分化多能性干細(xì)胞的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分化多能性干細(xì)胞的制造方法，更詳細(xì)而言，涉及分化能力提高了的 分化多能性干細(xì)胞的制造方法。此外，本發(fā)明還涉及在該制造方法中所使用的蛋白質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0002] 分化多能性干細(xì)胞被定義為：具備能夠轉(zhuǎn)變?yōu)榕c自身不同的多系統(tǒng)種類的細(xì)胞的 能力（分化多能性）、和能夠創(chuàng)造出即使經(jīng)過細(xì)胞分裂也具有與自身相同的能力的細(xì)胞來 作為子代細(xì)胞的能力（自我復(fù)制能力）的細(xì)胞，通常認(rèn)為胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）、誘導(dǎo)多能 性干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）等為符合該定義的細(xì)胞。并且，由于ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等具有所述能 力，因此非常期待它們在再生醫(yī)療、新藥開發(fā)領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。
[0003] 但是最近報(bào)告了 ：小鼠分化多能性干細(xì)胞和人分化多能性干細(xì)胞的基本性質(zhì)不 同，關(guān)于該分化能力，人分化多能性干細(xì)胞要遜色于小鼠分化多能性干細(xì)胞。
[0004] 關(guān)于小鼠分化多能性干細(xì)胞，可以通過實(shí)驗(yàn)較準(zhǔn)確地對分化多能性進(jìn)行評價(jià)。例 如，在將小鼠 ES細(xì)胞注入胚泡的腔內(nèi)時(shí)，有時(shí)內(nèi)部細(xì)胞塊和細(xì)胞彼此發(fā)生混合，來自ES細(xì) 胞的細(xì)胞在胚內(nèi)呈現(xiàn)正常的發(fā)生，將這種情況稱為形成嵌合體。對于小鼠 ES細(xì)胞而言，是 否能夠像這樣與發(fā)生時(shí)期相同的內(nèi)部細(xì)胞塊同期進(jìn)行發(fā)生是分化多能性是否良好的指標(biāo)。 還已知的是，此時(shí)若發(fā)生繼續(xù)進(jìn)行，則這些ES細(xì)胞的一部分將被動員為生殖細(xì)胞系。該生 殖細(xì)胞傳遞（germ line transmission)的發(fā)生意味著來自ES細(xì)胞的遺傳信息傳遞至下一 代，該意義上，能夠顯示出作為廣義上的正常細(xì)胞的適合性。此外，還存在也可以說是"最 后"的分化多能性的證明方法。在暫時(shí)抑制小鼠受精卵的細(xì)胞分裂后，將其在培養(yǎng)皿中培 養(yǎng)，貝 lJ形成4倍體（tetraploid)的胚泡。該4倍體胚泡中包含的內(nèi)部細(xì)胞塊乍一看性質(zhì)是 正常的，但卻不會繼續(xù)進(jìn)行此后的胚發(fā)生。因此，即使將該4倍體胚泡返送到以該狀態(tài)假 妊娠的母小鼠的子宮內(nèi)也無法獲得個(gè)體。但是，若將具有分化多能性的干細(xì)胞注入該4倍 體胚泡，使其形成前述的嵌合體，則此時(shí)僅所注入的細(xì)胞具有正常的核型，有助于發(fā)生。由 此，以單一世代產(chǎn)生完全來自于注入的分化多能性干細(xì)胞的個(gè)體。該方法通常稱為4倍體 補(bǔ)償（tetraploid - complementation)分析，此時(shí)出生的小鼠與注入的來源細(xì)胞有關(guān)，稱 為all - iPSC小鼠。還能夠如此地對小鼠中分化多能性進(jìn)行多重檢驗(yàn)，截至目前，大量證 據(jù)顯示小鼠 iPS細(xì)胞在嚴(yán)格意義上具有分化多能性。
