誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料及其制備方法,其解決了現(xiàn)有材料生物性能不理想的技術(shù)問(wèn)題，骨修復(fù)復(fù)合材料由石墨烯薄膜和生物活性玻璃構(gòu)成，生物活性玻璃均勻負(fù)載于石墨烯薄膜表面；生物活性玻璃為均勻球形形貌。本發(fā)明可用于骨修復(fù)復(fù)合材料及其制備領(lǐng)域。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及骨組織工程支架材料及其制備方法，具體地說(shuō)是一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料及其制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]理想的骨組織工程支架材料，不僅可以為成骨細(xì)胞生長(zhǎng)提供三維空間，而且具有骨引導(dǎo)活性及骨誘導(dǎo)活性，引導(dǎo)成骨細(xì)胞粘附、增殖，誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化。納米材料的眾多獨(dú)特的優(yōu)良的性質(zhì)使得其在眾多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景，而具有導(dǎo)電性能的納米材料更因其特殊的導(dǎo)電性能，受到了前所未有的重視。通過(guò)一系列加工，它可成為具有可視效果的刺激響應(yīng)性材料、帶有生物傳感器和神經(jīng)修復(fù)功能的生物識(shí)別薄膜材料、具有電刺激的藥物釋放器件以及具有生物相容性的柔性?xún)?chǔ)能材料等諸多材料體系。
[0003]作為導(dǎo)電納米材料中的一種，氧化石墨烯(G0)因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的力學(xué)、電學(xué)、熱學(xué)及化學(xué)特征，對(duì)其研究和應(yīng)用備受關(guān)注。以G0作為填充材料來(lái)增強(qiáng)復(fù)合材料的力學(xué)強(qiáng)度或者利用其它生物材料作為G0的修飾材料對(duì)G0進(jìn)行功能化是復(fù)合材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
[0004]生物玻璃(BG)與天然的骨及牙齒有著相似的組成，是較為重要的人工合成類(lèi)骨無(wú)機(jī)成分，為含有硅、鈉、鈣、磷等多種元素氧化物的活性材料，最新的研究表明生物活性玻璃中釋放的S1、Ca等物質(zhì)對(duì)于調(diào)節(jié)誘發(fā)成骨細(xì)胞周期開(kāi)始和進(jìn)程的基因具有激活作用，從而促進(jìn)了細(xì)胞的分化和增殖，促進(jìn)了新骨形成，具有良好的骨誘導(dǎo)作用，是一類(lèi)重要的骨修復(fù)材料，然而較低的斷裂韌性以及耐磨性阻礙了它的廣泛應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有材料生物性能不理想的技術(shù)問(wèn)題，提供一種生物性能理想、加工方法簡(jiǎn)單的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料及其制備方法。
[0006]為此，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料，骨修復(fù)復(fù)合材料由石墨烯薄膜和生物活性玻璃構(gòu)成，生物活性玻璃均勻負(fù)載于石墨烯薄膜表面;生物活性玻璃為均勻球形形貌。
[0007]優(yōu)選的，石墨烯薄膜為氧化石墨烯經(jīng)多巴胺改性而成。多巴胺為在改性過(guò)程中其表面的酚羥基與石墨烯表面官能團(tuán)發(fā)生了反應(yīng)，且多巴胺對(duì)氧化石墨烯產(chǎn)生了部分的還原作用。
[0008]優(yōu)選的，生物活性玻璃的材質(zhì)為正硅酸四乙酯、磷酸三乙酯和四水硝酸鈣。
[0009]優(yōu)選的，復(fù)合材料為薄膜材料，石墨烯薄膜層間距為0.39nm，生物活性玻璃的直徑為50nm?100nm〇
[0010]優(yōu)選的，復(fù)合材料中，石墨烯質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.5%?10%，其余為所述生物活性玻璃。
