專利名稱：：在噬菌體中產(chǎn)生重組基因的制作方法在噬菌體中產(chǎn)生重組基因本發(fā)明涉及在噬菌體或含噬菌體序列的質(zhì)粒中產(chǎn)生和檢測重組DNA序列的體內(nèi)方法，利用噬菌體和含噬菌體序列的質(zhì)粒產(chǎn)生雜合基因和由這些雜合基因編碼的雜合蛋白的方法，可用于這些方法的噬菌體和質(zhì)粒，以及包括合適的細菌宿主細胞和噬菌體或質(zhì)粒的試劑盒。與這些方法相關(guān)的DNA序列包括蛋白質(zhì)編碼序列和非編碼序列。用于開發(fā)酶的新特性的傳統(tǒng)誘變手段，如定點誘變、隨機誘變和易錯PCR有許多限制。這些手段只適用于已被克隆并進行功能鑒定，并且具有無關(guān)功能的基因或序列。還有，傳統(tǒng)誘變手段只能探測數(shù)目非常有限的置換總數(shù)，即便是對于單個基因也是如此。然而，在某些情況下，不只修飾一個基因，而還要修飾其他的基因，以表達具有新特性的蛋白質(zhì)可能是有必要的。這些其他的基因可以是例如互相協(xié)同而賦予單一表型的基因，或者是在一種或多種細胞機理如轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾、分泌或基因產(chǎn)物的蛋白水解降解中起作用的基因。通過傳統(tǒng)誘變手段分別優(yōu)化具有這種功能的所有基因的努力實際上將會是不可能的任務(wù)。另外，許多傳統(tǒng)誘變手段都以遺傳工程方法如限制酶切和連接的應(yīng)用為基礎(chǔ)。然而，所述限制酶切-連接手段有幾種實踐限制，即只有當(dāng)可得到方便的限制性位點時DNA分子才能夠精確組合，并且由于有用的限制性位點通常在長的DNA中重復(fù)，因而能夠被操作的DNA片段的大小是有限制的，通常為小于約20kb。大多數(shù)與傳統(tǒng)誘變手段相關(guān)的問題都能夠通過重組手段克服，所述重組手段必然伴隨隨機重組功能性基因的不同序列，使天然類似的或隨機突變的基因能夠進行分子混合。由于其試驗簡易性和不存在DNA-序列所施加的限制，重組提供改選DNA的替代方法。另外，使用重組手段獲得表型改善的突變的概率明顯高于應(yīng)用傳統(tǒng)誘變方法包括遺傳工程技術(shù)獲得突變的概率。重組與DNA復(fù)制和修復(fù)緊密偶聯(lián)。重組與DNA復(fù)制之間的這種緊密相互關(guān)系首先在噬菌體T4和相關(guān)的T-偶數(shù)噬菌體中發(fā)現(xiàn)。因為T4及其宿主埃希氏大腸桿菌(Escherichiacoli)的DNA在堿基組成和修飾上有所不同，并且因為噬菌體感染后宿主DNA被快速降解，所以T4復(fù)制和重組的分子狀態(tài)可以很容易地通過生物化學(xué)、生物物理學(xué)、和遺傳學(xué)方法研究。大多數(shù)必須基因中突變的早期鑒定和復(fù)制與重組對噬菌體編碼蛋白幾乎完全的依賴性允許分析重組和復(fù)制蛋白，以及用遺傳學(xué)和生化方法所獲得的結(jié)果的"真實性一企查(realitychecks)"。不考慮噬菌體中重組的詳細特征，與其中存在許多引發(fā)重組的不同系統(tǒng)的單細胞生物如細菌或酵母相反，只有少數(shù)引發(fā)重組的基于噬菌體的系統(tǒng)是已知的，其可用于產(chǎn)生新的嵌合或雜合基因。然而，大多數(shù)基于噬菌體的這些系統(tǒng)都有幾個缺點。特別是，大多數(shù)基于噬菌體的系統(tǒng)都不能容易有效地一企測新重組的DNA序列。因此，本領(lǐng)域仍然需要有效的噬菌體^r測系統(tǒng)，該系統(tǒng)特別允許在選擇壓力下快速筒單地檢測重組體和/或選擇重組體。因此本發(fā)明根本的技術(shù)問題是提供在噬菌體系統(tǒng)中簡單有效地產(chǎn)生重組嵌合基因的改進的方法和手段(means),特別是篩選和檢測這種重組序列的改進的方法和手段。本發(fā)明通過提供在包含噬菌體和細菌宿主細胞的系統(tǒng)中制備并檢測重組DNA序列的方法來解決該根本性技術(shù)問題，其中噬菌體包含側(cè)翼有要重組的第一個和第二個DNA序列的啟動子和位于第一個DNA序列下游的至少第一種標(biāo)志基因，其中兩個DNA序列之間的重組導(dǎo)致啟動子以翻滾(flip-flop)方式翻轉(zhuǎn)，并且，取決于啟動子的方向，一個或另一個DNA序列和至少第一種標(biāo)志基因能夠被轉(zhuǎn)錄或不被轉(zhuǎn)錄，該方法包括步驟a)在選擇性條件下孵育含噬菌體的第一種宿主細胞，在這樣的條件下，只有啟動子的方向使第一種標(biāo)志基因的基因產(chǎn)物表達時，才允許細胞和/或噬菌體增殖，和b)分離衍生于第一種宿主細胞的噬菌體后代，所述噬菌體后代生長和/或增殖于選擇性條件下，并包含第一個和第二個重組DNA序列。本發(fā)明提供基于噬菌體的系統(tǒng)，以在體內(nèi)篩選至少兩個有差別的(divergent)DNA序列或重組底物之間的重組事件。本發(fā)明的系統(tǒng)允許通過涉及來自兩個重組底物的DNA體內(nèi)交換的方法以快速有效的方式產(chǎn)生新的有益的DNA序列，所述DNA序列具有改善的特性，其中所述兩個重組底物也就是以翻轉(zhuǎn)的方向位于噬菌體上的要重組的兩個有差別的DNA序列。在所述噬菌體上，這兩個重組底物以給定構(gòu)象位于啟動子的側(cè)翼。該啟動子能夠以翻滾方式(flip-flop)改變其方向。取決于啟動子的方向，兩個重組底物中的一個或另一個被轉(zhuǎn)錄，類似地，重組底物下游的標(biāo)志基因也處于該轉(zhuǎn)此允許選擇特定的啟動子方向。由于涉及兩個重組底物的交換重組導(dǎo)致啟動子翻轉(zhuǎn)，因而可以在選擇特定下游標(biāo)志基因表達的條件下鑒定重組體。在本發(fā)明的重組方法中，在選擇第一種標(biāo)志基因的基因產(chǎn)物存在的條件下孵育包含噬菌體的宿主細胞。所使用的選擇性條件包括這些條件如果第一種標(biāo)志基因的基因產(chǎn)物被表達，則這些條件阻止宿主細胞的生長和/或增殖并因此還阻止噬菌體的增殖。這意味著只有第一種標(biāo)志基因自存在于本發(fā)明載體上的啟動子轉(zhuǎn)錄時宿主細胞的增殖和噬菌體的增殖才能發(fā)生，意。未著所述啟動子必須由于兩個要重組的DNA序列之間的重組而翻轉(zhuǎn)了它的方向，以使之能夠引導(dǎo)第一種標(biāo)志基因轉(zhuǎn)錄。因此，可以很容易地通過在選擇性條件下孵育宿主細胞而追蹤重組事件，所述選擇性條件選擇啟動子的翻轉(zhuǎn)并因此選擇重組DNA序列的產(chǎn)生。然而，本發(fā)明的方法具有可重復(fù)的優(yōu)勢，即其允許更多輪的重組。這些更多輪的重組以啟動子的翻轉(zhuǎn)為基礎(chǔ)，啟動子的翻轉(zhuǎn)起因于涉及兩個重組底物的交換重組。啟動子在第二輪重組中的翻轉(zhuǎn)有以下結(jié)果，即第一種標(biāo)志基因不能再被轉(zhuǎn)錄。然而，啟動子翻轉(zhuǎn)使現(xiàn)在相對于第一種標(biāo)志基因，位于啟動子另一側(cè)的其它標(biāo)志基因可以被轉(zhuǎn)錄。因此，包含第一輪重組的產(chǎn)物即第一個和第二個重組DNA序列的噬菌體后代可以再次被導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，以引發(fā)第二輪重組。在本發(fā)明方法的一個實施方案中，包含第一輪重組中獲得的噬菌體后代的宿主細胞在選擇第一種標(biāo)志基因的基因產(chǎn)物缺失的條件下孵育。在另一實施方案中，包含第一輪重組中獲得的噬菌體后代的宿主細胞在選擇第二種標(biāo)志基因的基因產(chǎn)物存在的條件下孵育。以此方式，可以通過簡單地改變選擇性條件并選擇啟動子的交替翻轉(zhuǎn)而進行多輪重組。因此，本發(fā)明的方法提供鑒定重組DNA序列的簡易快速的選擇系統(tǒng)，其基于標(biāo)志基因的交替表達，所述交替表達取決于啟動子的方向。根據(jù)本發(fā)明，開發(fā)了兩種選擇策略以在體內(nèi)高效構(gòu)建和檢測嵌合基因。這些選擇策略基于裂解性和溫和性噬菌體的不同生活周期，允許檢測裂解期期間的或作為細菌溶原菌的重組體。例如，在噬菌體發(fā)育的裂解期期間檢測的例子中，所述選擇以噬菌體本身的一個或多個基因，如入gam基因的表達或不表達為基礎(chǔ)。