[0005] 另一方面，關(guān)于人分化多能性干細(xì)胞，從倫理觀點(diǎn)出發(fā)當(dāng)然不能將上述的檢驗(yàn)法 用于人。作為其代用法通常使用的是畸胎瘤形成。將干細(xì)胞移植到裸小鼠的皮下，受到宿 主小鼠的血行支持，移植的細(xì)胞"隨機(jī)"分化、組織化。使該腫瘤片生長，從其病理標(biāo)本尋找 外?中·內(nèi)胚層，由此顯示出大致的分化多能性。但是，利用畸胎瘤形成法評價(jià)分化多能性 存在較大的問題。問題在于，在本法中，例如即使原干細(xì)胞的分化效率差，在能夠確認(rèn)向三 胚層分化的組織的階段也判斷為具有分化多能性。這是由于，即使腫瘤內(nèi)殘留有完全未繼 續(xù)發(fā)生的未分化細(xì)胞，大多情況下也無視該細(xì)胞地進(jìn)行分化多能性的評價(jià)?；チ鲂纬芍?， 若在原干細(xì)胞團(tuán)中存在數(shù)個(gè)真正的分化多能性細(xì)胞，則對其它細(xì)胞完全置之不理，評價(jià)方 法完全不具有定量性。例如，在小鼠 iPS細(xì)胞中，使用c 一 Myc制作的iPS細(xì)胞在畸胎瘤形 成中能確認(rèn)到三胚層分化能力，但進(jìn)行嵌合體形成時(shí)，幾乎都形成了來自iPS細(xì)胞的自然 發(fā)生的腫瘤。作為次優(yōu)選的策略，還考慮了實(shí)際中分別分化誘導(dǎo)為三胚層，對其進(jìn)行評價(jià)的 方法。該方法受分化方案影響，預(yù)期仍然難以進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)。
[0006] 進(jìn)而，關(guān)于人分化多能性干細(xì)胞還存在更深層的問題。這就是不存在具有均等地 分化為全部細(xì)胞系譜的潛在能力的理想化人分化多能性干細(xì)胞。根據(jù)長船等的報(bào)告，人ES 細(xì)胞并不存在在基因表達(dá)水平完全相同的兩個(gè)細(xì)胞，受其影響，各個(gè)ES細(xì)胞株偏向于向某 個(gè)特定的胚層的分化誘導(dǎo)性，進(jìn)而暗示了人ES細(xì)胞在定量方面并不具有充分的"分化多能 性"（非專利文獻(xiàn)1)。
[0007] 此外，從小鼠 ES細(xì)胞的建立起至人ES細(xì)胞的建立，經(jīng)過了 17年的時(shí)間。這是由 于通過小鼠 ES細(xì)胞的建立方法不能建立人ES細(xì)胞，無他。小鼠 ES細(xì)胞的自我復(fù)制培養(yǎng)中 需要白血病抑制因子（以下也稱為"LIF"），但人ES細(xì)胞在LIF添加培養(yǎng)基中不能進(jìn)行自 我復(fù)制。Thomson等發(fā)現(xiàn)，人ES細(xì)胞的維持所必須的是FGF和活化素（Activin) /Nodal (非 專利文獻(xiàn)2)。進(jìn)而明確了，小鼠 ES細(xì)胞借助于JAK/STAT信號，而人ES/iPS細(xì)胞中借助于 SMAD2/3信號，雙方借助于不同的信號系進(jìn)行各自的分化多能性干細(xì)胞的自我復(fù)制。此外， 普遍的看法是，在人分化多能性干細(xì)胞中，借助于SMAD2/3的細(xì)胞內(nèi)信號與NANOG的表達(dá)上 升有關(guān)。另一方面，SMAD2/3信號為哺乳類的發(fā)生中中內(nèi)胚層分化所必須的信號傳導(dǎo)通路， 實(shí)際上，為了以這些細(xì)胞系譜為目標(biāo)進(jìn)行分化誘導(dǎo)使用了高濃度的活化素 A。因此雖然目的 不同，但現(xiàn)狀是較多使用的人分化多能性干細(xì)胞的自我復(fù)制信號與該細(xì)胞向中內(nèi)胚層系的 分化信號是重復(fù)的。
[0008] 人ES細(xì)胞和小鼠 ES細(xì)胞在由胚泡建立這點(diǎn)上是共通的。但是，或許是由于前述 的培養(yǎng)條件的差異，它們的性質(zhì)并不相同。綜合迄今為止的見解，弄清了小鼠 ES細(xì)胞沿襲 了胚泡的內(nèi)部細(xì)胞塊的基因表達(dá)譜，而人ES細(xì)胞的性質(zhì)則與胚泡稍發(fā)達(dá)后形成的上胚層 內(nèi)的原始外胚層最相似。然后，利用與人ES細(xì)胞同樣的培養(yǎng)條件由小鼠上胚層直接建立了 上胚層干細(xì)胞（EpiSC)(非專利文獻(xiàn)3及4)，并認(rèn)為分化多能性大致可以分為兩種。一種是 以小鼠 ES細(xì)胞、小鼠 iPS細(xì)胞為代表的具有胚泡型分化多能性的干細(xì)胞，另一種是人ES細(xì) 胞、人iPS細(xì)胞、小鼠 EpiSC等上胚層型干細(xì)胞，前者的性質(zhì)被稱為原始態(tài)（naive)、后者的 性質(zhì)被稱為起始態(tài)（primed)(非專利文獻(xiàn)5)。
