促進角膜內(nèi)皮細胞粘附的藥劑的制作方法
【專利摘要】提供的是能夠有效地生長角膜內(nèi)皮細胞的方法和穩(wěn)定地供應(yīng)角膜內(nèi)皮制劑的方法。促進角膜內(nèi)皮細胞的粘附的含有Rho激酶抑制劑的藥劑，含有Rho激酶抑制劑的用于角膜內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)介質(zhì)，用于保存角膜的含有Rho激酶抑制劑的溶液，以及生產(chǎn)角膜內(nèi)皮制劑的方法，該方法包括使用以上培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細胞的步驟。
【專利說明】促進角膜內(nèi)皮細胞粘附的藥劑
[0001]本申請是國際申請日為2008年8月28日、國際申請?zhí)枮镻CT/JP2008/065459、進入國家階段的申請?zhí)枮?00880112897.X、發(fā)明名稱為“促進角膜內(nèi)皮細胞粘附的藥劑”的PCT申請的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及促進角膜內(nèi)皮細胞粘附的藥劑(agent)，它用于角膜內(nèi)皮細胞的粘附、維護或保護。
【背景技術(shù)】
[0003]當(dāng)從角膜(在眼球的最前部的透明組織)進入的光線到達視網(wǎng)膜激發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞時，認識到視覺信息，并且所產(chǎn)生的電信號經(jīng)由視神經(jīng)被傳輸?shù)侥X視覺皮層。為了具有良好的視力，該角膜需要是透明的。當(dāng)利用角膜內(nèi)皮細胞的泵吸功能和阻隔功能將水含量保持在恒定水平時，維持角膜的透 明度。
[0004]人的角膜內(nèi)皮細胞的密度在出生時是約3000個細胞/1mm2。一旦損傷，該細胞喪失再生的能力。在由于各種原因引起的角膜內(nèi)皮的功能性障礙所造成的內(nèi)皮角膜營養(yǎng)不良和大皰角膜病中，角膜會發(fā)生水腫和變得不透明，并且該視力明顯下降。目前，大皰角膜病是通過其中角膜的上皮、主質(zhì)和內(nèi)皮的整個三層結(jié)構(gòu)被移植的穿透性角膜成形術(shù)來治療的。然而，角膜的捐獻在日本是不夠的，并且雖然有大約5500名的角膜移植術(shù)等待患者，但是每年在日本進行約2700例角膜移植。
[0005]近年來，僅僅移植損傷組織的“部分移植”的想法已經(jīng)引起人們的注意以減少排異反應(yīng)和手術(shù)后并發(fā)癥的風(fēng)險，因此獲得更好的視覺功能。在角膜移植中，已經(jīng)進行了僅僅移植角膜上皮的上皮移植，移植口腔粘膜而不是移植角膜上皮的已培養(yǎng)的口腔粘膜上皮移植，移植主質(zhì)組織的深層式板層角膜移植術(shù)等等。也考慮了僅僅移植角膜內(nèi)皮的方法。對于角膜內(nèi)皮的移植，由在膠原層培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮層組成的角膜內(nèi)皮狀片是已知的(參見專利文件I和2)。然而，至于角膜內(nèi)皮細胞，特別地從人衍生的那些，因為角膜捐獻者的數(shù)量是有限的并且離體培養(yǎng)是困難的，因此以移植所需的數(shù)量生產(chǎn)培養(yǎng)細胞需要花費時間和成本。
[0006]人胚胎莖(ES)細胞顯示出高自復(fù)制性和多潛能性，并且從藥物應(yīng)用方面引起人們的注意。然而，它具有急劇減少的細胞數(shù)的實際問題，因為在培養(yǎng)步驟中分散細胞的手術(shù)容易引起細胞死亡。最近已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人ES細胞的培養(yǎng)過程中發(fā)生的細胞死亡是由Rho激酶(ROCK)的活化所引起，并且ROCK的抑制顯著地抑制細胞死亡，和報道說，通過使用ROCK抑制劑如Y-27632等，人ES細胞的大量培養(yǎng)和腦細胞的產(chǎn)生能夠可行(非專利文件I)。
[0007]Rho激酶(ROCK)抑制劑已知具有各種作用。例如，專利文件3公開了 Rho激酶抑制劑促進角膜軸索形成并且Rho激酶抑制劑用作恢復(fù)角膜感知的藥劑。另外，專利文件4公開了 Rho激酶抑制劑對于視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細胞具有軸突長出促進作用，并且用于視覺功能紊亂的醫(yī)治。[0008]專利文件I JP-A-2004-24852
[0009]專利文件2 JP-A-2005-229869
[0010]專利文件3:W02005/118582
[0011]專利文件4:W02002/083175
[0012]非專利文獻I:Nat Biotechnol.2007，25，681

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明解決的問題
[0014]本發(fā)明的目的是提供能夠有效地粘附角膜內(nèi)皮細胞的方式和穩(wěn)定地供應(yīng)角膜內(nèi)皮制劑的方式。
[0015]解決問題的手段
[0016]鑒于上述問題，本發(fā)明人已經(jīng)進行了深入的研究并且發(fā)現(xiàn)角膜內(nèi)皮細胞在培養(yǎng)底物上的粘附能夠通過在Rho激酶抑制劑的存在下培養(yǎng)細胞而引人注目地得到促進，這導(dǎo)致了本發(fā)明的完成。因此，本發(fā)明提供下列這些。
[0017][I]促進角膜內(nèi)皮細胞的粘附的藥劑，它包括Rho激酶抑制劑。
[0018][2]上述[I]的藥劑，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡唳基氨基甲?；?環(huán)己燒，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪(homopiperazine)和其可藥用鹽中的至少一種。
[0019][3]上述[I]的藥劑，其中該角膜肉皮細胞源自于人。
[0020][4]上述[I]到[3]中任何一項的藥劑，它是用于角膜內(nèi)皮功能紊亂的預(yù)防或治療的制劑。