在插入序列的一個方向上，自啟動子的轉(zhuǎn)錄激活例如gaw基因，其允許在EcolirecA菌苔上形成噬菌斑并阻止在五.P2溶原菌菌莒上形成噬菌斑。當(dāng)啟動子以反方向存在時，gam不轉(zhuǎn)錄則允許P2溶原菌上的裂解生長并阻止re"宿主上的生長。然而，重組體也可以作為溶原菌，即在其染色體中含有前噬菌體形式的噬菌體基因組回收，而不是作為噬菌斑回收。在一個方向上啟動子可以激活表達抗生素抗性標(biāo)志的基因且在另一方向上其激活另一表達不同抗生素抗性標(biāo)志的基因，而不是激活gflm基因的轉(zhuǎn)錄。利用本發(fā)明的兩種不同選擇策略，驚奇地發(fā)現(xiàn)噬菌體特別是噬菌體X以10-3至10-6的頻率有效地重組有差別的序列，該頻率取決于差別的程度。對于利用Xr^和ga附基因作為標(biāo)志基因的重組來說尤其是這樣，其中獲得了10-3的重組頻率。如果使用錯配修復(fù)缺陷型宿主細胞如Eco"AmMW突變體，則獲得更高的頻率。用本發(fā)明的方法獲得的結(jié)果是令人驚訝的，因為迄今為止只知道噬菌體能夠重組非常相似的，幾乎相同的序列，如Kleckner和Ross(J.Mol.Biol.，144(1980),215-221)所述。然而，關(guān)于噬菌體重組有差別的序列特別是差別非常大的序列的能力卻一無所知。因此，本發(fā)明產(chǎn)生和;f企測噬菌體中的重組DNA序列的方法的優(yōu)勢在于能夠重組差異非常大的DNA序列。出人意料地，發(fā)現(xiàn)能夠重組總體差異程度很高且只共享非常短片段的同源性或同一性的序列。重組序列的分析顯示發(fā)生重組的同一性序列中只能夠包含少許核苷酸，例如少于10個核苷酸。利用本發(fā)明的方法獲得的重組底物的多樣化顯然是非常有效的。不能鑒定明顯的重組熱點。在42種"flip"重組體中只有三種鑒定了相同的重組產(chǎn)物，它們都是通過重組兩個相同的有差別的序列即Oxa7和Oxa5獲得的。有利地，本發(fā)明的方法可以在野生型或錯配修復(fù)缺陷型細菌宿主細胞中實施。修復(fù)破壞的DNA的方法與遺傳重組的機理是緊密相關(guān)的，并且已知錯配修復(fù)機構(gòu)對有差別的序列之間重組即部分同源重組的頻率有抑制性影響。因此錯配修復(fù)系統(tǒng)的突變大大增強了細菌細胞中重組事件的總頻率。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)如果將錯配修復(fù)缺陷型細菌宿主細胞用于本發(fā)明的方法，則能夠?qū)嵸|(zhì)性地提高重組的頻率。例如，五.co/Z/l/m^S突變體中重組的頻率大約比相應(yīng)野生型細胞中高十倍。另外，發(fā)現(xiàn)如果在錯配修復(fù)缺陷型背景如在/m/W背景中實施本發(fā)明的方法，除了產(chǎn)生新的嵌合基因之外，重組還伴隨點突變的引入。與所用底物序列在序列水平上觀測到的多樣化一起，利用本發(fā)明的方法獲得的結(jié)果顯示，可以利用本發(fā)明提供的噬菌體工具在定向進化試驗中構(gòu)建大型多樣化基因文庫。用本發(fā)明的方法可以很容易地制備大型的重組、突變DNA序列的文庫，然后獲得了所需功能的變體可以利用適當(dāng)?shù)倪x擇或篩選系統(tǒng)鑒定。另外，本發(fā)明噬菌體用于引發(fā)重組方法的用途具有DNA序列操作容易和能夠在大型噬菌體群體中研究同步誘導(dǎo)的特定重組事件的明顯優(yōu)勢。因此，利用噬菌體能夠在短時間內(nèi)實施多輪重組，產(chǎn)生許多新的重組DNA序列。本發(fā)明在噬菌體中產(chǎn)生和纟全測重組DNA序列的方法的優(yōu)選實施方案涉及第二輪重組，包括步驟a)將1b)中獲得的噬菌體后代導(dǎo)入到第二種細菌宿主細胞中，b)在選擇性條件下孵育含噬菌體后代的第二種宿主細胞，在這樣的條件下，只有啟動子的方向使第一種標(biāo)志基因的基因產(chǎn)物不表達，才允許細胞和/或噬菌體的增殖，和c)分離衍生于第二種宿主細胞的噬菌體后代，所述噬菌體后代生長和/或增殖于選擇性條件下，并包含第三個和第四個重組DNA序列。在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實施方案中，通過對第二輪重組中獲得的噬菌體后代進行至少一次引發(fā)第一輪重組的另一步驟循環(huán)或引發(fā)第一和第二輪重組的另一步驟循環(huán)，產(chǎn)生更多的重組DNA序列。根據(jù)本發(fā)明，通過將包含啟動子側(cè)翼的兩個重組底物和第一種標(biāo)志基因的噬菌體導(dǎo)入到合適的細菌細胞中而制備含噬菌體的第一和/或第二種細菌宿主細胞，從而允許噬菌體進入裂解或溶菌生活周期。在本發(fā)明的上下文中，"噬菌體"是具有活力特征和非活力特征的病毒，其只感染細菌。特別地，所述噬菌體由DNA組成。有兩種主要的噬菌體類型，即裂解性噬菌體和溫和噬菌體。在溶菌性生活周期中自始至終進行復(fù)制的裂解性噬菌體終止其感染并突破宿主細胞的外殼，即裂解宿主細菌，以將其后代釋放到胞外環(huán)境中。溫和噬菌體是能夠顯示溶原性感染的噬菌體。溶原性感染以包含噬菌體的宿主細菌既不產(chǎn)生噬菌體后代也不將噬菌體后代釋放到胞外環(huán)境中為特征。相反，噬菌體的遺傳物質(zhì)插入或整合到宿主菌的DNA中。噬菌體的遺傳物質(zhì)與宿主細菌的DNA—起增殖。溫和噬菌體典型地顯示作為其營養(yǎng)期即非溶原期的裂解周期。根據(jù)本發(fā)明用于導(dǎo)入噬菌體的宿主細胞可以是不包含前噬菌體的細胞，或者是在其基因組中已含有前噬菌體的細胞，即溶原菌。在后一種情況中，優(yōu)選前噬菌體和所導(dǎo)入的噬菌體共有一些同源序列，以使導(dǎo)入的噬菌體能夠通過重組整合到宿主細胞的基因組中。在本發(fā)明方法特別優(yōu)選的實施方案中，所使用的噬菌體是噬菌體入。X噬菌體是溫和噬菌體，其能夠顯示裂解性或溶原性感染。X噬菌體有其自身的重組系統(tǒng)0^/)。Xcrosses中Red介導(dǎo)的重組的特征是斷裂-與-接合(break-and-join)機制、非交互性DNA交換和占總基因組大約10%的長度的異源雙鏈。然而，如果X自身的重組基因是突變的，那么它能夠通過宿主重組系統(tǒng)重組。在具有mi—g"附—喧菌體的crosses中，重組使用Eco/Z的re^4和rec5C基因。特征是斷裂-與-接合機制，可能為DNA的交互性交換并且通常為重組的熱點。在本發(fā)明的另一實施方案中，包含噬菌體的第一種細菌宿主細胞通過將包含噬菌體序列的質(zhì)粒、位于啟動子側(cè)翼的所要重組的兩個DNA序列和至少第一種標(biāo)志基因?qū)氲饺茉?，即在其基因組中含有前噬菌體的細胞中而制備。前噬菌體優(yōu)選包含與質(zhì)粒中所包含的噬菌體序列同源的序列，使包含啟動子和兩個側(cè)翼重組底物的質(zhì)粒的至少一部分和第一種標(biāo)志基因能夠整合到宿主細胞的基因組中。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，將來自這種質(zhì)粒的線性序列導(dǎo)入到溶原菌中以制備第一種細菌宿主細胞。在本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的實施方案中，所使用的質(zhì)粒為質(zhì)粒pMIX-LAM，它是質(zhì)粒pACYC184的衍生物，其包含pL+N啟動子區(qū)和噬菌體X的側(cè)翼序列cl+rexa和cIII+IS10。另夕卜pMIX-LAM還包含D^基因。所述載體還包含多克隆位點MCS1和MCS2，其位于包含啟動子的人pL+N片段的側(cè)翼，用于插入外源DNA序列。在X側(cè)翼區(qū)域cI和cIII中用適當(dāng)?shù)南拗泼讣羟邪亟M的兩個DNA序列的質(zhì)粒DNA,產(chǎn)生包含重組底物的片段和能夠被靶向到受體宿主溶原菌中的入基因組的片段。在本發(fā)明方法的又一特別優(yōu)選的實施方案中，所使用的載體是質(zhì)粒pAC-OX-OY,其來源于低拷貝數(shù)質(zhì)粒并包含colEl復(fù)制起點。質(zhì)粒pAC-OX-OY另外還包含位于兩個重組底物側(cè)翼的兩個抗性標(biāo)志5^,和CmR,和位于重組底物末端的耙向序列LG和LD。所述耙向序列促進整合至入前噬菌體基因組中。