[0011]本發(fā)明同時(shí)提供一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料的制備方法，氧化石墨稀合成通過(guò)優(yōu)化的Hmiimers法合成;復(fù)合材料的制備采用溶膠-凝膠法結(jié)合熱處理的方法完成。[〇〇12]優(yōu)選的，得氧化石墨、超聲得到分散均勻的單層或少層氧化石墨烯、鹽酸多巴胺溶液的配制、攪拌過(guò)夜、離心、烘干。
[0013]優(yōu)選的，溶膠-凝膠法結(jié)合熱處理的方法合成復(fù)合材料的制備包括如下步驟:正硅酸乙酯-磷酸三乙酯-四水硝酸鈣溶膠-凝膠溶液的配制、多巴胺改性的氧化石墨烯懸液的配制、多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃混合液配制、燒結(jié)、碳化。
[0014]優(yōu)選的，本發(fā)明提供的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料的制備方法，包括如下步驟:
[0015](1)氧化石墨烯的制備
[0016]采用優(yōu)化的Hummers法成功獲得氧化石墨，并通過(guò)超聲得到分散均勻的單層或少層氧化石墨烯:天然鱗片石墨與硝酸鈉按2:1的比例混合后加入230ml濃硫酸，之后冰浴條件下加入高錳酸鉀，攪拌，保持反應(yīng)溫度低于20°C;移走冰浴，在35°C水浴中保溫30分鐘后緩慢加入460ml去離子水，待反應(yīng)溫度下降到70°C，同樣溫度水浴10分鐘；隨后加入700ml雙氧水，使反應(yīng)終止;抽濾，將得到的黃褐色過(guò)濾物反復(fù)清洗、離心，至上清ph為7左右，烘干， 得到氧化石墨；[〇〇17]超聲分離:以lmg: lml的比例將氧化石墨與去離子水混合，將超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)功率調(diào)至800W，超聲2h，得到分散均勻的氧化石墨烯；
[0018](2)氧化石墨烯的還原
[0019]還原:基于步驟(1)中制備的氧化石墨烯，將氧化石墨烯、水合肼、氨水、去離子水以100mg: 10ml: 0.lml: 100ml的比例混合后在95 °C水浴中保持2h，反應(yīng)結(jié)束后抽濾，清洗，最后烘干得到還原的氧化石墨烯；
[0020](3)氧化石墨烯的改性[0〇21 ]按照步驟(1)中超聲的方法將氧化石墨稀與去離子水按照165mg: 100ml進(jìn)行超聲， 之后加入鹽酸多巴胺，配成濃度為〇.25mmol/L的溶液，攪拌過(guò)夜，離心，烘干，得到多巴胺改性的氧化石墨烯；
[0022](4)溶膠-凝膠法制備氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料[0〇23]采用溶膠-凝膠法制備0.5wt.%?10wt.%多巴胺改性的氧化石墨稀的/生物活性玻璃復(fù)合材料，制備過(guò)程為:實(shí)驗(yàn)采用正硅酸乙酯、磷酸三乙酯、四水硝酸鈣，通過(guò)溶膠-凝膠法來(lái)制備生物活性玻璃;首先，將磷酸三乙酯溶解于蒸餾水、無(wú)水乙醇與氨水的混合液體中，80°C充分?jǐn)嚢?4h，獲得水解的磷酸三乙酯溶液;然后將正硅酸乙酯與四水硝酸鈣加入磷酸三乙酯水解溶液中，室溫?cái)嚢?20h，形成溶膠-凝膠溶液;事先將步驟(3)中制備好的多巴胺改性的氧化石墨烯溶解于二甲基甲酰胺，超聲2h，形成均勻的多巴胺改性的氧化石墨烯懸液;將溶膠_凝膠溶液按比緩慢加入多巴胺改性的氧化石墨烯懸液中，控制多巴胺改性的氧化石墨烯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇.5wt.%?10wt.%，室溫?cái)嚢?h，隨后將多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃混合液在80°C燒結(jié)12h，得到多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃固體;多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃固體在氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境下通過(guò)系列升溫碳化方式進(jìn)一步碳化，最終形成多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合物，具體程序?yàn)? 300°C保持lh，750°C保持2h，1000°C保持3h，隨后自然降溫至室溫；
[0024] (5)多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃基底材料制備
