專利名稱：：用于真核細胞的生物基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地涉及將核酸分子轉(zhuǎn)移至真核細胞的技術(shù)并且特別是使用非病原菌將核酸序列轉(zhuǎn)移至真核細胞，例如植物細胞的技術(shù)。
背景技術(shù)：
：對于轉(zhuǎn)化技術(shù)在作物中的商業(yè)化應(yīng)用來說存在三個必要的過程(U將新的DNA導(dǎo)入合適的植物細胞/器官；(U)成功轉(zhuǎn)化的細胞/植物的生長或繁殖，通常涉及選擇或鑒別方法；和(iii)靶細胞/器官/階段中轉(zhuǎn)基因的表達。這些過程各自以幾種不同質(zhì)量和效率的選擇性技術(shù)代表。然而，第一步不僅對植物，而且對任何真核生物和細胞類型的轉(zhuǎn)化均為最關(guān)鍵的。目前存在兩類廣泛用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體的DNA導(dǎo)入方法，即物理方法和生物學(xué)方法。導(dǎo)入DNA的物理方法包括粒子轟擊、電穿孔和被原生質(zhì)體直接DNA攝取或?qū)⑵渥⑷朐|(zhì)體。這些目前實施形式的方法均存在實質(zhì)上的缺陷。導(dǎo)入的DNA的結(jié)構(gòu)趨向于復(fù)雜并且難以控制，且與導(dǎo)入相關(guān)的脅迫或使用這些方法所必需的再生的類型通常為致突變的。此外，圍繞這些方法的專利前景展望明顯不同，但無一不受到阻礙。生物轉(zhuǎn)化目前集中在使用天然遺傳改造物(geneticengineer)根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)將確定的新DM序列轉(zhuǎn)入植物。根瘤土壤桿菌為常見的土壤細菌，其基因中的某些天然插入植物并且使用植物系統(tǒng)表達細菌用作營養(yǎng)物的化合物形式的那些基因。在該過程中，轉(zhuǎn)入基因中的某些還導(dǎo)致形成常見于接近根和莖接合處的植物瘤，來源于它的名稱為冠癭病。該病侵害大范圍的雙子葉植物，它們構(gòu)成了開花植物的主要類群之一。所謂土壤桿菌屬(Agrobacterium)去甲型菌林用于植物轉(zhuǎn)化，它們已經(jīng)喪失了形成瘤和在植物上展示出減少的致病表型的能力。不過，至少存在七種染色體毒力基因和幾種其它影響毒力的仍然存在于常用土壤桿菌屬菌林中的基因。盡管存在這一缺陷，但是土壤桿菌屬介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化已經(jīng)廣泛用于轉(zhuǎn)化植物細胞。使用土壤桿菌屬的其它缺陷包括宿主范圍有限，并且它僅可以感染該范圍內(nèi)有限數(shù)量的細胞類型。特別重要的是，鑒于土壤桿菌屬可以感染許多雙子葉植物，單子葉植物更耐受感染。然而，單子葉植物構(gòu)成了世界上大部分重要的食物作物(例如稻米、玉米)。單子葉植物僅能夠被土壤桿菌屬在特定條件下并且使用特定類型的細胞、愈傷組織細胞或其它去分化組織轉(zhuǎn)化(例如美國專利US5，591，616;US6,037,552;US5,187,073;US6,074,877)。但是，眾所周知某些單子葉植物和某些雙子葉植物，例如大豆和其它豆科植物仍然難以用土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化。在指定植物物種的變種之間轉(zhuǎn)化率上也存在巨大差異，其中某些對土壤桿菌屬的基因轉(zhuǎn)移是完全抗拒的。盡管土壤桿菌屬存在這些缺陷，但是尚未開發(fā)出用于轉(zhuǎn)化真核細胞的其它細菌系統(tǒng)。認為其它細菌屬不適合于轉(zhuǎn)化植物。實際上，普遍認為土壤桿菌屬是具有跨界基因轉(zhuǎn)移能力的唯一細菌屬。盡管有些報導(dǎo)據(jù)稱證明了土壤桿菌屬誘導(dǎo)瘤的能力可以被轉(zhuǎn)移至其它相關(guān)的屬，包括才艮瘤菌(Klein和Klein，ArchMicrobiol.66:220-228，1953;Kern，Arch.Microbiol.52:325-344，1965)，但是結(jié)果無法一律再現(xiàn)，也不存在任何基因轉(zhuǎn)移的物證。例如，Hooykaas、Schilperoort及其同仁在70年代中到末期就報導(dǎo)了某些菌種，特別是三葉草根瘤菌(Rhizobiumtrifolii)和婉豆才艮瘤菌(R.leguminosarum)能夠在導(dǎo)入來自毒性土壤桿菌屬的Ti質(zhì)粒后在植物上形成瘤(Hooykaas等，Gen.Microbiol.98:477-484，1977;Hooykaas等，Gen.Microbiol.4:661-666，1984)，而其它種類，特別是苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)(目前稱作苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti))則不能(vanVeen等，Plant—MicrobeInteractions1:231-234，1988)。從那時起，幾乎沒有進行過額外的工作來驗證基因轉(zhuǎn)移發(fā)生或進一步檢驗根瘤菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的能力(如果有的話)。僅近來在來自才艮結(jié)纏感染(mat-infected)的黃瓜和番茄的蒼白桿菌屬(Ochrobactrium)、根瘤菌屬(Rhizobium)和中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)的環(huán)境分離物中發(fā)現(xiàn)了誘導(dǎo)根的Ri質(zhì)粒(Weller等，Appl.和Environ.Microbiol.70:2779-2785，2004)，這表明這些細菌可以維持發(fā)根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)Ri質(zhì)粒。然而，未證實與該病的因果關(guān)系，也沒有任何將DNA轉(zhuǎn)移至植物的證據(jù)。此外，證實中華根瘤菌屬的種類為Ti質(zhì)粒的貯主，但未對該細菌中Ti質(zhì)粒的功能性進行測試(Teyssier-Cuvelle等Molec.Ecol.8:1273-1284，1999)。因此，研究人員基本上僅使用土壤桿菌屬的單一種類根癌土壤桿菌，已知它可成功地轉(zhuǎn)化植物細胞。
發(fā)明內(nèi)容在本發(fā)明的一個方面中，提供了用于轉(zhuǎn)化真核細胞的系統(tǒng)。特別是，一種這樣的系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，它們對植物而言為非致病性的并且含有包括轉(zhuǎn)移所需基因的第一種核酸分子和包括一種或多種能夠轉(zhuǎn)移所關(guān)注的DNA序列的序列的第二種核酸分子。在各種不同的實施方案中，轉(zhuǎn)移所需的基因為來自土壤桿菌屬的Ti質(zhì)粒的vir基因或vir基因的同源物，諸如來自如RK2或RK4這類質(zhì)粒的tra基因。在其它實施方案中，能夠轉(zhuǎn)移的序列為來自土壤桿菌屬的Ti質(zhì)粒的T-邊緣序列。在某些實施方案中，所關(guān)注的DNA序列位于兩種T-邊緣序列之間。在其它實施方案中，能夠轉(zhuǎn)移的序列為來自任何移動性細菌質(zhì)粒的oriT序列。在另一個方面中，所述的細菌含有包括Ti質(zhì)粒，諸如來自土壤桿菌屬的去甲型Ti質(zhì)粒的vir基因區(qū)第一種質(zhì)粒；和包括一種或多種T-邊緣或oriT序列和所關(guān)注的DNA序列的第二種質(zhì)粒。在另一個方面中，所述的細菌含有單一質(zhì)粒，它包括Ti質(zhì)粒的vir基因區(qū)和一種或多種可操作地與所關(guān)注的MA序列連接的T-邊緣或oriT序列。設(shè)計將所關(guān)注的DNA序列轉(zhuǎn)移至真核細胞的質(zhì)粒和核酸分子。在一個實施方案中，導(dǎo)入細菌以便誘導(dǎo)所關(guān)注的DNA序列轉(zhuǎn)移至真核細胞的質(zhì)?？梢詾楹腥炕蛑辽俨糠講ir基因的根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)?；蚱溲苌?。該質(zhì)粒一般不含T-DNA區(qū)。在一些情況中，vir基因為誘導(dǎo)型的，在另一些情況中，vir基因為組成型表達的。在一個實施方案中，該質(zhì)粒具有一種或多種virG序列。在另一個實施方案中，輔助質(zhì)粒具有廣宿主范圍復(fù)制起點，諸如來自RK2質(zhì)粒的復(fù)制起點。在其它實施方案中，輔助載體具有一種或多種oriT序列，諸如來自RP4的oriT。在某些實施方案中，所述的載體具有選擇性標記。第二種核酸分子或質(zhì)?？梢詾門-DNA質(zhì)?；騎-DNA-樣質(zhì)粒，它具有執(zhí)行與T-DM邊緣序列相同功能的序列。在某些實施方案中，T-DNA邊緣序列的同源物為轉(zhuǎn)移起點(oriT)。當(dāng)?shù)诙N質(zhì)粒為T-DNA質(zhì)粒時，它具有至少一種T-DNA邊緣序列。能夠轉(zhuǎn)移所關(guān)注的DNA序列的序列(例如，T-邊緣序列)可操作地與所關(guān)注的DNA序列連接，使得所關(guān)注的DNA序列被轉(zhuǎn)移至受體真核細胞。此外，核酸分子可以含有編碼選擇性產(chǎn)物的基因以便能夠在細菌中或在真核細胞中選擇。獲得并且使用上述核酸分子或質(zhì)粒，通過接合、電穿孔或其它方式轉(zhuǎn)染與植物或植物細胞發(fā)生相互作用的非病原菌。合適的細菌包括，但不限于非致病性根瘤菌屬、中華根瘤菌屬、中間根瘤菌屬(Mesorhizobium)、'匱生才艮瘤菌屬(Bradyrhizobium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、固氮螺菌屬(Azospiri1lum)、紅球菌屬(Rhodococcus)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、歐文氏菌屬(Erwinia)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。使含有這些質(zhì)粒的細菌與適當(dāng)制備的植物、植物細胞或植物組織接觸足以將所關(guān)注的DNA序列轉(zhuǎn)移至細胞的時間。在一個實施方案中，選擇轉(zhuǎn)化的植物或細胞或組織。當(dāng)使用植物細胞或組織時，將轉(zhuǎn)化的細胞再生成植物。本發(fā)明的這些和其它方面在參照如下詳細描述和附圖時將變得顯而易見。此外，下文列出了更詳細描述某些操作步驟或組合物(例如，質(zhì)粒等)的各種參考文獻，因此將它們完整地引入作為參考。圖1A和B表示根瘤菌目中細菌的最新分類等級。圖2展示了典型二元載體的圖語。圖3A-F顯示了根瘤菌屬的種類NGR234(鏈霉素抗性菌林ANU240)(SEQIDNOS:1-3)、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummelitoli)1021(SEQIDNOS:4—6)、百脈中間根瘤菌(Mesorhizobiumloti)MAFF303099(SEQIDNOS:7-9)、紫金牛葉桿菌(Phyllobacteriummyrsinacearum)CAMBIA分離物WB1(SEQIDNOS:10-11)、大豆'漫生才艮瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)USDAllO(SEQIDNOS:12—14)的16SrDNA,atpD和recA基因以及根瘤土壤桿菌EHA105(SEQIDNOS:15-16)的16SrDNA，atpD基因的部分核苷酸序列。圖4顯示了來自根瘤土壤桿菌EHA105(SEQIDNO:17)的recA基因的部分核苷酸序列。圖5顯示了使用分離自EHA101的Ti質(zhì)粒DNA電穿孔的Ti質(zhì)粒消除的LBA288細胞轉(zhuǎn)化體的擴增分析結(jié)果。使用了下列引物泳道a，Atul6S(SEQIDNOS:21-22);泳道b，attScirc(SEQIDNOS:23-24);泳道c,attSpAT(SEQIDNOS:25-26);泳道d，AtuvirG(SEQIDNOS:27-28);泳道e，nptI(SEQIDNO:29-30);泳道f，virB(SEQIDNOS:31-32)。LBA288，Ti質(zhì)粒消除的土壤桿菌屬菌抹;EHAIOI，Ti質(zhì)粒DNA的供體菌林；轉(zhuǎn)化體1和2，LBA288的獨立轉(zhuǎn)化體。圖6說明了使用包含Ti質(zhì)粒(virG)的同源序列的自殺載體(pWBE58)將來自RP4的oriT整合于EHA105的Ti質(zhì)粒中的策略。圖7為對來自分別表示virG區(qū)(EHA105pTil)和accA區(qū),105pTi2)復(fù)制的兩種根癌土壤桿菌Ti質(zhì)粒自殺載體整合體的基因組腿的DNA印跡分析，圖8顯示了二元載體pCAMBIA1105.l的載體圖鐠。GUSP1usTm基因(美國專利US6391547);HYG(R)，潮霉素抗性基因；MCS，多克隆位點。圖9顯示了二元載體pCAMBIA1105.1R的載體圖鐠。GUSP1usTm基因(美國專利US6391547);HYG(R)，潮霉素抗性基因；MCS,多克隆位點的(注意MCS與pCAMBIA1105.1中的MCS不同)。圖IO為表示對來自分別包含根癌土壤桿菌修飾的Ti質(zhì)粒pTil和pTi3以及二元載體pCAMBIA1105.1R的根瘤菌屬種類NGR234的菌林(上圖)和苜蓿中華根瘤菌1021的菌林(中圖)的DNA的擴增分析結(jié)果的電泳凝膠。使用了下列引物；泳道a，Smel6SrDM(SEQIDNOS:33-34);泳道b，NodDl歸234(SEQIDNOS:35-36);泳道c，SmeNodQ+NodQ2(SEQIDNOS:37-39);泳道d,VirB(SEQIDNOS:31-32);泳道e,VirBllFW2+M13REV(鑒定pTil;SEQIDNOS:40-41);泳道f，M13FW+MoaAREV2(鑒定pTi3;SEQID廳42-43);泳道g，HygR510(SEQIDNOS:44-45);泳道h和h，，1405.1FW+M13FW(SEQIDNOS:46+42;鑒定二元載體中的特異性MCS;泳道h中的陽性對照為pCAMBIA1105.1R，而泳道h，中的陽性對照為pCAMBIA1105.1);泳道i，Atul6SrDNA(SEQIDN0S:21-22);泳道j，attScirc(SEQIDNOS:23-24);泳道k,attSpAT(SEQIDNOS:25-26);泳道M，合并的IOObp和lkbDNA梯。圖11A-C提供了分別與各自包含Ti質(zhì)粒和二元載體的根癌土壤桿菌(A圖)、苜蓿中華根瘤菌(B圖)和根瘤菌屬的種類(C圖)一起共培養(yǎng)后對GUS(p-葡糖苷酸酶)活性染色的(箭頭指向某些藍色區(qū))稻米愈傷組織的影像。圖12提供了分別與各自包含Ti質(zhì)粒和二元載體的根癌土壤桿菌、苜蓿中華根瘤菌和根瘤菌屬的種類一起共培養(yǎng)后對GUS活性染色的煙草葉片的影像。圖13顯示了在使用包含pTil和pCAMBIA1105.1R的根瘤菌屬的種類NGR234進行花浸漬轉(zhuǎn)化后在含有潮霉素的培養(yǎng)基上發(fā)芽的鼠耳芥屬(Arabidopsis)幼苗；箭頭指向生長的潮霉素抗性幼苗。圖14顯示了來自分別與根癌土壤桿菌和苜蓿中華根瘤菌的基因轉(zhuǎn)移感受態(tài)菌林共培養(yǎng)后再生的煙草枝條的GUS染色的葉端。圖15提供了使用引物Hyg700(SEQIDNOS:82-83)(上圖)和MCS(SEQIDNOS:46和79)(下圖)對分別與基因轉(zhuǎn)移感受態(tài)苜蓿中華根瘤菌(2-1,6，7-1，ll-l)和根癌土壤桿菌(l，2，3)共培養(yǎng)后再生的煙草枝條(基因型Wisconsin38)獲得的HygR基因擴增數(shù)據(jù)。圖16提供了與包含pTi3和pCAMBIAl105.1R的苜蓿中華根瘤菌一起共培養(yǎng)后再生的生了根的煙草枝條的照片。圖17A-B提供了具有GUS活性(藍色)的苜蓿中華根瘤菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的稻米愈傷組織和未轉(zhuǎn)化的稻米愈傷組織(白色)(A圖)和在根中具有可見的GUS活性(藍色)的苜蓿中華根瘤菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的稻米枝條、在發(fā)育枝條的基底部和枝條頂端的愈傷組織(B圖)的影像。圖18提供了獨立轉(zhuǎn)化的煙草(Tob)、鼠耳芥屬(Arab)和稻米植物及其各自的未轉(zhuǎn)化對照物(wt)的DNA印跡數(shù)據(jù)。本文所示的轉(zhuǎn)基因植物由苜蓿中華根瘤菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。(*)表示空的泳道。發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明提供了用于轉(zhuǎn)化真核細胞，尤其是植物細胞的菌種。用于本發(fā)明的菌種為可以與植物發(fā)生相互作用并且為非致病性的細菌。通過使用一種核酸分子，諸如來自土壤桿菌屬的Ti輔助質(zhì)粒或其衍生物和第二種核酸分子或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使這些細菌成為基因轉(zhuǎn)移感受態(tài)的，所述的一種核酸分子包括所有或部分vir基因區(qū)或功能等效物，并且第二種核酸分子或質(zhì)粒包括可操作地與能夠?qū)⑺P(guān)注的序列轉(zhuǎn)移至真核植物細胞的一種或多種序列連接的所關(guān)注的DNA序列。