包含重組底物的線性DNA片段通過限制酶切和純化或者通過表達盒(cassette)的PCR擴增獲得。在本發(fā)明的上下文中，"啟動子"為位于DNA序列如蛋白質(zhì)編碼序列上游的DNA區(qū)域，RNA-聚合酶能夠結(jié)合該DNA區(qū)域。如果啟動子處于正確的方向，那么位于下游的DNA序列的轉(zhuǎn)錄可以被啟動。根據(jù)本發(fā)明，所述啟動子的側(cè)翼為所要重組的兩個不相同的DNA序列，這兩個DNA序列以翻轉(zhuǎn)構(gòu)型存在。這兩個DNA序列之間的重組導(dǎo)致啟動子的翻轉(zhuǎn)。兩個側(cè)翼DNA序列之間的另一重組再次導(dǎo)致啟動子翻轉(zhuǎn)，如此所述啟動子翻轉(zhuǎn)回其原來的方向。因此，用于本發(fā)明的啟動子受制于翻滾機制，通過翻滾機制，啟動子方向在每輪重組中被翻轉(zhuǎn)。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，所述啟動子為X的pL啟動子。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，所述啟動子為人工啟動子Pro。根據(jù)本發(fā)明，用于制備第一種細菌宿主細胞的噬菌體或質(zhì)粒包含至少一種標(biāo)志基因即第一種標(biāo)志基因。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"標(biāo)志基因"指獨特的編碼蛋白質(zhì)的DNA序列，其只存在于所使用的噬菌體或質(zhì)粒上，而不存在于宿主細胞基因組的其他位置，并且位于噬菌體或質(zhì)粒上兩個重組底物中一個或兩個已重組DNA序列中一個的下游和所4吏用的啟動子的下游。在作為重組底物的相同DNA分子上或已重組的DNA序列上存在一個或多個標(biāo)志基因，可使重組事件發(fā)生，從而可以識別和選4奪重組DNA序列，特別是用遺傳學(xué)方法進行識別和選擇。根據(jù)本發(fā)明，第一種標(biāo)志基因位于要重組的第一個DNA序列的下游，并且也位于啟動子的下游。這種排列允許選擇涉及兩個重組底物即兩個要重組的DNA序列的交換(crossovers)，因為第一個和第二個DNA序列之間的重組導(dǎo)致啟動子翻轉(zhuǎn)，由此，依據(jù)啟動子的方向，第一種標(biāo)志基因能夠或不能夠被轉(zhuǎn)錄。因此第一種標(biāo)志基因基因產(chǎn)物的存在或缺失可用于選擇重組事件。這種排列也允許重復(fù)實施更多輪重組。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，第一種標(biāo)志基因選自X基因、營養(yǎng)標(biāo)志基因、抗生素抗性標(biāo)志基因和編碼酶亞基的序列。"營養(yǎng)標(biāo)志"是編碼基因產(chǎn)物的標(biāo)志基因，所述基因產(chǎn)物能夠補償生物或細胞的營養(yǎng)缺陷，并因此能夠在該營養(yǎng)缺陷型生物或細胞上賦予其原養(yǎng)型。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"營養(yǎng)缺陷型，，意思是生物或細胞必須生長在含有不能由營養(yǎng)缺陷型生物本身合成的必需營養(yǎng)的培養(yǎng)基中。營養(yǎng)標(biāo)志基因的基因產(chǎn)物促進營養(yǎng)缺陷型細胞中缺失的這種必需營養(yǎng)的合成。因此，營養(yǎng)標(biāo)志基因表達時，無需向培養(yǎng)所述生物或細胞的培養(yǎng)基添加該必需營養(yǎng)，因為所述生物或細胞已獲得原養(yǎng)型。"抗生素抗性標(biāo)志"是一種標(biāo)志基因，其表達的基因產(chǎn)物賦予表達它的細胞在給定濃度的指定抗生素存在下生長的能力，而沒有抗生素抗性標(biāo)志的細胞不能生長。如果細胞不能合成組裝完整酶結(jié)構(gòu)和獲得完全酶活性所需的所有酶亞基，并且如果酶活性的存在或缺失能夠通過遺傳學(xué)手段監(jiān)測，則"編碼酶亞基的序列"可以用作標(biāo)志基因。例如，如果酶活性是細胞的基本生化途徑所需的，所述基本生化途徑使細胞能夠在特定環(huán)境中生長和/或增殖，并且所述細胞不能合成完整酶結(jié)構(gòu)的所有組件，那么所述細胞不能在該環(huán)境中存活。因此，表達時，用作標(biāo)志基因的"編碼酶亞基的序列，，允許完整酶的組裝和細力包存活。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，第一種標(biāo)志基因是X的gaw基因。gam基因連同redX(或exo)和redb屬于引發(fā)重組的三種X基因。沒有Gam,X不能啟動滾動復(fù)制循環(huán)，因為RecBCD降解被置換的DNA線性末端。在本發(fā)明的方法中，gam基因自啟動子尤其是pL的轉(zhuǎn)錄允許在埃希氏大腸桿菌^"宿主細胞的菌苔上形成噬菌斑，并阻止在E.coliP2溶原性宿主細胞的菌苔上形成噬菌斑。相反，由于啟動子尤其是pL方向翻轉(zhuǎn)而使gam基因不轉(zhuǎn)錄，則允許在E.coliP2溶原性宿主細胞的菌苔上形成噬菌斑，并阻止在E.colirecA宿主細胞的菌苔上形成噬菌斑。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，第一種標(biāo)志基因是Cm11，其基因產(chǎn)物賦予細胞氯霉素抗性。因此，在本發(fā)明的方法中，CmR基因自啟動子尤其是Pro—個方向的轉(zhuǎn)錄允許細菌宿主細胞在含氯霉素的培養(yǎng)基上生長，而Cm11基因由于啟動子尤其是Pro方向翻轉(zhuǎn)而不轉(zhuǎn)錄則阻止細菌宿主細胞在含氯霉素的培養(yǎng)基上生長。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，一個以上的標(biāo)志可以位于所用噬菌體或質(zhì)粒上，由此導(dǎo)入其他標(biāo)志以增加選擇的嚴(yán)謹(jǐn)性。根據(jù)本發(fā)明，所用的噬菌體或質(zhì)?？梢园辽俚诙N標(biāo)志基因，所述第二種標(biāo)志基因位于所要重組的第二個DNA序列的下游，同時也位于啟動子的下游。因此，第一種和第二種標(biāo)志基因以翻轉(zhuǎn)構(gòu)象位于所用啟動子的側(cè)翼，由此，取決于啟動子的方向，兩個標(biāo)志基因中只有一個能夠自所述啟動子轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選第二種標(biāo)志基因選自營養(yǎng)標(biāo)志基因、抗生素抗性標(biāo)志基因和編碼酶亞基的序列。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，第二種標(biāo)志基因是5^c11,其優(yōu)選與作為第一種標(biāo)志基因的0^基因組合。^ec^基因自啟動子尤其是Pro的轉(zhuǎn)錄允許細菌宿主細胞在含壯觀霉素的培養(yǎng)基上生長，而^ec^基因由于啟動子尤其是Pro的方向翻轉(zhuǎn)而不轉(zhuǎn)錄則阻止細菌宿主細胞在含壯觀霉素的培養(yǎng)基上生長。根據(jù)本發(fā)明，細菌細胞用作宿主細胞，用于導(dǎo)入包含要重組的兩個DNA序列的噬菌體或質(zhì)粒。術(shù)語"細菌細胞"和"細菌宿主細胞"包括任何細胞，在該細胞中基因組以環(huán)形結(jié)構(gòu)自由地存在于細胞質(zhì)內(nèi)，即其中的基因組不由核膜包繞。所述宿主細胞可以已經(jīng)含有前噬菌體。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，細菌宿主細胞是革蘭氏陰性細菌尤其是co"、革蘭氏陽性細菌或藍細菌的細胞。根據(jù)本發(fā)明，可以優(yōu)選將具有功能性修復(fù)系統(tǒng)的細菌宿主細胞用于本發(fā)明的方法。錯配修復(fù)(MMR)系統(tǒng)是避免突變的其中一個最大的貢獻者，所述突變起因于復(fù)制中DNA聚合酶錯誤。然而，錯配修復(fù)通過確保遺傳重組的保真度也提升遺傳穩(wěn)定性。