酯，進而生產(chǎn)D-泛酸鈣。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的微生物，該微生物是在D-泛解酸內(nèi)酯和溴百里酚藍的篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生變色圈的絲狀真菌鐮孢霉屬Fusariu、赤霉屬Gibberella、曲霉屬Aspergill、青霉屬Penicillium、根霉屬Rhizopu、粘帚霉屬Gliocladium或短梗霉屬Aureobasidium的菌株及其突變株，其特征在于將該微生物應(yīng)用于微生物拆分DL-泛解酸內(nèi)酯生產(chǎn)D-泛解酸。
2.微生物拆分DL-泛解酸內(nèi)酯生產(chǎn)D-泛解酸的方法，包括以下步驟(1)權(quán)利要求1所述的微生物的培養(yǎng)；(2)利用權(quán)利要求1所述的微生物對DL-泛解酸內(nèi)酯進行選擇性拆分；其中微生物的培養(yǎng)是按常規(guī)的絲狀真菌培養(yǎng)方法進行發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)酶培養(yǎng)基為甘油0.1％～10％、蛋白胨0.1％～5％、酵母膏0.1％～5％、玉米漿0.1％～5％、pH值5.0～9.0，搖瓶發(fā)酵條件為20～35℃、100～200r/min、500mL三角瓶裝液量50～200mL、發(fā)酵培養(yǎng)2～7天，發(fā)酵液過濾得到粗酶液或濕菌體；選擇性拆分將DL-泛解酸內(nèi)酯配制成10％～70％水溶液，加入10～50mmol/LCaCl2，用NaOH或HCl溶液調(diào)pH為7.0～7.5，作為酶催化反應(yīng)底物，在發(fā)酵液過濾得到的粗酶液或濕菌體或經(jīng)戊二醛交聯(lián)固定化的菌體中加入該底物溶液，加入的量為每100ml底物溶液加入0.1g～10g濕菌體，控制pH為6.0～9.0、溫度20～55℃、攪拌轉(zhuǎn)速120～200r/min、反應(yīng)時間為8～16小時。
3.如權(quán)利要求1所述的微生物，其特征在于所述的鐮孢霉屬Fusariu為串珠鐮孢、尖鐮孢、球莖狀鐮孢、尖孢鐮刀菌豌豆?；?、尖喙鑣草鐮孢、燕麥鐮孢、草燕麥鐮孢、鏈狀鐮刀菌、黃色鐮孢、大刀鐮孢、雙胞鐮孢、雙孢鐮刀菌、木賊鐮孢、禾本科鐮孢、禾谷鐮孢、磚紅鐮刀菌、節(jié)孢鐮刀菌木菠蘿變種、幼角鐮孢、雪腐鐮孢、早熟禾鐮孢、早熟鐮刀菌、多枝鐮孢、接骨木鐮孢、鑣草鐮孢、腐皮鐮孢、馬特腐皮鐮孢、茄病鐮刀菌嗜石油變種、球孢鐮刀菌、膠孢鐮孢、腹?fàn)铉犳呋蛭g脈鐮孢。
4.如權(quán)利要求1所述的微生物，其特征在于所述的赤霉屬Gibberella為藤倉赤霉、小麥赤霉、玉蜀黍赤霉。
5.如權(quán)利要求1所述的微生物，其特征在于所述的曲霉屬Aspergill為黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、土曲霉。
6.如權(quán)利要求1所述的微生物，其特征在于所述的青霉屬Penicillium為產(chǎn)黃青霉。
7.如權(quán)利要求1所述的微生物，其特征在于所述的根霉屬Rhizopu為米根霉、華根霉、日本根霉。
8.如權(quán)利要求1所述的微生物，其特征在于所述的粘帚霉屬Gliocladium為鏈孢粘帚霉。
9.如權(quán)利要求1所述的微生物，其特征在于所述的短梗霉屬為Aureobasidium出芽短梗霉。
10.如權(quán)利要求1所述的微生物，其特征在于所述的絲狀真菌是以下之一。鐮孢霉屬Fusarium串珠鐮孢Fusarium moniliforme AS3.296，AS3.349，AS3.0752，AS3.1526，AS3.2835(GIM3.64)，AS3.2879(GIM3.65)，AS3.2962，AS3.2974，AS3.2989，AS3.2992，AS3.3489，AS3.4269(GIM3.398)，AS3.4722，AS3.4723，AS3.4759，AF93314，ACCC30133，ACCC30174，ACCC30175，ACCC30217，ACCC30325，ACCC30331，ACCC30334，ACCC31034，SW05HFusarium moniliforme var.intermedium AS3.2966Fusarium moniliforme Sheldon AS3.752(GIM3.63)，AF 93271，AF 93241，AF93242尖鐮孢Fusarium oxysporum AS3.283，AS3.1785，AS3.1786，AS3.179，AS3.1793，AS3.1795，AS3.1796，AS3.1799，AS3.3633，AS3.3638，AS3.4743，AS3.2830(GIM3.392)球莖狀鐮孢Fusarium oxysporum AS 3.3633Fusarium oxysporum Schlechtendal AS3.1789 ()GIM3.390，AS3.731(GIM3.391)尖孢鐮刀菌豌豆?