在某些方面中，通過使用包括vir基因或同源物和可操作地與能夠轉(zhuǎn)移的序列連接的所關(guān)注的DNA序列的單一核酸分子轉(zhuǎn)染使得這些細菌成為基因轉(zhuǎn)移感受態(tài)的。合適的非病原菌的鑒定用于本發(fā)明的細菌為那些可以與植物發(fā)生相互作用，而對^i物或植物細胞無害的細菌，即它們?yōu)榉侵虏⌒缘?。非病原菌為那些對植物而言為有利的或有益的細菌。非病原菌為那些不會?dǎo)致疾病狀態(tài)的細菌。疾病狀態(tài)的癥狀包括受侵害的植物組織的細胞死亡、維管元件的進行性發(fā)病和相鄰組織壞死、組織浸軟(例如軟腐病)和異常細胞分裂。(就更多有關(guān)植物病原菌的信息而言，參見"Kado，CI，"PlantPathogenicBacteria"inM.Dworkin等，eds.,TheProkaryotes:AnEvolvingElectronicResourcefortheMicrobiologicalCommunity,2ndedition,release3.0，21May1999，Springer-Verlag，NewYork,http:〃1ink.springer-ny.com/1ink/service/books/10125/。)使用非病原菌的一些優(yōu)點包括轉(zhuǎn)化質(zhì)量提高和易于使用、壞死或褐變最少或沒有這些情況和缺乏過敏性壞死反應(yīng)。此外，本發(fā)明的細菌與土壤桿菌屬相比較可以有效地與其它植物物種發(fā)生相互作用，從而為利用不同的充分演化的細菌-植物相互作用提供了巨大機會并且可以將它們轉(zhuǎn)變成基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當(dāng)打算針對指定的真核生物物種進行轉(zhuǎn)化實驗時，特別是如果它就是已知難以使用土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化的物種，那么這些細菌由此提供了進行選擇的有價值的備選方案。用于本發(fā)明的細菌與植物組織發(fā)生相互作用。盡管根伴隨細菌根瘤菌可能是人所共知的，但是用于本發(fā)明的細菌可以與任何植物組織，諸如根、葉、分生組織、生殖器官和莖相伴。它們還可以為植物內(nèi)生的。這類細菌包括，但不限于中華根瘤菌屬、中間根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、假單胞菌屬、固氮螺菌屬、紅球菌屬、葉桿菌屬、黃單胞菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、蒼白桿菌屬(0chrobacter)、歐文氏菌屬和芽孢桿菌屬的種。為伴隨植物的細菌的眾所周知的非致病性種類之一包括根瘤菌，即固定氮的細菌。根瘤菌包括一組革蘭氏陰性菌，它們具有在根上，或在某些情況下在豆科植物(例如大豆、豌豆、小扁豆和花生)莖上產(chǎn)生根瘤的能力。目前存在分類的幾個屬和接近40個種的根瘤菌，將它們中的一些列在圖1中。這些屬代表了oc-蛋白菌的第2亞群中的不同科(Gaunt等,IJSEM51:2037-2048，2001)。這包括根瘤菌屬、中華根瘤菌屬、異根瘤菌屬(Allorhizobium)、中間根瘤菌屬、慢生才艮瘤菌屬、固氮根瘤菌屬、甲基桿菌屬(Methylobacterium)等屬中的種。分子數(shù)據(jù)，諸如rDNA基因序列的相似性有助于目前的細菌分類觀點。由于在獲得更多數(shù)據(jù)時分類系統(tǒng)的流動性，所以鑒定菌種的最佳方法之一為16SrDNA基因的核酸序列同一性(相似性)；額外基因座的序列已經(jīng)證實了基于16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育(Gaunt等，IJSEM51:2037-2048，2001)。因此，細菌的屬和種的名稱在分類校訂時隨時間而改變。例如，通過比較rDNA基因，發(fā)現(xiàn)根瘤土壤桿菌是與放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)相同的種并且目前為該名稱。"名字表示的是什么？我們?nèi)∶麨槊倒逯?換句話說就是會發(fā)出香氣"(WilliamShakespeare,RomeoandJuliet,act2，sc.1，1.75-81599)。細菌可以獲自土壤樣品、植物組織、種質(zhì)庫、菌林保藏所和商品來源等處。用于培養(yǎng)不同細菌的條件為眾所周知的。可以檢測細菌的抗生素敏感性以便找到允許在防止其它細菌生長的選擇性條件下生長的合適的抗生素。通過將測試細菌平板接種在含有不同濃度的抗生素的固體培養(yǎng)基上并且對菌落進行計數(shù)來確定抗生素抗性和敏感性?；蛘?，可以通過每隔一段時間測定培養(yǎng)基中細菌的數(shù)量來確定在有不同抗生素存在和不同濃度下的生長率。易于通過在允許固體培養(yǎng)基上平板接種并且對菌落進行計數(shù)或通過分光光度吸收度測定來確定細菌數(shù)量和生長曲線。通過分子技術(shù)可以便利地確定本發(fā)明細菌的種。本領(lǐng)域中普遍使用的方法是將獲自該細菌的rDNA序列與根據(jù)已知細菌屬或種確定的rDNA序列進行比較，不過，代替rDNA序列或除了rDNA序列外還可以使用其它基因序列。正如實施例中證實的，通過將16SrDNA、recA和atpD核苷酸序列與序列數(shù)據(jù)庫比較來鑒定方案中使用的細菌；所有這些基因序列已經(jīng)預(yù)先用于細菌中的系統(tǒng)發(fā)育研究(Gaunt等，IJSEM51:2-37-2048，2001)。一般通過對基因組DNA的擴增片段進行測序獲得序列。用于擴增這些基因和許多其它基因的共有引物可以在文獻中找到(例如(Tan等，Appl.Environm.Microbiol.8:1273-1284，2001);(Gaunt等，IJSEM51:2037-2048，2001))或可以基于對來自相關(guān)種的序列進行序列比對進行設(shè)計。鑒定基于序列之間的匹配，如果至少為90%，至少為95%或至少為99%，那么是最佳的。為便于快速證實可用于本發(fā)明的菌林或多種菌林，還可以通過使用種-特異性或?qū)?特異性引物序列鑒定菌種。它們可以包括特異性擴增至少部分16SrDNA區(qū)、其它染色體區(qū)和質(zhì)粒攜帶的序列的引物。對廣泛收集的細菌菌林(例如那些用于實驗室的菌林)測試引物，并且僅那些擴增來自預(yù)計的種，而非來自其它種的正確產(chǎn)物的引物用于隨后的鑒定評價。在本發(fā)明的一個方面中，用于基因轉(zhuǎn)移的細菌應(yīng)能夠獲得和維持質(zhì)粒。在某些實施方案中，該質(zhì)粒為功能性的Ti質(zhì)粒或至少部分Ti質(zhì)粒。作為控制由土壤桿菌屬導(dǎo)致的植物中的冠癭病的研究的組成部分，Teyssier-Cuvelle等(Molec.Ecol.8:1273-1284,1999)研究了可以通過接合從土壤桿菌屬細胞獲得和維持Ti質(zhì)粒的細菌的土壤微生物區(qū)系。通過擴增rDNA基因并且與rDNA基因序列數(shù)據(jù)庫比較來確定轉(zhuǎn)接合細菌的分類。作者鑒定了兩種新的用于實施例中的菌種，它們與中華根瘤菌屬和根瘤菌屬極為接近?？梢孕揎椨杀景l(fā)明細菌獲得和維持的Ti質(zhì)粒以便增加其在某些種中的攝取或穩(wěn)定性或這兩者。例如，可以通過下列方式修飾Ti質(zhì)粒插入在這些菌種中識別的復(fù)制起點或使得所述質(zhì)粒變?yōu)榭梢苿拥霓D(zhuǎn)移起點(oriT)，或除去某些基因或使其突變，改善Ti質(zhì)粒的穩(wěn)定性或其移動至其它細菌。細菌還應(yīng)能夠誘導(dǎo)或組成型表達參與所關(guān)注的DNA序列轉(zhuǎn)移的基因。這些基因為由vir操縱子編碼的毒力基因或該毒力基因的同源物，諸如tra基因。當(dāng)使用vir基因時，一般通過由受傷的植物細胞天然釋放的酚類化合物或化合物，例如乙酰丁香酮的作用進行誘導(dǎo)，將所述化合物添加到細菌在外植體感染前生長的培養(yǎng)基中。證實vir基因、tra基因或其它同源物得到表達的任何方式都可以用于建立功能性。典型方式包括使用特異性抗體對蛋白質(zhì)進行的蛋白質(zhì)印跡分析、對與任何基西的啟動子連接的報道基因(例如使用vir啟動子-lacZ融合體)表達的分析或與報道基因，諸如綠色熒光蛋白融合的蛋白質(zhì)(例如virD4或virE2)的細胞定位的顯微鏡觀察。或者，可以在乙酰丁香酮誘導(dǎo)細菌培養(yǎng)物后，使形成的單鏈轉(zhuǎn)移中間體，諸如T-DNA分子直接在諸如含有未消化基因組DNA的DNA印跡上顯現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)可維持第一種核酸分子，諸如去甲型Ti質(zhì)粒的細菌應(yīng)能夠表達將所關(guān)注的DNA序列轉(zhuǎn)移至植物細胞中所涉及的基因。在一個實施方案中，將所關(guān)注的DNA序列裝配在T-DNA質(zhì)粒上，在其上，這些基因位于一個或兩個T-DNA邊緣的側(cè)翼。T-DNA邊緣為virD2蛋白切割T-DM質(zhì)粒的位點，導(dǎo)致形成松弛小體(T-復(fù)合物)，然后通過virB跨膜復(fù)合物被轉(zhuǎn)移至植物細胞。在另一個實施方案中，將所關(guān)注的DNA序列裝配在不具有T-DNA邊緣，而是含有執(zhí)行T-DNA邊緣相同功能的一種或兩種序列的質(zhì)粒上，即所述質(zhì)粒含有用于切割和切除含有所關(guān)注的DNA序列的單鏈DNA區(qū)的位點(Waters等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:1456-1460，1991;Ward等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:9350-9354,1991)。這些切割位點可以由質(zhì)粒，諸如RSF1010或CloDF13的轉(zhuǎn)移起點(oriT)區(qū)組成，已經(jīng)證實這兩種質(zhì)粒被virB跨膜復(fù)合物轉(zhuǎn)運(Buchanan-Wollastan等，1987;Escudero等，2003)。就T-DNA邊緣而言，可以存在一個或多個oriT區(qū)。如果存在兩個oriT區(qū)，那么一個oriT區(qū)一般位于所關(guān)注的DNA序列的任一側(cè)。使用非-T-DNA移動性載體將所關(guān)注的DNA序列從土壤桿菌屬細胞轉(zhuǎn)移至植物和酵母細胞的操作步驟已經(jīng)描述在WO2001/064925Al(Escudero等，Mol.Microbiol47:891-901，2003)中。該栽體來源于有限宿主范圍的質(zhì)粒CloDF13，它含有來自CloDF13的oriT和mobB和mobC基因以及含有GUS基因的植物表達盒，并且通過募集土壤桿菌屬的毒力器而被移動至植物細胞。經(jīng)證實轉(zhuǎn)化的植物組織表達GUS活性。在另一個實施方案中，用于本發(fā)明的細菌能夠維持由并非完整Ti質(zhì)粒的廣宿主范圍質(zhì)粒上的virB操縱子編碼的土壤桿菌屬Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移基西和可能的其它vir基因。此外，它們能夠維持含有待轉(zhuǎn)移至植物細胞的所關(guān)注的基因的第二種移動性質(zhì)粒，例如W02001/064925中使用的CloDF13的衍生物。此外，本發(fā)明的細菌以一種或另一種方式附著于植物組織或接觸細胞，以便將所關(guān)注的DNA轉(zhuǎn)移至植物細胞。就未知附著于或與植物細胞發(fā)生相互作用的菌林而言，可以通過許多方法評價附著或接觸的驗證。例如，可以使用焚光蛋白標記細菌并且與植物組織一起孵育；然后可以通過熒光顯微鏡檢查來觀察附著情況?；蛘?，還可以評價T-DNA轉(zhuǎn)移或整合中所涉及的細菌蛋白(例如virD2、virE2、virF)的轉(zhuǎn)移或T-DNA整合中所涉及的植物基因(例如RAT5)的誘導(dǎo)。核酸分子，包括質(zhì)粒的制備使用上述和本文所述的核酸分子轉(zhuǎn)染細菌。在本章節(jié)中，從質(zhì)粒方面描述核酸分子的制備。就含有并非質(zhì)粒的核酸分子(例如整合入細菌基因組的)的細菌而言，一般將質(zhì)粒用作起始材料。在本發(fā)明的一個方面中，使用兩種質(zhì)粒載體。所述的載體為(i)廣宿主范圍的小復(fù)制子，它通常具有允許在廣泛細菌，包括大腸桿菌(E.coli)和本發(fā)明的細菌中維持的質(zhì)粒的復(fù)制起點(oriV);和(ii)第二種質(zhì)粒，當(dāng)它為Ti質(zhì)粒時，被認為是"去甲型"，因為其位于T-DNA中誘導(dǎo)腫瘤的基因已經(jīng)被除去(美國專利US4，940，838、5，149，645和5,464,753)。第一種質(zhì)粒含有可操作地與左和右T-DNA邊緣(或至少右T-邊緣)連接的所關(guān)注的DNA序列。當(dāng)使用兩種邊緣序列時，所關(guān)注的DNA序列位于所述邊緣序列之間。當(dāng)僅使用一種邊緣序列時，所關(guān)注的DNA序列位于與待轉(zhuǎn)入靶真核細胞的位置足夠近和該位置上。為了表達所關(guān)注的序列，這些序列處于啟動子控制下。典型質(zhì)粒的示意圖如圖2中所示。在某些實施方案中，該質(zhì)粒具有能夠形成松弛小體的序列(US2003/0087439A1)。典型移動性質(zhì)粒來源于RSFIOIO(Scholz等，基因75(2)，271-288，1989，GenBank登錄號M28829)和CloDF13(Escudero等，MolMicrobiol.47:891-901，2003;GenBank登錄號NC002119)。第二種質(zhì)粒一般為廣宿主范圍質(zhì)粒，并且包括Ti質(zhì)粒vir基因的至少一部分或同源基因，諸如tra基因。盡管一般使用完整的vir基因或tra基因區(qū)(或其它功能性同源物)，但是這些基因中的一種或多種可以被缺失或被另一種同源物置換，只要剩余的基因足以導(dǎo)致所關(guān)注的DM序列的轉(zhuǎn)移。載體還可以含有用于在細菌中維持的oriV和選擇標記。當(dāng)將核酸分子整合入細菌染色體或其它自我復(fù)制的細菌DNA分子時，oriV并非必不可少的。一般而言，含有所關(guān)注的DNA的載體也含有用于鑒定轉(zhuǎn)化體的選擇或篩選標記。所述的標記可以在適當(dāng)條件下提供生長優(yōu)勢。某些眾所周知的選擇標記為藥物抗性基因，諸如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、除草劑抗性基因等。諸如在正選擇中，可以選擇性地使用其它選擇系統(tǒng)，包括編碼對其它毒性化合物的抗性的基因；編碼細胞生長所需產(chǎn)物的基因。這些"正選擇，，系統(tǒng)的實例是大量的(例如，參見美國專利US5，994，629)。或者，可以使用允許基于視覺表型，例如t葡糖醛酸糖苷酶或綠色熒光蛋白(GFP)表達選擇轉(zhuǎn)化細胞的篩選標記。選擇標記一般還具有基因轉(zhuǎn)錄所必需的可操作連接的調(diào)節(jié)元件，例如組成型或誘導(dǎo)型啟動子和終止序列，包括聚腺苷酸化信號序列。任選包括提高轉(zhuǎn)錄效率的元件。適用于本發(fā)明的典型小復(fù)制子載體基于pCAMBIA1305.2。已經(jīng)描述了其它載體(美國專利US4，536，475;5，733，744;4，940，838;5,464,763;5,501,967;5，731，179)或可以基于本文提供的指導(dǎo)原則構(gòu)建它們。pCAMBIA1305.2質(zhì)粒含有用于整合入植物宿主染色體的左和右邊緣序列，并且還含有細菌復(fù)制起點和選擇標記。這些邊緣序列位于兩種基因的側(cè)翼。一種為由雙CaMV35S啟動子驅(qū)動并且使用胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化位點的潮霉素抗性基因(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶或HYG)。第二種為來自多種生物體的任一種，諸如大腸桿菌、葡萄球菌屬(Staphyloccocus)、海棲熱袍菌(Thermatogamaritima)等的在CaMV35S啟動子和胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化位點控制下的p-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因(報道基因)。如果合適，CaMV35S啟動子被不同啟動子置換。另外插入上述表達單位的一種或插入該表達單位以代替GUS或HYG基因彈夾。含有將來自在土壤桿菌屬的DNA轉(zhuǎn)移至植物細胞所必需的基因的Ti質(zhì)粒還可以在其它屬的細菌中復(fù)制。特別是，Ti質(zhì)粒可以在根瘤菌中復(fù)制，并且是穩(wěn)定的(即不易于從細菌中消除)。在本發(fā)明的情況下使用的典型根瘤菌包括豌豆根瘤菌三葉草變種(Rhizobiumleguminosarumbv.Trifolii)(上文的豌豆根瘤菌)、根瘤菌屬的種類NGR234、百脈中間根瘤菌、紫金牛葉桿菌和苜蓿中華根瘤菌(上文的苜蓿根瘤菌)，它們均能夠支持和表達Ti質(zhì)粒的基因。在一個實施方案中，通過插入另一種復(fù)制起點，一般為廣宿主范圍復(fù)制起點，諸如RK2復(fù)制起點來修飾Ti質(zhì)粒，以便使Ti質(zhì)粒在某些細菌中更為穩(wěn)定。因此，當(dāng)適當(dāng)修飾和改造時，這些細菌可以用于將核酸序列轉(zhuǎn)入真核細胞，尤其是轉(zhuǎn)入植物細胞。包含在本發(fā)明細菌中的輔助Ti質(zhì)粒缺乏完整的T-DNA區(qū)，但含有vir區(qū)。