[0025]以蓋玻片作為基底，通過(guò)旋涂的方法形成有利于后期細(xì)胞生長(zhǎng)的基底材料;將直徑為14mm的蓋玻片置于體積比1:3的過(guò)氧化氫/濃硫酸的混合溶液中，在120°C保持10分鐘， 然后用無(wú)水乙醇和去離子水清洗，氮?dú)獗Ｗo(hù)吹干，得到表面清潔的蓋玻片；隨后，將清潔的蓋玻片浸入3%的硅烷溶液中30分鐘，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，沖洗，氮?dú)獗Ｗo(hù)下干燥;將多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃溶于無(wú)水乙醇中配制成質(zhì)量體積百分比為0.5 %的懸液，通過(guò)旋涂?jī)x上，使30yl懸液在功能化蓋玻片上均勻覆蓋，室溫下晾干， 以備后期實(shí)驗(yàn)使用。
[0026]本發(fā)明具有以下效果:
[0027] (1)本發(fā)明中多巴胺的改性在對(duì)氧化石墨烯(G0)有部分還原的基礎(chǔ)之上增加了氧化石墨烯在溶液中的分散性，減少了團(tuán)聚效應(yīng)，并為后續(xù)生物活性玻璃(BG)功能化提供了充裕的表面官能團(tuán)。通過(guò)溶膠-凝膠法可以在改性氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料 (DG0/BG)加載比例可控的條件下制備出具有獨(dú)特納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的DG0/BG導(dǎo)電支架材料，且 BG與DG0的混合比例以及DG0/BG表面形貌都可以進(jìn)行精確的調(diào)控。[〇〇28] (2)本發(fā)明所制得DG0/BG復(fù)合材料因具有合適的表面硬度、活性功能團(tuán)、生物分子吸附功能而具有良好的生物相容性，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附、增殖和分化;為石墨烯在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一個(gè)新的途徑。
[0029] (3)本發(fā)明所采用的制備和加工方法簡(jiǎn)單，可控性強(qiáng)，能用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0030]綜上所述，本發(fā)明所提供的復(fù)合材料在具有良好的理化性能，精確控制合適配比的DG0/BG因具有理想的表面硬度、活性功能團(tuán)、生物分子吸附功能而可以較好地調(diào)控 rBMSCs進(jìn)行成骨分化。【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1為本發(fā)明實(shí)施例2所述DG0透射電子顯微鏡照片；[〇〇32]圖2a為本發(fā)明實(shí)施例2所述石墨烯在改性前后的Raman圖譜；圖2b本發(fā)明實(shí)施例2 所述石墨烯在改性前后的FTIR圖譜；[〇〇33]圖3為本發(fā)明實(shí)施例2所述lwt.%DG0/BG復(fù)合材料的掃描電子顯微鏡照片；[〇〇34] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例2所述lwt.%DG0/BG復(fù)合材料的FTIR圖；[〇〇35]圖5為本發(fā)明實(shí)施例2所述lwt.%DG0/BG修復(fù)材料的成骨細(xì)胞培養(yǎng)1天的激光共聚焦顯示細(xì)胞骨架圖片；
[0036]圖6為本發(fā)明實(shí)施例2所述修復(fù)材料的成骨細(xì)胞培養(yǎng)7天的激光共聚焦顯示BMP2蛋白表達(dá)圖片?！揪唧w實(shí)施方式】
[0037]本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料及其制備方法，下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0038]實(shí)施例1[〇〇39] (1)氧化石墨烯(G0)的制備
[0040]采用優(yōu)化的Hummers法成功獲得氧化石墨，并通過(guò)超聲得到分散均勻的單層或少層氧化石墨烯。具體方法為:[0041 ]天然鱗片石墨與硝酸鈉按2:1的比例混合后加入230ml濃硫酸，之后冰浴條件下加入高錳酸鉀，攪拌，保持反應(yīng)溫度低于20°C。移走冰浴，在35°C水浴中保溫30分鐘后緩慢加入460ml去離子水，待反應(yīng)溫度下降到70°C，同樣溫度水浴10分鐘。隨后加入700ml雙氧水， 使反應(yīng)終止。抽濾，將得到的黃褐色過(guò)濾物反復(fù)清洗、離心，至上清ph為7左右，烘干，得到氧化石墨。