[0021][5]上述[4]的藥劑,它是前房內(nèi)(intracameral)注射或眼內(nèi)灌注流體的形式。
[0022][6]角膜內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)介質(zhì)，它包括Rho激酶抑制劑。
[0023][7]上述[6]的培養(yǎng)介質(zhì)，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)-反式_4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺酰基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0024][8]上述[6]的培養(yǎng)介質(zhì)，其中該角膜內(nèi)皮細胞源自于人。
[0025][9]角膜保存溶液，它包括Rho激酶抑制劑。
[0026][10]上述[9]的保存溶液，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0027][11]上述[9]的保存溶液，其中該角膜源自于人。
[0028][12]生產(chǎn)角膜內(nèi)皮制劑的方法，它包括使用上述[6]到[8]中任何一項的培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細胞的步驟。
[0029][13]上述[12]的方法，其中角膜內(nèi)皮細胞源自于人。
[0030] [14]Rho激酶抑制劑用于生產(chǎn)促進角膜內(nèi)皮細胞的粘附的藥劑的用途。
[0031][15]上述[14]的用途，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。[0032] [16]上述[14]的用途，其中角膜內(nèi)皮細胞源自于人。
[0033][17]上述[14]到[16]中任何一項的用途，其中促進角膜內(nèi)皮細胞的粘附的藥劑是用于角膜內(nèi)皮功能紊亂的預(yù)防或治療的制劑。
[0034][18]上述[17]的用途，其中促進角膜內(nèi)皮細胞的粘附的藥劑是前房內(nèi)注射或眼內(nèi)灌注流體的形式。
[0035][19]Rho激酶抑制劑用于生產(chǎn)角膜內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)介質(zhì)的用途。
[0036][20]上述[19]的用途，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0037][21]上述[19]的用途，其中角膜內(nèi)皮細胞源自于人。
[0038][22]Rho激酶抑制劑用于生產(chǎn)角膜保存溶液的用途。
[0039][23]上述[22]的用途，其中該Rho激酶抑制劑是選自(十)_反式_4_ (1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0040][24]上述[22]的用途，其中角膜源自于人。
[0041][25]促進角膜內(nèi)皮細胞的粘附的方法，它包括讓有效量的Rho激酶抑制劑與需要促進角膜內(nèi)皮細胞的粘附的靶或角膜內(nèi)皮細胞進行接觸。
[0042][26]上述[25]的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式_4_(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺酰基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0043][27]上述[25]的方法，其中角膜內(nèi)皮細胞源自于人。
[0044][28]上述[25]的方法，它為了防止或治療角膜內(nèi)皮功能紊亂。
[0045][29]上述[25]的方法，包括施用有效量的前房內(nèi)注射或眼內(nèi)灌注流體形式的Rho激酶抑制劑。
[0046][30]培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細胞的方法，它包括使用包括Rho激酶抑制劑的培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細胞的步驟。
[0047][31]上述[30]的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0048][32]上述[30]的方法，其中角膜內(nèi)皮細胞源自于人。
[0049][33]保護角膜的方法，它包括在包括Rho激酶抑制劑的角膜保護溶液中保留角膜移植物或角膜內(nèi)皮細胞的步驟。
[0050][34]上述[33]的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式_4_(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲酰基)環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺酰基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0051][35]上述[33]的方法，其中角膜源自于人。
[0052][36]生產(chǎn)角膜內(nèi)皮制劑的方法，它包括使用包括Rho激酶抑制劑的培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細胞的步驟。
[0053][37]上述[36]的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式_4_(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺酰基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
[0054][38]上述[36]的方法，其中角膜內(nèi)皮細胞源自于人。
[0055][39]治療大皰角膜病,角膜水腫或角膜白斑的方法,包括