而在細菌中以及在酵母和哺乳動物細胞中，包含少量錯配(<1%)的部分同源DNA底物之間與相同序列之間相比，發(fā)生重組的效率要低得多，在MMR-缺陷型林系中重組(基因轉(zhuǎn)換和/或交換)的頻率顯著升高。這意味著重組的高保真度不僅由重組酶的本質(zhì)屬性所引起，還由錯配修復(fù)系統(tǒng)對重組的編輯所引起。因此錯配修復(fù)機制對有差別的序列之間的重組有抑制效應(yīng)。在￡.co/Z中，曱基定向的MMR系統(tǒng)的兩種蛋白質(zhì)即MutS和MutL是這種強烈的抗重組活性所需的，而其它MMR系統(tǒng)蛋白質(zhì)MutH和UvrD的影響較不顯著。除了其在MMR和部分同源重組中的作用，MMR蛋白還在基因轉(zhuǎn)換期間去除非同源DNA中扮演重要角色。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，使用錯配修復(fù)系統(tǒng)缺陷的細菌細胞。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"錯配修復(fù)系統(tǒng)缺陷的"意思是細菌細胞的MMR系統(tǒng)是暫時或7Jc久損壞的。細菌細胞的MMR缺陷可以通過暫時或永久損壞MMR系統(tǒng)的任何策略獲得，所述策略包括但不限于突變和/或刪除涉及MMR的一個或多個基因、用試劑如UV光處理，其導(dǎo)致MMR的整體損傷，用試劑如2-氨基噪呤或包含過量錯配的異源雙鏈處理以暫時飽和和滅活MMR系統(tǒng)，以及涉及MMR的一個或多個基因的可誘導(dǎo)表達或抑制，例如通過可調(diào)節(jié)的啟動子誘導(dǎo)表達或進行抑制，其允許發(fā)生短暫失活。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，細菌宿主細胞的錯配修復(fù)缺陷起因于至少一個涉及MMR的基因的突變。在優(yōu)選實施方案中，細菌細胞具有突變的mwW基因、突變的mW丄基因、突變的mWZ/基因和/或突變的CArD基因。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"要重組的DNA序列"和"重組底物"指能夠通過重組過程發(fā)生重組的任意兩個DNA序列。重組底物可以包括已經(jīng)重組的DNA序列。重組底物之間的重組可以起因于同源或非同源重組。幾種類型的同源重組事件以損壞的DNA鏈與同源伴侶的堿基配對為特征，其中相互作用范圍可涉及數(shù)百個幾乎完美配對的堿基對。術(shù)語"同源性"指存在于兩個核酸分子序列之間的同一性程度。相反，不正常的或非同源的所要重組的第一個和第二個DNA序列是有差別的序列，即不相同但顯示一定程度的同源性的序列。這意味著所要重組的DNA序列至少有一個核苷酸或至少有兩個核苷酸的差異。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所要重組的第一個和第二個DNA序列的整體組成差異超過O,l%、超過5%、超過10%、超過20%、超過30%、超過40%或者超過50%。這意味著所要重組的第一個和第二個DNA序列差異也可以為55。/。、60%、65%甚至更高，優(yōu)選所要重組的DNA序列為共有至少一個或多個同源區(qū)域的序列，所述同源區(qū)域可以非常短。所述同源區(qū)域可以具有約5-50個核苷酸的長度。所要重組的重組底物或DNA序列可以具有天然或合成起源。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所要重組的第一個和第二個DNA序列為天然發(fā)生的序列和/或人工序列。所要重組的天然發(fā)生的DNA序列可以衍生于任何天然來源，包括病毒、細菌、真菌、動物、植物和人。所要重組的人工或合成DNA序列可以用任何已知的方法制備。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所要重組的DNA序列是編碼蛋白質(zhì)的序列，例如編碼酶的序列，其可以用于天然和非天然化合物的工業(yè)產(chǎn)生。酶或借助于酶所產(chǎn)生的化合物可用于藥物、化妝品、食品等的產(chǎn)生。蛋白質(zhì)編碼序列也可以是編碼在人和動物健康領(lǐng)域具有治療應(yīng)用的蛋白質(zhì)的序列。醫(yī)學(xué)上重要的蛋白質(zhì)的重要類別包括細胞因子和生長因子。蛋白質(zhì)編碼序列的重組允許產(chǎn)生新的突變序列，所述突變序列編碼具有改變的，優(yōu)選改進的功能和/或新獲得的功能的蛋白質(zhì)。以此方式，例如有可能提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、改變蛋白質(zhì)的底物特異性、提高其活性、演變出新的催化部位和/或融合來自兩種不同酶的結(jié)構(gòu)域。所要重組的編碼蛋白質(zhì)的DNA序列可以包括來自不同物種的序列，所述序列編碼相同或相似的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在其正常環(huán)境中具有相似的或相同的功能。所要重組的編碼蛋白質(zhì)的DNA序列可以包括來自相同蛋白質(zhì)或酶家族的序列。所要重組的編碼蛋白質(zhì)的序列也可以是編碼具有不同功能的蛋白質(zhì)的序列，例如編碼酶的序列，所述酶催化給定代謝途徑的不同步驟。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所要重組的第一個和第二個DNA序列選自beta-內(nèi)酰胺酶Oxa超家族的基因序列。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案，所要重組的DNA序列是非編碼序列，例如在其正常的細胞環(huán)境中涉及蛋白質(zhì)編碼序列的表達調(diào)節(jié)的序列。非編碼序列的例子包括但不限于啟動子序列、包含核糖體結(jié)合位點的序列、內(nèi)含子序列、多聚腺苷酸化序列等。通過重組這樣的非編碼序列，有可能衍變出突變的序列，其在細胞環(huán)境中導(dǎo)致對細胞學(xué)進程的調(diào)節(jié)發(fā)生改變，例如基因表達的改變。所要重組的非編碼DNA序列可以包括來自不同物種的序列，例如在其正常環(huán)境中具有相似的或相同的調(diào)節(jié)功能的序列。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明，所要重組的重組底物或DNA序列可以包含一個以上的蛋白質(zhì)編碼序列和/或一個以上的非編碼序列。例如，重組底物可以包含一個蛋白質(zhì)編碼序列和一個非編碼序列，或者包含不同蛋白質(zhì)編碼序列和不同非編碼序列的組合。因此，在本發(fā)明的另一實施方案中，所要重組的DNA序列可以由具有插入的和/或側(cè)翼的非編碼序列的一個或多個編碼序列組成。這意味著所要重組的DNA序列可以是例如在其5，-末端和/或3，-非翻基因序列。在本發(fā)明的又一實施方案中，所要重組的DNA序列可以由更大的連續(xù)序列所組成，所述連續(xù)序列包含超過一個具有插入的非編碼序列的編碼序列，例如可能屬于生物合成途徑或操縱子的那些。所要重組的DNA序列可以是已經(jīng)歷一個或多個重組事件，例如同源和/或非同源重組事件的序列。重組底物可以包含非突變的野生型DNA序列和/或突變的DNA序列。因此在優(yōu)選實施方案中，有可能重組已存在突變序列的野生型序列以衍變出新的突變序列。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，包含側(cè)翼有兩個重組底物的啟動子的噬菌體或質(zhì)粒通過用遺傳工程方法將片段插入到各自的載體中制備，所述片段各包含兩個重組底物的其中一個。各包含一個重組底物的這些片段可以例如用一種或兩種合適的限制酶剪切DNA分子，例如剪切包含要重組的兩個DNA序列中一個的質(zhì)粒獲得。由此獲得包含各個要重組的DNA序列的片段，所述DNA序列的側(cè)翼為末端如平端或突出端，所述末端使所述片段可以以所需方向插入到事先用一種或兩種限制酶剪切過且具有相同末端的噬菌體或質(zhì)粒中。也可以通過PCR擴增獲得要插入的片段，然后PCR產(chǎn)物也可以用限制酶剪切。