專利名稱：用于培養(yǎng)生物細(xì)胞的培養(yǎng)皿的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)生物細(xì)胞、優(yōu)選培養(yǎng)胚細(xì)胞的培養(yǎng)皿。
背景技術(shù)：
在體外受精(IVF)過(guò)程中，經(jīng)常對(duì)配子和胚胎進(jìn)行操作。操作涉及物理操作，如將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)皿移到另一個(gè)培養(yǎng)皿，剝脫和胞質(zhì)內(nèi)精子注射(ICSI)以及改變培養(yǎng)基的組成和物理參數(shù)(如溫度、pH和摩爾滲透壓濃度)。通常，配子和胚胎保存在4孔培養(yǎng)皿或60mm培養(yǎng)皿等中。認(rèn)為這些系統(tǒng)是開放培養(yǎng)系統(tǒng)并且同樣很難控制CO2，因?yàn)橐坏呐囵B(yǎng)皿中移開蓋子，CO2蒸發(fā)會(huì)導(dǎo)致pH改變。
培養(yǎng)時(shí)另一個(gè)非常重要的參數(shù)是溫度。在培養(yǎng)基中和胚胎操作(如變換培養(yǎng)基、顯微術(shù)和剝脫)期間，溫度是很難控制的。經(jīng)常看到大于±2℃的溫度波動(dòng)，這會(huì)降低細(xì)胞的生存力。在諸如體外卵成熟、體外受精、胚胎的3天培養(yǎng)、培養(yǎng)到胚泡期等過(guò)程中使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿，需要在每個(gè)過(guò)程中對(duì)各個(gè)細(xì)胞/胚胎多次操作。很難說(shuō)這些操作降低了細(xì)胞多少潛力，但是每次操作胚胎時(shí)，都伴隨著物理?yè)p傷、溫度和pH的改變以及來(lái)自周圍污染的危險(xiǎn)，所有的這些都是降低細(xì)胞生存力或胚胎植入潛力的因素。因此，需要設(shè)計(jì)能在IVF期間使培養(yǎng)條件最優(yōu)化的培養(yǎng)皿。
此外，常規(guī)培養(yǎng)皿的實(shí)際操作不是最適宜的。為了抬起培養(yǎng)皿，必需要同時(shí)抬起皿的底部和蓋子。如果操作員不仔細(xì)，他會(huì)僅僅抬起蓋子，導(dǎo)致培養(yǎng)皿掉落。
盡管IVF相關(guān)工業(yè)在增長(zhǎng)，在體外細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的主要進(jìn)展是一般經(jīng)驗(yàn)，并且僅僅進(jìn)行了很少的嘗試來(lái)開發(fā)特別為IVF設(shè)計(jì)和優(yōu)化的設(shè)備。
美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?002/0187078 A1描述了用于在微波爐中加熱的容納化合物的多孔平板。此平板是在其表面具有行列排列的平面構(gòu)材(planermember)。平板具有流體填充通道形式的熱儲(chǔ)蓄器，所述的通道沿著平板的側(cè)面部分縱向安置。
美國(guó)專利號(hào)4 786 601描述了組織培養(yǎng)容器(tissur culture holder)，它在培養(yǎng)孔下的底部具有絕緣室。絕緣室用空氣或清澈的液體填充，并且可以被密封或可以具有通道用來(lái)使空氣流通通過(guò)小室并且向上到孔上面的空間中。
美國(guó)專利號(hào)5 876 675描述了微流體裝置。該發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及包括一個(gè)手動(dòng)操作結(jié)構(gòu)的微流體裝置。在此裝置的對(duì)向邊緣，此手動(dòng)操作結(jié)構(gòu)顯示為內(nèi)錐形的或嵌入的邊緣。
特別為IVF設(shè)計(jì)的是在后面公開的方面，其具有培養(yǎng)胚胎細(xì)胞的室。
美國(guó)專利號(hào)5 484 731描述了多孔的體外受精平板。此平板配備有可分成足夠部分的可移動(dòng)蓋子。每個(gè)部分可以通過(guò)滑動(dòng)從封閉的位置移動(dòng)到開放的位置，從而每次暴露多個(gè)孔。
美國(guó)專利號(hào)6 448 169描述了胚胎培養(yǎng)的方法和包括培養(yǎng)容器如培養(yǎng)皿的設(shè)備。培養(yǎng)容器包含多個(gè)由多個(gè)間隔支柱產(chǎn)生的室，所述的支柱組合形成4個(gè)室。支柱用來(lái)在相鄰室之間同時(shí)也在增強(qiáng)生長(zhǎng)的養(yǎng)分間形成液體滲透屏障。
美國(guó)專利號(hào)5 449 620描述了用來(lái)培養(yǎng)胚胎系統(tǒng)細(xì)胞的方法和設(shè)備。在該發(fā)明中提供了包括固體支持物的設(shè)備，如在底部具有許多錐形凹坑的培養(yǎng)皿，其中可以將可控濃度的所選擇細(xì)胞類型鋪到每個(gè)凹坑中。凹坑的頂部直徑為大約0.2-0.3mm，且底部直徑為0.1-0.2mm。
美國(guó)專利號(hào)5 627 066描述了用于體外受精的方法和設(shè)備。在該發(fā)明中提供的設(shè)備包括帶有多個(gè)微室的培養(yǎng)皿。每個(gè)微室的體積超過(guò)了待受精卵母細(xì)胞的體積。小室的體積通常是卵母細(xì)胞體積的8到20倍。
國(guó)際專利申請(qǐng)WO 01/88087描述了用于胚胎細(xì)胞微流體操作的設(shè)備，包括公開了通過(guò)一般胚胎尺寸的通道(微通道)形成的運(yùn)送網(wǎng)絡(luò)。