[0056]使用包含Rho激酶抑制劑的培養(yǎng)介質(zhì)來培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細胞的步驟，和
[0057]將在上述培養(yǎng)步驟中獲得的角膜內(nèi)皮制劑移植到需要角膜內(nèi)皮移植的患者中的步驟。
[0058][40]上述[39]的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式_4_(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。[0059][41]上述[39]的方法，其中角膜內(nèi)皮細胞源自于人。
[0060]本發(fā)明的效果
[0061]促進本發(fā)明的角膜內(nèi)皮細胞的粘附的藥劑含有Rho激酶抑制劑作為活性成分。促進本發(fā)明的角膜內(nèi)皮細胞的粘附的藥劑促進角膜內(nèi)皮細胞的粘附和使得形成具有良好細胞形態(tài)和高細胞密度的角膜內(nèi)皮細胞層。因此，它可用作伴有角膜內(nèi)皮功能紊亂的疾病如大皰角膜病和角膜內(nèi)皮炎的治療劑或預(yù)防劑。本發(fā)明的促進角膜內(nèi)皮細胞的粘附的藥劑可用作在伴有角膜內(nèi)皮功能紊亂的疾病的治療或預(yù)防中保護角膜內(nèi)皮的藥劑。此外，本發(fā)明的促進角膜內(nèi)皮細胞的粘附的藥劑可用作在與眼內(nèi)手術(shù)如白內(nèi)障手術(shù)、玻璃體手術(shù)等等相關(guān)的角膜內(nèi)皮功能紊亂，由增大的眼內(nèi)壓引起的角膜內(nèi)皮功能紊亂(特別地青光眼侵襲)，或由接觸透鏡引起的不充足的氧氣所引起的角膜內(nèi)皮功能紊亂的治療或預(yù)防中保護角膜內(nèi)皮的藥劑。因為本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)或角膜保存溶液含有Rho激酶抑制劑，所以角膜內(nèi)皮細胞能夠很好地培養(yǎng)、維持或保存，并確保了角膜內(nèi)皮制劑的穩(wěn)定的供應(yīng)、維持或保存。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0062]圖1是兔子角膜內(nèi)皮細胞的原始培養(yǎng)物的相差顯微照片(在培養(yǎng)起始后的24小時之后，放大倍數(shù):100倍)。
[0063]圖2是顯示了由MTS分析法測試的兔子角膜內(nèi)皮細胞的原始培養(yǎng)物的生長的圖，其中縱軸顯示在第一天相對于Rock抑制劑(-)組的吸收率的值。
[0064]圖3是顯示了在培養(yǎng)起始后的24小時之后兔子角膜內(nèi)皮細胞的原始培養(yǎng)物的粘附的圖，其中該縱軸顯示了在培養(yǎng)起始后的24小時之后相對于Rock抑制劑(-)組的吸收率的值。
[0065]圖4是在培養(yǎng)起始后的第3天猴子角膜內(nèi)皮細胞的原始培養(yǎng)物的相差顯微照片，其中放大倍數(shù)是100倍。
[0066]圖5是人角膜內(nèi)皮細胞的原始培養(yǎng)物的相差顯微照片(第7天，放大倍數(shù):100倍)。
[0067]圖6顯示了猴子角膜肉皮細胞的原始培養(yǎng)物的照片(A =ROCK抑制劑㈠，B =ROCK抑制劑(十)，放大倍數(shù):20倍)和圖(C)顯示培養(yǎng)的細胞的總面積。
[0068]圖7是顯示了猴子角膜內(nèi)皮細胞的原始培養(yǎng)物的活細胞數(shù)的圖。
[0069]圖8是顯示Y-27632對于猴子角膜內(nèi)皮細胞的傳代培養(yǎng)物的影響的圖。[0070]圖9是顯示了在猴子角膜內(nèi)皮細胞的傳代培養(yǎng)過程中Y-27632對于細胞形態(tài)的影響的相差顯微照片(放大倍數(shù):100倍)。
[0071]圖10是顯示了在猴子角膜內(nèi)皮細胞的傳代培養(yǎng)過程中Y-27632對于細胞形態(tài)的影響的相差顯微照片(毒傘素?zé)晒馊旧?，放大倍?shù):200倍)。
[0072]圖11是顯示了 Y-27632對于猴子角膜內(nèi)皮細胞的細胞周期的影響的顯微照片(抗_Ki67抗體染色，放大倍數(shù):200倍)。
[0073]圖12顯示了考察Y-27632對于猴子角膜內(nèi)皮細胞的細胞周期的影響的流式細胞光度術(shù)的結(jié)果。圖12A顯示ROCK抑制劑(-)組的傳代培養(yǎng)的第I天，B顯示ROCK抑制劑(-)組的傳代培養(yǎng)的第2天，C顯示ROCK抑制劑⑴組的傳代培養(yǎng)的第I天，和D顯示ROCK抑制劑⑴組的傳代培養(yǎng)的第2天。
[0074]圖13是通過抗_Ki67抗體陽性細胞比率顯示了圖12的流式細胞光度術(shù)的結(jié)果的圖。
[0075]圖14是顯示Y-27632對于猴子角膜內(nèi)皮細胞的凋亡的影響的圖。
[0076]圖15是由死細胞的數(shù)量顯示Y-27632對于猴子角膜內(nèi)皮細胞的凋亡的影響的圖。
[0077]圖16是顯示Y-27632對于培養(yǎng)的猴子角膜內(nèi)皮細胞的密度的影響的圖。
[0078]圖17是顯示了在傳代培養(yǎng)后的24小時之后所培養(yǎng)的猴子角膜內(nèi)皮細胞的粘附的圖，其中該縱軸顯示了在傳代培養(yǎng)起始后的24小時之后相對于對照組的熒光度而言的fasudil組的值。
【具體實施方式】
[0079]本發(fā)明的促進角膜內(nèi)皮細胞的粘附的藥劑(以下有時簡寫為“本發(fā)明的粘附促進劑”)含有Rho激酶抑制劑作為活性成分。
[0080]在本發(fā)明中，Rho激酶指與Rho的活化一起活化的絲氨酸/蘇氨酸激酶。例子包括 ROKa (R0CKI1:Leung，T.et al.，J.Biol.Chem.，270，29051-29054，1995)，P160R0CK(ROK^，ROCK-1:Ishizaki, T.et al.，TheEMBO J.，15(8)，1885-1893，1996)和具
有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的其它蛋白質(zhì)。
[0081]在本發(fā)明中，一種類型的Rho激酶抑制劑可以單獨被含有，或幾種類型可以根據(jù)需要而相結(jié)合被含有。