為了有助于構(gòu)建既具有小復(fù)制子質(zhì)粒(或移動性質(zhì)粒)，又具有Ti質(zhì)粒的細菌菌林，Ti質(zhì)粒可以含有選擇標記、相容性復(fù)制起點和多個virG序列。盡管選擇標記在這兩種質(zhì)粒上可以相同，但是更典型的是這些標記不同，以便有利于證實這兩種質(zhì)粒的存在。輔助質(zhì)?；蛐?fù)制子或移動性載體可以任選含有至少一種額外的virG基因和任選含有修飾的virG基因。可以通過多種方法中的任一種將額外的virG基因插入Ti質(zhì)粒，所述的方法包括使用轉(zhuǎn)座子和同源重組(Kalogeraki和Winans，基因188:69-75，1997)。可以通過任何方法誘導(dǎo)同源重組，包括使用攜帶Ti質(zhì)粒(例如virG基因)的克隆片段的自殺質(zhì)粒或例如通過不相容性促使與Ti質(zhì)粒重組的穩(wěn)定復(fù)制子。此外，在含有virG的片段上可以包括編碼抗生素抗性的基因。Ti質(zhì)粒的其它序列可以類似地(完全或部分)被復(fù)制或被除去，包括對本申請的目的而言趨向于不重要的大區(qū)域?？梢匀芜x包括轉(zhuǎn)移起點，諸如RK2/RP4的oriT(Stabb和Ruby，Enzymol.358:413-426，2002)。這種類型的轉(zhuǎn)移起點允許借助于RK2/RP4或類似載體，包括衍生物的轉(zhuǎn)移功能使Ti質(zhì)粒移動至其它細菌，例如根瘤菌。典型的輔助質(zhì)粒為pTiBo542。還對這種高毒力的質(zhì)粒進行了完整測序(P.0ger，數(shù)據(jù)未公布)。已經(jīng)廣泛使用了去甲型衍生物pEHA101和pEHA105(Hood等，J.Bacteriol.168:1291-1301，1986;Hood等，TransgenicResearch2:208-218，1993)。其它輔助質(zhì)粒包括LBA4404、pGA系列、pCG系列中的那些等(參見Hellens和Mullineaux，"土壤桿菌屬二元Ti載體指南"-TrendsPlantSci.5:446-451，2000).例如，在美國專利US4，693，976、5，731，179和EP116718B2中充分描述了共整合載體的構(gòu)建。細菌的轉(zhuǎn)染一般而言，通過接合或通過直接轉(zhuǎn)移法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入本發(fā)明的細菌。通過將來自高度轉(zhuǎn)化-感受態(tài)土壤桿菌屬的適當(dāng)去曱型Ti'輔助，質(zhì)粒(例如來自EHA105的pEHA105)和修飾的基因轉(zhuǎn)移T-DNA載體(例如pCAMBIA1305.1)(或移動性質(zhì)粒)轉(zhuǎn)移至本發(fā)明的細菌，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌。這些細菌可以用于轉(zhuǎn)化植物和植物細胞?？梢酝ㄟ^生物學(xué)方法，諸如接合或通過物理方法，諸如電穿孔或PEG(聚乙二醇)介導(dǎo)的方法從含有Ti質(zhì)粒的土壤桿菌屬(或其它根瘤菌)轉(zhuǎn)移第一種質(zhì)粒，例如Ti質(zhì)粒。當(dāng)將來自根瘤土壤桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至選擇的細菌(例如根瘤菌)菌林時，如果土壤桿菌屬具有染色體負選擇標記，諸如輔源營養(yǎng)或抗生素敏感性，那么可輔助該操作步驟。可以通過缺失質(zhì)粒上的accR和/或traM基因獲得Ti質(zhì)粒的組成型接合能力(Teyssier-Cuvelle等，Molec.Ecol.8:1273-1284，1999)。否則，可以通過使用在冠癭病中天然產(chǎn)生的特異性冠癭氨基酸或使用可以(暫時)與Ti質(zhì)粒形成共整合物的自我轉(zhuǎn)移R質(zhì)粒(例如R772或RP4)進行接合的誘導(dǎo)。如果已經(jīng)通過插入外源性oriT，例如RP4/RK2的oriT改造了Ti質(zhì)粒，那么可以借助于在質(zhì)?；蚱淙旧w上含有相容性轉(zhuǎn)移功能的細菌菌株，例如大腸桿菌進行一種細菌與另一種細菌的接合。該過程可以在供體、受體和輔助菌林之間的三親接合中或在含有轉(zhuǎn)移基因的供體與受體之間的雙親接合中完成。將細菌轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基并且將推定的轉(zhuǎn)接合子進行充分的平板接種以便分離單細胞克隆。在轉(zhuǎn)接合后，可以對土壤桿菌屬進行選擇。如果土壤桿菌屬對受體細菌耐受的抗生素敏感，無論是天然抗性的還是作為具有小復(fù)制子質(zhì)粒結(jié)果抗性的，那么該抗生素可以用于選擇受體細菌菌林。類似地，如果使用輔助菌株，那么可以通過使用受體細菌耐受的相同或不同抗生素對其進行選擇。還可以通過例如由轉(zhuǎn)座子載體介導(dǎo)的整合提供抗生素抗性的外源基因，使這些輔助菌林成為抗生素抗性的。類似地，可以通過選擇Ti質(zhì)粒排除尚未接納Ti質(zhì)粒的細菌。一般而言，這種選擇也將是抗生素選擇，但依賴于Ti質(zhì)粒中的選擇標記。可以通過任何合適的方法驗證Ti質(zhì)粒的存在，不過，為方^f更起見，通常使用vir基因或任何其它Ti質(zhì)粒序列的擴增?？梢栽谑褂枚喾N試驗中的任一種，應(yīng)用乙酰丁香酮誘導(dǎo)后，檢查新宿主中Vir基因的表達，所述的試驗諸如RNA印跡分析、RT-PCR、實時擴增、微陣列上的雜交、蛋白質(zhì)印跡、對來自與vir基因的啟動子連接的報道基因的基因表達的分析等。還可以在不使用土壤桿菌屬作為供體菌林的情況下將Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至其它細菌。例如，已經(jīng)通過一種或另一種方式獲得了Ti質(zhì)粒的根瘤菌菌抹可以作為其它細菌受體菌林的Ti質(zhì)粒的供體。在某些情況下，這可避免干擾存在于許多細菌(即使并非所有細菌)中的限制性內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)。代替接合，可以將Ti質(zhì)粒電穿孔入受體細菌。已經(jīng)描述了Ti質(zhì)粒的分離和對其它土壤桿菌屬菌林，例如對Ti質(zhì)粒消除的菌林LBA288的電穿孔(Mozo等，PlantMol.Biol.16:617-918，1990)。類似地，可以對其它菌種進行電穿孔。為了轉(zhuǎn)移小質(zhì)?；蛞话銥樾≠|(zhì)粒的移動性二元載體，便利地使用電穿孔。二元載體應(yīng)與Ti質(zhì)粒相容，并且對兩者進行選擇?？梢酝ㄟ^擴增或通過從細菌中再分離質(zhì)粒并且通過限制性消化分析質(zhì)粒DNA來證實二元載體的存在。真核細胞的轉(zhuǎn)化可以在本發(fā)明的情況下轉(zhuǎn)化真核細胞。此外，可以使用單獨的細胞或細胞聚集物，諸如器官或組織或器官或組織的一部分。一般而言，在轉(zhuǎn)化前培養(yǎng)待轉(zhuǎn)化的細胞或組織，或可以在原位轉(zhuǎn)化細胞或組織。在某些實施方案中，在有添加劑存在下培養(yǎng)細胞或組織以便使它們更易受轉(zhuǎn)化。在其它實施方案中，從生物體中切下細胞或組織并且在沒有預(yù)先培養(yǎng)的情況下進行轉(zhuǎn)化。作為待轉(zhuǎn)化的細胞或組織來源的合適的真核生物包括植物、真菌和酵母?？梢允褂猛寥罈U菌屬轉(zhuǎn)化酵母細胞并且因此在本發(fā)明的情況下可以將這些酵母細胞用于測定和用于優(yōu)化條件。使用酵母的優(yōu)點在于酵母的快速生長和它在實驗室條件下生長的能力。易于根據(jù)轉(zhuǎn)化體改變的表型檢測它們，例如在缺乏必需生長成分的培養(yǎng)基上生長，而未轉(zhuǎn)化的細胞不能在該培養(yǎng)基上生長。然后通過對生長在選擇培養(yǎng)基上的菌落的數(shù)量進行計數(shù)來量化轉(zhuǎn)化率。通過土壤桿菌屬進行酵母細胞轉(zhuǎn)化不依賴于對植物轉(zhuǎn)化而言必需的附著基因的表達，并且通過使用自主復(fù)制DNA單元(微型染色體)可以避免對基因整合(如果需要)的需求。附著的解偶聯(lián)和來自全部基因轉(zhuǎn)移過程中的DNA整合可以簡化通過其它細菌進行的轉(zhuǎn)化的優(yōu)化。例如，在將Ti/T-DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至這些細菌后，可以通過遺傳互補，使用轉(zhuǎn)移至含pTi的細菌的根癌土壤桿菌基因組文庫優(yōu)化該系統(tǒng)。然后將該細菌文庫用于轉(zhuǎn)化酵母細胞并且選擇最有效轉(zhuǎn)化的細菌克隆?；蛘?，當(dāng)對根瘤土壤桿菌和某些菌種已經(jīng)完全測序并且可以比較時，在對用土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化而言重要的后者細菌中缺失的基因可以從土壤桿菌屬基因組中單獨挑選出來并且通過任何方式插入細菌基因組或在質(zhì)粒上表達。類似地，可以將這些細菌用于在各種試驗條件，諸如溫度、pH、營養(yǎng)添加劑等下轉(zhuǎn)化酵母細胞?？梢钥焖俅_定最佳條件且然后在植物細胞或其它真核細胞的轉(zhuǎn)化中測試。簡言之，在典型的轉(zhuǎn)化方案中，通過對含有Ti質(zhì)粒和二元載體的細菌培養(yǎng)物與葉片、原生質(zhì)體、分生組織或愈傷組織共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化植物細胞，以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物(Bevan，Nucl.Acids.Res.12:8711，1984;U.S.PatentNo.5,591,616)。在共培養(yǎng)幾天后，例如，通過洗滌并且用抗生素處理除去細菌，并且將植物細胞轉(zhuǎn)移至一般含有抑制或殺傷細菌生長的抗生素(例如頭孢噻肟)和諸如描述在美國專利US5，994，629中的任選選擇劑的培養(yǎng)后的培養(yǎng)基平板。將植物細胞進一步孵育幾天。此時可以測試轉(zhuǎn)基因的表達。在選擇培養(yǎng)基中進一步孵育幾周后，將愈傷組織或植物細胞轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基并且置于光照下。將幼苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基并且將所得植物轉(zhuǎn)入溫室。植物細胞轉(zhuǎn)化的備選方法包括將完整的花浸入細菌混懸液，使該植物進一步生長至種子形成，采集種子并且使它們在有僅允許轉(zhuǎn)化幼苗生長的選擇劑存在下發(fā)芽。或者，用僅轉(zhuǎn)化植物耐受的除草劑處理發(fā)芽的種子。重要的是要注意用于本發(fā)明的菌種可以以特異性方式與許多植物發(fā)生天然相互作用。這些細菌-植物相互作用與土壤桿菌屬天然與植物發(fā)生相互作用的方式極為不同。因此，通過土壤桿菌屬可轉(zhuǎn)化的組織和細胞在使用其它細菌的情況下可以是不同。尤其適于轉(zhuǎn)化的某些植物細胞類型包括分生組織、花粉和花粉管、種子胚、花、胚珠和葉。尤其適于轉(zhuǎn)化的植物包括玉米、稻米、小麥、大豆、苜蓿和其它豆科植物、馬鈴薯、番茄等。轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的使用本文所述的生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以用于將一種或多種所關(guān)注的DNA序列(轉(zhuǎn)基因)導(dǎo)入真核細胞且尤其是導(dǎo)入植物細胞。盡管通常為基因序列，但是所關(guān)注的序列實際上可以為任何核酸序列，無論它是否產(chǎn)生蛋白質(zhì)、RNA、反義分子或調(diào)節(jié)序列等。導(dǎo)入植物的轉(zhuǎn)基因可以編碼影響能育性，包括雄性不育性、雌性生殖力和無融合生殖的蛋白質(zhì)；植物保護基因，包括提供對疾病、細菌、真菌、線蟲、除草劑、病毒和昆蟲的抗性的蛋白質(zhì)；影響發(fā)育過程或提供新表型的基因和蛋白質(zhì)，諸如控制分生組織發(fā)育、花期、細胞分裂或衰老(例如，端粒末端轉(zhuǎn)移酶)、毒性(例如，白喉毒素、肥皂草毒蛋白)，影響膜透性(例如，葡糖苷酸通透酶(美國專利US5，432，081))、轉(zhuǎn)錄激活物或阻抑物，改變營養(yǎng)質(zhì)量，生產(chǎn)疫苗等的基因和蛋白質(zhì)。昆蟲和疾病抗性基因為眾所周知的。這些基因中的某些存在于植物基因組中并且已經(jīng)進行了遺傳鑒定。在細菌中發(fā)現(xiàn)了這些基因中的另一些并且用于提供抗性。特別是眾所周知的昆蟲抗性基因為編碼蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的晶體蛋白的基因。該晶體蛋白對各種昆蟲，諸如鱗翅目(lepidopterans)、雙翅目(Diptera)、半翅目(Hemiptera)和鞘翅目(Coleoptera)都具有活性。已經(jīng)克隆了這些基因中的許多。例如，參見GenBank;美國專利US5，317，096;5,254,799;5，460，963;5,308,760，5,466,597，5,2187,091，5，382，429，5,164,180，5,206,166，5,407,825，4,918,066。在本發(fā)明的情況下對核盤菌屬(Sclerotinia)、包嚢線蟲、煙草花葉病毒、亞麻銹病和冠銹病、稻瘟病、白粉病、黃萎病、薯蟲、坊蟲以及其它感染的其它抗性基因是有用的。用于其它轉(zhuǎn)基因，諸如控制雄性能育性的核苷酸序列可在美國專利US5，478，369和其中的參考文獻以及Mariani等，Nature347:737，1990中找到。用于轉(zhuǎn)化植物的其它轉(zhuǎn)基因包括制備用于人或動物的可食用疫苗的序列(例如美國專利US6136320，US6395964)，改變脂肪酸含量的序列，改變食物作物的氨基酸組成的序列(例如美國專利US6，664，445)，導(dǎo)入合成維生素，諸如維生素A和維生素E途徑中的酶的序列，提高鐵濃度的序列，控制果實催熟的序列，減少例如小麥和堅果的變應(yīng)性的序列，吸收和貯存毒性和有害物質(zhì)以便有助于清除被污染的土壤的序列，改變木材的纖維含量的序列，提高耐鹽性和耐早性等的序列。在誘導(dǎo)后，可以在選擇的組織中或在發(fā)育的某些階段以組成型方式產(chǎn)生所關(guān)注的DNA序列的產(chǎn)物。進行這類表達的調(diào)節(jié)元件為本領(lǐng)域眾所周知的。調(diào)節(jié)元件的許多實例可以在CAMBIAIPResource文件"用于調(diào)節(jié)基因表達的啟動子"1.0版，2003年10月中找到。提供下列實施例是為了解釋，而決非起限制作用。具體實施方式實施例1可以轉(zhuǎn)移DNA的菌種的鑒定測試趨異細菌以便鑒定能夠轉(zhuǎn)化DNA的菌種。菌林獲自公共種質(zhì)庫或分離自土壤、其它自然環(huán)境或任何植物組織。通過擴增和測序信息基因，包括rDNA基因atpD和recA來鑒定菌種(Gaunt等，IJSEM51:2037-2048，2001)。將擴增產(chǎn)物的DNA序列與具體細菌的公知序列進行比較。此時，存在的具有預(yù)計大小的擴增產(chǎn)物可以用于鑒定。如上所述，合適的菌種以一種或另一種方式與植物發(fā)生天然相互作用。它們包括與植物伴生的植物內(nèi)生細菌，諸如根瘤菌，已知它們可用于固定氮并且能夠為植物所利用。還包括可以附著于植物并且具有有益的或中性的與植物相互作用的細菌，即附生菌。測試了下列菌種根瘤菌屬的種類NGR234(鏈霉素抗性菌株ANU240)，苜蓿中華根瘤菌菌林1021、百脈中間根瘤菌MAFF303099、紫金牛葉桿菌、大豆慢生根瘤菌USDAllO、草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)(保藏號WAC1664)和熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)(保藏號WAC1650)。所有菌林均獲自公共種質(zhì)庫(WAC，PlantResearchDivisionCultureCollection,WesternAustralianDepartmentofAgricultureBaron-MayCourt,SouthPerth,WA6151Australia),但除外紫金牛葉桿菌菌抹，其為自發(fā)實驗室分離物。通過對16SrDNA基因以及分別編碼膜ATP合酶的P-亞單位和DNA重組和修復(fù)系統(tǒng)的一部分的atpD和recA基因進行擴增和測序來鑒定菌種(Gaunt等，IJSEM51:2037-2048，2001)。用于擴增和測序部分16SrDNA基因的引物序列為SEQIDNOS:47-50，用于atpD基因的引物序列為SEQIDNOS:51-52,且用于recA基因的引物序列為SEQIDNOS:53-54。獲自對為測定的菌林產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物測序的核苷酸序列如圖3A-F和圖4中所示。這些序列在與基因序列數(shù)據(jù)庫，例如GenBank比較時揭示出分別與根瘤菌屬的種類NGR234、苜蓿中華根瘤菌菌林1021、百脈中間根瘤菌MAFF303099、紫金牛葉桿菌和大豆慢生根瘤菌USDA110的最高相似性。通過擴增染色體上和基因組巨大質(zhì)粒部分上的信息基因靶并且通過凝膠電泳在有或沒有預(yù)期的擴增產(chǎn)物存在下評分進行額外的菌抹鑒定。這類擴增可以快速證實操作步驟過程中的菌林基因型并且證實根瘤菌中的質(zhì)粒，諸如一種或多種巨大質(zhì)粒，通常稱作共生質(zhì)粒(pSym)或土壤桿菌屬中的Ti質(zhì)粒和巨大質(zhì)粒，稱作pAT質(zhì)粒的獲得、喪失或維持。