Jukka Hyrinen的芬蘭專利申請(qǐng)F(tuán)I 884 551公開了包括下列結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)皿具有多個(gè)用于培養(yǎng)卵母細(xì)胞的大孔的基部結(jié)構(gòu)和帶有開口的可旋轉(zhuǎn)蓋子，所述的開口適合于一行大孔以致于當(dāng)開口與這行大孔對(duì)準(zhǔn)時(shí)，通過(guò)蓋子中的開口可以開通4個(gè)大孔。每次開通至少4個(gè)孔導(dǎo)致不必要的二氧化碳蒸發(fā)和不必要的熱量損失，這是不利的。
美國(guó)專利號(hào)5 891 712公開了懸滴培養(yǎng)皿，其在底部具有用字母標(biāo)記的凹槽。
用于卵母細(xì)胞的微通道公開于S.M.Willadsen“A method for cultureof micromanipulated sheep embryos and its use to produce monozygotictwins”(Nature，第277卷，第298-299頁(yè)，1979，1月25日)以及H.H.vander Ven等人“Fertilization of human oocytes in capillary tubes with verysmall numbers of spermatozoa”(Human Reproduction，第4卷，第1期，第72-76頁(yè)，1989)中。在其中容納卵母細(xì)胞(暴露于流經(jīng)通道的流體)的帶屏障的微通道公開于美國(guó)專利號(hào)6 193 647中或報(bào)道于Glasgow等人，“Individual embryo transport and retention on a chip”(發(fā)表在Micro TotalAnalysis systems 1998，第13-18頁(yè)，1989年10月)以及H.C.Zeringe等人，“Micro fluidic single embryo in PDMS”(展示于在1999年10月13-16日于佐治亞的亞特蘭大召開的第21屆IEEE生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)國(guó)際年會(huì)暨1999年生物醫(yī)學(xué)工程協(xié)會(huì)秋季年會(huì)(21stAnn.Int’l.Conf.of theIEEE Eng.In Med.and Bio.Soc.and the 1999 Ann.Fall Meeting of the Biomed.Eng.Society))。
盡管上述提到的特別設(shè)計(jì)的培養(yǎng)皿已經(jīng)改進(jìn)了用于卵母細(xì)胞IVF操作，仍存在改進(jìn)的需要。要特別考慮這些方面，如減少二氧化碳蒸發(fā)、pH穩(wěn)定性和降低熱量損失。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于IVF的皿，其具有增強(qiáng)的適用性，特別是降低了二氧化碳蒸發(fā)，這意味著增強(qiáng)了pH穩(wěn)定性。
該目標(biāo)是通過(guò)這樣的培養(yǎng)皿來(lái)實(shí)現(xiàn)的，即所述培養(yǎng)皿包括具有多個(gè)用于培養(yǎng)卵母細(xì)胞的大孔的基部結(jié)構(gòu)，此培養(yǎng)皿還包括具有可移動(dòng)部分的蓋子，其中可移動(dòng)部分具有適合于大孔大小的開口，可移動(dòng)部分在第一個(gè)位置和其它位置之間移動(dòng)，當(dāng)可移動(dòng)部分在第一個(gè)位置時(shí)，所有的大孔是被蓋子封閉的；當(dāng)可移動(dòng)部分在其它位置上時(shí)，對(duì)于每個(gè)其它位置，開口對(duì)準(zhǔn)一個(gè)大孔以便允許通過(guò)蓋子中的開口每次僅開通一個(gè)大孔。
因此，根據(jù)本發(fā)明，不需要抬起蓋子來(lái)開通孔。抬起蓋子會(huì)引起蓋子周圍空氣發(fā)生相當(dāng)大的對(duì)流并且增加了蒸發(fā)，但是輕輕旋轉(zhuǎn)或滑動(dòng)減少了對(duì)流。另外，基于培養(yǎng)皿的構(gòu)造，每次只有一個(gè)孔是開通的。即使持續(xù)相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間開通一個(gè)孔，其它孔也不受影響，因?yàn)椴皇撬锌椎纳w子均被打開，因此沒(méi)有發(fā)生蒸發(fā)和溫度改變?？傊?，尤其避免了不必要的二氧化碳蒸發(fā)，即增加了pH的穩(wěn)定性。此外，對(duì)于其它孔而言降低了熱量損失。
在實(shí)際的實(shí)施方案中，可移動(dòng)部分一般由透明材料制造，它是能在第一個(gè)位置和其它位置之間旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)動(dòng)圓盤。在此實(shí)施方案中，大孔應(yīng)當(dāng)以圓形方式排列。備選地，可移動(dòng)部分可以是滑動(dòng)排列。在此實(shí)施方案中，大孔可以線性排列。但是，其它實(shí)施方案也是可以的。
對(duì)比在上述芬蘭專利申請(qǐng)F(tuán)I 884 551中公開的培養(yǎng)皿，本發(fā)明的培養(yǎng)皿具有另外的優(yōu)勢(shì)。在FI 884 551的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)動(dòng)整個(gè)蓋子來(lái)打開或關(guān)閉孔。另外，蓋子延伸到下面皿邊緣的四周。這意味著此旋轉(zhuǎn)不能用一只手進(jìn)行或至少是只能非常困難的以一只手進(jìn)行。但是，對(duì)于醫(yī)學(xué)助手，一只手打開和關(guān)閉是非常需要的。對(duì)于本發(fā)明的培養(yǎng)皿，為了開通單個(gè)孔，不需要轉(zhuǎn)動(dòng)蓋子本身，而是移動(dòng)蓋子的一部分。因此，例如可以將帶有蓋子的培養(yǎng)皿拿在一只手上，而用同一只手的拇指容易地移動(dòng)/轉(zhuǎn)動(dòng)可移動(dòng)部分，如蓋子上的可旋轉(zhuǎn)圓盤。