[0082]Rho激酶抑制劑的例子包括公開在下面文獻中的化合物:
[0083]US4678783, Patent34212 17，W099/20620, W099/61403, W002/076976,W002/076977, W002/100833, W003/059913, W003/062227, W02004/009555, W02004/022541,W02004/108724, W02005/003101, W02005/039564, W02005/034866, W02005/037197,W02005/037198, W02005/035501, W02005/035503, W02005/035506, W02005/080394,W02005/103050,W02006/057270,ff02007/026664等等。此類化合物能夠根據(jù)在所公開的每一篇文獻中描述的方法來生產(chǎn)。特定的例子包括1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪(fasudil)，(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷(Y-27632)等等。作為這些化合物，可優(yōu)選使用商購的產(chǎn)品。
[0084]這些當(dāng)中，(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪和其可藥用鹽是優(yōu)選使用的，因為它們在角膜內(nèi)皮細胞的粘附的促進上是特別優(yōu)異的。作為化合物的鹽，藥物學(xué)上可接受的酸加合鹽是優(yōu)選的。該酸的例子包括無機酸，如鹽酸，氫溴酸，硫酸等等，有機酸，如甲磺酸，富馬酸，馬來酸，苦杏仁酸，檸檬酸，酒石酸，水楊酸等等。更優(yōu)選的是(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷2鹽酸鹽和1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪鹽酸鹽。
[0085]在本發(fā)明中，“角膜內(nèi)皮細胞的粘附的促進”的例子包括在角膜內(nèi)皮細胞之間的粘附的促進和角膜內(nèi)皮細胞對培養(yǎng)底物的粘附的促進兩者。
[0086]本發(fā)明的粘附促進劑提供對于從哺乳動物(例如人，小鼠，大鼠，倉鼠，兔子，貓，狗，牛，綿羊，猴子等等)的角膜組織中所分離的角膜內(nèi)皮細胞或?qū)τ趶钠浞蛛x的并且傳代(passaged)的角膜內(nèi)皮細胞的粘附促進作用。因為本發(fā)明的粘附促進劑在來源于人的角膜內(nèi)皮細胞的粘附促進作用上是優(yōu)異的，來源于人的角膜內(nèi)皮細胞被認為特別難以培養(yǎng)和傳代(passage),人來源的角膜內(nèi)皮細胞是優(yōu)選的革巴。
[0087]角膜內(nèi)皮細胞在維持角膜的透明度上起著作用。當(dāng)內(nèi)皮細胞的密度在某個范圍下降時，該角膜產(chǎn)生溶脹并且變得無法維持透明度，據(jù)此產(chǎn)生了角膜內(nèi)皮功能紊亂。本發(fā)明的粘附促進劑促進角膜內(nèi)皮細胞的粘附，使得具有良好細胞形態(tài)和高細胞密度的角膜內(nèi)皮細胞層能夠形成，并且進一步顯示出對角膜內(nèi)皮細胞的凋亡抑制作用。因此，它可用作伴有角膜內(nèi)皮功能紊亂的疾病如大皰角膜病和角膜內(nèi)皮炎的治療劑或預(yù)防劑。另外，本發(fā)明的粘附促進劑可用作與眼內(nèi)手術(shù)如白內(nèi)障手術(shù)、玻璃體手術(shù)等等相關(guān)的角膜內(nèi)皮功能紊亂，由增大的眼內(nèi)壓引起的角膜內(nèi)皮功能紊亂(特別地青光眼侵襲)，或由因為接觸透鏡導(dǎo)致的不充足的氧氣所引起的角膜內(nèi)皮功能紊亂的治療劑或預(yù)防劑。
[0088]盡管本發(fā)明的粘附促進劑沒有特別限制，只要它具有適合于局部給藥于眼睛的劑型就行，但是它優(yōu)選以前房內(nèi)注射或眼內(nèi)灌注流體形式配制。它們能夠通過在本領(lǐng)域中廣泛使用的普通方法來制備。當(dāng)它以前房內(nèi)注射或眼內(nèi)灌注流體形式被局部施用于眼睛時，Rho激酶抑制劑和角膜內(nèi)皮細胞在身體內(nèi)接觸，并且促進角膜內(nèi)皮細胞的粘附。
[0089]例如，當(dāng)本發(fā)明的粘附促進劑用作前房內(nèi)注射或眼內(nèi)灌注流體時，穩(wěn)定劑(例如，亞硫酸氫鈉，硫代硫酸鈉，依地酸鈉，檸檬酸鈉，抗壞血酸，二丁基羥基苯等等)，增溶劑(例如，甘油，丙二醇，聚乙二醇，聚氧化乙烯氫化蓖麻油等等)，懸浮劑(例如，聚乙烯基吡咯烷酮，羥丙基甲基纖維素，羥甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉等等)，乳化劑(例如，聚乙烯吡咯烷酮，大豆磷脂，蛋黃卵磷脂，聚氧化乙烯氫化蓖麻油，聚山梨酸酯80等等)，緩沖劑(例如，磷酸鹽緩沖劑，乙酸鹽緩沖劑，硼酸鹽緩沖劑，碳酸鹽緩沖劑，檸檬酸鹽緩沖劑，三羥甲基氨基甲烷緩沖液，谷氨酸，ε-氨基己酸等等)，增稠劑(例如，水溶性纖維素衍生物比如甲基纖維素，羥乙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素等等，硫酸軟骨素鈉，透明質(zhì)酸鈉，聚羧乙烯，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇等等)，防腐劑(例如，苯扎氯銨，氯化芐乙氧銨，雙氯苯雙胍己烷葡糖酸鹽，氯丁醇，芐醇，脫氫醋酸鈉，對-羥基苯甲酸酯，依地酸鈉，硼酸等等)，等滲劑(例如，氯化鈉，氯化鉀，甘油，甘露糖醇，山梨糖醇，硼酸，葡萄糖，丙二醇等等)，pH調(diào)節(jié)劑(例如，鹽酸，氫氧化鈉，磷酸，乙酸等等)，清涼劑(例如，L-薄荷醇，d-莰酮，d-2-莰醇，薄荷油等等)等等能夠作為添加劑添加進去。這些添加劑的添加量取決于添加劑的種類和用途以及其它因素來改變，并且以能夠?qū)崿F(xiàn)添加劑的目的的濃度添加。