[0009] 如上，原始態(tài)型分化多能性干細(xì)胞和起始態(tài)型分化多能性干細(xì)胞在均具有向三胚 層分化的能力、若移植到裸小鼠中則形成畸胎瘤的方面是共通的。但是，原始態(tài)型的分化 多能性干細(xì)胞反映了在發(fā)生階段中接近受精卵的早期狀態(tài)（胚泡）的性質(zhì)，因此容易建立 等，進(jìn)而，具有能產(chǎn)生完全來自于該細(xì)胞的個(gè)體程度的完全的分化多能性。另一方面，起始 態(tài)型分化多能性干細(xì)胞有時(shí)還反映了比胚泡的發(fā)生階段前進(jìn)的上胚層的性質(zhì)，不容易建立 等。此外，如上所述，還明確了該細(xì)胞中存在分化多能性偏倚（非專利文獻(xiàn)1)。進(jìn)而還明確 了，起始態(tài)型分化多能性干細(xì)胞不具有生殖細(xì)胞傳遞能力、嵌合體形成能力，在包括分化多 能性在內(nèi)的分化能力方面，具有起始態(tài)型性質(zhì)的人分化多能性干細(xì)胞等比具有原始態(tài)型性 質(zhì)的小鼠分化多能性干細(xì)胞差。
[0010] 在再生醫(yī)療的實(shí)用化、新藥開發(fā)中，要求該人分化多能性干細(xì)胞具有能夠提供多 種多樣的細(xì)胞、組織、臟器等程度的高分化能力。因此，強(qiáng)烈需要提高具有起始態(tài)型性質(zhì)的 人分化多能性干細(xì)胞等的分化能力的方法，但現(xiàn)狀是目前尚未開發(fā)出所述方法。
[0011] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0012] 非專利文獻(xiàn)
[0013] 非專利文獻(xiàn) I :Osafune，K.等、Nat Biotechnol、2008 年、26 卷 3 號、313 ~315 頁
[0014] 非專利文獻(xiàn) 2 :Thomson，J.A.等、Science、1998 年、282 卷、5391 號、1145 ~7 頁
[0015] 非專利文獻(xiàn) 3 出rons，I.等、Nature、2007 年、448 卷、7150 號、191 ~195 頁
[0016] 非專利文獻(xiàn) 4 :Tesar，P. J. Nature、2007 年、448 卷、7150 號、196 ~199 頁
[0017] 非專利文獻(xiàn) 5 :Nichols，J.等、Cell Stem Cell、2009 年、4 卷、6 號、487 ~492 頁

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 發(fā)明所要解決的問題
[0019] 本發(fā)明是鑒于前述現(xiàn)有技術(shù)所具有的問題而作出的，目的在于提供一種分化能力 提高了的分化多能性干細(xì)胞的制造方法、以及在該制造方法中有用的物質(zhì)。
[0020] 用于解決問題的手段
[0021] 本發(fā)明者們?yōu)榱藢?shí)現(xiàn)前述目的，對小鼠分化多能性干細(xì)胞和人分化多能性干細(xì)胞 的性質(zhì)差異進(jìn)行了深入研宄。
[0022] 小鼠分化多能性干細(xì)胞具有接近于著床前的胚泡的內(nèi)部細(xì)胞塊的性質(zhì)。另一方 面，人分化多能性干細(xì)胞的性質(zhì)則與著床后的上胚層內(nèi)的原始外胚層最相似。并且，猜測由 于該發(fā)生階段的差異，人分化多能性干細(xì)胞在分化多能性方面也比小鼠分化多能性干細(xì)胞 差。
[0023] 此外，通常認(rèn)為在發(fā)生過程中早期化存在2種類型。為從剛受精后至著床早期中 發(fā)生的"早期胚中的早期化"、和著床后在生殖細(xì)胞形成過程中發(fā)生的"胚系中的早期化"。 鑒于該點(diǎn)，本發(fā)明者們仔細(xì)調(diào)查了為了消去從著床前的胚泡至著床后的上胚層的記憶而在 "胚系中的早期化"中表達(dá)的多種因子，并著眼于其中的TET1。