[0042]超聲分離:以lmg: 1ml的比例將氧化石墨與去離子水混合，將超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)功率調(diào)至800W，超聲2h，得到分散均勻的氧化石墨烯。[〇〇43](2)氧化石墨烯(G0)的還原
[0044] 還原:基于(1)中制備的G0，將G0、水合肼、氨水、去離子水以100mg: 10ml: 0.1ml: l〇〇ml的比例混合后在95°C水浴中保持2h，反應(yīng)結(jié)束后抽濾，清洗，最后烘干得到還原的氧化石墨稀(G)。[〇〇45](3)氧化石墨烯(G0)的改性[0〇46 ] 按照(1)中超聲的方法將G0與去離子水按照16 5mg: 10 0m 1進(jìn)行超聲，之后加入鹽酸多巴胺，配成濃度為〇.25mmol/L的溶液，攪拌過(guò)夜，離心，烘干，得到多巴胺改性的氧化石墨烯(DG0)〇[〇〇47](4)溶膠-凝膠法制備氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料(DG0/BG)[〇〇48] 采用溶膠-凝膠法制備0.5wt.%DG0的DG0/BG復(fù)合材料，制備過(guò)程為:實(shí)驗(yàn)采用正硅酸乙酯(TE0S)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸鈣(CN)等，通過(guò)溶膠-凝膠法來(lái)制備58S的生物活性玻璃(BG)。首先，將0.36ml TEP溶解于蒸餾水、無(wú)水乙醇與氨水的混合液體中，80 °C 充分?jǐn)嚢?4h，獲得水解的TEP溶液。然后將0.65ml TE0S與0.35g CN加入TEP水解溶液中，室溫?cái)嚢?20h，形成溶膠-凝膠溶液。事先將(3)中制備好的DG0稱(chēng)取0.0067g溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，超聲2h，形成均勻的DG0懸液。將溶膠-凝膠溶液按比緩慢加入DG0懸液中，室溫?cái)嚢?h，隨后將DG0/BG混合液在80°C燒結(jié)12h，得到0.5wt.%DG0/BG固體。0.5wt.%DG0/BG 固體在氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境下通過(guò)系列升溫碳化方式進(jìn)一步碳化，最終形成〇.5wt.%DG0/BG復(fù)合物，具體程序?yàn)?300°C保持lh，750°C保持2h，1000°C保持3h，隨后自然降溫至室溫。
[0049](5)DG0/BG基底材料制備
[0050]以蓋玻片作為基底，通過(guò)旋涂的方法形成有利于后期細(xì)胞生長(zhǎng)的基底材料。將直徑為14mm的蓋玻片置于體積比1:3的過(guò)氧化氫/濃硫酸的混合溶液中，在120°C保持10分鐘， 然后用無(wú)水乙醇和去離子水清洗，氮?dú)獗Ｗo(hù)吹干，得到表面清潔的蓋玻片。隨后，將清潔的蓋玻片浸入3%的硅烷(3-APTES)溶液中30分鐘，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，沖洗，氮?dú)獗Ｗo(hù)下干燥。將〇.5wt.%DG0/BG溶于無(wú)水乙醇中配制成0.5% (w/v)的懸液，通過(guò)旋涂?jī)x上，使30yl懸液在功能化蓋玻片上均勻覆蓋，室溫下晾干，以備后期實(shí)驗(yàn)使用。[0051 ]通過(guò)以上步驟所得的復(fù)合材料含有多巴胺改性的氧化石墨烯和生物活性玻璃，其為薄膜狀材料，改性石墨烯在復(fù)合材料中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇.5wt.%。[〇〇52] 實(shí)施例2[〇〇53] 步驟(1)、(2)、(3)與實(shí)施例1相同。[〇〇54](4)溶膠-凝膠法制備氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料(DG0/BG)[0〇55] 米用溶|父-凝|父法制備lwt.%DG0的DG0/BG復(fù)合材料，制備過(guò)程為:實(shí)驗(yàn)米用正娃酸乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸鈣(CN)等，通過(guò)溶膠-凝膠法來(lái)制備58S的生物活性玻璃(BG)。