[0090] 活性成分在本發(fā)明的粘附促進劑中的量通常是0.00001-lw/v %，優(yōu)選0.00001-0.lw/v %，更優(yōu)選0.000 l-0.0 lw/v %。盡管劑量和給藥頻率將取決于癥狀，年齡，體重和給藥形式而變化，但是，當(dāng)它用作成年人的前房內(nèi)注射劑時，例如，含有
0.0001-0.lw/v %、優(yōu)選0.0001-0.01w/v%的活性成分的制劑通常能夠通過0.01-0.1mL/每次給藥的方式每天給藥幾次，優(yōu)選1-2次，更優(yōu)選I次。
[0091] 當(dāng)角膜內(nèi)皮細胞在試管中培養(yǎng)時，本發(fā)明的粘附促進劑也能夠被添加到培養(yǎng)介質(zhì)中。當(dāng)通過向培養(yǎng)介質(zhì)中添加Rho激酶抑制劑來繼續(xù)培養(yǎng)時，Rho激酶抑制劑和角膜內(nèi)皮細胞在活體外接觸，并促進角膜內(nèi)皮細胞的粘附。
[0092]本發(fā)明提供角膜內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)介質(zhì)，該介質(zhì)含有Rho激酶抑制劑。在本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)中所含的Rho激酶抑制劑是如上所述。
[0093]本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)能夠含有一般用于內(nèi)皮細胞(例如，DMEM(GIBC0 BRL)，血清(例如，胎牛血清(FBS))，生長因子(例如，b-FGF)，抗生素(例如，青霉素，鏈霉素)等等的培養(yǎng)的介質(zhì)。
[0094]在本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)中Rho激酶抑制劑的濃度通常是1-100 μ Μ，優(yōu)選5-20 μ Μ，更優(yōu)選10 μ Mo
[0095]本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)通過增大角膜內(nèi)皮細胞的粘附來防止細胞的脫落，并且使得形成具有良好細胞形態(tài)和高細胞密度的角膜內(nèi)皮細胞層。因此，它能夠優(yōu)選用于本發(fā)明的角膜內(nèi)皮制劑的下述生產(chǎn)方法中。另外，本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)也用于維持角膜內(nèi)皮細胞。
[0096]本發(fā)明提供含有Rho激酶抑制劑的角膜保存溶液。在本發(fā)明的角膜保存溶液中所含的Rho激酶抑制劑是如上所述。角膜保存溶液是用于保存從捐獻者所分離的角膜移植物直至移植給接受者為止的液體。
[0097]本發(fā)明的角膜保存溶液的例子包括通常用于角膜移植術(shù)的保存溶液(角膜鞏膜的外植體保存溶液(Optisol GS:注冊商標(biāo))，角膜移植術(shù)的眼球的保存溶液(ΕΡΙΙ:注冊商標(biāo)))，鹽水，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)等等，它們中的每一種含有Rho激酶抑制劑。
[0098]在本發(fā)明的角膜保存溶液中Rho激酶抑制劑的濃度通常是l-100μΜ，優(yōu)選5-20 μ Μ,更優(yōu)選 10 μ Mo
[0099]本發(fā)明的角膜保存溶液通過增大角膜內(nèi)皮細胞的粘附來防止細胞的脫落，并且使得形成具有良好細胞形態(tài)和高細胞密度的角膜內(nèi)皮細胞層。因此，它能夠用作用于器官移植等等的角膜保存溶液。另外，本發(fā)明的保存溶液也用作角膜內(nèi)皮細胞的低溫保藏的保存溶液。為了低溫保藏，甘油，二甲亞砜，丙二醇，乙酰胺等等可以進一步被添加加到本發(fā)明的保存溶液中。
[0100]本發(fā)明提供生產(chǎn)角膜內(nèi)皮制劑的方法，它包括使用本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細胞的步驟。
[0101]該角膜內(nèi)皮制劑特征性地含有底物和在底物上的角膜內(nèi)皮細胞層，該層已經(jīng)在試
管中培養(yǎng)。
[0102]在本發(fā)明中，底物沒有特別限制，只要它能夠承載所培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細胞層并且能夠在移植之后在體內(nèi)維持它的形狀至少3天。另外，當(dāng)在試管中培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細胞時底物可具有支架(scaffold)的作用，或在培養(yǎng)之后可僅僅起著承載角膜內(nèi)皮細胞層的作用。優(yōu)選地，底物用于培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細胞，并且作為支架，在培養(yǎng)完成之后直接用于移植。
[0103]上述底物的例子包括從天然物質(zhì)如膠原、明膠、纖維素等等衍生的聚合物材料，合成聚合物材料如聚苯乙烯，聚酯，聚碳酸酯，聚(N-異丙基丙烯酰胺)等等，可生物降解的聚合物材料如聚乳酸，聚乙醇酸等等，氫氧磷灰石，羊膜等等。
[0104]盡管上述底物的形狀沒有特別限制，只要它支持角膜內(nèi)皮細胞層并且適合于移植就行，但是它優(yōu)選是片。當(dāng)本發(fā)明的制劑是片時，它能夠在移植過程中被切成適合于應(yīng)用位點的尺寸之后使用。還有可能將小片卷起，然后將它從傷口的口緣插入。優(yōu)選的特定例子包括覆蓋病變角膜內(nèi)皮區(qū)域的約80%的圓形。也優(yōu)選的是在上述圓的鄰近部分中形成狹縫，這樣它能夠緊密地粘附于應(yīng)用位點。
[0105]在優(yōu)選的實施方案中，上述底物是膠原。作為膠原，可優(yōu)選使用描述在JP-A-2004-24852中的膠原片。該膠原片能夠根據(jù)描述在上述JP-A-2004-24852中的方法從例如羊膜制備。
[0106]上述角膜內(nèi)皮細胞層優(yōu)選顯示出下列特性中的至少一種。更優(yōu)選，它顯示出下列特性中的兩種或多種，更優(yōu)選全部。
[0107](I)該細胞層具有單個層狀結(jié)構(gòu)。這是在身體內(nèi)角膜內(nèi)皮細胞層的諸多特性中的一種。