[0024] 已經(jīng)明確了 TETl蛋白質(zhì)為具有將5-甲基化胞嘧啶的甲基羥基化而將其變換為 5_羥甲基胞嘧啶的作用的酶。此外，近年來，關(guān)于該蛋白質(zhì)，還推測發(fā)生由前述5-羥甲基胞 嘧啶進(jìn)一步生成胞嘧啶、即去甲基化。此外，還猜測TETl蛋白質(zhì)通過競爭性地阻礙DNMT1、 DNMT3a、DNMT3b等DNA甲基化酶與DNA甲基化位點(diǎn)的結(jié)合，來維持DNA的低甲基化狀態(tài)。 因此強(qiáng)烈暗示了 TETl蛋白質(zhì)與DNA的去甲基化或低甲基化狀態(tài)的維持機(jī)制有關(guān)。此外，就 TETl蛋白質(zhì)而言，在小鼠中，在從受精卵直至胚泡的早期胚的發(fā)生過程以及由原始生殖細(xì) 胞、胚泡建立的ES細(xì)胞等中都確認(rèn)到TET1蛋白質(zhì)的表達(dá)。因此，與前述DNA的去甲基化等 綜合起來，還強(qiáng)烈暗示了 TETl蛋白質(zhì)與細(xì)胞的"早期化"有關(guān)。但是，尚未對人類中的TETl 蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行過解析。
[0025] 因此，在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平對人iPS細(xì)胞中的TETl的表達(dá)進(jìn)行了調(diào)查。其結(jié)果 是，與小鼠 ES細(xì)胞等同樣地，在人iPS細(xì)胞中也確認(rèn)到TETlmRNA的豐富表達(dá)。此外，此時(shí) 在人iPS細(xì)胞中檢測出的2種TETlmRNA(cDNA)的序列在部分外顯子的有無方面均與此前 已知的序列不同，因此本發(fā)明者們成功地發(fā)現(xiàn)了新的TETl的剪接變體。
[0026] 但是，其另一方面令人驚訝的是，與小鼠 ES細(xì)胞等不同的是，在人iPS細(xì)胞中未檢 測到TETl蛋白質(zhì)的表達(dá)。并且，猜測該TETl蛋白質(zhì)的表達(dá)的有無使得小鼠分化多能性干 細(xì)胞和人分化多能性干細(xì)胞的分化能力產(chǎn)生差異，對于使該TETl蛋白質(zhì)在人分化多能性 干細(xì)胞中表達(dá)的方法進(jìn)行了深入研宄。其結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)通過在天然型的TETl蛋白質(zhì)的氨基 末端（N末端）添加肽標(biāo)簽可使該蛋白質(zhì)在人分化多能性干細(xì)胞中穩(wěn)定地表達(dá)。此外，還驚 奇地發(fā)現(xiàn)，即使僅將從N末端起的第2位氨基酸置換為不同的氨基酸，也使該蛋白質(zhì)的表達(dá) 穩(wěn)定化。
[0027] 然后，在使這樣的能夠在人分化多能性干細(xì)胞中穩(wěn)定地表達(dá)的變異型TETl蛋白 質(zhì)（改變TETl蛋白質(zhì)）在人iPS細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)此前已經(jīng)確認(rèn)在人分化多能性干細(xì)胞 中表達(dá)的、顯示向中內(nèi)胚層分化的傾向的T、SOX17的表達(dá)消失。因此，明確了利用改變TETl 蛋白質(zhì)能夠消除人iPS細(xì)胞中的這類分化誘導(dǎo)的偏倚（分化誘導(dǎo)的偏向性）。
[0028] 此外明確了：在將導(dǎo)入有改變TETl蛋白質(zhì)的人iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)為神經(jīng)系統(tǒng)（外 胚層）時(shí)，分化誘導(dǎo)的抑制因子即OCT3/4及NANOG的表達(dá)迅速消失。特別是已知NANOG的 表達(dá)是向幾乎所有細(xì)胞種類的分化誘導(dǎo)的抑制要因，因此還明確了：通過導(dǎo)入改變TETl蛋 白質(zhì)，能夠消除分化多能性干細(xì)胞中的由該因子引起的對分化誘導(dǎo)的抵抗性，切實(shí)發(fā)揮該 細(xì)胞的分化多能性。另一方面還明確了 ：通過導(dǎo)入改變TETl蛋白質(zhì)，作為神經(jīng)發(fā)生的必需 因子的S0X2、SOXl等神經(jīng)標(biāo)志物的表達(dá)在向神經(jīng)系統(tǒng)的分化誘導(dǎo)過程中是亢進(jìn)的。特別 是，SOXl的表達(dá)量與在未導(dǎo)入TETl蛋白質(zhì)的情況下制作的現(xiàn)有iPS細(xì)胞的分化誘導(dǎo)過程 相比，上升約60倍，因此猜測通過導(dǎo)入該蛋白質(zhì)，分化多能性干細(xì)胞向神經(jīng)系統(tǒng)分化的能 力也提高約60倍。