首先，將0.36ml TEP溶解于蒸餾水、無(wú)水乙醇與氨水的混合液體中，80 °C充分?jǐn)嚢?4h，獲得水解的TEP溶液。然后將0.65ml TE0S與0.35g CN加入TEP水解溶液中，室溫?cái)嚢?20h，形成溶膠-凝膠溶液。事先將(3)中制備好的DG0稱(chēng)取0.0136g溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，超聲2h，形成均勻的DG0懸液。將溶膠-凝膠溶液按比緩慢加入DG0懸液中，室溫?cái)嚢?h，隨后將DG0/BG混合液在80 °C燒結(jié)12h，得到1 wt.% DG0/BG固體。1 wt.% DG0/BG固體在氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境下通過(guò)系列升溫碳化方式進(jìn)一步碳化，最終形成lwt.%DG0/BG復(fù)合物，具體程序?yàn)?300°C保持lh，750°C保持2h，1000°C保持3h，隨后自然降溫至室溫。
[0056](5)DG0/BG基底材料制備[〇〇57]以蓋玻片作為基底，通過(guò)旋涂的方法形成有利于后期細(xì)胞生長(zhǎng)的基底材料。將直徑為14mm的蓋玻片置于體積比1:3的過(guò)氧化氫/濃硫酸的混合溶液中，在120°C保持10分鐘， 然后用無(wú)水乙醇和去離子水清洗，氮?dú)獗Ｗo(hù)吹干，得到表面清潔的蓋玻片。隨后，將清潔的蓋玻片浸入3%的硅烷(3-APTES)溶液中30分鐘，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，沖洗，氮?dú)獗Ｗo(hù)下干燥。將lwt.%DG0/BG溶于無(wú)水乙醇中配制成0.5% (w/v)的懸液，通過(guò)旋涂?jī)x上，使30yl懸液在功能化蓋玻片上均勻覆蓋，室溫下晾干，以備后期實(shí)驗(yàn)使用。[〇〇58]通過(guò)以上步驟所得的復(fù)合材料含有多巴胺改性的氧化石墨烯和生物活性玻璃，其為薄膜狀材料，改性石墨烯在復(fù)合材料中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為Iwt.%。[〇〇59] 實(shí)施例3[〇〇6〇]步驟(1)、(2)、(3)與實(shí)施例1相同。[〇〇611(4)溶膠-凝膠法制備氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料(DG0/BG)[0〇62] 米用溶|父-凝|父法制備3wt.%DG0的DG0/BG復(fù)合材料，制備過(guò)程為:實(shí)驗(yàn)米用正娃酸乙酯(TE0S)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸鈣(CN)等，通過(guò)溶膠-凝膠法來(lái)制備58S的生物活性玻璃(BG)。首先，將0.36ml TEP溶解于蒸餾水、無(wú)水乙醇與氨水的混合液體中，80 °C充分?jǐn)嚢?4h，獲得水解的TEP溶液。然后將0.65ml TE0S與0.35g CN加入TEP水解溶液中，室溫?cái)嚢?20h，形成溶膠-凝膠溶液。事先將(3)中制備好的DG0稱(chēng)取0.0415g溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，超聲2h，形成均勻的DG0懸液。將溶膠-凝膠溶液按比緩慢加入DG0懸液中，室溫?cái)嚢?h，隨后將DG0/BG混合液在80 °C燒結(jié)12h，得到3wt.% DG0/BG固體。3wt.% DG0/BG固體在氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境下通過(guò)系列升溫碳化方式進(jìn)一步碳化，最終形成3wt.%DG0/BG復(fù)合物，具體程序?yàn)?300°C保持lh，750°C保持2h，1000°C保持3h，隨后自然降溫至室溫。
[0063](5)DG0/BG基底材料制備[〇〇64]以蓋玻片作為基底，通過(guò)旋涂的方法形成有利于后期細(xì)胞生長(zhǎng)的基底材料。將直徑為14mm的蓋玻片置于體積比1:3的過(guò)氧化氫/濃硫酸的混合溶液中，在120°C保持10分鐘， 然后用無(wú)水乙醇和去離子水清洗，氮?dú)獗Ｗo(hù)吹干，得到表面清潔的蓋玻片。隨后，將清潔的蓋玻片浸入3%的硅烷(3-APTES)溶液中30分鐘，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，沖洗，氮?dú)獗Ｗo(hù)下干燥。將3wt.%DG0/BG溶于無(wú)水乙醇中配制成0.5% (w/v)的懸液，通過(guò)旋涂?jī)x上，使30yl懸液在功能化蓋玻片上均勻覆蓋，室溫下晾干，以備后期實(shí)驗(yàn)使用。[〇〇65]通過(guò)以上步驟所得的復(fù)合材料含有多巴胺改性的氧化石墨烯和生物活性玻璃，其為薄膜狀材料，改性石墨烯在復(fù)合材料中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3wt.%。