；虯CCC31037尖喙鑣草鐮孢Fusarium acuminatum AS3.4277，AS3.4603Fusarium anthophilum AS3.4712，AS3.4742Fusarium annulatum AS3.4728燕麥鐮孢Fusarium avenaceum AS3.0709，AS3.1809，AS3.3628，AS3.4594草燕麥鐮孢Fusarium avenaceum var.herbarum AS3.3641Fusarium avenaceum subsp.herbarum〖WT〗(Corda)SaccardoAF 93248Fusarium avenaceum(Corda ex Fries)Saccardo AF 93243鏈狀鐮刀菌Fusarium catenulatum AS3.4704Fusarium chlamydosporum AS3.3642黃色鐮孢Fusarium culmorum AS3.4734大刀鐮孢Fusarium culmorum AS3.4283，AS3.4595Fusarium dlaminii AS3.1768，AS3.4737雙胞鐮孢Fusarium dimerum AS3.1831雙孢鐮刀菌Fusarium dimerum AS3.4596Fusarium dimerum Penz.AF 93237木賊鐮孢Fusarium equiseti AS3.1806，AS3.1812，AS3.1813，AS3.1815，AS3.1832，AS3.3658，AS3.4597Fusarium equiseti(Corda)Saccardo AF 93245，AF 93235Fusarium fujikuroi AS3.4716，AS3.4729禾本科鐮孢Fusarium graminearum AS3.349，AS3.3489，AS3.3631，AS3.4521，AS3.4522禾谷鐮孢Fusarium graminearum AS3.0712，AS3.4733，AS3.4598Fusarium graminearum Schw.AF 97003磚紅鐮刀菌Fusarium lateritium AS3.4599節(jié)孢鐮刀菌木菠蘿變種Fusarium merismoides var.artocarpum AS3.4491Fusarium napiforme AS3.4735幼角鐮孢Fusarium neoceras AS3.1818，AS3.1819，AS3.4736Fusarium neoceras Wollenw et Reink AF 93236雪腐鐮刀菌Fusarium nivale AS3.46雪腐鐮孢Fusarium nivale AS3.1852Fusarium nygamai AS3.0713，AS3.4732Fusarium oxysporum Schlechtendal AF 93327Fusarium oxysporum Schlechtendal AF 93247早熟禾鐮孢Fusarium poae AS3.3805早熟鐮刀菌Fusarium poae AS3.4601Fusarium proliferatum AS3.471，AS3.1777，AS3.4709，AS3.4724Fusarium proliferatum var.minus AS3.4726Fusarium proliferatum var.proliferatum AS3.474，AS3.3635，AS3.4738，AS3.4739，AS3.4741，F(xiàn)usarium redolens AS3.2626多枝鐮孢Fusarium reticulatum AS3.0708，AS3.0721Fusarium roseum Link AF 93274接骨木鐮孢Fusarium sambucinum AS3.1837，AS3.1844，AS3.1846，AS3.4602Fusarium sacchari var.elongatum AS3.4727Fusarium sambucinum Fuckel AF 93238，AF 93337Fusarium semitectum AS3.0719鑣草鐮孢Fusarium scirpi AS3.3656腐皮鐮孢Fusarium solani AS3.183，AS3.584，AS3.1791，AS3.1828，AS3.2189，AS3.2889，AS3.4604馬特腐皮鐮孢Fusarium