從下列方面顯而易見，本發(fā)明的培養(yǎng)皿提供了多個(gè)相關(guān)的解決方案以改進(jìn)用于IVF的培養(yǎng)皿技術(shù)，盡管此皿也可以用于其它目的。在下列實(shí)施方案中給出了在培養(yǎng)皿操作中減少熱量損失的其它手段。
基部結(jié)構(gòu)可以包括底杯和包含孔的遮蓋頂部部分。頂部部分和底杯之間的空腔可以用液體(一般為水)充滿，以作為熱量?jī)?chǔ)蓄器，孔壁延伸到所述儲(chǔ)蓄器中與空腔中流體進(jìn)行熱接觸。為了使效率最優(yōu)化，空腔不僅可以延伸到孔壁側(cè)面周圍，還可以延伸到孔底之下。由于空腔的體積大于孔的體積，空腔中的液體用作孔中培養(yǎng)基的有效溫度緩沖液。當(dāng)培養(yǎng)皿從溫度穩(wěn)定的環(huán)境中移出時(shí)，與沒(méi)有和孔熱接觸的液體儲(chǔ)蓄器的培養(yǎng)皿相比，熱量損失顯著減少。如果在具有空氣層流(空氣具有較低的溫度)的工作臺(tái)上操作，這是非常重要的。
同樣，當(dāng)培養(yǎng)皿放在加熱板上，如在培養(yǎng)箱中時(shí)，從加熱板到孔中培養(yǎng)基的傳熱是更加溫和的，這是因?yàn)闊崃勘仨毷紫却┻^(guò)空腔中的液體。
為了確保從加熱板到溫度緩沖液的適當(dāng)熱傳送，底部部分的外面是平面的。一般底杯或頂部部分或二者是用透明材料如聚合物制造的。這種方式下，可以不用打開蓋子而通過(guò)顯微鏡容易地觀察到皿中的細(xì)胞。
可以為大孔提供間隔凹坑或微孔，用來(lái)防止卵母細(xì)胞或胚胎在流體對(duì)流期間在大孔中四處漂浮。通過(guò)將一個(gè)卵母細(xì)胞或胚胎放在此微孔中，操作員知道它的位置并且不需要在培養(yǎng)基中尋找它。微孔的可能形式是圓筒，例如，直徑為0.4mm或更大，甚至直徑為44mm，并且深度為0.3-0.7mm，任選包含一個(gè)圓錐形頂部以易于進(jìn)入和吸取。另外，大孔可以包括用于精液的略大的微孔。略大的微孔與卵母細(xì)胞微孔可以用通道相連接，用來(lái)指導(dǎo)精子從精液微孔到卵母細(xì)胞微孔。
培養(yǎng)皿還可以包括至少一對(duì)操作孔，一般是多對(duì)操作孔，其中至少一對(duì)中的兩個(gè)操作孔通過(guò)微通道連接。此微通道的直徑適用于卵母細(xì)胞大小，例如直徑僅略大于卵母細(xì)胞或是卵母細(xì)胞直徑的幾倍。此類微通道可以用于在通道中受精或用于胚胎的初級(jí)培養(yǎng)階段。其優(yōu)點(diǎn)是，微通道如此狹窄以致于促使流經(jīng)通道的流體非?？拷涯讣?xì)胞，以便沖洗和清潔卵母細(xì)胞。通過(guò)減少培養(yǎng)基的體積，能容易地控制培養(yǎng)基中二氧化碳CO2和氧氣O2的量，這是因?yàn)榻档土藬U(kuò)散常數(shù)。另外，通過(guò)減少體積，細(xì)胞釋放的自分泌/旁分泌物質(zhì)將不會(huì)象在具有較大體積的培養(yǎng)系統(tǒng)中所見的那樣被稀釋，這被認(rèn)為是與卵母細(xì)胞/胚胎的能育/植入性質(zhì)或潛力有關(guān)的優(yōu)勢(shì)。
為了防止卵母細(xì)胞被偶然地沖出微通道，微通道可以包括有障礙物的靜止室，該障礙物阻止卵母細(xì)胞通過(guò)但是允許流體通過(guò)。障礙物可以為例如具有適當(dāng)網(wǎng)孔大小的網(wǎng)。
可將至少一對(duì)操作孔和微通道構(gòu)造成為一個(gè)單元，可以將所述的單元放到頂部部分中并且如果需要從頂部部分更換下來(lái)。例如，制備此單元并且放在不同的位置來(lái)用培養(yǎng)基儲(chǔ)存并且當(dāng)需要時(shí)放到頂部部分中。
培養(yǎng)皿可以包含溫度指示器來(lái)指示孔中培養(yǎng)基的溫度。例如溫度指示器可以包括內(nèi)裝的微傳感器或者通過(guò)改變顏色或改變強(qiáng)度進(jìn)行溫度指示的溫度條。由于孔中培養(yǎng)物的溫度與空腔中液體的溫度近似相等，可以將傳感器放置在只與空腔液體熱接觸的地方。其優(yōu)點(diǎn)是溫度傳感器和卵母細(xì)胞的培養(yǎng)基沒(méi)有直接的接觸，這樣避免了因溫度傳感器可能有菌造成卵母細(xì)胞污染。
培養(yǎng)皿還可以包含培養(yǎng)皿的電子標(biāo)識(shí)，如在RFID(無(wú)線射頻識(shí)別)技術(shù)中所見到的那樣。能夠鑒別各個(gè)培養(yǎng)皿以便于當(dāng)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移回患者中時(shí)不犯錯(cuò)誤是非常重要的。同樣，此技術(shù)可以與患者所攜帶的類似標(biāo)記和身份手鏈結(jié)合。以這種方式可將皿(有細(xì)胞)和患者聯(lián)系起來(lái)。在計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)中，可以將皿的標(biāo)識(shí)儲(chǔ)存并且和特定的患者相關(guān)聯(lián)。因此，本發(fā)明還涉及此類培養(yǎng)皿和旨在由人來(lái)攜帶的與培養(yǎng)皿相關(guān)的ID指示物的組合，其中ID指示物和RFID標(biāo)簽可通過(guò)多種手段相互關(guān)聯(lián)，例如通過(guò)相同的ID號(hào)。
除了獨(dú)特標(biāo)識(shí)之外，還可以加上生產(chǎn)數(shù)據(jù)，例如生產(chǎn)日期、批號(hào)等。