[0066] 實(shí)施例4
[0067]步驟(1)、(2)、(3)與實(shí)施例1相同。[〇〇68](4)溶膠-凝膠法制備氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料(DG0/BG)[0〇69] 米用溶|父-凝|父法制備5wt.%DG0的DG0/BG復(fù)合材料，制備過(guò)程為:實(shí)驗(yàn)米用正娃酸乙酯(TE0S)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸鈣(CN)等，通過(guò)溶膠-凝膠法來(lái)制備58S的生物活性玻璃(BG)。首先，將0.36ml TEP溶解于蒸餾水、無(wú)水乙醇與氨水的混合液體中，80 °C充分?jǐn)嚢?4h，獲得水解的TEP溶液。然后將0.65ml TE0S與0.35g CN加入TEP水解溶液中，室溫?cái)嚢?20h，形成溶膠-凝膠溶液。事先將(3)中制備好的DG0稱(chēng)取0.0706g溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，超聲2h，形成均勻的DG0懸液。將溶膠-凝膠溶液按比緩慢加入DG0懸液中，室溫?cái)嚢?h，隨后將DG0/BG混合液在80 °C燒結(jié)12h，得到5wt.% DG0/BG固體。5wt.% DG0/BG固體在氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境下通過(guò)系列升溫碳化方式進(jìn)一步碳化，最終形成5wt.%DG0/BG復(fù)合物，具體程序?yàn)?300°C保持lh，750°C保持2h，1000°C保持3h，隨后自然降溫至室溫。
[0070](5)DG0/BG基底材料制備
[0071]以蓋玻片作為基底，通過(guò)旋涂的方法形成有利于后期細(xì)胞生長(zhǎng)的基底材料。將直徑為14mm的蓋玻片置于體積比1:3的過(guò)氧化氫/濃硫酸的混合溶液中，在120°C保持10分鐘， 然后用無(wú)水乙醇和去離子水清洗，氮?dú)獗Ｗo(hù)吹干，得到表面清潔的蓋玻片。隨后，將清潔的蓋玻片浸入3%的硅烷(3-APTES)溶液中30分鐘，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，沖洗，氮?dú)獗Ｗo(hù)下干燥。將5wt.%DG0/BG溶于無(wú)水乙醇中配制成0.5% (w/v)的懸液，通過(guò)旋涂?jī)x上，使3〇yl懸液在功能化蓋玻片上均勻覆蓋，室溫下晾干，以備后期實(shí)驗(yàn)使用。[〇〇72]通過(guò)以上步驟所得的復(fù)合材料含有多巴胺改性的氧化石墨烯和生物活性玻璃，其為薄膜狀材料，改性石墨烯在復(fù)合材料中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5wt.%。[〇〇73] 實(shí)施例5[〇〇74]步驟(1)、(2)、(3)與實(shí)施例1相同。[〇〇75](4)溶膠-凝膠法制備氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料(DG0/BG)[0〇76] 米用溶|父-凝|父法制備10wt.%DG0的DG0/BG復(fù)合材料，制備過(guò)程為:實(shí)驗(yàn)米用正娃酸乙酯(TE0S)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸鈣(CN)等，通過(guò)溶膠-凝膠法來(lái)制備58S的生物活性玻璃(BG)。首先，將0.36ml TEP溶解于蒸餾水、無(wú)水乙醇與氨水的混合液體中，80 °C充分?jǐn)嚢?4h，獲得水解的TEP溶液。然后將0.65ml TE0S與0.35g CN加入TEP水解溶液中，室溫?cái)嚢?20h，形成溶膠-凝膠溶液。事先將(3)中制備好的DG0稱(chēng)取0.1491g溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，超聲2h，形成均勻的DG0懸液。將溶膠-凝膠溶液按比緩慢加入DG0懸液中，室溫?cái)嚢?h，隨后將DG0/BG混合液在80 °C燒結(jié)12h，得到10wt.% DG0/BG固體。10wt.% DG0/BG固體在氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境下通過(guò)系列升溫碳化方式進(jìn)一步碳化，最終形成l〇wt.%DG0/BG復(fù)合物，具體程序?yàn)?300°C保持lh，750°C保持2h，1000°C保持3h，隨后自然降溫至室溫。