本文使用的基因型分型引物由擴增至少部分染色體編碼的16SrDNA基因和其它細菌基因的菌林-或種-特異性引物組成。為了設(shè)計合適的引物序列，從GenBank中檢索靶向基因的核苷酸序列并且進行序列比對。理想的情況是，進行比對的序列包括來自盡可能多的菌種的基因，并且還包括根瘤土壤桿菌的基因。從序列比對中選擇特異性擴增來自僅一個菌種或其亞群的序列的引物序列。選擇種特異性引物對，以便在通過凝膠電泳分離時，擴增的產(chǎn)物具有不同的大小，從而使得易于在單一或多元反應(yīng)過程中對它們進行評分。靶向于快速基因型分型的染色體基因包括，但不限于16SrDNA基因和存在于環(huán)狀染色體上的根瘤土壤桿菌的attS基因。用于鑒定存在于細菌中的巨大質(zhì)粒的特異性引物包括那些靶向根瘤菌屬的種類NGR234中的單一pSym質(zhì)粒上的NodDl基因，分別存在于苜蓿中華根瘤菌的pSymA和pSymB質(zhì)粒上的NodQ和NodQ2基因和存在于兩個百脈中間才艮瘤菌巨大質(zhì)粒pMLa和pMLb上的兩個repA基因座的引物。按照這類方式設(shè)計所有這些質(zhì)粒引物，以便它們選擇性擴增且由此僅鑒定特定的巨大質(zhì)粒。其它引物使用土壤桿菌屬Ti質(zhì)粒上的virG和virB基因的擴增部分和存在于在大部分(即使不是全部)土壤桿菌屬菌林中發(fā)現(xiàn)的pAT巨大質(zhì)粒上的attS基因拷貝。選擇產(chǎn)生不同大小擴增產(chǎn)物的所有引物，以便易于評價凝膠上的PCR產(chǎn)物。選自來自不同細菌的相關(guān)基因的序列比對的引物序列如表l中所示。用于擴增的模板為通過下列步驟獲得的煮熟的菌落使用移液管尖端從平板上的菌落中吸取一些細胞，將它們重新懸浮于含有IOOnL無菌水的試管中，煮沸3分鐘并且在室溫下冷卻粗DNA制品。然后將4nL該制品用于20jiiL擴增反應(yīng)。或者，可以通過任何公知方法分離純化的或更大量富集的DNA。對不同菌種和菌抹嚴格測試所有引物并且使用相同擴增程序利用這些引物，所述的擴增程序由在94'C下初始變性1分鐘，然后94X:下30秒、58。C下30秒和72。C下1分鐘的35個循環(huán)以及在下最終延伸2分鐘組成。通過瓊脂糖凝膠電泳分離擴增反應(yīng)的產(chǎn)物并且通過與已知大小的DNA條帶的梯進行比較來確定其大小。證實測定的菌抹獲得的產(chǎn)物大小是否符合對該菌抹預(yù)計的大小。一般而言，使細菌菌抹生長在選擇培養(yǎng)基上。為了找到用于本實施例中測試的菌抹的合適的選擇生長條件，將細胞混懸液完全涂布到含有幾種不同抗生素之一(25、50、100和/或200mg/L)或利福平(100mg/L)的酵母甘露糖醇(YM)瓊脂培養(yǎng)基上并且孵育長達7天。每個平板鋪展至少1(T個細胞。在孵育后，記下菌落數(shù)量(條件是〈10)或?qū)毦?+)相對生長估計值進行評分。大豆慢生根瘤菌USDA110對艮他霉素(25mg/L)、利福平(100mg/L)具有耐藥性并且對鏈霉素(200mg/L)具有中度耐藥性。百脈中間根瘤菌MAFF303099對所有測試的抗生素都敏感。苜蓿中華根瘤菌1021和根瘤菌屬的種類NGR234(菌抹ANU240)對鏈霉素(200mg/L)具有耐藥性并且對艮他霉素(25mg/L)和利福平(100mg/L)具有輕度耐藥性。紫金牛葉桿菌菌抹對卡那霉素(50mg/L)、氨芐西林(IOOmg/L)、氯霉素(IOOmg/L)和鏈霉素(200mg/L)具有耐藥性。還對細菌菌林測試了在LB瓊脂平板上的生長。所有測試的細菌均可以在LB培養(yǎng)基上生長，不過，生長速度和菌落形態(tài)有所不同。類似地，可以測試其它培養(yǎng)基，例如合成基本培養(yǎng)基，并且可以檢驗其它抗生素或生長培養(yǎng)基成分，諸如不同的糖類或維生素。優(yōu)先地且為了避免培養(yǎng)任何污染微生物，使細菌生長在為使用的特定菌林選擇的條件下。因此，使根瘤菌屬的種類和苜蓿中華根瘤菌生長在YM+strep200上，使紫金牛葉桿菌生長在YM+Km50上，使大豆慢生根瘤菌生長在YM+RifIOO上并且使百脈中間根瘤菌生長在普通的YM平板上。為了找到用于消除植物轉(zhuǎn)化實驗后的細菌的合適條件，使細菌菌林生長在含有不同濃度頭孢噻肟、特美汀和拉氧頭孢的平板上，這三種常用的抗生素用于對土壤桿菌屬進行反選擇。結(jié)果表明使用低濃度的頭孢噻肟(50mg/L)完全抑制了除苜蓿中華根瘤菌外所有測試菌林的生長；使用200mg/L的拉氧頭孢或使用頭孢噻肟與特美汀(兩者均為100mg/L)的組合可以抑制苜蓿中華根瘤菌的生長。將已知濃度的土壤桿菌屬加入到如根據(jù)連續(xù)稀釋后的菌落計數(shù)確定的也為已知濃度的根瘤菌培養(yǎng)物(根瘤菌屬的種類、苜蓿中華根瘤菌或百脈中間根瘤菌)中。將lml含有109cfu/mL根瘤菌種與106-10°cfu土壤桿菌屬的混合物鋪展在LB培養(yǎng)基上并且在28t:下培養(yǎng)2-3天。土壤桿菌屬以快于根瘤菌種的速率生長。培養(yǎng)2天后，易于在根瘤菌生長薄膜中檢測單個土壤桿菌屬菌落(例如在含有根瘤菌菌苔的單個平板上，可以觀察到10個土壤桿菌屬的菌落)。使用根瘤菌種的轉(zhuǎn)化實驗可以通過在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)1mL孵育培養(yǎng)基(一般含有109cfu的根瘤菌)利用這種差別生長速率，以便監(jiān)測土壤桿菌屬污染。此外，在典型轉(zhuǎn)化實驗中，用無菌液體洗滌共培養(yǎng)平板，然后在LB上培養(yǎng)以便監(jiān)測土壤桿菌屬污染。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>(1)這些引物還擴增NGR234菌林ANU240中的16SrRM基因。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>(1)這些引物還擴增NGR234菌林ANU240中的16SrRNA基因。實施例2可以用作Ti質(zhì)粒供體的土壤桿菌屬菌林的鑒定、Ti質(zhì)粒的分離和通過電穿孔轉(zhuǎn)移至其它細菌用作Ti質(zhì)粒來源的土壤桿菌屬菌林為高毒力菌林EHA105，它含有Ti質(zhì)粒pEHA105，即去甲型pTiBo542衍生物(Hood等，TransgenicResearch2:208-218，1993)。為了確認該菌林，為16SrDNA基因(SEQIDNOS:22-23)和環(huán)狀染色體(SEQIDNOS:23-24)或pAT巨大質(zhì)粒(SEQIDNOS:25-26)上的attS基因設(shè)計土壤桿菌屬特異性基因型分型引物。還設(shè)計了用于擴增Ti質(zhì)粒上的序列，即virG(SEQIDNOS:27-28)和virB基因(SEQIDNOS:31-32)的引物。測試這些引物對土壤桿菌屬DNA的特異性和有效擴增。還在由所有為基因轉(zhuǎn)移測定的其它菌種制備的DNA模板上測試了這些引物。結(jié)果證實了土壤桿菌屬DNA的特異性擴增，但無可檢測的從其它細菌模板的擴增。這些或其它引物組可以用于證實在植物轉(zhuǎn)化過程中使用的細菌培養(yǎng)物、混懸液或任何其它制品中不存在土壤桿菌屬細胞。為了確定可在另一菌種培養(yǎng)物中檢測到的土壤桿菌屬細胞的最低數(shù)量。可以進行如下實驗。在29。C下使土壤桿菌屬的近親，豌豆根瘤菌三葉草變種(菌抹ANU843)的培養(yǎng)物在TY(胰蛋白胨-酵母提取物)培養(yǎng)基中生長至O.D.,為l.0，相當(dāng)于108-l(T個細胞/mL。在29。C下使根癌土壤桿菌EHA101生長在含有卡那霉素(50mg/L)的LB培養(yǎng)基中并且以10倍的等級進行稀釋。通過將等分部分平板接種到LB瓊脂平板上并且對細胞數(shù)量進行計數(shù)來確定稀釋液各自中的細胞數(shù)量。根據(jù)這些計算，確定每ml中的細胞數(shù)量并且制備在10inL體積中含有20、200、2000和20.000個細胞的連續(xù)稀釋液。然后準備含有IOpL的10-倍稀釋的相當(dāng)于2x105個細胞的根瘤菌培養(yǎng)物和80pL無菌水的4支試管；加入來自各土壤桿菌屬稀釋液的IO^L，使得試管各自分別含有2、20、200和2000個土壤桿菌屬細胞。通過在IOO^L水的總體積中添加2000個土壤桿菌屬細胞準備第5支試管，它不含根瘤菌細胞。將全部試管均保持在沸水浴中3分鐘以便裂解細胞并且釋放DNA。使用來自來自試管l-5的10pL模板DNA在20pl總體積中進行擴增。擴增混合物含有兩組引物(雙擴增)，一組對豌豆根瘤菌16SrDNA基因(SEQIDNOS:18-19)具有特異性，且一組對根癌土壤桿菌16SrDNA基因(SEQIDNOS:20-21)具有特異性，它們分別擴增豌豆根瘤菌和根癌土壤桿菌中的部分16SrDNA基因并且在凝膠電泳時產(chǎn)生不同大小的產(chǎn)物(分別約700和410bp)。使用在1分鐘過程中94匸下的初始變性溫度，然后是94C下30秒、58。C下30秒、下1分鐘和在72C下2分鐘過程中的最終延伸的4O個循環(huán)進行擴增反應(yīng)。通過電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物并且通過溴化乙錠染色使其顯現(xiàn)。為了分離用于對其它細菌進行電穿孔的Ti質(zhì)粒，使2mLEHA101培養(yǎng)物在LB+卡那霉素(50mg/L)中生長至OD600為1.0。EHA101與EHA105極為相似，但含有可對該菌林提供卡那霉素抗性的NptI基因(Hood等，J.Bacteriol,168:1291-1301，1986)。通過適合于分離大質(zhì)粒的改進的堿性裂解法分離質(zhì)粒DNA。將培養(yǎng)物以20x稀釋入新鮮培養(yǎng)基并且使其再生長2-3小時。通過離心收集細胞(2500xg，10分鐘)并且重新懸浮于2mLTE(IOmMTris，pH8和1mMEDTA)緩沖液中，再次沉淀并且重新懸浮于40jtLTE中。將O.6inL新鮮制備的裂解緩沖液(4。/。在TE中的SDS，pH12.4)加入到L5mLEppendorf管中并且將細菌細胞用移液管吸移入該裂解溶液且謹慎混合。將該混懸液在37。C下孵育2分鐘，然后通過添加30pL2.OMTris-HClpH7.O并且緩慢倒置試管進行中和，直到注意到粘度改變。然后通過添加240jiL5MNaCl并且將試管在水上孵育l-4小時沉淀染色體DNA。在以16000xg離心10分鐘后，將上清液傾入新試管并且加入550jiL異丙醇以便沉淀質(zhì)粒DNA。將試管放置在-20。C下30分鐘，然后以16000xg離心3分鐘。除去上清液并且在室溫下干燥沉淀。將沉淀重新懸浮于IOTE，在4'C下孵育過夜。通過電穿孔將Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入其它細菌。在此我們顯示了將pTi轉(zhuǎn)移至為Ti質(zhì)粒消除的土壤桿菌屬菌林LBA288。按照用于根癌土壤桿菌的標準操作步驟，由成指數(shù)生長的細胞制備電感受態(tài)細胞。將40pl融化的感受態(tài)細胞加入到含有IOnl重新懸浮的EHA101質(zhì)粒DM的試管中，緩慢混合并且轉(zhuǎn)移至冷卻的微量吸收池(Bio-Rad，0.1cm電極距離)。通過Bio-Rad的基因脈沖器和脈沖控制器以13kV/cm的場強施加5分鐘的單一電脈沖。較低的場強因其較大的能力而一般在電穿孔過程中使用，以便增加Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的效率。在電脈沖后即刻加入600plSOC并且將細胞混懸液轉(zhuǎn)移至l.5mLEppendorf管且孵育l小時。然后將IOOpL等分部分鋪展到含有利福平(50mg/L)(就LBA288而言)和卡那霉素(50mg/L)(就Ti質(zhì)粒而言)的LB瓊脂平板上。在28T下孵育2天后，在平板上觀察到菌落。對大量菌落進行擴增以便檢驗來自EHA101的Ti質(zhì)粒的存在。圖5顯示了使用用于染色體、pAT質(zhì)粒和Ti質(zhì)粒的引物對兩種獨立轉(zhuǎn)化體以及供體和受體菌林的分析結(jié)果。結(jié)果揭示出LBA288菌抹已經(jīng)獲得了EHA101的Ti質(zhì)粒。同樣，可以使用適合于每個種的特定的電穿孔條件將Ti質(zhì)粒電穿孔入其它菌種。通過植物轉(zhuǎn)化實驗證實Ti質(zhì)粒的功能性。實施例3移動性Ti質(zhì)粒的構(gòu)建盡管Ti質(zhì)粒一般為自我接合質(zhì)粒，但是其在實驗室條件下的移動因不存在活化它們的接合器所必需的特定成分和條件而是不方便的。在本實施例中，通過插入RP4/RK2輔助質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移起點(oriT)使得來自EHA105的去曱型Ti質(zhì)粒成為傳遞性的。還將抗生素抗性標記插入Ti質(zhì)粒，以便能夠選擇轉(zhuǎn)接合子。然后可以通過由RP4/RO質(zhì)粒提供的轉(zhuǎn)移功能使所得修飾的Ti質(zhì)粒移動并且進行選擇。使用插入Ti質(zhì)粒中的栽體，通過同源重組將RP4oriT插入Ti質(zhì)粒中?？梢允褂脦追N類型的載體，諸如自殺載體或廣宿主范圍載體。自殺載體含有并非在土壤桿菌屬中為功能性的復(fù)制起點和一種或多種抗生素選擇標記。對這些標記進行選擇促使自殺載體重組至基因組，例如重組至Ti質(zhì)粒。其它合適的載體含有在土壤桿菌屬(例如RK2)中穩(wěn)定的廣宿主范圍復(fù)制起點。通過使用與廣宿主范圍載體不相容的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌林并且選擇這兩種質(zhì)粒而促使后者插入Ti質(zhì)粒中。通過將Ti質(zhì)粒區(qū)克隆入自殺或廣宿主范圍載體增強同源重組，由此能夠使該區(qū)與Ti質(zhì)粒上的相同序列重組。在本實施例中，使用來源于Topo載體PCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)的自殺載體。擴增將作為同源重組的耙起作用的Ti質(zhì)粒的序列并且將T/A克隆入該Topo載體。所述的靶序列包括位于分別來自virBll和virC2基因的部分序列側(cè)翼的完整virG基因(引物序列VirBllFW和VirC2REV;SEQIDNOS:66-67))。通過使用引物moaAFW和moaAREV(SEQIDNOS:68-69)對來自moaA基因的部分序列并JU吏用引物accAFW和accAREV(SEQIDNOS:70-71)對來自accA基因的部分序列分別進行T/A克隆構(gòu)建兩種其它的自殺載體。這三種基因位于沿Ti質(zhì)粒序列的不同位置上，并且與自殺載體的重組由此在三個不同區(qū)(在單獨的Ti質(zhì)粒中)中導(dǎo)致對Ti質(zhì)粒的修飾。通過測序證實所得的自殺載體構(gòu)建體。然后使用引物oriTFW和oriTREV(SEQIDN0S:72-73)由質(zhì)粒pSUP202，即RP4載體的衍生物擴增RP4oriT序列。將oriT產(chǎn)物克隆入三種自殺栽體的XbaI位點，轉(zhuǎn)移至大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞并且通過測序證實該質(zhì)粒載體。自殺質(zhì)粒之一pWBE58的載體圖譜與用于同源重組至EHA105的Ti質(zhì)粒的策略如圖6中所示。然后將自殺載體電穿孔入根瘤土壤桿菌EHA105。在補充了卡那霉素(50mg/L)和羧芐西林(100mg/L)的LB平板上選擇含有載體整合體的推定轉(zhuǎn)化體(這兩種選擇標記均存在于自殺載體上)。在3天內(nèi)獲得通過在virG、accA或moaA基因座上的同源重組已經(jīng)將自殺載體整合入Ti質(zhì)粒的候選菌落并且通過擴增對這些菌落中存在的修飾的Ti質(zhì)粒進行測定。用于驗證將完整自殺質(zhì)粒整合入Ti質(zhì)粒的引物如下用于pTi::pWBE58整合體，目前稱作pTil的virBllFW2(SEQIDNO:40)和M13REV(SEQIDNO:41);用于pTi::pWBE60整合體，目前稱作pTi2的accAFW2(SEQIDNO:74)和M13REV(SEQIDNO:41);和用于pTi::pWBE62整合體，目前稱作pTi3的M13FW(SEQIDNO:42)和moaAREV2(SEQIDNO:75)。在每種情況中，M13引物退火至自殺載體序列，而第二種引物退火至在各自的自殺栽體中克隆的區(qū)外部的序列。使用在1分鐘過程中94'C下的初始變性，然后是94。C下30秒、58匸下3Q秒、72'C下2分鐘和在72C下2分鐘的最終延伸的35個循環(huán)進行擴增。通過瓊脂糖凝膠電泳分離擴增的產(chǎn)物。結(jié)果(圖7)顯示了對每種載體整合而言，存在預(yù)計的擴增產(chǎn)物，分別為對于pTil，1496bp產(chǎn)物；對于pTi2，2080bp;和對于pTi3，1627bp。對含有未修飾Ti質(zhì)粒的野生型EHAl05菌林而言未獲得擴增產(chǎn)物。通過DNA印跡分析獲得自殺載體整合入Ti質(zhì)粒中的進一步證據(jù)?；蚪MDNA分離自野生型EHA105菌林、Ti質(zhì)粒-消除的土壤桿菌屬菌林LBA288和含有修飾的Ti質(zhì)粒pTil和pTi2的EHA105菌林。用限制性內(nèi)切核酸酶XbaI消化基因組DNA并且通過凝膠電泳運行過夜進行分離。XbaI切割自殺栽體兩次，在oriT序列的每側(cè)一次。在修飾的Ti質(zhì)粒序列中，這應(yīng)導(dǎo)致分別對重復(fù)virG和accA區(qū)內(nèi)部的DNA進行切割，從而產(chǎn)生各自含有virG或accA片段的兩種片段。然后將消化的基因組DNA印跡到膜上，固定并且與DNA探針雜交。在單獨的泳道中，加載XbaI-消化的自殺載體DNA。