在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實施方案中，包含側(cè)翼有兩個重組底物的啟動子的噬菌體或質(zhì)粒通過包含各重組底物的片段的同源重組而制備。在這種情況下，所要重組的片段的側(cè)翼具有與噬菌體或質(zhì)粒的序列同源的序列，使所述片段能夠同源重組到載體中啟動子的左側(cè)和右側(cè)。包含兩個重組底物的噬菌體或質(zhì)粒導(dǎo)入到宿主細胞，并在選擇性條件下孵育含各載體的宿主細胞后，分離包含重組DNA序列的噬菌體后代，所述選擇性條件為僅僅當(dāng)啟動子處于使標(biāo)志基因的基因產(chǎn)物表達的方向時，允許細胞和/或噬菌體增殖。根據(jù)是否選擇哪種選擇策略，即檢測在裂解期期間的重組體或作為溶原菌的重組體，而從噬菌斑或者從溶原菌分離包含重組DNA序列的噬菌體后代。噬菌體后代分離后，可以分離和/或分析第一種細菌宿主細胞的噬菌體后代中包含的第一個和第二個重組DNA序列和/或第二種細菌宿主細胞的噬菌體后代中包含的第三個和第四個重組序列。例如，可以通過PCR擴增和/或限制酶裂解分離重組DNA序列。如果所述重組DNA序列編碼蛋白質(zhì)，那么可以對分離的重組DNA序列測序和/或?qū)⑵洳迦朐诒磉_載體中，處于一個或多個合適的調(diào)節(jié)單元的功能性控制下，以在合適的宿主細胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。如果重組DNA序列包含具有調(diào)節(jié)功能的非編碼序列，可以對分離的重組DNA序列測序和/或?qū)⑵洳迦朐诎瑘蟮阑虻谋磉_載體中，以研究它們對該報道基因表達的調(diào)節(jié)效應(yīng)。因此，本發(fā)明還涉及在包含噬菌體和細菌宿主細胞的系統(tǒng)中產(chǎn)生雜合或嵌合基因的方法，其中實施產(chǎn)生和4企測重組DNA序列的本發(fā)明的方法，并從包含于細菌細胞的噬菌體后代或者從包含于細菌細胞菌苔上的噬菌斑中的噬菌體后代選擇和/或分離如此獲得的雜合或嵌合基因。根據(jù)本發(fā)明的方法，分析分離的雜合基因和/或?qū)⑵洳迦氲奖磉_載體中，處于至少一個調(diào)節(jié)單元的功能性控制下。本發(fā)明還涉及可以通過產(chǎn)生和檢測重組DNA序列的本發(fā)明的方法和/或產(chǎn)生雜合或嵌合基因的本發(fā)明的方法獲得的雜合基因。本發(fā)明還涉及在包含噬菌體和細菌宿主細胞的系統(tǒng)中產(chǎn)生由雜合基因編碼的雜合蛋白質(zhì)的方法，其中實施用于產(chǎn)生和檢測重組DNA序列的本發(fā)明的方法和/或用于產(chǎn)生雜合基因的本發(fā)明的方法使雜合基因形成，并且其中由雜合基因所編碼的雜合蛋白表達后從細菌細胞或者細菌細胞菌苔上噬菌斑中選出和/或分離出。因此在本發(fā)明的一個實施方案中，如果選擇裂解選擇策略，則由雜合基因編碼的雜合蛋白可以在噬菌斑中選擇和/或可以由其分離。如果所述選擇策略基于溶原菌，則雜合蛋白可以在溶原菌中選擇和/或由其分離。在本發(fā)明方法的另一實施方案中，通過分離編碼雜合蛋白的雜合基因，將該基因插入到表達載體中處于至少一個調(diào)節(jié)單元的功能性蛋白。然后，在允許雜合蛋白表達的條件下培養(yǎng)包含所述表達載體的宿主細胞。接下來可以在合適的條件下表達、選擇、分離和/或分析雜合蛋白。本發(fā)明還涉及蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)由雜合基因編碼，并且能夠通過產(chǎn)生雜合蛋白的本發(fā)明的方法獲得。另外，本發(fā)明還涉及噬菌體人構(gòu)建體，其包含啟動子Pro,SpecR標(biāo)志和CmR標(biāo)志位于啟動子Pro的側(cè)翼，其中啟動子和SpecR標(biāo)志之間至少排列有用于插入第一個外源DNA序列的第一個和第二個限制性位點，并且在啟動子和C附R之間至少排列有用于插入第二個外源DNA序列的第三個和第四個限制性位點。另外，本發(fā)明還涉及質(zhì)粒pMIX-LAM，它是質(zhì)粒pACYC184的衍生物，包含pL+N啟動子區(qū)和噬菌體入的側(cè)翼序列cl+rexa和cIII+IS10。另外pMIX-Lam還包含0^基因。所述載體還包含多克隆位點MCS1和MCS2，其位于包含啟動子的XpL+N片段的側(cè)翼，用于插入外源DNA序列。在人側(cè)翼區(qū)域cl和clll中用適當(dāng)?shù)南拗泼讣羟邪亟M的兩個DNA序列的質(zhì)粒DNA,產(chǎn)生包含重組底物且能夠被靶向到受體宿主溶原菌中的入基因組的片段。本發(fā)明還涉及質(zhì)粒pAC-OX-OY,其來源于低拷貝數(shù)質(zhì)粒并包含colEl復(fù)制起點。質(zhì)粒pAC-OX-OY包含位于兩個重組底物側(cè)翼的兩個抗性標(biāo)志SpecR和CmR，位于重組底物末端的耙向序列LG和LD。所述耙向序列促進向X前噬菌體基因組中整合。包含重組底物的線性DNA片段通過限制酶切和純化或者通過盒子(cassette)的PCR擴增獲得。本發(fā)明還涉及可用于實施本發(fā)明的方法的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，所述試劑盒有至少三個容器，第一個容器容納含啟動子pL和gam基因的噬菌體λ的DNA或者包含該噬菌體的EcolirecA-菌抹細胞，第二個容器容納EcolirecA-菌抹細胞，第三個容器容納EcoliP2溶原性菌抹細胞。本發(fā)明的另一實施方案涉及試劑盒，所述試劑盒有至少三個容器，第一個容器容納質(zhì)粒pMIX-LAN的DNA或容納還有質(zhì)粒pMIX-LAN的E.colorecA-菌抹細胞，第二個容器容納E.colorecA-菌抹細胞，第三個容器容納EcoliP2溶原性菌林細胞。本發(fā)明的又一實施方案涉及試劑盒，所述試劑盒有至少兩個容器，第一個容器容納含啟動子Pro及其側(cè)翼的SpecR標(biāo)志和CwR標(biāo)志的噬菌體X的DNA或者包含該噬菌體的Ecoli菌株細胞，第二個容器容納Ecoli菌抹細胞。本發(fā)明的另一實施方案涉及試劑盒，所述試劑盒有至少兩個容器，第一個容器容納質(zhì)粒pAC-OX-OY的DNA或含有質(zhì)粒pAC-OX-OY的菌林細胞，第二個容器容納E.coli菌株細胞根據(jù)本發(fā)明，包含于所述試劑盒中的E.coli菌株的細胞是mutS。本發(fā)明還涉及質(zhì)粒pMIX-LAM、質(zhì)粒pAC-OX-OY、包含啟動子pL和gam基因的噬菌體X或者包含側(cè)翼為SpecR標(biāo)志和CmR標(biāo)志的啟動子Pro的噬菌體λ在產(chǎn)生和/或檢測重組DNA序列的本發(fā)明的方法中、在產(chǎn)生雜合基因的本發(fā)明的方法中、或者在產(chǎn)生雜合蛋白的本發(fā)明的方法中的用途。通過以下附圖和實施例闡述本發(fā)明。圖l顯示裂解選擇策略的原理。重組底物(Oxa7-Oxall或Oxa7-Oxa5基因?qū)?以翻轉(zhuǎn)方向克隆在pL啟動子側(cè)翼。Xgflw基因位于導(dǎo)入的Oxa7序列的下游。其中pL右向轉(zhuǎn)錄的噬菌體為g"柳-,其能夠在P2溶原菌上裂解性增殖但不能在￡.co"recv4-細胞上裂解性增殖。其中pL左向轉(zhuǎn)錄的噬菌體為g"m+，其能夠在五.co//re^-細胞上裂解性增殖但不能在P2溶原菌上裂解性增殖。涉及所插入的重組底物的交換通過pL的翻轉(zhuǎn)完成，因此可以在合適的宿主上選擇重組體。該策略是可重復(fù)的，因為可以實施多輪重組。圖2顯示溶原性選擇策略的原理。重組底物(所顯示的是Oxa7-Oxall基因?qū)?以翻轉(zhuǎn)的方向克隆在Pro啟動子側(cè)翼。賦予抗生素抗性(此處為氯霉素和壯觀霉素)的基因位于Oxa序列的下游。其中Pro右向轉(zhuǎn)錄的溶原菌可以在含壯觀霉素的培養(yǎng)基上選擇，其中Pro左向轉(zhuǎn)錄的溶原菌可以在含氯霉素的培養(yǎng)基上選擇。涉及所插入的重組底物的交換通過Pro的翻轉(zhuǎn)完成，并且可以在涂布于適當(dāng)抗生素上的溶原菌中選擇。該策略是可重復(fù)的，因為可以實施多輪重組。圖3顯示用于裂解選擇策略的載體pMAP188。將重組底物(OxaX和OxaY)導(dǎo)入到含啟動子的XpL+N片段側(cè)翼的位點中。