[0029] 并且還發(fā)現(xiàn)，正如反映了這些轉(zhuǎn)錄因子的增減那樣，即使在僅確認(rèn)到現(xiàn)有的未表 達(dá)TETl蛋白質(zhì)的人iPS細(xì)胞微量地向神經(jīng)細(xì)胞分化的分化誘導(dǎo)條件下，在導(dǎo)入了改變TETl 蛋白質(zhì)的人iPS細(xì)胞中，幾乎100%的細(xì)胞能夠分化為神經(jīng)細(xì)胞。此外還確認(rèn)了：通過改變 TETl蛋白質(zhì)的導(dǎo)入，不僅是向所述外胚層系分化的能力提高，分化多能性干細(xì)胞向內(nèi)胚層 系的分化能力也提尚。
[0030] 此外，令人驚訝的是，還明確了利用將從N末端起第2位的氨基酸置換為不同的氨 基酸、并且使雙加氧酶區(qū)域缺失的改變TETl蛋白質(zhì)也可實(shí)現(xiàn)這樣的分化能力的提高。即， 表明在所述分化能力的提高中，雙加氧酶區(qū)域所承擔(dān)的去甲基化活性并非必需，只要維持 了 TETl蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合能力就足夠了。
[0031] 此外還明確了 ：通過將前述的改變TETl蛋白質(zhì)與所謂的重編程（reprogramming) 因子（0ct3/4、Sox2、Klf4及c 一 Myc) -起導(dǎo)入體細(xì)胞，不僅能夠提高所獲得的iPS細(xì)胞的 分化能力，而且還能夠提高該iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率（制造效率）。
[0032] 此外發(fā)現(xiàn)，未導(dǎo)入TETl蛋白質(zhì)而制作的現(xiàn)有的iPS細(xì)胞中，癌相關(guān)標(biāo)志物（GPC4、 GAGE2B及GAGE7)高度表達(dá)，另一方面導(dǎo)入TETl蛋白質(zhì)而制作的iPS細(xì)胞中，這些癌相關(guān)標(biāo) 志物的表達(dá)被抑制，從而還明確了通過導(dǎo)入TETl蛋白質(zhì)從而獲得的iPS細(xì)胞，不僅能夠提 高分化能力及該iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率（制造效率），而且能夠提高其安全性。
[0033] 本發(fā)明是基于以上的見解而完成的，提供分化能力提高了的分化多能性干細(xì)胞的 制造方法。此外，本發(fā)明提供在該制造方法中有用的變異型TETl蛋白質(zhì)及成為該變異型蛋 白質(zhì)的材料的新的TETl蛋白質(zhì)、以及編碼這些蛋白質(zhì)的核酸。更詳細(xì)而言，本發(fā)明提供以 下方案。
[0034] < 1 >一種分化多能性干細(xì)胞的制造方法，其包含將選自下述（a)~（c)中的至 少一種分子導(dǎo)入分化多能性干細(xì)胞或用于誘導(dǎo)為該細(xì)胞的體細(xì)胞的工序，
[0035] (a)TETl 蛋白質(zhì)
[0036] (b)編碼TETl蛋白質(zhì)的核酸
[0037] (c)插入有編碼TETl蛋白質(zhì)的核酸的載體。
[0038] < 2 >根據(jù)< 1 >所述的制造方法，所述TETl蛋白質(zhì)為變異型TETl蛋白質(zhì)，是與 正常型TETl蛋白質(zhì)相比穩(wěn)定性提高了的蛋白質(zhì)。
[0039] < 3 >根據(jù)< 2 >所述的制造方法，所述變異型TETl蛋白質(zhì)為從其氨基末端起第 2位的氨基酸殘基與正常型TETl蛋白質(zhì)的從氨基末端起第2位的氨基酸殘基不同的TETl 蛋白質(zhì)。
[0040] < 4 >根據(jù)< 2 >或< 3 >所述的制造方法，所述變異型TETl蛋白質(zhì)為進(jìn)一步缺 失了雙加氧酶區(qū)域的TETl蛋白質(zhì)。