[0077](5)DG0/BG基底材料制備[〇〇78]以蓋玻片作為基底，通過(guò)旋涂的方法形成有利于后期細(xì)胞生長(zhǎng)的基底材料。將直徑為14mm的蓋玻片置于體積比1:3的過(guò)氧化氫/濃硫酸的混合溶液中，在120°C保持10分鐘， 然后用無(wú)水乙醇和去離子水清洗，氮?dú)獗Ｗo(hù)吹干，得到表面清潔的蓋玻片。隨后，將清潔的蓋玻片浸入3%的硅烷(3-APTES)溶液中30分鐘，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，沖洗，氮?dú)獗Ｗo(hù)下干燥。將l〇wt.%DG0/BG溶于無(wú)水乙醇中配制成0.5 % (w/v)的懸液，通過(guò)旋涂?jī)x上，使30yl懸液在功能化蓋玻片上均勻覆蓋，室溫下晾干，以備后期實(shí)驗(yàn)使用。
[0079]通過(guò)以上步驟所得的復(fù)合材料含有多巴胺改性的氧化石墨烯和生物活性玻璃，其為薄膜狀材料，改性石墨烯在復(fù)合材料中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為l〇wt.%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料，其特征是所述骨修復(fù)復(fù)合材料由石 墨烯薄膜和生物活性玻璃構(gòu)成，所述生物活性玻璃均勻負(fù)載于所述石墨烯薄膜表面;所述 生物活性玻璃為均勻球形形貌。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料，其特征在于所述 石墨烯薄膜為氧化石墨烯經(jīng)多巴胺改性而成。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料，其特征在于所述 生物活性玻璃的材質(zhì)為正硅酸四乙酯、磷酸三乙酯和四水硝酸鈣。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料，其特征在于所述 復(fù)合材料為薄膜材料，所述石墨稀薄膜層間距為〇.39nm，所述生物活性玻璃的直徑為50nm ?100nm〇5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料，其特征在于所述 復(fù)合材料中，所述石墨烯質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.5 %?10 %，其余為所述生物活性玻璃。6.如權(quán)利要求1?5之一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料的制備方 法，其特征是所述氧化石墨稀合成通過(guò)優(yōu)化的Hmiimers法合成;所述復(fù)合材料的制備采用溶 膠-凝膠法結(jié)合熱處理的方法完成。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料的制備方法，其特 征在于所述多巴胺改性的氧化石墨稀的制備包括如下步驟:采用優(yōu)化的Hummers獲得氧化 石墨、超聲得到分散均勻的單層或少層氧化石墨烯、鹽酸多巴胺溶液的配制、攪拌過(guò)夜、離 心、烘干。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料的制備方法，其特 征在于所述溶膠-凝膠法結(jié)合熱處理的方法合成復(fù)合材料的制備包括如下步驟:正硅酸乙 酯-磷酸三乙酯-四水硝酸鈣溶膠-凝膠溶液的配制、多巴胺改性的氧化石墨烯懸液的配制、 多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃混合液配制、燒結(jié)、碳化。