所得質(zhì)粒DNA用酶消化，所述酶在人側(cè)翼區(qū)域cl和clll中剪切以產(chǎn)生包含改組盒的片段，可以將其定向到受體宿主溶原菌的入基因組。圖4顯示由裂解選擇策略獲得的Xgt11oxa7-5"flip"重組體對的示意性比對。a)在野生型背景中獲得的重組體。b)在mwW背景中獲得的重組體。Oxa7序列，灰色；Oxa5序列，黑色。條帶上所示點突變區(qū)域表示Oxa7和Oxa5之間相同序列的間距。圖5顯示用于裂解選擇策略的載體pMIX-LAM。將所要改組的基因插入到多克隆位點MCS1和MCS2中，MCSl和MCS2位于包含啟動子的XpL+N片^:的側(cè)翼。所得質(zhì)粒DNA用酶消化，所述酶在X側(cè)翼區(qū)域cI和cIII中剪切以產(chǎn)生包含改組盒的片段，可以將其定向到受體宿主溶原菌的人基因組。圖6顯示包含兩個重組底物(OxaX和OxaY)的載體pAC-OX-OY的一般性示意圖，該載體用于溶原菌選擇策略。該質(zhì)粒源于具有co正l復(fù)制起點的低拷貝數(shù)質(zhì)粒。兩個抗性標(biāo)志(此處為壯觀霉素和氯霉素)位于所要改組的基因的側(cè)翼。促進向入前噬菌體基因組特異性整合的靶向序列(LG和LD)位于改組盒的末端。包含改組盒的線性DNA片段通過限制酶切和純化或者通過改組盒的PCR擴增獲得。圖7顯示通過溶原性選擇策略獲得的重組體Oxa7-Oxal1和Oxa7-Oxa5基因?qū)Φ男蛄蟹治鼋Y(jié)果。(在兩個例子中，ORF最末端的序列信息丟失)。實施例一般策略為了在體內(nèi)高效構(gòu)建嵌合基因，開發(fā)了兩種選擇策略。兩種系統(tǒng)都利用了使兩個重組底物位于啟動子側(cè)翼并采取翻轉(zhuǎn)構(gòu)型的構(gòu)建體。取決于啟動子的方向，兩個重組底物中的一個或另一個被轉(zhuǎn)錄，類似地，這些底物下游的基因也處于該轉(zhuǎn)錄控制之下。這些下游基因的表達可以在合適條件下檢測和選擇，因此允許選擇特定的啟動子方向。由于涉及兩個重組底物的交換重組導(dǎo)致啟動子翻轉(zhuǎn)，因而可以在選擇特定下游基因表達的條件下鑒定重組體。a)裂解選擇策略基于裂解選擇策略的系統(tǒng)允許在裂解期期間檢測重組體。如圖1所示克隆有差別的序列。選擇是基于λgam基因的表達或不表達。在插入序列的一個方向上，自λ啟動子pL的轉(zhuǎn)錄激活gam基因，其允許在colirecA-菌莒上形成噬菌斑并阻止在E.coliP2溶原菌菌苔上形成噬菌斑。當(dāng)pL以相反方向存在時，gam不轉(zhuǎn)錄，從而允許P2溶原菌上的裂解生長并阻止recJ-宿主上的生長。b)溶原性選擇策略在該系統(tǒng)中，回收重組體作為溶原菌一在它們的染色體中含有X基因組的細胞-而不是作為噬菌斑。代替gam基因的激活轉(zhuǎn)錄，在一個方向，人工啟動子Pro激活表達抗生素抗性標(biāo)志的基因(此處為壯觀霉素)，而在另一個方向其激活另一個表達抗生素抗性的基因(此處為氯霉素；參見圖2)。檢測了兩個基于X的策略在野生型和MMR缺陷型五.co"菌抹中重組成對的有差別的序列的能力。挑選編碼beta-內(nèi)酰胺酶Oxa7、Oxall和Oxa5的三個部分同源基因作為重組底物以一企測這兩種系統(tǒng)。Oxall和Oxa7核苷酸序列差別程度為4.5%，Oxa5和Oxa7序列差別程度為22%。在兩個例子中，在質(zhì)粒中構(gòu)建由位于可翻轉(zhuǎn)的啟動子側(cè)翼的兩個重組底物組成的重組盒，然后轉(zhuǎn)化到合適的宿主溶原菌中，以構(gòu)建包含這些盒的起始溶原菌。將這些溶原菌置于啟動人裂解周期的條件下，導(dǎo)致噬菌體的釋放，在所述噬菌體中已發(fā)生了滾環(huán)介導(dǎo)的重組。按照特異于各系統(tǒng)的方法選擇重組序列并通過測序鑒定。利用擁有重組盒的噬菌體顯示該系統(tǒng)可重復(fù)屬性以啟動新一輪的重組，其中所述重組盒具有嵌合序列。生物JM1052Xlambda6Tl1pMIX-LAM于2005年6月20日由MIXISFranceS.A.,Paris保藏在DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,Braunschweig,Germany(DSMZ):DSM17434。生物JM105pACOX隱OY(AA)于2005年6月20日由MIXISFranceS.A.,Paris保藏于DSMZ:DSM17435。方法與材料所用菌抹所使用的Ecoli菌抹列于表l。表Ecoli滴抹<table>complextableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>(*)這些菌抹的mutS衍生物通過轉(zhuǎn)導(dǎo)制備將重組盒導(dǎo)入X溶原菌和產(chǎn)生原始噬菌體原種(stock)對于兩種選擇策略，均用合適的限制酶消化含重組盒的質(zhì)粒，以產(chǎn)生線性DNA片段，線性DNA片段的側(cè)翼為與目標(biāo)人前噬菌體同源的序列。使E.coliAB1157:入CI854::pKD46細胞成為感受態(tài)的，并用純化的線性DNA轉(zhuǎn)化。誘導(dǎo)感受態(tài)之前，用L-阿拉伯糖處理細胞，L-阿拉伯糖促進pKD46上編碼的red-gam復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄。該復(fù)合體介導(dǎo)改組盒通過同源重組整合到前噬菌體基因組(KirillA.etal,PNAS2000,97,6640-6645)。在合適的抗生素存在下于30。C選擇含有整合的改組盒的溶原菌。為產(chǎn)生噬菌體原種，溶原菌于許可溫度下在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至00=0.2。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到42。C10min，然后轉(zhuǎn)移到37。C,直至裂解完成。離心后，將氯仿(l/500)添加到上清，所得噬菌體原種存儲于4。C。用裂解選擇策略選擇重組體野生型和mwWP2溶原菌(NK5196[P2]衍生物)用原始噬菌體原種感染，并涂布在富含營養(yǎng)的培養(yǎng)基上以獲得噬菌斑。為選擇第一輪重組體("flip"),從這些噬菌斑制備噬菌體，并用于感染C600recJ細胞和NK5196(P2)溶原菌。為選擇第二輪重組體("flop")，從recA宿主上長出的噬菌斑制備噬菌體，并用于再感染C600recA細胞和NK5196(P2)溶原菌。用各宿主上形成噬菌斑的相對頻率測定重組頻率。用溶原性選擇策略選擇重組體用原始噬菌體原種感染C600hfl7和C600hflmutS細胞，并在壯觀霉素上涂布以獲得抗性溶原菌。對于第一輪重組體選擇，誘導(dǎo)溶原菌以使之裂解，制備噬菌體原種并用于感染C600hfl細胞。在氯霉素或壯觀霉素上選擇溶原菌。改組序列的分子分析對于兩種選擇策略，均用特異性引物對PCR擴增第一輪和第二輪重組體分子并用標(biāo)準(zhǔn)方法測序。結(jié)果利用裂解選擇策略在X中重組-實施例I構(gòu)建了包含改組盒的質(zhì)粒，所述改組盒具有Oxa7-Oxa7、Oxa7-Oxa11和Oxa7-Oxa5重組底物。圖3顯示包含兩個不同Oxa底物的質(zhì)粒pMAP188的結(jié)構(gòu)。從質(zhì)粒切出改組盒并導(dǎo)入到宿主溶原菌中，然后將其用于產(chǎn)生原始噬菌體原種。包含兩種不同X衍生物Xgtll(Young,RAandDavis,RW,1983PNAS80:1194-1198)和入c/S57(Hendrix,RWetal.(eds)inLambdaII,1983,CSH)的溶原菌用作重組研究的宿主。表2顯示兩種X衍生物均可用于制備重組體，取決于Oxa差別程度和X宿主，mw"背景中頻率通常比野生型背景中高十倍。表2.用Xgtll和k/857宿主在野生型和/m^S背景中獲得的"flip"重組頻率。以(活菌數(shù)gam＋(活菌數(shù)gam＋活菌數(shù)gam-)計算重組頻率，表示為三個獨立試驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。*用更敏感的方案測定Oxa7-Oxall基因?qū)Φ闹亟M頻率的試驗結(jié)果。