[0041] < 5 >根據(jù)< 1 >所述的制造方法，所述TETl蛋白質(zhì)為包含序列號：2、4或6中 記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
[0042] <6 >-種蛋白質(zhì)，其為變異型TETl蛋白質(zhì)，與正常型TETl蛋白質(zhì)相比穩(wěn)定性提 尚。
[0043] < 7 >根據(jù)< 6 >所述的蛋白質(zhì)，從氨基末端起第2位的氨基酸殘基與正常型 TETl蛋白質(zhì)的從氨基末端起第2位的氨基酸殘基不同。
[0044] < 8 >根據(jù)< 7 >所述的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步缺失了雙加氧酶區(qū)域。
[0045] < 9 >-種蛋白質(zhì)，包含序列號：4或6中記載的氨基酸序列。
[0046] < 10 >-種核酸，編碼< 6 >~< 9 >中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。
[0047] < 11 >一種載體，其插入有< 10 >所述的核酸。
[0048] < 12 >-種分化多能性干細(xì)胞或用于誘導(dǎo)為該細(xì)胞的體細(xì)胞，導(dǎo)入有選自下述 (a)~（c)中的至少一種分子，
[0049] (a)TETl 蛋白質(zhì)
[0050] (b)編碼TETl蛋白質(zhì)的核酸
[0051] (c)插入有編碼TETl蛋白質(zhì)的核酸的載體。
[0052] 發(fā)明的效果
[0053] 根據(jù)本發(fā)明，能夠提高分化多能性干細(xì)胞的分化能力。此外，能夠高效率地制造 iPS細(xì)胞。此外，還能夠制造腫瘤形成能力被抑制、安全性高的分化多能性干細(xì)胞。
【附圖說明】
[0054] 圖1為表示在蛋白質(zhì)酶體抑制劑（MG132)存在下或非存在下利用蛋白質(zhì)印跡法對 人iPS細(xì)胞株（#58、#237及#105)中的TETl蛋白質(zhì)的表達(dá)量進(jìn)行分析的結(jié)果的照片。
[0055] 圖2為表示在MG132存在下或非存在下利用定量RT - PCR法對人iPS細(xì)胞株 (#58、#237及#105)中的TETlmRNA的表達(dá)量進(jìn)行分析的結(jié)果的圖表。需要說明的是，圖中 縱軸表示對同一樣品進(jìn)行3個(gè)反應(yīng)、求出其平均值并以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化而得 的相對值。此外，各個(gè)柱中的誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)誤差（圖5、8~23中也相同）。
[0056] 圖3為表示在人iPS細(xì)胞中表達(dá)的3種TETl基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)的概略圖。上段示 出作為Refseq而公知的TETl基因的編碼區(qū)域（CDS)及該CDS所編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。中 段及下段示出本發(fā)明人等此次新發(fā)現(xiàn)的2種TETl基因剪接變體的CDS及該CDS所編碼的 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
[0057] 圖4為表示利用蛋白質(zhì)印跡法對強(qiáng)制表達(dá)在N末端配置有FLAG標(biāo)簽的TETl的人 iPS細(xì)胞株（NFLAG TET10E)、強(qiáng)制表達(dá)在C末端配置有FLAG標(biāo)簽的TETl的細(xì)胞株（CFLAG TET10E)、以及僅表達(dá)載體的對照人iPS細(xì)胞株（pCAG - IP)中的TETl蛋白質(zhì)的表達(dá)量進(jìn) 行分析的結(jié)果的照片。