通過下列步驟制備DM探針對相應(yīng)于通過使用M13引物(SEQIDNOS:41—42)和accAFW+accAREV引物(SEQIDNOS:70-71)分別對從相應(yīng)自殺載體擴增的virG基因和accA基因的擴增產(chǎn)物進行DIG標i己(HighPrimeDIG才示i己試齊寸盒，Rochediagnostics,Mannheim,Germany)。在對雜交和洗滌的膜進行曝光后的膠片顯影揭示出在野生型菌林中存在單個條帶而在pTil和pTi2菌林中存在兩個條帶。不具有Ti質(zhì)粒的LBA288菌抹未顯示出任一探針的條帶，從而表明探針與Ti質(zhì)粒區(qū)結(jié)合。結(jié)果證實完整的自殺載體已經(jīng)通過單交換事件整合入Ti質(zhì)粒的同源區(qū)，由此使在載體(分別為virG和accA)中克隆的區(qū)重復(fù)。這一結(jié)果如圖7中所示。在pTil中，這一過程導(dǎo)致完整virG基因的重復(fù)，而在pTi2中，插入了AccA基因的第二截短的拷貝，。在土壤桿菌屬中，已經(jīng)證實含有重復(fù)virG基因或增強的virG活性的菌林增加了基因轉(zhuǎn)移的感應(yīng)性。實施例4Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至大腸桿菌和其它細菌以及Ti質(zhì)粒在大腸桿菌中的操作在本實施例中，將Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至大腸桿菌細胞并且在大腸桿菌中維持和修飾。(Hille等，J.Bacteriol.154:693-701，1983)證實了野生型章魚氨酸Ti質(zhì)粒與廣宿主范圍質(zhì)粒R722之間自發(fā)的穩(wěn)定共整合可以在大腸桿菌中得以維持。通過電穿孔或接合將RK2復(fù)制起點和轉(zhuǎn)移起點插入和轉(zhuǎn)移至大腸桿菌來修飾去甲型Ti質(zhì)粒EHA105。未修飾的Ti質(zhì)粒在某些菌種中不穩(wěn)定。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，通過插入廣宿主范圍復(fù)制起點修飾Ti質(zhì)粒，由此使得它更為穩(wěn)定并且能在其它菌種，包括，但不限于大腸桿菌中復(fù)制。然后使修飾的Ti質(zhì)粒與非-土壤桿菌屬種類接合，例如與大豆慢生根瘤菌或巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)接合?？梢詫⒃谀硞€種中穩(wěn)定維持的任何復(fù)制起點或穩(wěn)定蛋白基因用于穩(wěn)定Ti質(zhì)粒。首先通過插入在大腸桿菌中具有活性的復(fù)制起點修飾Ti質(zhì)粒。通過用來自Topo栽體PCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)的卡那霉素抗性基因置換四環(huán)素抗性基因(tetA和tetR)修飾廣宿主范圍質(zhì)粒pRK404，即RK2的較小衍生物(Scott等，質(zhì)粒50:74-79，2003;GenBank登記號AY204475)。用BseRI消化pRK404,并且用T4DM聚合酶使大片段變?yōu)槠蕉瞬⑶遗c含有kai^和來自PCR2.1的F1ori的EcoRV/Xmnl片段連接。所得IO.5kb載體為卡那霉素抗性的并且稱作pRK404km。為了有利于與Ti質(zhì)粒的同源重組，將Ti質(zhì)粒的序列克隆入pRK404km栽體。使用引物virBllFW和virC2REV(就virG而言;SEQIDN0S:66-67)以及引物moaAFW和moaAREV(就moaA而言；SEQIDN0S:68-69)擴增完整virG基因和含有側(cè)翼DNA的moaA基因的一部分，所述引物均攜帶限制位點。用HindIII(virG)或BamHI(moaA)消化擴增產(chǎn)物并且與類似地消化的pRK404km質(zhì)粒連接。將連接反應(yīng)電穿孔入大腸桿菌和在卡那霉素(50mg/L)上生長且在有X-gal和IPTG存在下仍為白色的轉(zhuǎn)化體，并且分析其中預(yù)計質(zhì)粒的存在。然后將所得載體電穿孔入野生型EHA105感受態(tài)細胞并且在卡那霉素(50mg/L)上選擇轉(zhuǎn)化體?；蛘?，使pRK404km/virG或pRK404km/moaA質(zhì)粒與EHA105在三親接合中借助于另一種大腸桿菌菌林提供的RP4-4或在雙親接合中使用大腸桿菌菌株S17-1(具有在其染色體中整合的RP4轉(zhuǎn)移功能)接合，其中已經(jīng)對大腸桿菌菌抹S17-1電穿孔了pRK404km/virG或pRK404km/moaA質(zhì)粒。所得EHA105轉(zhuǎn)化體很可能攜帶pRK-衍生的質(zhì)粒載體作為單獨的質(zhì)粒。為了促使這些栽體整合入Ti質(zhì)粒，用與前述載體不相容的另一種incP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌抹，并且針對初始pRK載體上的KanR基因和第二種incP載體上的選擇標記選擇轉(zhuǎn)接合子/整合體。通過與攜帶RP4-4(為卡那霉素敏感性的RP4的衍生物)的大腸桿菌菌林接合轉(zhuǎn)化EHA轉(zhuǎn)化體并且在含有卡那霉素(50mg/L)和羧節(jié)西林(100mg/L)的M9蔗糖(對大腸桿菌反選擇)平板上選擇。在所得轉(zhuǎn)接合子中，某些菌落具有在Ti質(zhì)粒virG或moaA序列區(qū)中整合的pRK-載體，并且額外攜帶RP4-4載體。然后將這些菌落用于與大腸桿菌的接合實驗，其中在371C下在含有卡那霉素(50mg/L)的LB平板上選擇大腸桿菌轉(zhuǎn)接合子。所得大腸桿菌菌落可能已經(jīng)獲得了RP4-4質(zhì)粒加上Ti質(zhì)粒。將許多菌落在新鮮平板上鋪板幾次，并且通過在含有羧芐西林(100mg/L)的LB上影印鋪板檢查RP4-4質(zhì)粒的自發(fā)喪失。通過使用用于Ti質(zhì)粒標記virG、virB和moaA的引物(分別為SEQIDNOS:27-28;31-32;和68-69)擴增證實這些大腸桿菌菌林中存在Ti質(zhì)粒?？梢酝ㄟ^用于在革蘭氏陰性菌中的遺傳操作的常用工具，包括轉(zhuǎn)座子誘變和X重組酶支持的同源重組操作大腸桿菌中的Ti質(zhì)粒?？梢允勾蟮牟糠謴膶⒒蜣D(zhuǎn)移至植物而言非必需的區(qū)中的Ti質(zhì)粒中缺失。可以插入序列以便增加Ti質(zhì)粒的穩(wěn)定性、維持性或基因轉(zhuǎn)移能力。然后通過電穿孔或接合方法將修飾的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)回至合適的細菌菌林并且用于轉(zhuǎn)化植物或其它真核生物。實施例5用于通過根癌土壤桿菌和非-土壤桿菌屬細菌進行植物轉(zhuǎn)化的"標記的"二元載體的構(gòu)建在本實施例中，將二元載體系統(tǒng)用于將基因轉(zhuǎn)移至植物。將所關(guān)注的DNA序列轉(zhuǎn)移至植物的細菌載體因此含有不含T-DNA的去甲型Ti質(zhì)粒和在T-DNA邊緣之間含有所關(guān)注的基因的栽體。在此使用的栽體來源于pCAMBIA系列栽體，即來自pCAMBIA1305.l(GenBank登錄號AF354045)。通過用來自pPZP200的壯觀霉素/鏈霉素抗性標記(SpecR)置換卡那霉素抗性標記叩tl來修飾載體(Hajdukiewicz等，PlantMolec.Biol.25:989-994，1994)。用引物SpecFWNsil(SEQIDNO.76)和SpecREVSacII(SEQIDNO.77)從pPZP200擴增Spe基因，用Nsil和SacII消化并且與來自pCAMBIA1305.1Nsil/SacII消化物的兩種大片段連接，從而排除了含有Kai/基因的988bp片段。在檢查連接的片段的正確取向后，所得的載體具有置換了Kai^基因的Spe基因并且被稱作pCAMBIA1105.1。這種栽體的圖語如圖8中所示。它含有pCAMBIA1305.1的全部特征，包括在左和右T-DNA邊緣內(nèi)的潮霉素抗性彈夾和GusPlus(美國專利US6，391，547)報道基因彈夾。GusPlus基因含有內(nèi)含子，從而防止它在細菌中被表達。在細菌混懸液的X-GlcA染色后，未檢測到藍色斑點。類似地，通過使用SpecfwSacII和SpecrevSacII(SEQIDNOS:78+77)從pPZP200擴增Spec"基因并且連接至pCAMBIA1305.1的唯一SacII位點來構(gòu)建pCAMBIA1405.1。這種載體pCAMBIA1405.l具有組合的Kan和Spec抗性并且含有與其親代載體和pCAMBIA1105.1完全相同的T-DNA區(qū)。為了驗證基因轉(zhuǎn)移.已經(jīng)通過非-土壤桿菌屬種類的輔助和不是通過污染土壤桿菌屬細胞而發(fā)生，將與用作轉(zhuǎn)化過程中的陽性對照的轉(zhuǎn)移至土壤桿菌屬菌林的載體相比稍有不同的二元載體轉(zhuǎn)移至本發(fā)明的細菌。為了標記這種二元載體和使該標記序列被整合至靶植物種的基因組，修飾T-DM區(qū)的一小部分，例如將稍有不同的多克隆位點用于兩種載體中或在邊緣序列內(nèi)的任何區(qū)中造成小的缺失或插入。將在此稱作"標記的二元載體"(MBV)的一種二元載體僅轉(zhuǎn)移至非-土壤桿菌屬菌林，并且決不導(dǎo)入任何的土壤桿菌屬菌林。將另一種二元載體(BV)僅導(dǎo)入土壤桿菌屬菌林。通過橫跨標記序列擴增并且測定產(chǎn)物的DNA序列可以對轉(zhuǎn)化的植物組織分析整合入基因組的T-DNA序列的類型。由此可以通過擴增或可選地或另外通過測序來檢驗任何的T-DM整合。因此，可以將T-DNA的起點確定為來源于靶細菌菌株或土壤桿菌屬。在本實施例中，通過用與Topo載體PCR2.1(Invitrogen，Carlsbad,CA)稍有不同的位點置換其多克隆位點來標記pCAMBIA1105.1載體。將來自Topo載體的多克隆位點作為PvuII片段切掉并且連接至PvuII-消化的pCAMBIA1105.1。通過橫跨多克隆位點序列擴增并且通過對完整多克隆位點進行序列分析來分析所得栽體。標記的載體稱作pCAMBIA1105.1R(圖9)并且將其僅電穿孔入本發(fā)明的細菌。類似地，將原始載體pCAMBIA1105.1或相關(guān)載體pCAMBIA1305.1和1405.1僅電穿孔入土壤桿菌屬，并且將所得菌抹用作基因轉(zhuǎn)移的陽性對照。通過用引物1405.l(SEQIDNO.46)和P35S5，rev(SEQIDNO.79)擴增MCS證實與原始載體相比在標記的二元載體中不同的MCS序列，從而產(chǎn)生1105.1/1305.1/1405.1系列載體的491bp產(chǎn)物和標記的二元載體pCAMBIA1105.1R的572bp產(chǎn)物。這一結(jié)果如圖15中所示。實施例6可以轉(zhuǎn)移DNA的細菌菌抹的構(gòu)建在本實施例中，為DNA轉(zhuǎn)移而通過摻入土壤桿菌屬Ti質(zhì)粒和T-DNA二元載體來改造細菌菌林。首先通過接合將Ti質(zhì)粒從土壤桿菌屬轉(zhuǎn)移至本發(fā)明的細菌菌抹。pTi輔助質(zhì)粒具有強毒力功能，例如來自EHA105的pEHA105，并且?guī)в嘘栃赃x擇標記。在一個實施方案中，通過RP4/RK2質(zhì)粒接合器的輔助實現(xiàn)Ti質(zhì)粒的移動。這些IncP質(zhì)粒或其衍生物能夠使攜帶RP4/RK2的轉(zhuǎn)移起點(oriT)的質(zhì)粒移動(參見實施例3)。如果本發(fā)明的細菌菌抹不具有有用的選擇標記，那么首先通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的誘變或通過任何的重組手段將選擇標記插入其基因組。將攜帶pTil的EHA105和攜帶pTi3的EHA105(兩種pTis均攜帶對卡那霉素和羧千西林的抗性；參見實施例3)用作供體菌林。將攜帶RP4-4(RP4的卡那霉素敏感性衍生物)的大腸桿菌或攜帶pRK2073(壯觀霉素抗性RP4衍生物，它在土壤桿菌屬或本發(fā)明菌林中無活性的有限宿主范圍復(fù)制子上含有RP4轉(zhuǎn)移功能)的大腸桿菌用作輔助菌抹，將根瘤菌屬的種類NGR234(鏈霉素抗性菌林ANU240)和苜蓿中華根瘤菌菌林1021(鏈霉素抗性)用作受體菌林。通過在三親接合中合并含有Ti質(zhì)粒的供體土壤桿菌屬、根瘤菌受體菌林和輔助RP4/M2(衍生物)菌株的活躍生長的培養(yǎng)物引起接合。將細菌混合物轉(zhuǎn)移至置于非選擇性YM生長培養(yǎng)基上的硝化纖維素濾膜上并且在29匸下孵育幾小時或過夜。然后重新懸浮濾膜上的細胞并且在有利于轉(zhuǎn)接合子，即含有Ti質(zhì)粒的根瘤菌生長的選擇平板(含有鏈霉素(IOOmg/L)、卡那霉素(50mg/L)和羧千西林(50mg/L)的YM)上鋪板。將候選轉(zhuǎn)接合子作為單細胞菌落充分鋪板并且通過擴增檢查其中pTi(例如vir基因)的存在且證實為根瘤菌菌林。對各菌種中的一個菌林的擴增分析結(jié)果如圖10中所示。另外，對轉(zhuǎn)接合子分析存在的RP4-衍生的輔助質(zhì)粒(使用引物RP4FW和REV;SEQIDNOS:80-81)。為進一步應(yīng)用選擇缺乏該質(zhì)粒的菌林。然后用pCAMBIA1105.1R(參見實施例4)，通過電穿孔轉(zhuǎn)化含有Ti質(zhì)粒的根瘤菌菌林。在含有卡那霉素(50mg/L)(用于選擇pTi)和鏈霉素(100mg/L)(用于選擇二元載體)的YM培養(yǎng)基上選擇推定的轉(zhuǎn)化體。3-5天后觀察候選菌落，將其在新平板上鋪板并且通過擴增對存在的二元載體(hygR的引物，SEQIDN0S:44-45;和多克隆位點，SEQIDNOS:46+79)、Ti質(zhì)粒(virG，virB和moaA引物，SEQID冊S:27-28;31-32;68-69)和用于菌抹證實的基因型分型標記(Smel6S，SEQIDNOS:33-34;和NodDl，SEQIDNOS:35-36;或NodQ，SEQIDNOS:37-38，分別就根瘤菌屬和苜蓿中華根瘤菌而言)進行分析。作為在這些菌抹中二元載體維持的進一步證據(jù)，由在28X:下在選擇或不選擇(卡那霉素(50mg/L)+壯觀霉素(IOOmg/L))的情況下生長2天的培養(yǎng)物制備質(zhì)粒DM。通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離一般用一種或多種限制酶消化的質(zhì)粒DNA。在所有提取中均可檢測到二元載體。在另一個實驗中，使Ti質(zhì)粒pTil在三親接合中從含有pTil和RP4-4的土壤桿菌屬菌抹EHA105移動至大豆慢生根瘤菌菌林USDA110,隨后在含有Rin00(就大豆慢生根瘤菌而言)和卡那霉素(50mg/L)和羧節(jié)西林(IOOmg/L)(就pTil而言)的YM上選擇。獲得了含有pTil的大豆慢生根瘤菌的菌落。然后用pCAMBIA1105.1R電穿孔該菌抹。還在雙親接合過夜中使用含有pTil和RP4-4的根瘤菌屬的種類NGR234菌株使pTil移動至百脈中間根瘤菌MAFF303099。首先通過轉(zhuǎn)座子插入單拷貝的慶大霉素抗性基因(通過DNA印跡證實)改造百脈中間根瘤菌菌林；在含有Gm30(就百脈中間根瘤菌而言)和卡那霉素(50mg/L)(就pTil而言)的YM上進行轉(zhuǎn)接合子選擇。獲得含有pTil的幾打百脈中間根瘤菌轉(zhuǎn)接合子。它們中的大部分還獲得了RP4-4;因此在80個轉(zhuǎn)接合子菌落上通過擴增進行篩選，并且鑒定了不含RP4-4的3個菌落。然后用pCAMBIA1105.1R電穿孔這些菌林之一。然后轉(zhuǎn)化植物組織。通過測定GUS活性驗證成功的轉(zhuǎn)化。作為陽性對照，用相關(guān)載體pCAMBIA1105.1或pCAMBIA1405.1轉(zhuǎn)化土壤桿菌屬供體菌林并且用于轉(zhuǎn)化植物組織。在另一個實驗中，基因轉(zhuǎn)移感受態(tài)苜蓿中華根瘤菌菌林已經(jīng)保留了苜蓿結(jié)瘤的能力。使苜蓿種子發(fā)芽，使之接觸苜蓿中華根瘤菌并且在含有生長培養(yǎng)基的大培養(yǎng)皿中生長4周。給在植物根上形成的瘤接種野生型菌林和改造的苜蓿中華根瘤菌菌株，表明存在的Ti質(zhì)粒和二元載體不會減少結(jié)瘤。實施例7根瘤菌屬介導(dǎo)的稻米的轉(zhuǎn)化在本實施例中，用均包含pTi3和pCAMBIA1105.1R的根瘤菌屬的種類NGR234和苜蓿中華根瘤菌1021(對于這些菌林的構(gòu)建參見實施例4和5)轉(zhuǎn)化稻米愈傷組織。對照菌林包括包含pCAMBIA1405.1載體的土壤桿菌屬菌林EHA105。在菌抹EHA105中的vir輔助Ti質(zhì)粒(Hood等，TransgenicRes.2:208-218，1993)來源于succinamopine類超毒力Ti質(zhì)粒pTiBo542。如下制備轉(zhuǎn)化組織。使表面滅菌的稻米種子在26C下的暗處在含有生長素(2,4-D)的2N6培養(yǎng)基上生長4周以形成愈傷組織。然后將盾片衍生的愈傷組織再分成4-8mffl直徑的片并且置于含有2N6培養(yǎng)基的平板上且在26T下的暗處孵育4-10天。將這些盾片衍生的愈傷組織用于轉(zhuǎn)化。將根瘤菌菌林在含有合適的抗生素(卡那霉素(40mg/L)和壯觀霉素(80mg/L)的YM培養(yǎng)基上劃線并且在29匸下孵育3天。此時，細胞在平板上形成菌莒。將土壤桿菌屬菌抹在含有卡那霉素(50mg/L)和壯觀霉素(IOOmg/L)的AB培養(yǎng)基上劃線并且在29'C下生長2天。保持謹慎以使根瘤菌培養(yǎng)物不被土壤桿菌屬污染。從平板中采集細菌并且重新懸浮于含有100乙酰丁香酮(AS)的AAM或minA培養(yǎng)基中。將土壤桿菌屬的細菌混懸液的O.D.6。。調(diào)節(jié)至1.0并且將根瘤菌的細菌混懸液的0.D.6。。調(diào)節(jié)至15(選擇相當(dāng)于中-指數(shù)生長期的數(shù)字)。