RFID技術(shù)還可以用來(lái)在實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生數(shù)據(jù)，其顯示了皿從培養(yǎng)箱中移出的時(shí)間、培養(yǎng)皿在培養(yǎng)箱外多長(zhǎng)時(shí)間、誰(shuí)進(jìn)行此項(xiàng)操作等。每次有人操作此皿時(shí)，在培養(yǎng)皿內(nèi)的標(biāo)記由RFID讀數(shù)裝置讀出。這是在臨床質(zhì)量控制中有價(jià)值的工具和針對(duì)訴訟(如來(lái)自患者)的重要文件。
本發(fā)明的培養(yǎng)皿可以包含被動(dòng)RFID標(biāo)簽，通過(guò)標(biāo)簽特征的傳遞它只對(duì)呼叫RF信號(hào)應(yīng)答。通過(guò)將這些標(biāo)簽加入到皿中，信息可以在標(biāo)識(shí)區(qū)和控制區(qū)被讀出，ID區(qū)是與建立在手動(dòng)操作細(xì)胞的IVF工作站中的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)相連接的無(wú)線電發(fā)送機(jī)/接收器。隨后，所有的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存通過(guò)與RFID讀數(shù)裝置相連接的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。例如，系統(tǒng)可以儲(chǔ)存培養(yǎng)皿移出培養(yǎng)箱的時(shí)間和放回它們的時(shí)間。另外，在不同工作站中的操作可以通過(guò)ID區(qū)來(lái)識(shí)別并且儲(chǔ)存用于以后的控制。
備選地，培養(yǎng)皿可以包含具有微處理器的主動(dòng)系統(tǒng)和RFID標(biāo)簽。在后一種情況中，參數(shù)例如但不限于溫度、二氧化碳濃度和/或pH、以及其它通過(guò)與微處理器連接的適當(dāng)傳感器測(cè)量的新陳代謝參數(shù)可以作為數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)傳送至微處理器并在其中儲(chǔ)存，之后可以通過(guò)使用RFID技術(shù)從微處理器中讀出數(shù)據(jù)。
通過(guò)向培養(yǎng)皿中加入RFID標(biāo)簽，可以產(chǎn)生溫度日志，其能使胚胎學(xué)家重新取回這一非常重要的信息。此數(shù)據(jù)對(duì)于確認(rèn)和控制培養(yǎng)期是有價(jià)值的。溫度或穩(wěn)定的溫度條件被認(rèn)為是細(xì)胞培養(yǎng)中最重要的。例如，當(dāng)培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中移出的時(shí)間長(zhǎng)度超過(guò)預(yù)先確定的值時(shí)、或參數(shù)如溫度、二氧化碳含量、pH或其它參數(shù)偏離了預(yù)先設(shè)定的區(qū)間時(shí)，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的微處理器可以開始警報(bào)。
可以在皿周圍的水儲(chǔ)蓄器中讀出溫度使得傳感器不接觸孔中的培養(yǎng)物本身。這使污染的危險(xiǎn)性最小。二氧化碳傳感器可以在培養(yǎng)物上面的氣體中測(cè)量二氧化碳含量并且也可以避免污染培養(yǎng)物。
也可以將主動(dòng)加熱元件加入到皿中，使得皿本身可以是自給單元(selfcontained unit)。
為了使錯(cuò)誤的危險(xiǎn)最小，本發(fā)明的培養(yǎng)皿可以包括用于不同時(shí)間設(shè)置的指示器。例如，培養(yǎng)皿可以具有染成特定顏色的部分，其中顏色可以指示一周的日期、細(xì)胞樣品培養(yǎng)在哪里。其中，此部分是旋轉(zhuǎn)盤未被染色的蓋子。僅將蓋子染色的優(yōu)點(diǎn)是不影響對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的顯微觀察，因?yàn)榭椎牡撞窟€是明亮的，并且旋轉(zhuǎn)盤也是明亮的?？梢栽O(shè)想，此顏色指示可以通過(guò)明亮塑料蓋子的明顯可辨性但稍微染色來(lái)實(shí)現(xiàn)。
培養(yǎng)皿的蓋子由頂部部分或底杯的邊緣或通過(guò)這些組合來(lái)支持。如此制造基部部分的結(jié)構(gòu)，即在一個(gè)位置時(shí)，蓋子緊蓋在孔上并且基本關(guān)閉孔，而在第二個(gè)位置上，例如旋轉(zhuǎn)90度或180度的位置上，蓋子放在距離孔具有較小距離之處。當(dāng)培養(yǎng)皿放置在CO2培養(yǎng)箱中，使培養(yǎng)箱中氣體和孔中培養(yǎng)基發(fā)生CO2交換時(shí)，需要此半封閉的位置。
當(dāng)培養(yǎng)皿在培養(yǎng)箱外時(shí)，在蓋子的較低側(cè)會(huì)發(fā)生冷凝。為了防止當(dāng)轉(zhuǎn)動(dòng)蓋子時(shí)在蓋子上的凝聚物會(huì)被刮掉并且掉進(jìn)一個(gè)孔中，在轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)提起蓋子從而防止冷凝物被刮掉。另一方面，當(dāng)沒(méi)有孔開通時(shí)，希望蓋子緊蓋在孔上。為此原因，在另外的實(shí)施方案中，當(dāng)蓋子在所有孔都封閉的位置時(shí)放下蓋子并且當(dāng)向一個(gè)孔被開通的位置轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)略微提起蓋子。此類提起動(dòng)作可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)期間在斜面上的向上滑動(dòng)機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)。如果使用平滑材料如聚合物，蓋子的旋轉(zhuǎn)可以通過(guò)一個(gè)手指的溫和移動(dòng)接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)，即使在斜面上提起-放下時(shí)亦如此。備選地，在通常位于大孔上方的那些位置處將可移動(dòng)部分如圓盤挖穴。在此情形下，凝聚物將位于這些穴中并且不會(huì)在可移動(dòng)部分移動(dòng)期間被刮掉。