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料的制備方法，其特 征在于包括如下步驟:(1)氧化石墨烯的制備采用優(yōu)化的Hummers法成功獲得氧化石墨，并通過(guò)超聲得到分散均勻的單層或少層氧 化石墨烯:天然鱗片石墨與硝酸鈉按2:1的比例混合后加入230ml濃硫酸，之后冰浴條件下 加入高錳酸鉀，攪拌，保持反應(yīng)溫度低于20°C;移走冰浴，在35°C水浴中保溫30分鐘后緩慢 加入460ml去離子水，待反應(yīng)溫度下降到70°C，同樣溫度水浴10分鐘；隨后加入700ml雙氧 水，使反應(yīng)終止;抽濾，將得到的黃褐色過(guò)濾物反復(fù)清洗、離心，至上清ph為7左右，烘干，得 到氧化石墨；超聲分離:以lmg: lml的比例將氧化石墨與去離子水混合，將超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)功率調(diào) 至800W，超聲2h，得到分散均勻的氧化石墨烯；(2)氧化石墨烯的還原還原:基于步驟(1)中制備的氧化石墨烯，將氧化石墨烯、水合肼、氨水、去離子水以 100mg: 10ml: 0.lml: 100ml的比例混合后在95°C水浴中保持2h，反應(yīng)結(jié)束后抽濾，清洗，最后 烘干得到還原的氧化石墨烯；(3)氧化石墨烯的改性按照步驟(1)中超聲的方法將氧化石墨烯與去離子水按照165mg: 100ml進(jìn)行超聲，之后 加入鹽酸多巴胺，配成濃度為〇.25mmol/L的溶液，攪拌過(guò)夜，離心，烘干，得到多巴胺改性的 氧化石墨烯；(4)溶膠-凝膠法制備氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料采用溶膠-凝膠法制備〇.5wt.%?10wt.%多巴胺改性的氧化石墨稀的/生物活性玻璃 復(fù)合材料，制備過(guò)程為:實(shí)驗(yàn)采用正硅酸乙酯、磷酸三乙酯、四水硝酸鈣，通過(guò)溶膠-凝膠法 來(lái)制備生物活性玻璃;首先，將磷酸三乙酯溶解于蒸餾水、無(wú)水乙醇與氨水的混合液體中， 80 °C充分?jǐn)嚢?4h，獲得水解的磷酸三乙酯溶液;然后將正硅酸乙酯與四水硝酸鈣加入磷酸 三乙酯水解溶液中，室溫?cái)嚢?20h，形成溶膠-凝膠溶液;事先將步驟(3)中制備好的多巴胺 改性的氧化石墨烯溶解于二甲基甲酰胺，超聲2h，形成均勻的多巴胺改性的氧化石墨烯懸 液;將溶膠-凝膠溶液按比緩慢加入多巴胺改性的氧化石墨烯懸液中，控制多巴胺改性的氧 化石墨烯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5wt.%?10wt.%，室溫?cái)嚢?h，隨后將多巴胺改性的氧化石墨 烯/生物活性玻璃混合液在80°C燒結(jié)12h，得到多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃固 體;多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃固體在氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境下通過(guò)系列升溫碳化方 式進(jìn)一步碳化，最終形成多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合物，具體程序?yàn)?300 。(:保持lh，750°C保持2h，1000°C保持3h，隨后自然降溫至室溫；(5)多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃基底材料制備以蓋玻片作為基底，通過(guò)旋涂的方法形成有利于后期細(xì)胞生長(zhǎng)的基底材料;將直徑為 14mm的蓋玻片置于體積比1:3的過(guò)氧化氫/濃硫酸的混合溶液中，在120°C保持10分鐘，然后 用無(wú)水乙醇和去離子水清洗，氮?dú)獗Ｗo(hù)吹干，得到表面清潔的蓋玻片；隨后，將清潔的蓋玻 片浸入3%的硅烷溶液中30分鐘，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，沖洗，氮?dú)獗Ｗo(hù)下 干燥;將多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃溶于無(wú)水乙醇中配制成質(zhì)量體積百分比 為0.5%的懸液，通過(guò)旋涂?jī)x上，使30yl懸液在功能化蓋玻片上均勻覆蓋，室溫下晾干，以備 后期實(shí)驗(yàn)使用。
【文檔編號(hào)】A61L27/10GK105999396SQ201610312485
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月12日
【發(fā)明人】鄧旭亮, 莫曉菊, 衛(wèi)彥, 張學(xué)慧, 沈洋, 蔡晴
【申請(qǐng)人】北京大學(xué)口腔醫(yī)院