將混懸液保持在室溫下2-3小時。然后將20mL細菌混懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿或其它合適的無菌容器。將4-7天的去分化的愈傷組織加入到細菌混懸液中，渦旋并且保持30分鐘。然后將愈傷組織干印跡在無菌WhatmanNo.1濾紙上并且轉(zhuǎn)移至2N6-AS平板上。將愈傷組織在26"C下的暗處共培養(yǎng)3-7天?？梢愿淖兓鞈乙汉陀糜诟鼍值墓才囵B(yǎng)培養(yǎng)基以便提供對發(fā)生基因轉(zhuǎn)移的足夠或改善的支持。例如，通過將生物素添加到培養(yǎng)基中改善苜蓿中華根瘤菌的生長。類似地，當(dāng)細菌在含有100iliMAS和5生物素的RM0P培養(yǎng)基(用于煙草，參見實施例9)上生長時，生長得以改善且轉(zhuǎn)化增加。7天后，用含有250mg/L頭孢噻肟的水洗滌與細菌一起共培養(yǎng)的愈傷組織以便除去細菌；將愈傷組織轉(zhuǎn)至含有補充了250mg/L頭孢噢將的25mL水的平板上，渦旋并且孵育20分鐘。在這一段時間中，大部分細菌從愈傷組織中釋放。將愈傷組織干印跡在無菌WhatmanNo.1濾紙上且然后轉(zhuǎn)至含有250rag/L的頭孢噻肟(殺滅保持附著于愈傷組織狀態(tài)的細菌)和50mg/L潮霉素(選擇轉(zhuǎn)基因愈傷組織)的2N6-CH平板。將愈傷組織在26。C下的暗處孵育約4周，在此期間，每隔2周將它們在新鮮選擇培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)一次。小的轉(zhuǎn)基因潮霉素抗性愈傷組織在潮霉素上選擇4周后開始增殖。將增殖的愈傷組織轉(zhuǎn)移到2N6-TCH上并且使它們進一步生長約2周，此時，將它們轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基(RGH6)上并且使它們進一步在暗處生長1周。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)至光亮處并且使它們生長4-6周。在5-10天后，愈傷組織開始變成綠色，并且在2-3周后，枝條開始分化。將這些枝條轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(二分之一強度的MSH)上，并且在根形成時，將植物轉(zhuǎn)移至溫室。通過用X-GlcA(5-溴-4-氯-3-吲哚基p-D葡糖苷酸)染色少數(shù)洗滌的愈傷組織來測試瞬時GUS表達。圖11顯示了在與土壤桿菌屬、中華根瘤菌屬或根瘤菌屬的種類的菌抹一起共培養(yǎng)5天后測定的愈傷組織的GUS活性。在與根瘤菌一起共培養(yǎng)后在愈傷組織上觀察到了藍色染色區(qū)，不過，與在與土壤桿菌屬一起共培養(yǎng)后觀察到的相比，染色頻率較低。圖17顯示了在與含有pTi3和pCAMBIA1105.1R的苜蓿中華根瘤菌一起共培養(yǎng)后獲得的GUS染色的稻米小植物。在根中，在枝條的基底部和在葉尖端中觀察到了GUS活性。擴增分析揭示出存在pCAMBIA1105.1R-特異性MCS，從而證實了在該植物中整合的T-DNA來源于苜蓿中華根瘤菌菌林。檢驗潤濕劑對轉(zhuǎn)化的影響。潤濕劑包括各種洗滌劑(例如，Triton)和其它試劑，諸如SilwetL77。還檢驗了SilwetL77對苜蓿中華根瘤菌介導(dǎo)的稻米轉(zhuǎn)化的作用。將稻米愈傷組織與苜蓿中華根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R在含有0.005%-0.1%(w/v)的SilwetL77的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。在22。C下共培養(yǎng)7天后，使用X-GlcA測定愈傷組織的GUS活性。下表顯示了添加0.01%或0.02%濃度的SilwetL77提高了稻米愈傷組織的轉(zhuǎn)化率。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>實施例8用于根瘤菌介導(dǎo)的稻米轉(zhuǎn)化的選擇性條件在本實施例中，測試了用于轉(zhuǎn)化的各種選擇性條件。這些條件中的一些包括愈傷組織發(fā)育的天數(shù)、溫度、共培養(yǎng)基、排除或填充劑的使用，諸如硫酸葡聚糖、果聚糖、微晶纖維素、PEG和PVP，并且檢驗了涉及轉(zhuǎn)化率的稻米組織的齡期。在25。C下將稻米種子在添加了乙酰丁香酮(100KiM)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(2N6，pH5.8)上培養(yǎng)7天。在愈傷組織誘導(dǎo)7天后，將約60pL苜蓿中華根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R置于發(fā)育的愈傷組織之上；然后在25C下將愈傷組織和細菌一起共培養(yǎng)7天且隨后使用X-GlcA測定其GUS活性。就這一特定實驗而言，在YM培養(yǎng)基(具有合適的抗生素選擇)上將苜蓿中華根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R培養(yǎng)2天，且然后將其重新懸浮于AAMAS培養(yǎng)基中至0.D.(600nm)約為1.0，并且進一步在室溫22-26C下培養(yǎng)2-3小時。在91個測定的愈傷組織中，一個具有GUS活性。這一結(jié)果提示僅具有7天去分化的愈傷組織可以被苜蓿中華根瘤菌轉(zhuǎn)化，并且愈傷組織與細菌培養(yǎng)物的標準40分鐘孵育可能不一定必要。聯(lián)合測試轉(zhuǎn)化前愈傷組織發(fā)育的天數(shù)、愈傷組織發(fā)育的孵育溫度和用于轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)基的類型。在本實驗中，在22或251C下將稻米種子在愈傷組織發(fā)育培養(yǎng)基(2N6，pH5.8)上培養(yǎng)5、6或7天；使用兩種不同的共培養(yǎng)基-2N6AS(標準共培養(yǎng)基，pH5.2)或2N6+AS(含有100HM乙酰丁香酮的標準愈傷組織發(fā)育培養(yǎng)基，pH5.8);用于愈傷組織與苜蓿中華根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R共培養(yǎng)的共培養(yǎng)條件為在22或25。C下共培養(yǎng)8天。共培養(yǎng)后，測定愈傷組織的GUS活性。來自典型實驗的結(jié)果如下表中所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>這些結(jié)果表明隨同在2N6培養(yǎng)基上僅6天去分化，稻米愈傷組織對中華根瘤菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化而言是感受態(tài)的。此外，中華根瘤菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在22或25X:下去分化6或7天后發(fā)生。還可以使用5.2或5.8的pH的培養(yǎng)基實現(xiàn)轉(zhuǎn)化，表明pH范圍是可接受的。檢驗不同組織，例如種子、發(fā)芽幼苗、愈傷組織的被轉(zhuǎn)化的能力。就下表中的數(shù)據(jù)而言，使用稻米種子、為愈傷組織發(fā)育培養(yǎng)7天的種子和來自培養(yǎng)的種子的新近收獲的愈傷組織。如表中所示用苜蓿中華根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R處理這些組織且然后在8天共培養(yǎng)后測定其GUS活性。如本文其它部分中所述通過培養(yǎng)并且重新懸浮于AAMAS中至0.D.6。Q約為1.0來制備苜蓿中華根瘤菌(pTi3)pCAMBIAl105.1R。將稻米組織在苜蓿中華根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R混懸液中孵育40分鐘，或就稻米種子而言，與置于稻米種子之上的約60nL細菌培養(yǎng)物一起孵育。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>如上表中所示，這些結(jié)果提示嫩盾片衍生的愈傷組織(來自1周齡幼苗)與使用更老齡的愈傷組織(4周齡)相比會提高苜蓿中華根瘤菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率。在下列實驗中，檢驗了聚乙二醇(PEG)(MW3350和8000)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(MW360，000)對轉(zhuǎn)化率的作用。使用中華根瘤菌屬在有PEG(MW3350)存在下轉(zhuǎn)化稻米愈傷組織。在YM培養(yǎng)基(具有合適的抗生素選擇)上將苜蓿中華根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R培養(yǎng)3-4天，然后重新懸浮于AAMAS培養(yǎng)基中且在室溫22-26'C下培養(yǎng)2-3小時。恰在孵育愈傷組織前，將重新懸浮的苜蓿中華根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R與含有PEG的AAMAS培養(yǎng)基混合至最終0.D.6。。約為l.O且PEG濃度在0-20。/。(w/v)范圍內(nèi)。將稻米愈傷組織孵育40-50分鐘，導(dǎo)液并且在無菌濾紙上干燥20-30分鐘且然后在22"C下在2N6AS培養(yǎng)基(pH5.2)上共培養(yǎng)7天。在共培養(yǎng)后，使用X-GlcA測定愈傷組織的GUS活性(O.5mg/mlX-GlcA，5分鐘真空滲入并且在37'C下過夜孵育)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>上表中的這些結(jié)果表明添加0.5-20%PEG(mw3350)可以將苜蓿中華根瘤菌介導(dǎo)的稻米愈傷組織轉(zhuǎn)化提高2-4倍。檢驗了PEG(MW8000)和PVP(聚乙烯吡咯烷酮MW360，000)對中華根瘤菌屬介導(dǎo)的稻米愈傷組織轉(zhuǎn)化的進一步作用。轉(zhuǎn)化方案如上所述，但不同的是將PEG(MW8000)或PVP(MW360，000)而不是PEG(MW3350)加入到孵育培養(yǎng)基中。將稻米愈傷組織與苜蓿中華根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R在有0-20%(w/v)PEG或0-100/。PVP(w/v)存在下一起孵育且然后在22"C下在2N6AS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)7天。共培養(yǎng)<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>上表中的這些結(jié)果表明向孵育培養(yǎng)基中添加PEG(MW8000)或PVP(MW360，OOO)提高了苜蓿中華根瘤菌介導(dǎo)的稻米愈傷組織轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率。實施例9根瘤菌介導(dǎo)的煙草的轉(zhuǎn)化在本實施例中，用含有Ti質(zhì)粒和二元載體的根瘤菌轉(zhuǎn)化煙草葉片。用于本實驗的外植體組織為在來自4-5周齡組織培養(yǎng)生長的生根植物的上面展開的煙草葉上穿孔的1cm2葉片。用于本實施例中的細菌為根瘤菌屬的種類NGR234(ANU240)和苜蓿中華根瘤菌1021，它們均含有pTi3和pCAMBIA1105.1R(參見實施例3-5)。作為基因轉(zhuǎn)移的陽性對照，使用含有pTil和pCAMBIA1405.1的土壤桿菌屬EHA105菌林。在含有卡那霉素(40mg/L)和壯觀霉素(80mg/L)的YM平板上充分鋪展細菌(根瘤菌)，或者在含有卡那霉素(50mg/L)和壯觀霉素(100mg/L)的AB平板上充分鋪展細菌(土壤桿菌屬)。將平板在28C下孵育2-3天。從平板上刮下細菌并且重新懸浮于20mLminA液體中直到OD60。為1.0-1.5。從上面的煙草葉上切下葉片，轉(zhuǎn)移至含有細菌混懸液的培養(yǎng)皿中，并且孵育5分鐘。任選地，將葉片在Whatman1號濾紙上吸干。將葉片置于膠凝的共培養(yǎng)基上，例如RM0P?；蛘?，將葉片倒置放置在膠凝培養(yǎng)基上。將平板在19-28iC下的暗處孵育2天(土壤桿菌屬)或5-7天(根瘤菌)。將葉片轉(zhuǎn)移至選擇平板(RMOP-TCH)上并且在28。C下和每天以16小時日光的光亮中孵育2-3周。每2周將葉片傳代培養(yǎng)一次。當(dāng)枝條出現(xiàn)時，將小植物轉(zhuǎn)移至MST-TCH平板上以便小植物再生。當(dāng)根出現(xiàn)時，將小植物轉(zhuǎn)移至溫室中的土壤。在共培養(yǎng)后即刻通過在X-GlcA中染色葉片過夜監(jiān)測基因轉(zhuǎn)移效率(Jefferson,PlantMolBiol.Rep5:387-405，1987)。表5顯示了使用根瘤菌菌林和作為對照的土壤桿菌屬菌抹的典型煙草轉(zhuǎn)化實驗的結(jié)果。圖12顯示了使用這些細菌轉(zhuǎn)化的幾個煙草葉的影像。表7菌種Ti質(zhì)粒二元載體測定的葉片數(shù)量藍色斑點總數(shù)每個葉片上藍色斑點的平均數(shù)根瘤菌屬的種類pTi3pCAMBIA1105.1R1020.2苜蓿中華根瘤菌pTi3pCAMBIA1105.1R10596根癌土壤桿菌pTilpCAMBIA1405.1103000~300表6顯示了使用含有pTi3和pCAMBIA1105.1R的苜蓿中華根瘤菌的幾個轉(zhuǎn)化實驗的結(jié)果。嫩煙草葉的使用顯著增加了基因轉(zhuǎn)移(每個葉片的藍色斑點比稍老齡葉的藍色斑點多15倍)；就土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化而言，對兩種葉類型而言，基因轉(zhuǎn)移看起來差不多相似。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>為了確定用于煙草葉處理的根瘤菌培養(yǎng)物不含任何污染的土壤桿菌屬細胞，在與非土壤桿菌的生長相比有利于土壤桿菌屬菌落生長的培養(yǎng)基上將用于葉處理的細菌混懸液充分鋪板。將煙草葉片在不同比例(參見下表)的苜蓿中華根瘤菌和根瘤土壤桿菌EHA105(pCAMBIAl305.2)的混合物中孵育，共培養(yǎng)3天且然后測定葉片的GUS活性。通過在合適的培養(yǎng)基上將連續(xù)稀釋液鋪板并且對菌落計數(shù)以便確定每ml培養(yǎng)物的cfu而分別確定這兩種細菌培養(yǎng)物的濃度。因為苜蓿中華根瘤菌不含二元栽體，所以葉片的任何轉(zhuǎn)化均必須為用EHA105轉(zhuǎn)化的結(jié)果。這些結(jié)果表明在3天共培養(yǎng)后，在109cfu/ml中華根瘤菌屬中小至IOcfu的土壤桿菌屬可以以極低頻率導(dǎo)致煙草的轉(zhuǎn)化。在20pL苜蓿中華根瘤菌混懸液中甚至存在1000個包含pCAMBIA1305.1的土壤桿菌屬細胞也僅在添加后(add-back)實驗中產(chǎn)生幾個藍色斑點，其中所述的苜蓿中華根瘤菌混懸液含有pTi3，但不含二元載體(SmepTi3)，其結(jié)果如下表中所示。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>作為土壤桿菌屬不存在于煙草轉(zhuǎn)化實驗中的進一步證據(jù)，在除去外植體后通過向平板中添加2mLLB培養(yǎng)基并且在28匸下振搖1小時從平板上洗掉在共培養(yǎng)平板上生長的細菌團。然后在有利于土壤桿菌屬生長的平板上將100該混懸液鋪板。在2天期限內(nèi)未觀察到在這些平板上生長的菌落。此外，使100jil在共培養(yǎng)前后的細菌混懸液旋轉(zhuǎn)沉降，重新懸浮于無菌水中并且用于使用土壤桿菌屬特異性attScirc引物(SEQID歸:23-24)和作為陽性對照的Smel6S引物(SEQIDNOS:33-34)的擴增分析。結(jié)果還提示土壤桿菌屬DNA不存在于樣品中。在含有潮霉素的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)與苜蓿中華根瘤菌pTi3pCAMBIA1105.1R和與土壤桿菌屬pTilpCAMBIA1405.1共培養(yǎng)的葉片。使枝條發(fā)育并且使小植物再生。圖16顯示了與基因轉(zhuǎn)移稱職的苜蓿中華根瘤菌菌林共培養(yǎng)后再生的煙草植物照片。測定來自許多獨立植物的葉尖端的GUS活性。結(jié)果如圖14中所示，其揭示出在測定的三個葉尖端中各自具有強GUS活性，而未轉(zhuǎn)化的煙草葉尖端無GUS活性。表8顯示了使用苜蓿中華根瘤菌pTi3pCAMBIA1105.1R和根癌土壤桿菌pTilpCAMBIA1405.1進行兩次獨立轉(zhuǎn)化實驗后再生的生根植物的數(shù)量。由在含有選擇(50mg/L潮霉素)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的枝條形成根是該枝條被遺傳轉(zhuǎn)化的良好指征。數(shù)據(jù)為根形成的低估值，因為在早期時間點釆集數(shù)據(jù)并且這些枝條的中的某些仍然可以形成根。如下表中所示，就每個葉片中回收的推定轉(zhuǎn)化的枝條的數(shù)量而言，苜蓿中華根瘤菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化低于土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化5-9倍。