從前述顯而易見，本發(fā)明的培養(yǎng)皿具有幾個(gè)優(yōu)于已知技術(shù)的改進(jìn)的相關(guān)特征。使用大孔、操作孔和微通道，本發(fā)明的培養(yǎng)皿可以用于完成卵母細(xì)胞培養(yǎng)，包括受精過(guò)程。大孔和微通道的組合給出了優(yōu)化受精和培養(yǎng)(通過(guò)減少培養(yǎng)物體積并從而制造微環(huán)境)的全部合一的培養(yǎng)系統(tǒng)并且通過(guò)減少細(xì)胞操作減輕了操作的困難。僅使用一個(gè)皿減輕了操作人員的工作并且降低了出現(xiàn)錯(cuò)誤和意外的危險(xiǎn)性。
附圖簡(jiǎn)述參考附圖，將更詳細(xì)的解釋和舉例說(shuō)明本發(fā)明，其中

圖1顯示了培養(yǎng)皿的圖，圖2顯示了培養(yǎng)皿部分的特寫，圖3顯示了如何將安全蓋子和操作把手整合到培養(yǎng)皿完整設(shè)計(jì)的部分中，
圖4顯示了包括頂部部分和底杯的基部結(jié)構(gòu)，圖5a顯示了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，其中將溫度傳感器裝在培養(yǎng)皿中，圖5b顯示了本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，其中將溫度傳感器裝在培養(yǎng)皿中，圖6a顯示了大孔的實(shí)施方案，圖6b顯示了大孔的備選實(shí)施方案，圖6c是大孔的特寫圖示，圖7顯示了操作孔和微通道的實(shí)施方案，圖8顯示了本發(fā)明的實(shí)施方案，其中說(shuō)明了大孔和微通道的相對(duì)位置，圖9顯示了所謂靜止室的實(shí)施方案，圖10顯示了操作孔的特寫圖，圖11顯示了可使用可交換微通道單元的系統(tǒng)中的原理，，圖12顯示了用于微通道單元的加熱塊(warming block)，圖13是培養(yǎng)皿的備選實(shí)施方案。
發(fā)明詳述/優(yōu)選實(shí)施方案在圖1中，圖解說(shuō)明了本發(fā)明培養(yǎng)皿1的實(shí)施方案。培養(yǎng)皿1包括基部結(jié)構(gòu)2和蓋子3?；拷Y(jié)構(gòu)2包括用于培養(yǎng)卵母細(xì)胞和胚胎的多個(gè)大孔4和操作孔14，操作孔通過(guò)微通道5成對(duì)連接用于受精。
培養(yǎng)皿1具有帶有直立凸緣13的操作把手6(在圖3中更加詳細(xì)顯示)，在使用時(shí)將蓋子3放在它們之間的凹進(jìn)部分7中。直立凸緣13在邊緣的凹陷部分12處包圍著蓋子3，使得在用操作把手6操作時(shí)，不會(huì)將蓋子3意外的抬離皿1。因此，操作把手6使得能更安全的拿起皿1。另一方面，當(dāng)要將蓋子3抬離皿1時(shí)，可以通過(guò)手指的夾緊動(dòng)作容易的進(jìn)行，此時(shí)手指放在對(duì)面的凹進(jìn)部分7上蓋子3邊緣的凸出部分12’上，蓋子3在凹進(jìn)部分7中被支撐并且延伸到基部結(jié)構(gòu)2的外圍外面。這可以詳見圖3。
在此顯示了4個(gè)操作把手6，但是對(duì)于本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員顯而易見的是操作把手的數(shù)量可以與圖1中所描述的不同。
蓋子3帶有旋轉(zhuǎn)圓盤8，所述的圓盤可以按照虛線所示圍繞軸9旋轉(zhuǎn)。位于旋轉(zhuǎn)圓盤8下面的蓋子3帶有4個(gè)對(duì)應(yīng)于大孔4的窗口10，并且旋轉(zhuǎn)圓盤8帶有一個(gè)開口11，通過(guò)旋轉(zhuǎn)它可以與窗口10中的一個(gè)對(duì)準(zhǔn)以開通所對(duì)準(zhǔn)窗口10下的大孔4。用蓋子3中的旋轉(zhuǎn)圓盤8，使得一次只能暴露1個(gè)大孔4成為可能。因此，此功能性顯著減少了CO2從大孔4的蒸發(fā)并且由此增加了大孔4中pH的穩(wěn)定性以及溫度穩(wěn)定性。此功能性對(duì)于所培養(yǎng)細(xì)胞的生存力是及其重要的。
在所示的實(shí)施方案中，每次一個(gè)大孔4是開通的或者一個(gè)操作孔14是開通的，以使得其它孔4、14都是被遮蓋的。由于此原因，為了使在蓋子3中具有一個(gè)開口11的位置，將一個(gè)操作孔14或一個(gè)大孔4虛設(shè)并且不用于培養(yǎng)，此時(shí)所有孔均被遮蓋。
同樣，在圖1中還顯示了向下方向的環(huán)狀隆起17，其用作穴，冷凝的水可以聚集在其中而不致于在蓋子3旋轉(zhuǎn)時(shí)被從圓盤8上刮掉。通過(guò)防止這種聚集的水被刮進(jìn)大孔中，減少了污染的危險(xiǎn)性。
在圖2中，顯示了培養(yǎng)皿1的部分的特寫圖，其中圖示了培養(yǎng)皿1的人類工程學(xué)設(shè)計(jì)。操作把手6具有內(nèi)錐邊緣，其具有向著培養(yǎng)皿1底部的負(fù)斜面20。把手6的彎曲面應(yīng)當(dāng)能夠使手方便握住培養(yǎng)皿1。已經(jīng)證明，半徑為36mm或更大的弧形把手6是方便的。人類工程學(xué)設(shè)計(jì)提供了拿起培養(yǎng)皿1時(shí)的更好的把手，并且操作把手6的內(nèi)錐斜面20降低了拿起其周邊時(shí)培養(yǎng)皿1掉下來(lái)的危險(xiǎn)性。