[0108](2)該細胞層具有約1，000_約4，000個細胞/mm2的細胞密度。特別地，當(dāng)成年人是接受者(移植接受 者)時，它優(yōu)選是約2，000-約3，000個細胞/mm2。
[0109](3)構(gòu)成細胞層的細胞具有基本上六邊形的平面圖。這是構(gòu)成在身體內(nèi)的角膜內(nèi)皮細胞層的細胞的諸多特性中的一種。本發(fā)明的制劑類似于在身體內(nèi)的角膜內(nèi)皮細胞層，顯示出與先天的角膜內(nèi)皮細胞層的功能類似的功能，并且也能夠顯示出活體內(nèi)增殖能力。
[0110](4)細胞在細胞層中規(guī)則地排列。在身體內(nèi)的角膜內(nèi)皮細胞層中，構(gòu)成該層的細胞規(guī)則排列，鑒于此原因，角膜內(nèi)皮細胞被認為維持正常功能和高透明度并且該角膜被認為適當(dāng)?shù)仫@示出水控制功能。因此，具有該形態(tài)特征的本發(fā)明制劑預(yù)計顯示出與在身體內(nèi)角膜內(nèi)皮細胞層的功能類似的功能。
[0111]本發(fā)明的生產(chǎn)方法包括使用本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細胞的步驟并且例如能夠通過下列方法來進行。
[0112]〈1>角膜內(nèi)皮細胞的采集和在試管中的培養(yǎng)
[0113]角膜肉皮細胞是通過普通方法從接受者他自己/她自己或合適捐獻者的角膜中采集的。考慮到在本發(fā)明中的移植條件，可以制備外源的角膜內(nèi)皮細胞。例如，Descemet膜和角膜組織的內(nèi)皮細胞層是從角膜基質(zhì)上剝離，放入到培養(yǎng)皿中，然后用中性蛋白酶(dispase)等等處理。通過這一方法,從Descemet膜上分出角膜內(nèi)皮細胞。保留在Descemet膜上的角膜內(nèi)皮細胞能夠通過移液管移取和類似方式被取出。在Descemet膜的取出后，角膜內(nèi)皮細胞在本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)。培養(yǎng)介質(zhì)能夠例如通過適當(dāng)?shù)靥砑覨BS(月臺牛血清)，b-FGF(basic-fibloblast生長因子)，和抗生素如青霉素、鏈霉素和類似物到商購DMEM(Dulbecco，s Modified Eagle’s Medium)中，和進一步添加 Y-27632 或 fasudil 到其中而獲得。優(yōu)選使用在表面上具有I型膠原，IV型膠原，粘連蛋白，層粘連蛋白或牛角膜內(nèi)皮細胞的細胞外基質(zhì)等等的涂層的培養(yǎng)容器(培養(yǎng)皿)。或者，可以使用用商購?fù)繉觿┤鏔NC涂覆混合物(注冊商標(biāo))等等處理的一般培養(yǎng)容器。通過該涂層和本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)的結(jié)合使用，促進了角膜內(nèi)皮細胞在培養(yǎng)容器的表面上的粘附，并且實現(xiàn)了良好生長。
[0114]盡管角膜內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)的溫度條件沒有特別限制，只要角膜內(nèi)皮細胞生長就行，但是考慮到生長效率，例如，溫度是約25-約45°C，優(yōu)選約30-約40°C，和進一步優(yōu)選是約37°C。該培養(yǎng)是在約5-10% CO2濃度的環(huán)境中在濕潤條件下在普通細胞培養(yǎng)器中進行。
[0115]〈2>傳代培養(yǎng)
[0116]傳代培養(yǎng)能夠在經(jīng)受培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細胞的生長之后進行。當(dāng)細胞達到亞融合或融合時優(yōu)選進行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)能夠如下進行。該細胞能夠通過用胰蛋白酶-EDTA等處理從培養(yǎng)容器的表面上分離，并且回收。本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)被添加到回收的細胞中得到細胞懸液。在細胞的回收過程中或在回收之后優(yōu)選進行離心處理。該離心處理獲得具有高細胞密度的細胞懸液。優(yōu)選的細胞密度是大約1-2 X IO6個細胞/mL。作為這里的離心處理的條件，例如能夠提及500rpm(30g)-1OOOrpm(70g), 1-10分鐘。
[0117]按照與在上述初始培養(yǎng)中相同的方式將細胞懸液接種在培養(yǎng)容器上，然后培養(yǎng)。盡管在傳代過程中的稀釋比率取決于細胞的條件，但是它是大約1: 2-1: 4，優(yōu)選約I: 3。該傳代培養(yǎng)能夠在與上述初始培養(yǎng)的培養(yǎng)條件類似的培養(yǎng)條件下進行。盡管培養(yǎng)時間取決于所使用的細胞的條件來改變，但是它例如是7-30天。以上傳代培養(yǎng)能夠根據(jù)需要進行多次。通過使用本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)，在培養(yǎng)的最初階段中細胞粘附會增大，據(jù)此培養(yǎng)時間能夠縮短。[0118]〈3>角膜內(nèi)皮細胞層的制備
[0119]細胞懸液被接種在底物如膠原片等等上，然后培養(yǎng)。這里，接種細胞的數(shù)量被控制，使得最終生產(chǎn)的角膜內(nèi)皮制劑具有具備所需細胞密度的細胞層。確切地說，接種細胞，使得形成具有約1，000-約4，000個細胞/mm2的細胞密度的細胞層。培養(yǎng)能夠在與上述初始培養(yǎng)的那些條件類似的條件和其它類似條件下進行。盡管培養(yǎng)時間取決于所使用的細胞的條件來改變，但是它例如是3-30天。
[0120]通過按照上述方式進行培養(yǎng)，能夠獲得其中在底物上已形成了在試管中所培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細胞層的角膜內(nèi)皮制劑。