表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>植物從葉片再生并且通過擴增T-DNA標記進行分析?；蚪MDNA分離自葉片并且用于擴增潮霉素基因(SEQIDNOS:82-83)和MCS序列(SEQIDNO:46和79)。結(jié)果如圖15中所示并且概括在表9中。所有4種與苜蓿中華根瘤菌共培養(yǎng)的植物和所有3種與根癌土壤桿菌共培養(yǎng)的植物表現(xiàn)出存在潮霉素帶且由此證實被轉(zhuǎn)化。此外，所有4種苜蓿中華根瘤菌轉(zhuǎn)化的植物展示出572bp擴增產(chǎn)物，與在pCAMBIA1105.1R中相應(yīng)的序列一致；相反，土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化的植物展示出相當(dāng)于pCAMBIA1405.1中MCS序列的491bp產(chǎn)物。該結(jié)果證實在苜蓿中華根瘤菌轉(zhuǎn)化的植物中存在來源于根瘤菌特異性標記的pCAMBA1105.1R載體，而非來源于pCAMBIA1405.1的T-DM區(qū)，它具有較小的MCS并且僅電穿孔入土壤桿菌屬菌林。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>類似地，在與含有pTi3和pCAMBIA1105.1R的根瘤菌屬的種類NGR234共培養(yǎng)后獲得5種煙草植物。所有這些植物均在其葉中表達GUS并且展示出MCS和HygB基因的預(yù)計的擴增帶，從而證實它們是因根瘤菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化所致。圖18顯示了來自煙草、鼠耳芥屬和稻米植物轉(zhuǎn)化體的限制基因組DNA的雜交模式。就該實驗而言，用EcoRI限制酶消化約等于3x106基因組拷貝的適量的基因組DNA(稻米，3ng;煙草，27和鼠耳芥屬，0.75pg)，在1%瓊脂糖凝膠上分離并且使用NaOH轉(zhuǎn)移至HybondN+膜(Sambrook等，1989Molecularcloning:alaboratorymanual.ColdSpringHarbor,NY.ColdSpringHarborPress)。寸吏用備用標記珠(Pharmacia,UppsalaSweden)，用ot-32P-dCTP標記DNA探針并且通過NICK柱(Pharmacia)純化。在下通過在SDS-PreHyb緩沖液(7。/o(w/v)SDS，l%(w/v)BSA，0.5MNaHPO，pH7.2，1mMEDTA)中旋轉(zhuǎn)預(yù)雜交膜。在約4小時后，將標記的探針加入到所述緩沖液中并且持續(xù)孵育16小時。在651C下使用2XSSC+0.1%SDS將膜洗滌兩次，每次10分鐘，然后使用0.2XSSC+0.1%SDS洗滌兩次，每次10分鐘。用塑料薄膜包裹膜，此后在-80C下在感光快性照相膠片上曝光。使用標準顯影操作步驟使膝光的膠片顯影。正如圖18中所示，雜交模式對每種轉(zhuǎn)化體而言是不同的，證實每種植物是獨立轉(zhuǎn)化的結(jié)果。T-DNA拷貝數(shù)獲自7種鼠耳芥屬植物，57種煙草植物和一種稻米植物，它們均使用苜贛中華根瘤菌或根瘤菌屬種類轉(zhuǎn)化。將煙草葉片與如實施例6中構(gòu)建的百脈中間根瘤菌共培養(yǎng)。在5天共培養(yǎng)后，4個區(qū)域?qū)υ诳傆婭O個葉片上的GUS表達而言染色呈陽性；分別在7或9天共培養(yǎng)后，在IO個葉片各自上分別觀察到了55和25個表達GUS的轉(zhuǎn)化灶。實施例10RP4存在對基因轉(zhuǎn)移的作用在T-DNA切除和轉(zhuǎn)移后基因轉(zhuǎn)移至植物與細菌接合具有許多相似性(例如Pansegrau等，Proc.Natl.Acad.SciUSA90:11538-11542，1993;Hamilton等，J.Bacteriol.154:693-701，2000;Bravo-Angel等，J.Bacteriol.181:5758-5765，1999)。而且，可以將某些移動性質(zhì)粒，諸如RSF1010和CloDF13通過Ti質(zhì)粒的virB系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至植物細胞(Fullner,J.Bacteriol.180:430-434，1998;Escudero等，Mol.Microbiol.47:891-901，2003)，并且已經(jīng)通過土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，使用含有pClo栽體，而不含T-DNA邊緣序列的GUS獲得了轉(zhuǎn)化的植物(Escudero等，Mol.Microbiol.47:891-901，2003)。此外，在野生型土壤桿菌屬菌林中存在RSF1010通過一種過程抑制其毒力，在該過程中，該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化形式與virD2-T鏈復(fù)合物和/或virE2竟?fàn)幑餐妮敵鑫稽c(Stahl等，J.Bacteriol.180:3933-3939，1998)。在此我們證實在基因轉(zhuǎn)移感受態(tài)細菌中存在RP4-4，即廣宿主范圍IncP質(zhì)粒RP4的卡那霉素敏感性衍生物干擾其基因轉(zhuǎn)移至植物的能力。將煙草葉片和稻米愈傷組織與含有Ti質(zhì)粒和二元載體并且具有或沒有RP4-4質(zhì)粒的細菌菌林共培養(yǎng)。通過將來自含有RP4-4的大腸桿菌的質(zhì)粒進行接合轉(zhuǎn)移并且在羧節(jié)西林(IOOmg/L)上選擇轉(zhuǎn)接合子制備含有RP4-4的菌林?；蛘?，可以在細菌群體中選擇含有RP4-4的菌林，其中使用大腸桿菌RP4-4菌抹作為輔助菌抹，在使來自EHA105的修飾Ti質(zhì)粒與任何根瘤菌菌林接合后獲得所述的細菌群體。通過在有用于一部分RP4質(zhì)粒的引物(SEQIDNOS:80-81)存在下，使用防止非特異性結(jié)合的62'C的退火溫度進行擴增來證實在菌林中存在或不存在RP4-4。在本實施例中，評價含有pCAMBIA1405.1具有和沒有RP4-4的土壤桿菌屬菌林EHA105的基因轉(zhuǎn)移能力。將結(jié)果概括在表10中。在沒有RP4-4存在下，在測定的10個煙草葉片上檢測到了約3000個表達GUS的GUS轉(zhuǎn)化灶。相反，對IO個葉片而言，含有RP4-4質(zhì)粒的菌林僅產(chǎn)生73個GUS轉(zhuǎn)化灶，這一結(jié)果僅為缺乏RP4-4的菌林的基因轉(zhuǎn)移效率的2.4%。在稻米愈傷組織轉(zhuǎn)化中，結(jié)果甚至更為顯著在與含有RP4-4的土壤桿菌屬菌林共培養(yǎng)后在93個愈傷組織中未觀察到GUS活性，而在受到使用缺乏RP4-4的菌林轉(zhuǎn)化的30個愈傷組織中有27個表現(xiàn)出GUS活性。這一結(jié)果表明RP4-4質(zhì)粒的存在阻礙了基因轉(zhuǎn)移，可能的原因在于接合過程中的某一部分干擾了T-DNA或vir蛋白轉(zhuǎn)移至植物細胞。在使用包含Ti質(zhì)粒和二元載體的苜蓿中華根瘤菌和根瘤菌屬的種類NGR234菌抹的類似實驗中，上述結(jié)果得到證實(參見表10)。與含有RP4-4的苜蓿中華根瘤菌菌抹共培養(yǎng)的煙草葉片在10個測試的葉片中未產(chǎn)生表達GUS的斑點，而對老葉和嫩葉材料而言，不含RP4-4的類似菌抹各自在IO個葉片上分別產(chǎn)生了22和306個GUS轉(zhuǎn)化灶。就不含RP4-4的根瘤菌屬種類的菌抹而言，觀察到2個GUS轉(zhuǎn)化灶，而對含有RP4-4的相同種的菌林而言未獲得轉(zhuǎn)化灶。再則，結(jié)果提示了IncP質(zhì)粒對這些菌抹的轉(zhuǎn)化能力的顯著性負面作用。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>表14<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>的鼠耳芥屬植物的未成熟的花莖浸入細菌混懸液，使其開花并且開始形成種子，且收獲種子并且使其在對轉(zhuǎn)化體生長選擇性的培養(yǎng)基上發(fā)芽。用于本實施例的細菌為根瘤菌屬的種類NGR234(ANU240)和苜蓿中華根瘤菌1021，它們均含有pTi3和pCAMBIA1105.1R(參見實施例3-5)。作為基因轉(zhuǎn)移的陽性對照，使用含有pTi3和pCAMBIA1405.1的土壤桿菌屬EHA105。在含有卡那霉素(40mg/L)和壯觀霉素(80mg/L)的YM平板(根瘤菌屬)或含有卡那霉素(50mg/L)和壯觀霉素(100mg/L)的minA平板(土壤桿菌屬)上將細菌充分鋪板。將平板在28C下孵育2-3天。將來自平板的細菌重新懸浮于滲入培養(yǎng)基(lxMS鹽，5%蔗糖，50mMMES-KOHpH5.7，0.1%SilwetL-77)中至0.D.6。。nm為1.0。將鼠耳芥屬種子種植到土壤中并且在20C下生長室內(nèi)孵育幾周(例如4周)，直到它們開始開花。將花序浸入細菌混懸液；或者將細菌混懸液噴在植物上。將植物保持在箱內(nèi)1天且此后在2(TC無遮蓋下生長直至產(chǎn)生種子(約3-4周)。收獲種子，然后在旋轉(zhuǎn)器上用70%(v/v)乙醇，隨后用20%(v/v)TritonX-100進行表面滅菌20分鐘。將種子在無菌蒸餾水中充分洗滌，然后使其在含有l(wèi)xMS鹽、3%蔗糖、0.05%MES-KOHpH5.7、0.8%Phytagel和30mg/L潮霉素的平板上發(fā)芽。將推定的轉(zhuǎn)化體置于土壤中并且轉(zhuǎn)入溫室。在此階段，測定葉的GUS活性以便測定T-DNA的存在。圖13顯示了使用根瘤菌屬種類的菌林的轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果。在本實驗中，300粒種子中有1粒為潮霉素抗性的。結(jié)果表明根瘤菌屬的種類NGR234可以通過花浸入轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化鼠耳芥屬種系。在類似的實驗中，含有pTi3和pCAMBIA1105.1R的苜蓿中華根瘤菌菌林產(chǎn)生3林潮霉素抗性鼠耳芥屬幼苗，它們表達GUS并且具有如通過擴增揭示并通過DNA印跡分析證實的整合的pCAMBIA1105.1R特異性MCS和HygK標記。如上所述進一步進行鼠耳芥屬的花浸入轉(zhuǎn)化，但不同的是使用改良的滲入培養(yǎng)基。通過改變pH、蔗糖濃度和Silwet濃度來改變滲入培養(yǎng)基。通過陽性GUS染色并且如本文所述使用mcs-特異性引物擴增來證實所得轉(zhuǎn)化體。使用的不同類型的培養(yǎng)基包括(i)低蔗糖培養(yǎng)基(1XMS鹽，1%蔗糖，50mMMES-K0HpH5.7，0.1%SilwetL-77);(ii)低Silwet培養(yǎng)基(1XMS鹽，5%蔗糖，50mMMES-K0HpH5.7,0.02%SilwetL-77);(iii)pH7培養(yǎng)基(IXMSsalts,5%蔗糖，50mMMES-KOHpH7，0.1%SilwetL-77);和組合培養(yǎng)基(1XMS鹽，1%蔗糖，50raMMES-KOHpH7，0.02%SilwetL-77)。下表中列出的結(jié)果提示通過使用組合培養(yǎng)基獲得由苜蓿中華根瘤菌改善的轉(zhuǎn)化頻率，在組合培養(yǎng)基中使Si1wet和蔗糖濃度降低且使pH增加。此外，當(dāng)使用pH7培養(yǎng)基時，也提高了由根瘤菌屬的種類改善的轉(zhuǎn)化頻率。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>實施例12根瘤菌介導(dǎo)的完整植物的轉(zhuǎn)化已經(jīng)大量研發(fā)了植物轉(zhuǎn)化方案用于土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。使用本發(fā)明的以不同方式與植物和植物組織發(fā)生相互作用的細菌，改進了用于轉(zhuǎn)化的方案和組織，以便適應(yīng)細菌-植物相互作用的具體特征。在本實施例中，將含有pTi和二元載體的根瘤菌種類用于菜豆(尸力aseo/^w〃7S)的完整植物轉(zhuǎn)化。用于本實施例的細菌為4艮瘤菌屬的種類NGR234(ANU240)和苜蓿中華根瘤菌1021菌林，它們均含有pTi3和pCAMBIA1105.1R。將在含有卡那霉素(40mg/L)和壯觀霉素(80mg/L)的液體TY培養(yǎng)中生長至600nm處的OD為1.5的細胞沉淀，重新懸浮于含有100jiM乙酰丁香酮的AAM培養(yǎng)基中并且用于植物共培養(yǎng)。給菜豆表面滅菌并且使其在培養(yǎng)皿中的濕濾紙上發(fā)芽。將幼苗在細菌混懸液中孵育30分鐘，吸干并且轉(zhuǎn)移至濕濾紙上。5天共培養(yǎng)后，通過用X-GlcA處理測定幼苗的GUS活性。在幼苗上的GUS轉(zhuǎn)化灶表明存在已經(jīng)獲得并且表達含GusPlus的T-DNA的細胞。實施例13轉(zhuǎn)化載體插入位點的分析可以使用多種眾所周知的方法中的任一種測定位于T-DNA插入位點側(cè)翼的植物DNA序列。就本實施例而言，使用稱作限制性消化/連接物連接的技術(shù)建立側(cè)翼序列(Cottage等，2001.PlantMol.BiolRep.19，321-327)。簡言之，使用限制酶，諸如Dral或不在T-DM內(nèi)切割的另一種酶將植物DNA消化完全。在限制的熱失活后，通過用氯仿提取將其取出。通過乙醇沉淀收集DNA。在退火條件下將寡核苷酸ADAPL和ADSPS和ADSPS—起孵育，與消化的基因組DNA混合并且與基因組DM連接。使用寡核苷酸API以及對位于鄰近左側(cè)(HYGR1,HYGR2)或右側(cè)(GPFW1，GPFW2，GPFW3，NOSpolyAfw)T-DNA邊緣的T-DM序列具有特異性的引物進行連接物連接的基因組DM擴增，所述的寡核苷酸API在其5，端上具有EcoRI識別序列且然后是與ADAPL相同的序列。下列參數(shù)用于擴增最初為94X:下的2分鐘變性，隨后是94'C下30秒、60*€下30s、68'C下4分鐘的30個循環(huán)和68'C下10分鐘的1個循環(huán)。將擴增反應(yīng)體系稀釋100倍，此后使用嵌套銜接引物MP1和對接近左或右側(cè)T-DNA邊緣的T-DNA序列具有特異性的嵌套引物進行第二輪擴增。使擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上運行。從凝膠上純化條帶并且對其進行DNA序列反應(yīng)和分析。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>16bp位于鼠耳芥屬植物#4中單一T-DNA插入物側(cè)翼的序列表現(xiàn)出與擬南芥(A.thaliana)染色體I上的蛋白磷酸酶2C基因完全匹配。此外，用于鼠耳芥屬植物#5的T-DNA插入位點的序列在左和右側(cè)邊緣表現(xiàn)出與鼠耳芥屬染色體I(BAC克隆T23G18和T6D22)中位點的匹配，但在插入位點上存在20bp缺失。用于鼠耳芥屬植物#6的T-DNA插入位點位于染色體III(鼠耳芥屬BACF16B3)上。對稻米植物中單一T-DNA整合位點的分析表明T-DNA被整合入稻米染色體11(BAC克隆OSJNBa0081F16;圖X)。煙草的結(jié)果表明T-DNA已經(jīng)整合入獨立的基因座(圖X)。此外，單拷貝的插入頻率極高。實施例14苜蓿中華根瘤菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物子代中GUS活性或潮霉素抗性的分離通過以上實施例中教導(dǎo)的方案，使用中華根瘤菌屬轉(zhuǎn)化稻米、煙草和鼠耳芥屬。在幼苗階段中檢驗下一代的GUS活性。給稻米種子表面滅菌并且使其在含有潮霉素的培養(yǎng)基上進行體外發(fā)芽。使煙草和鼠耳芥屬種子在土壤中發(fā)芽。DNA印跡分析表明所有轉(zhuǎn)基因親代植物均具有單拷貝的T-DNA插入片段且因此GUS活性和潮霉素應(yīng)按3:1分離。表18<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>*使稻米幼苗在含有潮霉素的培養(yǎng)基上發(fā)芽，并且在該培養(yǎng)基上，13粒種子發(fā)芽，而8粒種子未發(fā)芽。所有13粒發(fā)芽的種子均具有GUS活性，而對未發(fā)芽的種子沒有測定出GUS活性。基于卡方檢驗，在觀察到的與預(yù)計的幼苗數(shù)量之間無顯著性差異，表明GUS活性(或潮霉素抗性)，但不包括煙草植物Sm02-2。因此，這些結(jié)果證實功能性gus和hygR基因以預(yù)計的3:1比例的遺傳性。從上文中可以理解，盡管本文為解釋目的描述了本發(fā)明的具體實施方案，但是可以在不脫離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的情況下進行各種變型。因此，本發(fā)明并不限于它們，而由所附的權(quán)利要求限定。