solani var.martii AS3.3639茄病鐮刀菌嗜石油變種Fusarium solani var.petroliphilum AS3.4489Fusarium solani(Martius)Appel et Wollenweber AF 93239，AF 93250，AF93249球孢鐮刀菌Fusarium sphaerosporum AS3.4488膠孢鐮孢Fusarium subglutinans AS3.473，AS3.4711，AS3.4725Fusarium tricinctum AS3.4731Fusarium tricinctum(Corda)Sacc.AF 93240腹?fàn)铉犳逨usarium ventricosum AS3.4610蝕脈鐮孢Fusarium vasinfectum AS3.1854，AS3.4305赤霉屬Gibberella藤倉赤霉Gibberella fujikuroi AS3.1756，AS3.1763，AS3.1764，AS3.1765，AS3.1775，AS3.4663，AF 93164藤倉赤霉串珠變種Gibberella fujikuroi var.moniliforme AS3.4714，AS3.4715，AS3.4746，AS3.4747藤倉赤霉藤倉變種Gibberella fujikuroi var.fujikuroi AS3.4748，AS3.4749藤倉赤霉間型變種Gibberella fujikuroi var.intermedia AS3.4717，AS3.4718，AS3.4719，AS3.4750藤倉赤霉膠孢變種Gibberella fujikuroi var.subglutinans AS3.4744，AS3.4745Gibberella fujikuroi(Saw.)Wollenw.AF 9201，AF 92016小麥赤霉Gibberella saubinetii AS3.4267，AS3.4288玉蜀黍赤霉Gibberella zeae AS3.2873，ACCC31053，ACCC31054，ACCC31055，ACCC31056，ACCC31057，ACCC31058，ACCC31059，ACCC31060曲霉屬Aspergillus黑曲霉Aspergillus niger JIMS3013，JIM3024，SW SW33，SW13-1，SW Zzq-19米曲霉Aspergillus oryzae JIM3008，JIM3009，SIM 206泡盛曲霉Aspergillus awamori AS3.0078，AS3.0079，AS3.0324，AS3.0327，AS3.0344土曲霉Aspergillus terrus SW 3.19土曲霉Aspergillus terrus SW 3.20青霉屬Penicillium產(chǎn)黃青霉Penicillium chrysogenum AF 93097，AF 93073，AF93098根霉屬Rhizopus米根霉Rhizopus oryzae AF 93277，AF 93156，GIM3.207，GIM3.208，JIM 3054華根霉Rhizopus chinesis AS3.0817，AS3.0947，AS3.0948日本根霉Rhizopus japonesis AS3.0237，AS3.0820，AS3.0821，JIM 3053粘帚霉屬Gliocladium鏈孢粘帚霉Gliocladium catenulatum AS3.3655短梗霉屬Aureobasidium出芽短梗霉Aureobasidium pullulans CGMCC 124全文摘要
本發(fā)明涉及微生物酶拆分DL－泛解酸內(nèi)酯生產(chǎn)D－泛解酸的方法。利用鐮孢霉屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)、粘帚霉屬(Gliocladium)以及短梗霉屬(Aureobasidium)等屬絲狀真菌的產(chǎn)D－泛解酸內(nèi)酯水解酶的菌株，發(fā)酵培養(yǎng)，以濕菌體為粗酶，以化學(xué)合成的DL－泛解酸內(nèi)酯為底物，進行選擇性水解DL－泛解酸內(nèi)酯中的D－泛解酸內(nèi)酯生成高光學(xué)活性的D－泛解酸。L－泛解酸內(nèi)酯可以回收，經(jīng)過消旋化反應(yīng)得到DL－泛解酸內(nèi)酯重新用于拆分。
文檔編號C12R1/77GK1793321SQ20051012356
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月22日
發(fā)明者孫志浩, 過鑫富 申請人:浙江杭州鑫富藥業(yè)股份有限公司, 江南大學(xué)