[0121]在本發(fā)明中，該角膜內(nèi)皮制劑可以含有本發(fā)明的培養(yǎng)介質(zhì)以維持角膜內(nèi)皮細胞。另外，該角膜內(nèi)皮制劑可以含有本發(fā)明的角膜保存溶液，直至它用于移植為止。本發(fā)明也提供本發(fā)明的角膜內(nèi)皮制劑和培養(yǎng)介質(zhì)或保存溶液的結(jié)合物。
[0122]由本發(fā)明的生產(chǎn)方法獲得的角膜內(nèi)皮制劑能夠用作需要角膜內(nèi)皮的移植的疾病的治療用移植物，所述疾病例如是大皰角膜病，角膜水腫，角膜白斑，特別地，由于角膜營養(yǎng)不良、創(chuàng)傷或眼內(nèi)手術(shù)導(dǎo)致的角膜內(nèi)皮功能紊亂所引起的大皰角膜病。
[0123]本發(fā)明的粘附促進劑和角膜內(nèi)皮制劑的給藥患者包括，例如哺乳動物(例如，人，小鼠，大鼠，倉鼠，兔，貓，狗，牛，綿羊，猴子等等)。
[0124]實施例
[0125]本發(fā)明在下面參見實施例來更詳細地進行解釋，這些實施例不認為是限制性的。根據(jù) the International Guiding Principles for Biomedical Research InvolvingAnimals 以及 Act on welfare and management of animals 和與實驗動物的喂養(yǎng)、持有等相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)來使用實驗動物。根據(jù)the Association for Research in Vision andOphthalmology 針對 the Use ofAnimals in Ophthalmic and Vision Research 的指南來進行這一實驗。
[0126]實施例1[0127]ROCK抑制劑對于兔子角膜內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)的影響的研究
[0128]從安樂死之后立即分離出的兔角膜組織上分離出粘附有角膜內(nèi)皮細胞的Descemet 膜。Descemet 膜與中性蛋白酶 II (1.2U/ml, Roche Applied Science) 一起在37°C，5% CO2的條件下培養(yǎng)45分鐘，然后通過移液管移取手術(shù)以機械方式分離出角膜內(nèi)皮細胞。分離的角膜肉皮細胞進行離心處理，ROCK抑制劑(+)組的細胞在添加有￥-27632(10 μ M)的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中進行攪拌以及ROCK抑制劑(-)組的細胞在沒有添加Υ-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中進行攪拌，達到相同的濃度，并且這些細胞是以約2000個細胞/孔的密度被接種在96孔板上。作為用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)，使用添加有1%胎牛血清和 2mg/ml bFGF (Gibco Invitrogen)的培養(yǎng)介質(zhì)(DMEM, Gibco Invitrogen)。該板用FNC涂覆混合物(Athena ES)預(yù)處理10分鐘。在從培養(yǎng)起始后的72小時，該培養(yǎng)介質(zhì)被交換并且在72小時后，ROCK抑制劑(+)組和ROCK抑制劑(-)組都在不含Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的常規(guī)介質(zhì)中培養(yǎng)，直到第5天為止。在培養(yǎng)起始后的24小時之后，兔子角膜內(nèi)皮細胞的原始培養(yǎng)物的相差顯微照片示于圖1中。從培養(yǎng)起始之后的第I天到第3天,這些細胞是每24小時通過使用CellTiter96 (注冊商標(biāo))AQueous One SolutionCell Proliferation (Promega)由 MTS ([3- (4, 5- 二甲基喔唑-2-基)~5~ (3~ 竣基甲氧基苯基)-2- (4-磺基苯基)-2H-四唑鎗])分析法來計數(shù)(圖2)。
[0129]在ROCK里抑制劑⑴組中(圖1B)，在細胞接種之后在24小時(I天)中的細胞粘附顯著地增加到ROCK抑制劑㈠組(圖1A)的約2.8倍(圖2和3)。在第3天當(dāng)細胞實現(xiàn)融合時，在兩個組之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異(圖2)。從它可以清楚地看出，在兔子角膜內(nèi)皮細胞的原始培養(yǎng)物中傳代之后Y-27632具有在早期階段增大細胞粘附的作用。另外，在使用兔子角膜內(nèi)皮細胞的傳代培養(yǎng)的研究中也獲得類似的結(jié)果，因此，Y-27632被認為對于在原始培養(yǎng)物和傳代培養(yǎng)中傳代之后的早期細胞粘附起作用。
[0130]實施例2
[0131]Y-27632對于猴子角膜內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)的影響的研究
[0132]從為了其它目的被安樂死的獼猴(Macaca fascicularis)解離的角膜組織中分離出粘附有角膜內(nèi)皮細胞的Descemet膜。對于ROCK抑制劑(+)組，Descemet膜放入到添加了 Υ-27632(10μΜ)的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中并在37°C，5% CO2的條件下培養(yǎng)10分鐘。對于ROCK抑制劑(-)組，該膜被放入到?jīng)]有添加Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中并且在相同的條件下培養(yǎng)10分鐘。作為用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)，使用與實施例1中相同的細胞培養(yǎng)介質(zhì)。在培養(yǎng)之后獲得的Descemet膜與中性蛋白酶(Dispase) II (1.2U/ml, Roche AppliedScience) 一起在37°C，5% CO2的條件下培養(yǎng)45分鐘，然后通過移液管移取手術(shù)以機械方式分離出角膜內(nèi)皮細胞。分離的角膜內(nèi)皮細胞進行離心處理并在Υ_27632(+)和Y-27632 (-)達到相同濃度的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中攪拌，然后這些細胞以約20000個細胞/孔的密度被接種在12孔板上。該板用FNC涂覆混合物(Athena ES)預(yù)處理10分鐘。在從培養(yǎng)起始后的72小時，該培養(yǎng)介質(zhì)被交換并且在72小時后，ROCK抑制劑⑴組和ROCK抑制劑(-)組都在不含Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的常規(guī)介質(zhì)中培養(yǎng)。