序列表SEQID名稱序列5，-3，NO.116SrDM根瘤菌屬的種類NGR234參見圖32atpD根瘤菌屬的種類NGR234參見圖33recA根瘤菌屬的種類NGR234參見圖3416SrDNA苜蓿中華根瘤菌1021參見圖35atpD苜蓿中華根瘤菌1021參見圖36recA苜蓿中華根瘤菌1021參見圖3716SrDNA百脈中間根瘤菌參見圖3MAFF3030998atpD百脈中間根瘤菌MAFF303099參見圖39recA百脈中間根瘤菌MAFF303099參見圖31016SrDM紫金牛葉桿菌參見圖311atpD紫金牛葉桿菌參見圖31216SrDNA大豆慢生根瘤菌USDAllO參見圖313atpD大豆慢生根瘤菌USDAllO參見圖314recA大豆慢生根瘤菌USDAllO參見圖31516SrDNA根癌土壤桿菌EHA105參見圖316atpD根癌土壤桿菌EHA105參見圖317recA根癌土壤桿菌EHA105參見圖318Rlel6SfwCACGTAGGCGGATCGATC19Rlel6SrevTTAGCTCACACTCGCGTGCT20Atul6SfwGGCTTAACACATGCAAGTCGAAC21Atul6SrevCGGGGCTTCTTCTCCGACT22Atul6Sfw2GAATAGCTCTGGGAAACTGGAAT23AUScircfwCAGGCTCAAACCGCATTTCC24AttScircrevGTAAGTCCAGCCTCTTTCTCA25AUSpATfwGTGCTTCGGATCGACGAAAC26AttSpATrevGGAGAATGGGAGTGACCTGA27AtuvirGfwCGCTAAGCCGTTTAGTACGA28AtuvirGrevCCCCTCACCAAATATTGAGTGTAG29NptlfwCAGGTGCGACAATCTATCGA30NptlrevAGCCGTTTCTGTAATGAAGG31VirBfwTGACCTTGGCCAGGGAATTG32VirBrevTCCTGTCATTGGCGTCAGTT33S邁el6SfwTGTGCTAATACCGTATGAGC34Smel6SrevCAGCCGAACTGAAGGATACG35NodDlNGR234fwGCCAGAAATGTTCATGTCGCACA36NodDl歸234revAATGGGTTGCGGAAGTTCGGT37SmeNodQfwGACAGGATCCTCCACGCTCA38SmeNodQrevCGCCAGGTCGTTCGGTTGG39SmeNodQ2revGCTCATAGGGCGAGGATACA40VirBllFW2ACGGCGCGAATCCAATCCAA41M13REVCAGGAAACAGCTATGAC42M13FWGTAAAACGACGGCCAG43MoaArev2TAAGCGTCCCATCGAGATCG44HygRfwGCATCTCCCGCCGTGCACAG45HygRrevGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG461405.lfwCTGGCACGACAGGTTTC4/h廠n//■oCAGGCTTAACACATGCAAGTC4816Srev801ACCAGGGTATCTAATCCTGT4916Sfw714GAACACCAGTGGCGAAGGC5016Srevl492CGGCTACCTTGTTACGACTT51atpDfw294ATCGGCGAGCCGGTCGACGA52AtpDrev771GCCGACACTTCCGAACCNGCCTG53recAfw63ATCGAGCGGTCGTTCGGCAAGGG54RecArev504TTGCGCAGCGCCTGGCTCAT55Mlol6SfwCCCATCTCTACGGAACAACT56Mlol6SrevACTCACCTCTTCCGGACTCG57MlopMURepCfwGACGGCCGAGCCAAGGACGA58MlopMLRepCrevCACATGGCAAGCCTCCTCA59MlopMlbrepCfwGATGCTGGAAAGCTTCACAAGT60Pmyl6SfwCTGGTAGTCTTGAGTTCGAG61Pmyl6SrevCCAGCCTAACTGAAGGAAAC62PmyGyrBfwCTGGCTGCGTCTCAAGATTC63PmyGyrBrevCCTTTGCCTTCTTCGCCTGC64Bjal6SfwGGGCGTAGCAATACGTCA65Bjal6SrevCTTCGCCACTGGTGTTCTTG66VirBllfwATAAGCTTCTCTACGGCGATCGATGTCA67VirC2revATCTGCAGTGCTCGAGGTCGCTCGAAGT68MoaAfwATGGATCCGGTCTTGAAAGCTTGGCTCA69MoaArevATGGATCCTGCCGTGGTCTCGTGTTCTGG70AccAfwATGGATCCGAGCAGGGAGAGGACAACCA71AccArevATGGATCCTCGGGTCCTGAAAGATCATC720riTfwGGATCCTCTAGACTGGAAGGCAGTACACCTTGATAG73OriTrevGGATCCTCTAGATTCCTGCATTTGCCTGTT74AccAfw275MoaArev276SpecfwNsiI77SpecrevSacII78SpecfwSacII79P35S5'rev80RP4fw81RP4rev82Hyg700fw83Hyg700rev84ADAPL85ADSPS86API87MPI88HYBR189HYGR290GPFW191GPFW292GPFW393NOSpolyAfw94煙草3-59596煙草1597煙草16-298稻米00199鼠耳芥屬5100鼠耳芥屬666說明書第60/61頁TCCAGAGCTGCGGAAGAAGCTCGTTAAGCGTCCCATCGAGATCGATGCATGATATATCTCCCAATTTGTGCCGCGGATGACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCAATTCCGCGGCATGATATATCTCCCAATTTTACGGCGAGTTCTGTTAGGTAGCTGGCTGACGAACCTGCGGGCGTCCTTGGAACGATGCTACTCACCGCGACGTCTGTCGCGCGTCTGCTGCTCCATCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTP-ACCTGCCC-H2N*GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGCTATAGGGCTCGAGCGGCGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCCTTCGATGGCGGTGATCTCGCGATGAGTTTGAGAACTTCGTGGGTGACCAACATTCCAGATTTCGGCTAGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATtatcagtgttTGAAGCCACTTTGCTTCTTCGTTTTTTTCtatcagtgttTGAAGAATCTAGGTATTTCAATTTGGTTGtatcagtttTGATAGTACGTGATTTAGCTCGGGATTTAtatcagtgttTGACCCGATCAGCACCAAGTGCGGAACATtatcagtgttTGGTGTGAGAGGAGACGAGGCGAGAGTGOSJNBa0081F16TATCAGTGTTTGAATGTTAATTTAATTATAAAACATGTAT23G18TATCAGTGTTTGACCGGATCGATGGATGCA101煙草3-5L102鼠耳芥屬4103鼠耳芥屬5L104鼠耳芥屬7AAATTGTGAF16B3acattaaaaa#AAGTGATCATTAGACTTTCACACCCAgtgttatta"CTACTTCGAGAATCCCCAATGTTACCPP2CGCGTCAATTTGTTTACAATGTTTTACAAGTTTTAATCTCT23G18GCGTCAATTTGTTTACAACATTCATATAAACATAGATTT22E19權(quán)利要求1.將所關(guān)注的DNA序列導(dǎo)入植物的方法，包括使植物或植物組織或植物細胞或原生質(zhì)體接觸非病原菌，該非病原菌含有(i)包括用于接合轉(zhuǎn)移所需的基因的第一種核酸分子；和(ii)包括一種或多種能夠轉(zhuǎn)移的與所關(guān)注的DNA序列可操作地連接的序列的第二種核酸分子；其中用于轉(zhuǎn)移所需的基因產(chǎn)物起將所關(guān)注的DNA序列轉(zhuǎn)移入植物、植物細胞、植物組織或原生質(zhì)體的作用。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中用于接合轉(zhuǎn)移所需的基因為來自土壤桿菌屬的Ti質(zhì)粒的vir基因。3.權(quán)利要求l所述的方法，其中用于接合轉(zhuǎn)移所需的基因為土壤桿菌屬的vir基因的同源物。4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的同源物為來自IncP質(zhì)粒的tra基因。5.權(quán)利要求l所述的方法，其中能夠轉(zhuǎn)移的序列為來自土壤桿菌屬的Ti質(zhì)粒的T-邊緣序列。6.權(quán)利要求l所述的方法，其中能夠轉(zhuǎn)移的序列為移動性質(zhì)粒的oriT序列。7.權(quán)利要求6所述的方法，其中移動性質(zhì)粒為IncP質(zhì)粒RK2、IncP質(zhì)粒RP4、IncQ質(zhì)粒RSF1010或IncQ質(zhì)粒CloDF13。8.權(quán)利要求l所述的方法，其中將第一種核酸分子整合入非病原菌的基因組。9.權(quán)利要求l所述的方法，其中第一種和第二種核酸分子為自我復(fù)制質(zhì)粒。10.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的細菌為非病原菌，該非病原菌選自根瘤菌屬、假單胞菌屬、固氮螺菌屬、紅球菌屬、葉桿菌屬，黃單胞菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、歐文氏菌屬、蒼白桿菌屬、中華根瘤菌屬、中間根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬和芽孢桿菌屬組成的組。11.將所關(guān)注的DNA序列導(dǎo)入植物的方法，包括使植物或植物組織或植物細胞或原生質(zhì)體接觸非病原菌，該非病原菌含有(i)包括Ti質(zhì)粒的vir基因區(qū)的第一種質(zhì)粒；和(ii)包括一種或多種與所關(guān)注的DNA序列可操作地連接的T-邊緣序列的第二種質(zhì)粒；其中vir基因產(chǎn)物起將所關(guān)注的DNA序列轉(zhuǎn)移入植物、植物細胞、植物組織或原生質(zhì)體的作用。12.權(quán)利要求ll所述的方法，其中第一種質(zhì)粒為來自土壤桿菌屬的去甲型Ti質(zhì)粒。13.權(quán)利要求ll所述的方法，其中第一種質(zhì)粒或第二種質(zhì)?；蜻@兩種質(zhì)粒進一步包括編碼選擇性產(chǎn)物的序列。14.權(quán)利要求13所述的方法，其中編碼第二種質(zhì)粒的選擇性產(chǎn)物的序列可操作地與T-邊緣序列連接并且可以在植物中選擇所述的產(chǎn)物。15.權(quán)利要求ll所述的方法，其中所述的細菌為非病原菌，該非病原菌選自根瘤菌屬、假單胞菌屬、固氮螺菌屬、紅球菌屬、葉桿菌屬、黃單胞菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、歐文氏菌屬、蒼白桿菌屬、中華根瘤菌屬、中間根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬和芽孢桿菌屬組成的組。16.將所關(guān)注的DNA序列導(dǎo)入植物的方法，包括使植物或植物組織或植物細胞或原生質(zhì)體接觸含有核酸分子的非病原菌，所述的核酸分子包括Ti質(zhì)粒的vir基因區(qū)和一種或多種可操作地與所關(guān)注的DNA序列連接的T-邊緣序列。17.權(quán)利要求16所述的方法，其中通過包括T-邊緣序列和vir基因區(qū)的載體與包括所關(guān)注的DNA序列的載體之間的同源重組形成所述的核酸分子。18.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的細菌為非病原菌，該非病原菌選自根瘤菌屬、假單胞菌屬、固氮螺菌屬、紅球菌屬、葉桿菌屬、黃單胞菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、歐文氏菌屬、蒼白桿菌屬、中華根瘤菌屬、中間根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬和芽孢桿菌屬組成的組。19.與植物細胞發(fā)生相互作用的非病原菌，包含(a)包括用于接合轉(zhuǎn)移所需的基因的第一種核酸分子；和(b)包括一種或多種能夠轉(zhuǎn)移的與所關(guān)注的DNA序列可操作地連接的序列的第二種核酸分子；其中用于轉(zhuǎn)移所需的基因產(chǎn)物起將所關(guān)注的DNA序列轉(zhuǎn)移入植物、植物細胞、植物組織或原生質(zhì)體的作用。20.權(quán)利要求19所述的細菌，其中用于接合轉(zhuǎn)移所需的基因為來自土壤桿菌屬的Ti質(zhì)粒的vir基因。21.權(quán)利要求19所述的細菌，其中用于接合轉(zhuǎn)移所需的基因為土壤桿菌屬的vir基因的同源物。22.權(quán)利要求19所述的細菌，其中所述的同源物為來自移動性質(zhì)粒的tra基因，IncP質(zhì)粒為RK2或RP4質(zhì)粒。23.權(quán)利要求19所述的細菌，其中能夠轉(zhuǎn)移的序列為來自土壤桿菌屬的Ti質(zhì)粒的T-邊緣序列。24.權(quán)利要求19所述的細菌，其中能夠轉(zhuǎn)移的序列為移動性質(zhì)粒的oriT序列。25.權(quán)利要求24所述的細菌，其中移動性質(zhì)粒為RK2、RP4、RSF1010或CloDF13。26.權(quán)利要求19所述的細菌，其中將第一種核酸分子整合入非病原菌的基因組。27.權(quán)利要求19所述的細菌，其中第一種和第二種核酸分子為自我復(fù)制質(zhì)粒。28.權(quán)利要求19所述的細菌，其中所述的細菌為非病原菌，該非病原菌選自根瘤菌屬、假單胞菌屬、固氮螺菌屬、紅球菌屬、葉桿菌屬、黃單胞菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、歐文氏菌屬、蒼白桿菌屬、中華根瘤菌屬、中間根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬和芽孢桿菌屬組成的組。29.與植物細胞發(fā)生相互作用的非病原菌，該細菌包含(a)包括Ti質(zhì)粒的vir基因的第一種質(zhì)粒；和(b)包括一種或多種可操作地與所關(guān)注的DM序列連接的T-邊緣序列的第二種質(zhì)粒；其中vir基因產(chǎn)物起將所關(guān)注的DNA序列轉(zhuǎn)移入植物、植物細胞、植物組織或原生質(zhì)體的作用。30.權(quán)利要求29所述的細菌，其中第一種質(zhì)粒為來自土壤桿菌屬的去甲型Ti質(zhì)粒。31.權(quán)利要求29所述的細菌，其中第一種質(zhì)?；虻诙N質(zhì)?；蜻@兩種質(zhì)粒進一步包括編碼選擇性產(chǎn)物的序列。32.權(quán)利要求29所述的細菌，其中編碼第二種質(zhì)粒的選擇性產(chǎn)物的序列可操作地與T-邊緣序列連接并且可以在植物中選擇所述的產(chǎn)物。33.權(quán)利要求29所述的細菌，其中所述的細菌為非病原菌，該非病原菌選自根瘤菌屬、假單胞菌屬、固氮螺菌屬、紅球菌屬、葉桿菌屬、黃單胞菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、歐文氏菌屬、蒼白桿菌屬、中華根瘤菌屬、中間根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬和芽孢桿菌屬組成的組。34.與含有核酸分子的植物細胞發(fā)生相互作用的非病原菌，該細菌包括Ti質(zhì)粒的vir基因區(qū)和一種或多種可操作地與所關(guān)注的DNA序列連接的T-邊緣序列。35.權(quán)利要求34所述的細菌，其中通過包括T-邊緣序列和vir基因區(qū)的載體與包括所關(guān)注的DNA序列的栽體之間的同源重組形成所述的核酸分子。36.權(quán)利要求34所述的細菌，其中所述的細菌為非病原菌，該非病原菌選自根瘤菌屬、假單胞菌屬、固氮螺菌屬、紅球菌屬、葉桿菌屬、黃單胞菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、歐文氏菌屬、蒼白桿菌屬、中華根瘤菌屬、中間根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬和芽孢桿菌屬組成的組。37.生產(chǎn)對基因轉(zhuǎn)移而言處于感受態(tài)的細菌的方法，包括如下任何次序的步驟(a)在所述的細菌中導(dǎo)入包括用于接合轉(zhuǎn)移所需的基因的第一種核酸分子；和(b)在所述的細菌中導(dǎo)入包括一種或多種能夠轉(zhuǎn)移的可操作地與所關(guān)注的DNA序列連接的序列的笫二種核酸分子；其中所述的細菌為非致病性的并且與植物細胞發(fā)生相互作用。38.生產(chǎn)對基因轉(zhuǎn)移而言處于感受態(tài)的細菌的方法，包括如下任何次序的步驟(a)在所述的細菌中導(dǎo)入包括Ti質(zhì)粒的vir基因區(qū)的第一種質(zhì)粒；和(b)在所述的細菌中導(dǎo)入包括一種或多種可操作地與所關(guān)注的DNA序列連接的T-邊緣序列的第二種質(zhì)粒；其中所述的細菌為非致病性的并且與植物細胞發(fā)生相互作用；且其中所得的細菌含有至少一個第一種質(zhì)粒和至少一個第二種質(zhì)粒。全文摘要本發(fā)明一般地涉及將核酸分子轉(zhuǎn)移至真核細胞的技術(shù)。特別是將與植物細胞發(fā)生相互作用的非病原菌種類用于轉(zhuǎn)移核酸序列。用于轉(zhuǎn)化植物的細菌通常含有二元載體，諸如帶有Ti質(zhì)粒vir區(qū)的質(zhì)粒和帶有含有所關(guān)注的DNA序列的T區(qū)的質(zhì)粒。文檔編號C12N15/82GK101123869SQ200580029146公開日2008年2月13日申請日期2005年6月28日優(yōu)先權(quán)日2004年6月28日發(fā)明者R·A·杰斐遜申請人:卡姆比亞公司