圖3給出了如何將安全蓋3和操作把手6整合到培養(yǎng)皿1的完整設(shè)計(jì)的部分中。把手6是負(fù)向傾斜的，具有最小為8度的斜面20。當(dāng)安全蓋3放在基部結(jié)構(gòu)2上的凹進(jìn)部分7中時(shí)，安全蓋3邊緣的凹陷部分12平放在凸緣13的后面，因此使得在握住凹陷把手6時(shí)不可能偶然提起安全蓋3。當(dāng)安全蓋3需要離開蓋子3時(shí)，在凹進(jìn)部分7中蓋子3邊緣的凸出部分12’的邊緣31提起它。與蓋子邊緣在皿本身邊緣之外的常規(guī)培養(yǎng)皿相比，這具有極大的優(yōu)勢(shì)。使用常規(guī)培養(yǎng)皿可能導(dǎo)致出現(xiàn)操作皿時(shí)僅僅握住蓋子周圍而未握住皿本身的意外。因?yàn)槔缏涯讣?xì)胞和胚胎的供應(yīng)不足，所以避免出現(xiàn)此類意外是重要的。此外，如果需要另外手術(shù)以確保卵母細(xì)胞新的供應(yīng)，則會(huì)對(duì)相關(guān)個(gè)體具有一些危險(xiǎn)性，這會(huì)再次增加相關(guān)個(gè)體和其親屬的心理壓力。
另外在培養(yǎng)皿基部結(jié)構(gòu)2中提供了4個(gè)小洞15，對(duì)應(yīng)于僅在某個(gè)位置適合洞15的4個(gè)針16。在此位置中，蓋子3緊緊適合基部結(jié)構(gòu)2以防止從孔4、14的蒸發(fā)。如果將蓋子旋轉(zhuǎn)180度后放在基部結(jié)構(gòu)上，則針16就偏移了洞15，使得它們不再適合洞15但是放在基部結(jié)構(gòu)2的表面。在此位置上，蓋子3被放置在能為培養(yǎng)孔通風(fēng)的半封閉位置上。
在圖4中圖解說(shuō)明了基部結(jié)構(gòu)2，其包括兩個(gè)主要部分底杯40和遮蓋頂部部分41。頂部部分41可以帶有4個(gè)大孔4和4個(gè)微通道5，每個(gè)微通道連接一對(duì)操作孔14。在這點(diǎn)上需要強(qiáng)調(diào)的是，在某些情況下孔和微通道5的其它構(gòu)造可以是有利的并且本發(fā)明不局限于僅作為實(shí)例說(shuō)明的此構(gòu)造。
可以將頂部部分41和底杯40做成一個(gè)部分或兩個(gè)彼此可拆卸的部分。在后一種情況下，同樣的底杯14可以與不同的頂部部分41一起使用。這使得制造商生產(chǎn)和出售具有能用于廣泛多種目的的多種孔和通道構(gòu)造的備用頂部部分41成為可能。此外，對(duì)于培養(yǎng)皿1的使用者而言，這更加經(jīng)濟(jì)和環(huán)保。
對(duì)頂部部分41進(jìn)行設(shè)計(jì)，使得由于底杯40外圍向底部的負(fù)斜面20，頂部部分41的邊緣將靠在底杯40邊緣的內(nèi)部側(cè)面43上，從而在底杯40和頂部部分41之間留有空腔。
可以用透明滅菌液體填充底杯40和頂部部分41之間的空腔。可以通過(guò)頂部部分41中的兩個(gè)洞44添加液體。對(duì)于本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員顯而易見的是，根據(jù)本發(fā)明，洞44的數(shù)量、大小和位置可以與圖4中所示有所不同。
此透明滅菌液體是培養(yǎng)皿1的溫度穩(wěn)定系統(tǒng)(TSS)的一部分。使用完全填充底杯40和頂部部分41間空腔并完全圍繞培養(yǎng)孔的溫度緩沖液體會(huì)相當(dāng)大地降低孔4、14中培養(yǎng)基的溫度變化。如果使用透明液體，則用透明材料制造的底杯和頂部部分對(duì)培養(yǎng)皿1中細(xì)胞的觀察干擾最小。底部和中間層之間的水層實(shí)際上增強(qiáng)了可見性，事實(shí)上，它只是物鏡和蓋玻片之間的一滴水。通過(guò)從熱表面穿過(guò)圍繞在孔周圍的溫度緩沖液的傳導(dǎo)，將熱量轉(zhuǎn)移到此液體，或者通過(guò)對(duì)流轉(zhuǎn)移熱量(如在培養(yǎng)皿1被放進(jìn)培養(yǎng)箱內(nèi)的情況一樣)。
特定的安全蓋3也是TSS系統(tǒng)的一部分并且是減少溫度變化中很重要部分。蓋子3是絕緣的并且由于它每次僅打開一個(gè)孔4，從孔4的蒸發(fā)保持在最低并且從而減少了熱量損失。
在圖5a中，圖解說(shuō)明了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，其中將溫度傳感器50加進(jìn)培養(yǎng)皿1中?？梢詫囟葌鞲衅餮b入TSS系統(tǒng)的儲(chǔ)蓄器中。儲(chǔ)蓄器和培養(yǎng)基的溫度基本相同或者少量偏離，因此，傳感器給出了培養(yǎng)基中溫度的間接測(cè)量。在圖5b中，圖解說(shuō)明了本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，其中將溫度傳感器51放在培養(yǎng)皿1的中心。
有幾個(gè)原因使得將傳感器放在儲(chǔ)蓄器中如果將它放在和細(xì)胞相同的地方，胚胎學(xué)家會(huì)擔(dān)心胚胎被污染，其次在顯微觀察時(shí)傳感器會(huì)防礙觀察。在這點(diǎn)上需要強(qiáng)調(diào)的是，培養(yǎng)皿1可以用來(lái)培養(yǎng)除胚細(xì)胞外的其它類型的細(xì)胞，但是由于IVF是培養(yǎng)皿1的主要用途，所以在本申請(qǐng)中重復(fù)提到這一科學(xué)。備選地，內(nèi)置溫度傳感器50和51是微傳感器或LC溫度條。