<table>Complextableseetheoriginaldocumentpagex</column></row><table>在"flip"和"flop"重組循環(huán)后分離出四十六個重組Oxa對并測序(22個Oxa7-Oxall;24個Oxa7-Oxa5)。圖4示意性顯示重組Oxa基因的例子，是于第一輪重組后在人gtll宿主中由Oxa7-Oxa5底物對獲得的。重組底物的多樣化是有效的。沒有鑒定出明顯的重組熱點42個分離的"flip"重組體(所有的Oxa7-Oxa5重組體)中，只在三例中回收了相同的重組產(chǎn)物。非常短的序列同一性間距足以允許重組(參見例如圖4boxa7-5no.1)。在附wW背景中，重組還伴隨點突變的引入。正如所期望的，第二個重組循環(huán)("flop")導(dǎo)致底物基因多樣化增加。這些結(jié)果顯示X噬菌體系統(tǒng)能夠有效地重組有差別的序列。在所用條件下總的重組頻率高得令人吃驚。λirW和gam基因的重組尤其是這樣，其頻率達到10、參見表3)。表3.野生型和wwW背景中用Xgtll和Xc/S57獲得的"flop"重組頻率。Oxa7-ll和Oxa7-5底物對用具有不同長度的相同序列片段的兩個"flip"重組產(chǎn)物構(gòu)建。bp:堿基對；sz:相同序列的大小；n.d.:未測定。<table>complextableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>這些結(jié)果與在序列水平上觀測的底物基因多樣化一起，表明x工具能夠用于在定向進化試驗中構(gòu)建多樣化基因的大型文庫。利用裂解選4奪策略在x中重組-實施例n由于載體pMAP188(參見圖3)較大，顯示對宿主細菌有毒性，并且不具有用于進一步克隆的合適的限制性位點，因而構(gòu)建了新的質(zhì)粒pMlX-LAM(參見圖5)。將兩個關(guān)鍵特征摻入到該構(gòu)建體中l(wèi))新的載體包含幾簇入序列，包括可翻轉(zhuǎn)的啟動子和編碼基本X功能的基因，并且還允許改組盒靶向到前噬菌體基因組；和2)所述載體提供容易亞克隆的獨特位點，這些位點能夠交換其它多克隆位點以方便更多復(fù)合基因或基因簇的導(dǎo)入。pMIX-LAM是pACYC184衍生物，包括可翻轉(zhuǎn)的XpL啟動子區(qū)域及其側(cè)翼存在的多克隆位點，是以pMAP188作模板擴增而獲得的產(chǎn)物。它還包括cl和cIII側(cè)翼序列，是從pMAP188分離的限制性片段。利用溶原菌選擇策略在X中重組在這個方法中，重組體的鑒別取決于個體細胞(含改組盒的溶原菌)的選才奪，所述細胞中位于兩個重組底物之間的人工啟動子轉(zhuǎn)換方向，允許重組底物下游的兩個抗生素抗性標(biāo)志的其中一個或另一個表達。圖6描述載體的基本特征，所述載體具有要重組的包含改組盒的基因。構(gòu)建了包含Oxa7-Oxa7、Oxa7-Oxal1和Oxa7-Oxa5重組底物的改組盒。改組盒整合到受體溶原菌中后，通過誘導(dǎo)裂解獲得噬菌體原種。用噬菌體原種感染野生型和MMR缺陷型五.co"改組菌抹。這些菌抹還具有//W突變，其促進更高的溶原菌產(chǎn)率(Herman，C.etal.1993.PNAS.90:10861-10865)。出的溶原菌回收重組的Oxa7-Oxal1和Oxa7-Oxa5基因?qū)Σy序。氯霉素抗性克隆的序列顯示它們都是重組體，具有不同程度的嵌合(參見圖7)。所有測序的ORFs都是全長的并可能編碼功能性蛋白。在從MMR缺陷型背景(mutS-)獲得的四個重組體序列中觀測點突變。值得注意的是分離了包括有較大差別的基因(Oxa7-Oxa5,22%差別程度)的重組體。權(quán)利要求1.在包含噬菌體和細菌宿主細胞的系統(tǒng)中制備并檢測重組DNA序列的方法，其中噬菌體包含啟動子、其側(cè)翼的要重組的第一個和第二個DNA序列、和位于第一個DNA序列下游的至少第一種標(biāo)志基因，其中所述兩個DNA序列之間的重組導(dǎo)致啟動子的翻滾方式翻轉(zhuǎn)，并且，取決于啟動子的方向，一個或另一個DNA序列和所述標(biāo)志基因能夠被轉(zhuǎn)錄或不被轉(zhuǎn)錄，該方法包括步驟a)在選擇性條件下孵育含所述噬菌體的第一種細菌宿主細胞，在這樣的條件下，只有所述啟動子的方向使第一種標(biāo)記基因的基因產(chǎn)物被表達，才允許細胞和/或噬菌體增殖，和b)從第一種宿主細胞分離噬菌體后代，所述后代在選擇性條件下生長和/或增殖，并包含第一個和第二個重組DNA序列。2.權(quán)利要求1的方法，進一步包括步驟a)將lb)中獲得的噬菌體后代導(dǎo)入到第二種細菌宿主細胞中，b)在選擇性條件下孵育含噬菌體后代的第二種宿主細胞，所述選擇性條件允許進行重組，并且在這樣的條件下，只有啟動子的方向使第一種標(biāo)記基因的基因產(chǎn)物不表達，才允許細胞和/或噬菌體的增殖，和c)從第二種宿主細胞分離噬菌體后代，所述后代在選擇性條件下生長和/或增殖，并包含第三個和第四個重組DNA序列。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中通過對2c)中獲得的噬菌體后代進行另一個從步驟la)至lb)或從步驟la)至lb)加步驟2a)至2c)的循環(huán)至少一次而制備其他的重組DNA序列。4.權(quán)利要求1至3任一項的方法，其中包含噬菌體的第一種和/或第二種宿主細胞通過將噬菌體導(dǎo)入到其基因組中有或沒有前噬菌體的細菌細胞中而制備。5.權(quán)利要求1至4任一項的方法，其中所述噬菌體是噬菌體人的衍生物。6.權(quán)利要求1至3任一項的方法，其中包含噬菌體的第一種宿主細胞通過將包含噬菌體序列、啟動子側(cè)翼要重組的兩個DNA序列和第一種標(biāo)志基因的質(zhì)粒導(dǎo)入到其基因組中包含前噬菌體的細菌細胞中而制備。7.權(quán)利要求6的方法，其中將所述質(zhì)粒導(dǎo)入到包含前噬菌體的細菌細胞中時，所述質(zhì)粒通過同源重組整合到基因組中。8.權(quán)利要求6或7的方法，其中所述質(zhì)粒是質(zhì)粒pMIX-LAM，它是包括噬菌體人的pL+N啟動子區(qū)域和側(cè)翼序列cl+rexa和cIII+IS10的質(zhì)粒pACYC184的衍生物，并且能夠被靶向到宿主溶原菌的X基因組中。9.權(quán)利要求6或7的方法，其中所述質(zhì)粒是pAC-OX-OY,它來源于低拷貝數(shù)質(zhì)粒并且包含colEl復(fù)制起點和促進整合到X前噬菌體基因組的靶向序列LG和LD。10.權(quán)利要求1至9任一項的方法，其中所述啟動子是X的pL啟動子。11.權(quán)利要求1至9任一項的方法，其中所述啟動子是啟動子Pro。12.權(quán)利要求1至11任一項的方法，其中第一種標(biāo)志基因選自X基因、營養(yǎng)標(biāo)志基因、抗生素抗性標(biāo)志基因和編碼酶亞基的序列。13.權(quán)利要求12的方法，其中第一種標(biāo)志基因是入的gam基因。14.權(quán)利要求13的方法，其中g(shù)am基因自flip狀態(tài)的啟動子的轉(zhuǎn)錄允許在E.colirecA宿主細胞的菌苔上形成噬菌斑，并阻止在E.coliP2溶原性宿主細胞的菌莒上形成噬菌斑。15.權(quán)利要求13的方法，其中由于啟動子的flop方向而引起的gam基因不轉(zhuǎn)錄允許在EcoliP2溶原性宿主細胞的菌苔上形成噬菌斑并且阻止在E.colirecj宿主細胞的菌苔上形成噬菌斑。16.權(quán)利要求12的方法，其中第一種標(biāo)志基因是CW1。17.權(quán)利要求16的方法，其中CmR基因自flip狀態(tài)的啟動子的轉(zhuǎn)錄允許細菌宿主細胞在含氯霉素的培養(yǎng)基上生長，由于啟動子的flop方向而引起的CmK基因不轉(zhuǎn)錄則阻止細菌宿主細胞在含氯霉素的培養(yǎng)基上生長。18.權(quán)利要求1至17任一項的方法，其中所述噬菌體或質(zhì)粒包含位于要重組的第二個DNA序列下游的第二種標(biāo)志基因，并且，取決于啟動子的方向，它能夠被轉(zhuǎn)錄或不能被轉(zhuǎn)錄。19.權(quán)利要求18的方法，其中在選擇性條件下孵育包含具有第二種標(biāo)志基因的噬菌體后代的第二種宿主細胞，在這樣的條件下，只有啟動子的方向使第二種標(biāo)志基因的基因產(chǎn)物表達時，才允許細胞和/或噬菌體的增殖。