[0058] 圖 5 為表示利用定量 RT - PCR 法對 NFLAG TET10E、CFLAG TET10E、以及 pCAG - IP中的TETlmRNA的表達(dá)量進(jìn)行分析的結(jié)果的圖表。
[0059] 圖6為表示為了分析改變TETl蛋白質(zhì)的改變位點(diǎn)與穩(wěn)定性的相關(guān)性而使用的、改 變TETl蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的概略圖。圖中，從上方起的第一段示出人TETl基因（變體2)的CDS 及該CDS所編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。從上方起的第二段表示使人TETl蛋白質(zhì)的N末端部分 (包含670氨基酸的蛋白質(zhì)）和GFP標(biāo)簽融合了的蛋白質(zhì)（#93)的結(jié)構(gòu)。從上方起的第三 段表示使從N末端起第2位的位置的絲氨酸殘基被置換為甘氨酸殘基的人TETl蛋白質(zhì)的 N末端部分（包含670氨基酸的蛋白質(zhì)）和GFP標(biāo)簽融合了的蛋白質(zhì)（#94)的結(jié)構(gòu)。從上 方起的第四段表示使在N末端添加有FLAG標(biāo)簽的人TETl蛋白質(zhì)的N末端部分（包含670 氨基酸的蛋白質(zhì)）和GFP標(biāo)簽融合了的蛋白質(zhì)（#95)的結(jié)構(gòu)。
[0060] 圖7為表示利用FACS對分別導(dǎo)入了具有圖6所示的結(jié)構(gòu)的GFP融合TETl蛋白質(zhì) (#93、#94及#95)的人iPS細(xì)胞進(jìn)行分析的結(jié)果的直方圖。需要說明的是，圖中以"人iPS 細(xì)胞"表示的直方圖為表示對作為陰性對照的未表達(dá)GFP的iPS細(xì)胞進(jìn)行分析的結(jié)果。
[0061] 圖8為表示使人iPS細(xì)胞（圖中"hiPSC")、和強(qiáng)制表達(dá)N末端添加了 FLAG標(biāo)簽的 TETl蛋白質(zhì)的人iPS細(xì)胞（圖中"TETlo/e - hiPSC"）分化誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞時(shí)的、TETlmRNA 的表達(dá)量的經(jīng)時(shí)變化的圖表。圖中的縱軸表示開始向神經(jīng)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)起的天數(shù)（圖 9~23中也同樣）。
[0062] 圖9為表示使人iPS細(xì)胞、和強(qiáng)制表達(dá)N末端添加了 FLAG標(biāo)簽的TETl蛋白質(zhì)的 人iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞時(shí)的、DNMT3A mRNA的表達(dá)量的經(jīng)時(shí)變化的圖表。
[0063] 圖10為表示使人iPS細(xì)胞、和強(qiáng)制表達(dá)N末端添加了 FLAG標(biāo)簽的TETl蛋白質(zhì)的 人iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞時(shí)的、DNMT3B mRNA的表達(dá)量的經(jīng)時(shí)變化的圖表。
[0064] 圖11為表示使人iPS細(xì)胞、和強(qiáng)制表達(dá)N末端添加了 FLAG標(biāo)簽的TETl蛋白質(zhì)的 人iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞時(shí)的、NANOG mRNA的表達(dá)量的經(jīng)時(shí)變化的圖表。
[0065] 圖12為表示使人iPS細(xì)胞、和強(qiáng)制表達(dá)N末端添加了 FLAG標(biāo)簽的TETl蛋白質(zhì)的 人iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞時(shí)的、0CT3/4mRNA的表達(dá)量的經(jīng)時(shí)變化的圖表。
[0066] 圖13為表示使人iPS細(xì)胞、和強(qiáng)制表達(dá)N末端添加了