在圖6a中，顯示了帶有用于卵母細(xì)胞的4個(gè)微孔60和一個(gè)用于精液的較大微孔61的大孔，微孔60和較大微孔61被放置在4個(gè)大孔4的中間。在圖6b中圖解說(shuō)明了大孔4的另一個(gè)實(shí)施方案，所述大孔包含4個(gè)用于卵母細(xì)胞的微孔60和一個(gè)用于精液的微孔61，其中微孔61中的精液微孔通過(guò)通道70與含有卵母細(xì)胞的微孔60相連。通道70指導(dǎo)精細(xì)胞到卵母細(xì)胞并且使受精最優(yōu)化。
在圖6c中，顯示了微孔60的可能構(gòu)造，其通過(guò)錐形物(cone)67所示放大。微孔60具有用來(lái)存放卵母細(xì)胞/胚胎的圓筒形下部部分65以及易于移液管進(jìn)入的錐形上部部分66。
在圖7中圖解說(shuō)明了具有微通道5的一對(duì)操作孔14的實(shí)施方案，其中微通道的整體形狀主要是圓筒形。在圖8中圖解說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施方案，其中顯示了大孔4和微通道5的相對(duì)位置。
操作孔14使得在微培養(yǎng)通道5中操作細(xì)胞成為可能。如在圖10(操作孔14的特寫圖)中更詳細(xì)的圖解，此操作可以通過(guò)移液管進(jìn)行。此類操作孔14(其中使用常規(guī)移液管引入培養(yǎng)基或細(xì)胞并且在微培養(yǎng)通道5中產(chǎn)生壓力或真空)是有利的，因?yàn)樵谖⑴囵B(yǎng)通道5中不需要特別的工具操作細(xì)胞。移液管尖端100顯示為虛線。此設(shè)計(jì)的獨(dú)特功能性表明，移液管尖端100是多么適合微培養(yǎng)通道5的管口構(gòu)造63。此管口構(gòu)造63傾斜使得在用移液管移液的同時(shí)進(jìn)行顯微觀察成為可能。將管口構(gòu)造63放在微通道5的任意一端。
當(dāng)插入到微通道時(shí)，可以將卵母細(xì)胞91放在靜止室(在圖9中更詳細(xì)顯示)中。在圖91中，只顯示了一個(gè)胚胎91，但是將幾個(gè)胚胎同時(shí)放在一個(gè)微培養(yǎng)通道5中也沒(méi)有問(wèn)題。
通過(guò)將胚胎經(jīng)由移液管100沖洗到微通道中，可以將它們放入到微通道5中。相反，通過(guò)使用真空可以將卵母細(xì)胞從微通道5中移出。真空通過(guò)移液管等產(chǎn)生。壓力和真空用來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞、添加和移除培養(yǎng)基以及移除堆積的細(xì)胞。
微通道5的另一個(gè)性質(zhì)是，它可以以如下方式傾斜，即通過(guò)重力推動(dòng)的將胚胎移動(dòng)到微培養(yǎng)通道5的靜止室64中。
在圖9中圖解說(shuō)明了所謂的靜止室64(包含胚胎91)的實(shí)施方案。障礙物92用來(lái)防止在進(jìn)行剝脫、換培養(yǎng)基等時(shí)，胚胎91漏出微通道5。特定的障礙物92使得在靜止室64中移除胚胎的堆積復(fù)合物成為可能。障礙物92還防止了胚胎91在換培養(yǎng)液或其它操作時(shí)被吸走。
培養(yǎng)皿的功能性使得用立體顯微鏡和倒置顯微鏡觀察細(xì)胞成為可能。靜止室64(在培養(yǎng)時(shí)靜止)也可用于同時(shí)觀察。由于皿的材料是透明的，可以在不移除蓋子3的情況下監(jiān)控細(xì)胞。
在圖11中圖解說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施方案，說(shuō)明了在可以使用不同大小的微通道單元111的可交換系統(tǒng)中的原理。本設(shè)的計(jì)獨(dú)特功能性使得用具有不同尺寸或功能的其它微培養(yǎng)單元更換單個(gè)微培養(yǎng)通道單元111成為可能。這是使培養(yǎng)皿1更加通用的另一個(gè)方面。
在圖12中圖解說(shuō)明，其中單獨(dú)的微培養(yǎng)通道單元111可以放置在加熱塊120中。加熱塊120具有和培養(yǎng)皿1相同類型的蓋子3。加熱塊120可以是圓的、矩形的或任何其它所需的形狀并且包括多個(gè)微通道單元111、大孔4和微孔(60、61)或它們的組合。
在圖13中，顯示了本發(fā)明的培養(yǎng)皿1的備選實(shí)施方案。此皿1包括5個(gè)大孔4，其中4個(gè)大孔具有微孔60并用于培養(yǎng)，并且第五個(gè)孔4’沒(méi)有微孔，其用于清洗/沖洗目的。此培養(yǎng)皿1另外包括用圓形壁131圍繞的圓形區(qū)域130，在其中有溫度緩沖水儲(chǔ)蓄器。底杯40中的圓形壁131具有這種優(yōu)點(diǎn)，即當(dāng)裝配培養(yǎng)皿1時(shí)，它能容易和安全的緊貼在頂部部分41中相應(yīng)的密封環(huán)上。通過(guò)中央孔44’將水加入到壁131內(nèi)的儲(chǔ)蓄器重。備選地，此皿可以由5個(gè)具有微孔的大孔以及5個(gè)沒(méi)有微孔的大孔組成。
如前所述，本發(fā)明的培養(yǎng)皿提供了幾個(gè)相關(guān)的解決方案以改進(jìn)用于IVF的培養(yǎng)皿的技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)皿(1)，其包括帶有多個(gè)用于培養(yǎng)卵母細(xì)胞的大孔(4)的基部結(jié)構(gòu)(2)，此培養(yǎng)皿另外包括具有可移動(dòng)部分(8)的蓋子(3)，可移動(dòng)部分(8)具有適合大孔(4)大小的開口(11)，可移動(dòng)部分(8)在第一個(gè)位置和其它位置之間移動(dòng)，其中在第一個(gè)位置上時(shí)所有大孔被蓋子(3)關(guān)閉，在其它位置上時(shí)，對(duì)于每個(gè)其它位置開口(11)對(duì)準(zhǔn)一個(gè)大孔(4)以允許每次通過(guò)蓋子(3)中的開口(11)僅僅開通一個(gè)大孔。