20.權(quán)利要求18或19的方法，其中第二種標(biāo)志基因選自營養(yǎng)標(biāo)志基因、抗生素抗性標(biāo)志基因和編碼酶亞基的序列。21.權(quán)利要求20的方法，其中第二種標(biāo)志基因是SpecR。22.權(quán)利要求21的方法，其中Specr基因自flop狀態(tài)的啟動子的轉(zhuǎn)錄允許細菌宿主細胞在含壯觀霉素的培養(yǎng)基上生長，由于啟動子的flip方向而引起的SpecR基因不轉(zhuǎn)錄則阻止細菌宿主細胞在含壯觀霉素的培養(yǎng)基上生長。23.權(quán)利要求1至22任一項的方法，其中所述細菌宿主細胞是革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌或藍細菌的細胞。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌是E.coli。25.權(quán)利要求1至24任一項的方法，其中所述細菌宿主細胞具有功能性錯配修復(fù)系統(tǒng)。26.權(quán)利要求1至24任一項的方法，其中所述細菌宿主細胞是錯配修復(fù)系統(tǒng)暫時或永久性缺陷的。27.權(quán)利要求26的方法，其中錯配修復(fù)系統(tǒng)的暫時或永久性缺陷起因于，一種或多種涉及錯配修復(fù)系統(tǒng)的基因的突變、刪除、和/或可誘導(dǎo)的表達或抑制，用使錯配修復(fù)系統(tǒng)飽和的試劑處理和/或用完全敲除錯配修復(fù)的試劑處理。28.權(quán)利要求26或27的方法，其中所述細菌細胞具有突變的mmuts基因和/或突變的mutL基因。29.權(quán)利要求1至28任一項的方法，其中所要重組的第一個和第二個DNA序列有至少兩個核苷酸的差異。30.權(quán)利要求1至29任一項的方法，其中所要重組的第一個和第二個DNA序列是天然發(fā)生的序列和/或人工序列。31.權(quán)利要求30的方法，其中所要重組的第一個和/或第二個DNA序列來源于病毒、細菌、植物、動物和/或人。32.權(quán)利要求1至31任一項的方法，其中所要重組的第一個和第二個DNA序列各包含一個或多個蛋白質(zhì)編碼序列和/或一個或多個非編碼序列。33.權(quán)利要求1至32任一項的方法，其中要重組的第一個和/或第二個DNA序列向噬菌體或質(zhì)粒的插入，通過將包含相應(yīng)DNA序列的片段克隆到事先用至少一種限制酶剪切的噬菌體或質(zhì)粒的位點來實施。34.權(quán)利要求1至32任一項的方法，其中要重組的第一個和/或第二個DNA序列向噬菌體或質(zhì)粒的插入，通過包含相應(yīng)DNA序列的片段的同源重組來實施，所述片段的側(cè)翼為與噬菌體或質(zhì)粒序列同源的序列。35.權(quán)利要求1至34任一項的方法，其中包含重組DNA序列的噬菌體后代是從噬菌斑分離的。36.權(quán)利要求1至34任一項的方法，其中包含重組DNA序列的噬菌體后代是從溶原細菌分離的。37.權(quán)利要求1至36任一項的方法，包括分離和/或分析第一種細菌宿主細胞的噬菌體后代中包含的第一個和第二個重組DNA序列和/或第二種細菌宿主細胞的噬菌體后代中包含的第三個和第四個重組序列。'38.權(quán)利要求37的方法，其中所述重組DNA序列通過PCR擴增和/或通過限制酶裂解分離。39.在包含噬菌體和細菌宿主細胞的系統(tǒng)中制備雜合基因的方法，包括實施權(quán)利要求1至38任一項的方法，并且從細菌細胞中或者細菌細胞的菌莒上形成的噬菌斑中包含的噬菌體后代選出和/或分離出所得的雜合基因。40.權(quán)利要求39的方法，其中在至少一種調(diào)節(jié)單元的功能性控制下分析所分離的雜合基因和/或?qū)⑵洳迦氲奖磉_載體中。41.在包含噬菌體和細菌宿主細胞的系統(tǒng)中產(chǎn)生由雜合基因編碼的雜合蛋白的方法，包括實施權(quán)利要求1至38任一項的方法，結(jié)果形成雜合基因，并且由雜合基因編碼的雜合蛋白在表達后從細菌細胞或者從細菌細胞的菌莒上形成的噬菌斑中選出和/或分離出。42.權(quán)利要求41的方法，其中在至少一種調(diào)節(jié)單元的功能性控制下分離編碼雜合蛋白的雜合基因并將其插入到表達載體中。43.權(quán)利要求42的方法，其中將包含所插入的雜合基因的表達載體導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗骷毎小?4.權(quán)利要求43的方法，其中在允許雜合蛋白表達的條件下培養(yǎng)包含所述表達載體的宿主細胞。45.雜合基因，可以由權(quán)利要求1至38任一項的方法或者由權(quán)利要求39或40的方法獲得。46.蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求45的雜合基因編碼，并且可由權(quán)利要求41至44任一項的方法獲得。47.噬菌體人的衍生物，包含啟動子Pro及其側(cè)翼的5^e^標(biāo)志和0^標(biāo)志，其中至少第一個和第二個限制性位點排列在啟動子和S/ec^標(biāo)志之間，用于插入第一個外源DNA序列，以及至少第三個和第四個限制性位點排列在啟動子和G^標(biāo)志之間，用于插入第二個外源DNA序列。48.質(zhì)粒pMIX-LAM,其為質(zhì)粒pACYC184的衍生物，包含噬菌體X的pL+N啟動子區(qū)域和側(cè)翼序列cl+rexa和cIII+IS10、位于含啟動子的pL+N片段側(cè)翼的多克隆位點MCS1和MCS2、以及C附R標(biāo)志基因，并且能夠被靶向到宿主溶原菌的X基因組中。49.質(zhì)粒pAC-OX-OY，其衍生于低拷貝數(shù)質(zhì)粒，包含colEl復(fù)制起點、標(biāo)志基因CmR和5^ecR以及靶向序列LG和LD,其促進向入前噬菌體基因組中的整合。50.試劑盒，有至少三個容器，第一個容器容納含啟動子pL和gaw基因的噬菌體X的DNA或者包含該噬菌體的E.coilrecA菌抹細胞，第二個容器容納E.coilrecA菌抹細胞，第三個容器容納E.coilP2溶原性菌抹細胞。51.試劑盒，有至少三個容器，第一個容器容納質(zhì)粒pMIX-LAM的DNA或容納含有質(zhì)粒pMIX-LAM的EE.coilrecA菌林細胞，第二個容器容納E.coilrecA菌抹細胞，第三個容器容納E.coilP2溶原性菌抹細胞。52.試劑盒，有至少兩個容器，第一個容器容納權(quán)利要求47所述噬菌體衍生物的DNA或容納含權(quán)利要求47所述噬菌體衍生物的E.coilrecA菌抹細胞，第二個容器容納E.coilrecA菌株細胞。53.試劑盒，有至少兩個容器，第一個容器容納質(zhì)粒pAC-OX-OY的DNA或者容納含有質(zhì)粒pAC-OX-OY的E.coilrecA菌抹細胞，第二個容器容E.coilrecA菌林細胞。54.權(quán)利要求50至53任一項的試劑盒，其中所述E.coilrecA菌林細胞為mutS-。55.用途，是質(zhì)粒pMIX-LAM、質(zhì)粒pAC-OX-OY、包含啟動子pL和gaw基因的噬菌體X、或權(quán)利要求47的噬菌體，在權(quán)利要求l至38的制備和/或檢測重組DNA序列的方法中、在權(quán)利要求39或40的制備雜合基因的方法中、或者在權(quán)利要求41至44任一項的產(chǎn)生雜合蛋白的方法中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及在噬菌體或包含噬菌體序列的質(zhì)粒中制備和檢測重組DNA序列的體內(nèi)方法，利用噬菌體和含有噬菌體序列的質(zhì)粒制備雜合基因和由這些雜合基因編碼的雜合蛋白的方法，可用于這些方法的噬菌體和質(zhì)粒，包含合適的細菌宿主細胞和噬菌體或質(zhì)粒的試劑盒。與這些方法相關(guān)的DNA序列包括蛋白質(zhì)編碼序列和非編碼序列。文檔編號C12N15/10GK101203608SQ200580029734公開日2008年6月18日申請日期2005年7月6日優(yōu)先權(quán)日2004年7月6日發(fā)明者亞歷山德羅·盧克,?？恕に固亓_貝爾,瑪麗-阿格尼斯·珀蒂,簡·T·馬丁索恩,米羅斯拉夫·雷德曼申請人:麥克西斯法國股份有限公司