[0133] 從圖4,在從培養(yǎng)起始后的24小時之后在稱猴(Macaca fascicularis)角膜內(nèi)皮細胞的原始培養(yǎng)物中，顯然更多的細胞粘附于在ROCK抑制劑(+)中的板上(圖4b)，這是指與ROCK抑制劑(-)相比而言(圖4A)。在達到融合之前的天數(shù)對于ROCK抑制劑(+)是3，而對于ROCK抑制劑(-)是7。從其中可以表明，在培養(yǎng)起始之后的早期階段中Y-27632增加細胞粘附并且是有用的藥物，該藥物甚至在認為與兔子相比體外培養(yǎng)比較困難的猴子角膜內(nèi)皮細胞中能夠進行細胞培養(yǎng)。
[0134]實施例3
[0135]Y-27632對于人角膜內(nèi) 皮細胞的培養(yǎng)的影響的研究
[0136]在從US眼庫獲得的人角膜組織中，中心部分(直徑7_)已經(jīng)用于角膜移植術(shù)和使用剩下的外圍角膜組織。分離已粘附有角膜內(nèi)皮細胞的Descemet膜。對于ROCK抑制劑(+)組，Descemet膜被放入到添加了 Υ_27632(10μΜ)的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中并且在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)10分鐘。對于ROCK抑制劑(-)組，該膜被放入到?jīng)]有添加Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中并且在相同的條件下培養(yǎng)10分鐘。作為用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)，使用與實施例1中相同的細胞培養(yǎng)介質(zhì)。在培養(yǎng)之后的Descemet膜與中性蛋白酶(Dispase) II (1.2U/ml, Roche Applied Science) 一起在 37°C, 5% CO2 的條件下培養(yǎng) 45 分鐘，然后通過移液管移取手術(shù)以機械方式分離出角膜內(nèi)皮細胞。分離的角膜內(nèi)皮細胞進行離心處理并在Y-27632(+)和Υ-27632(_)達到相同濃度的用于角膜內(nèi)皮的介質(zhì)中攪拌，然后這些細胞以約10000個細胞/孔的密度被接種在已用FNC涂覆混合物(Athena ES)預(yù)處理的48孔板上。從外圍角膜組織獲得的人角膜內(nèi)皮細胞的數(shù)量是極其少的，因此，一只眼睛的捐獻者角膜在一個孔中培養(yǎng)。用于該研究的捐獻者角膜是:對于ROCK抑制劑(+)組，在捐獻者(年齡69歲)的死亡之后的6天開始培養(yǎng)，和對于ROCK抑制劑(-)組，在捐獻者(年齡51歲)死亡之后的7天開始培養(yǎng)。對于年齡和從捐獻者的死亡到細胞培養(yǎng)所消逝的時間的影響被認為是幾乎相同的。
[0137]在從培養(yǎng)起始后的72小時，該培養(yǎng)介質(zhì)被交換，并且在72小時后，ROCK抑制劑(十)組和ROCK抑制劑(-)組都在不含Y-27632的用于角膜內(nèi)皮的常規(guī)介質(zhì)中培養(yǎng)。為了研究對于在培養(yǎng)起始后的早期階段中的細胞粘附以及細胞形態(tài)的影響，用相差顯微鏡觀察細胞并且在培養(yǎng)起始后用數(shù)字式照象機拍取照片(圖5)。
[0138]從圖5中，在培養(yǎng)起始后的第7天，由與正常角膜內(nèi)皮細胞類似的細胞(均勻的多角形細胞)組成的融合和高度致密的單個細胞層是在ROCK抑制劑(+)組中形成的(圖5B)，而具有低密度的成纖維細胞狀長條形內(nèi)皮細胞僅僅在ROCK里抑制劑(-)組中以小島形狀存活(圖5A)。從這些結(jié)果可以認為，在已知極其難以培養(yǎng)的人角膜內(nèi)皮的原始培養(yǎng)中，具有在培養(yǎng)起始后的早期階段中增大細胞粘附的作用的Y-27632在培養(yǎng)介質(zhì)中的添加能夠?qū)崿F(xiàn)具有良好細胞形態(tài)和高細胞密度的角膜內(nèi)皮細胞層的形成。
[0139]配方實施例1
[0140]會有Rho激酶抑制劑的前房內(nèi)注射劑
[0141]根據(jù)常規(guī)方法制備下列前房內(nèi)注射劑。
[0142]
【權(quán)利要求】
1.Rho激酶抑制劑用于生產(chǎn)角膜內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)介質(zhì)的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲?；?環(huán)己烷，1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪和其可藥用鹽中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1 的用途，其中該角膜內(nèi)皮細胞源自于人。
【文檔編號】C12N5/071GK103937738SQ201410200362
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2008年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2007年8月29日
【發(fā)明者】木下茂, 小泉范子, 上野盛夫 申請人:千壽制藥株式會社, 木下茂