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的培養(yǎng)皿，其中可移動(dòng)部分是可以在第一個(gè)位置和其它位置之間旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)動(dòng)圓盤(8)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的培養(yǎng)皿，其中蓋子(3)被構(gòu)造成在第一個(gè)位置中時(shí)具有低的狀態(tài)以便在第一個(gè)位置中時(shí)緊密遮蓋住孔(4)，并且在其它位置上具有升高的狀態(tài)以防止在旋轉(zhuǎn)期間刮掉凝聚物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的培養(yǎng)皿，其中可移動(dòng)部分(8)被構(gòu)造成具有適合大孔的作為穴的的隆起(17)，其用于將凝聚物聚集在穴中以防止在可移動(dòng)部分(8)移動(dòng)時(shí)從可移動(dòng)部分上刮掉凝聚物。
5.根據(jù)前面權(quán)利要求任意一項(xiàng)的培養(yǎng)皿，其中基部結(jié)構(gòu)(2)包括底杯(40)和頂部部分(41)，所述的基部結(jié)構(gòu)在底杯(40)和頂部部分(41)之間具有空腔，頂部部分(41)包括孔(4)，其中孔(4)的壁延伸到空腔中用于和空腔中的流體熱接觸以便于當(dāng)空腔中存在液體時(shí)空腔作為孔的熱儲(chǔ)蓄器。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的培養(yǎng)皿，其中空腔延伸到孔(4)壁的側(cè)面周圍以及孔(4)底部的下面。
7.根據(jù)前面權(quán)利要求任意一項(xiàng)的培養(yǎng)皿，其另外包括至少一對(duì)操作孔(14)，至少一對(duì)的兩個(gè)操作孔(14)用微通道(5)連接，微通道(5)的直徑具有適合于卵母細(xì)胞大小的大小。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的培養(yǎng)皿，其中微通道(5)包括具有障礙物(92)的靜止室(64)，所述障礙物用來(lái)防止卵母細(xì)胞(91)穿過(guò)障礙物(92)但是允許流體穿過(guò)障礙物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的培養(yǎng)皿，其中將至少一對(duì)操作孔(42、62)和微通道(5)構(gòu)造成為一個(gè)單元(111)，在頂部部分(41)中單元是可安置和可更換的。
10.根據(jù)前面權(quán)利要求任意一項(xiàng)的培養(yǎng)皿，其中培養(yǎng)皿包括用于指示孔中培養(yǎng)基溫度的溫度指示器(50、51)。
11.根據(jù)前面權(quán)利要求任意一項(xiàng)的培養(yǎng)皿，其中培養(yǎng)皿包括用于識(shí)別的RFID標(biāo)簽。
12.根據(jù)前面權(quán)利要求任意一項(xiàng)的培養(yǎng)皿，其中培養(yǎng)皿包括至少一個(gè)用于測(cè)量培養(yǎng)溫度、pH或二氧化碳濃度的傳感器，其中所述傳感器具有電子讀出器。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的培養(yǎng)皿，其中培養(yǎng)皿包括與電子讀出器相連接的微處理器，所述微處理器用于接收和處理來(lái)自傳感器的電子信號(hào)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的培養(yǎng)皿，其中為微處理器編寫程序，使得當(dāng)至少一個(gè)傳感器測(cè)量參數(shù)超出預(yù)定范圍時(shí)微處理器會(huì)產(chǎn)生警報(bào)信號(hào)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的培養(yǎng)皿，其中培養(yǎng)皿包括主動(dòng)RFID標(biāo)簽，它與微處理器電子連接用來(lái)將數(shù)據(jù)從微處理器傳遞到遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)。
16.根據(jù)權(quán)利要求11或從屬于權(quán)利要求11的權(quán)利要求12-15中任意一項(xiàng)的培養(yǎng)皿與旨在由人攜帶的與培養(yǎng)皿相關(guān)的ID指示物的組合，其中ID指示物和RFID標(biāo)簽通過(guò)多種手段相互關(guān)聯(lián)。
全文摘要
一種培養(yǎng)皿，其包括具有多個(gè)用于培養(yǎng)卵母細(xì)胞和胚胎的大孔(4)的基部結(jié)構(gòu)(2)，此培養(yǎng)皿另外包括具有可移動(dòng)部分(8)的蓋子(3)，可移動(dòng)部分(8)具有適合大孔(4)尺寸的開口(11)，可移動(dòng)部分(8)在第一個(gè)位置和其它位置之間移動(dòng)，其中可移動(dòng)部分(8)在第一個(gè)位置上時(shí)所有大孔被蓋子(3)關(guān)閉，在其它位置時(shí)對(duì)于每一個(gè)其它位置(11)開口(11)和一個(gè)大孔(4)對(duì)準(zhǔn)以便允許通過(guò)蓋子(3)中的開口(11)開通此大孔(4)。
文檔編號(hào)C12M1/22GK1989237SQ200580024994
公開日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2005年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月24日
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