專利名稱：具有增加的琥珀酸產(chǎn)量的突變大腸桿菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在代謝工程微生物中生產(chǎn)琥珀酸、蘋果酸、延胡索酸和其他羧基酸類的方法。
背景技術(shù)：
昂貴的特種化合品琥珀酸鹽及其衍生物具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用。琥珀酸作為原材料被用于食品、藥物、塑料制品、化妝品和紡織品，并且被用于電鍍和廢氣凈化(waste-gasscrubbing)(61)。琥珀酸可以作為一些塑料前體的原料，如1，4-丁二醇(BDO)，四氫呋喃和γ-丁內(nèi)酯。而且，琥珀酸和BDO可以用作聚酯的單體。如果琥珀酸鹽的成本可以被降低，它將作為用于生產(chǎn)其他散裝化學(xué)品的中間原料而變得非常有用(47)。除了琥珀酸以外，其他4-碳二羧酸，如蘋果酸和延胡索酸也具有原料潛力。
從葡萄糖、木糖、山梨糖醇和其他“綠色”可更新原料(在本案中通過發(fā)酵過程)生產(chǎn)琥珀酸鹽、蘋果酸鹽和延胡索酸鹽是替代從不可更新資源中提取這些酸類的較高能耗方法的一條途徑。琥珀酸鹽是產(chǎn)丙酸細(xì)菌厭氧發(fā)酵的中間體，但那些過程產(chǎn)生低產(chǎn)量和濃度。很早就已知道大腸桿菌發(fā)酵能產(chǎn)生酸類的混合物?？墒?，對(duì)于每摩爾被發(fā)酵的葡萄糖而言，只產(chǎn)生1.2摩爾甲酸，0.1-0.2摩爾乳酸和0.3-0.4摩爾琥珀酸。因此，以發(fā)酵方法生產(chǎn)羧酸的努力導(dǎo)致相對(duì)大量的生長底物，如葡萄糖，不能被轉(zhuǎn)變成所需的產(chǎn)物。
人們做了許多嘗試對(duì)大腸桿菌無氧中心代謝途徑進(jìn)行代謝工程設(shè)計(jì)，以提高琥珀酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率(7，8，12，14，15，20，24，32，44，48)?；蚬こ膛c生產(chǎn)條件優(yōu)化的結(jié)合也顯示提高了琥珀酸的產(chǎn)量。一個(gè)實(shí)例是一種利用雙期(dual phase)發(fā)酵生產(chǎn)模式生產(chǎn)琥珀酸的突變大腸桿菌菌株的生長，該模式包括初始的有氧生長期，隨后的無氧生產(chǎn)期或/和利用二氧化碳、氫或兩種氣體的混合物來改變無氧發(fā)酵的頂部空間條件(35，49)。
特別地，通過擴(kuò)增、添加或減少某一特定途徑來操縱酶的水平，可以導(dǎo)致所需產(chǎn)物的高產(chǎn)量。已經(jīng)描述了用于在無氧條件下生產(chǎn)琥珀酸的各種基因改進(jìn)，這些改進(jìn)利用了大腸桿菌混合酸發(fā)酵途徑。一個(gè)實(shí)例是從大腸桿菌過表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepc)(34)。在另一實(shí)例中，通過過表達(dá)大腸桿菌中天然的延胡索酸還原酶(frd)延胡索酸到琥珀酸的轉(zhuǎn)化被提高(17，53)。某些酶不是大腸桿菌固有的，但能潛在地促進(jìn)琥珀酸的生產(chǎn)量。通過將埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)中的丙酮酸羧化酶(pyc)轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，琥珀酸的生產(chǎn)量得到提高(14，15，16)。其他代謝工程策略包括使琥珀酸的競爭性途徑失活。當(dāng)蘋果酸酶在具有失活的丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)和乳酸脫氫酶(ldh)基因的宿主中過表達(dá)時(shí)，琥珀酸成為主要的發(fā)酵產(chǎn)物(44，20)。在同一突變株(pfl-和ldh-)內(nèi)的失活的葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶體系(ptsG)也顯示在大腸桿菌內(nèi)產(chǎn)出更高的琥珀酸產(chǎn)出量并促進(jìn)生長(8)。
假設(shè)所有的碳通量都經(jīng)過天然的琥珀酸發(fā)酵途徑(

圖1)，無氧條件下來自葡萄糖的琥珀酸的最大理論產(chǎn)量(基于摩爾)限制在1mol/mol。發(fā)酵途徑將草酰乙酸(OAA)轉(zhuǎn)化為蘋果酸、延胡索酸，其次是琥珀酸，該途徑每產(chǎn)生1摩爾琥珀酸，需要2摩爾NADH。從發(fā)酵途徑產(chǎn)出高產(chǎn)量琥珀酸的最大障礙是由于NADH的限制。這是因?yàn)?摩爾葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑僅能提供2摩爾NADH；而，經(jīng)由天然的發(fā)酵途徑形成1摩爾琥珀酸需要2摩爾NADH。無氧生產(chǎn)琥珀酸還受到緩慢的細(xì)胞生長和產(chǎn)出量的限制的牽制。
通過操縱代謝途徑，代謝工程具有顯著提高過程產(chǎn)出量的潛力。特別地，通過特定途徑的擴(kuò)增、添加或減少來調(diào)控酶的水平，能夠?qū)е滤璁a(chǎn)物的高產(chǎn)量。本領(lǐng)域所需要的是改進(jìn)的細(xì)菌菌株，和迄今所提供的菌株相比，所述改進(jìn)的菌株能產(chǎn)出更高水平的琥珀酸和其他羧酸。
發(fā)明概述本發(fā)明描述了具有多于兩個(gè)途徑的蛋白質(zhì)失活以提高在無氧條件下羧酸產(chǎn)出量的細(xì)菌，其中，所產(chǎn)生的羧酸是琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、草酰乙酸或乙醛酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白ADHE、LDHA、ACKA、PTA、ICLR和ARCA是失活的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白的不同組合被失活，包括ADHE、LDHA、ACKA、PTA、ICLR和ARCA。這些蛋白的失活還可以與ACEA、ACEB、ACEK、PEPC、PYC或CITZ的過表達(dá)相結(jié)合，以進(jìn)一步增加琥珀酸的產(chǎn)量。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，建立了破壞菌株(disruption strain)，其中adhE、ldhA、iclR、arcA和ack-pta基因均被破壞。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，adhE、ldhA、iclR、arcA和ack-pta基因的不同組合被破壞。突變菌株被命名為SBS330MG、SBS440MG、SBS550MG、SBS660MG和SBS990MG，提供了本發(fā)明中的一些實(shí)施方案。
此外，還描述了用突變細(xì)菌菌株生產(chǎn)羧酸的無氧方法，其中，所述方法包括將上述突變細(xì)菌菌株接種培養(yǎng)物，在無氧條件下培養(yǎng)所述菌株，以及從培養(yǎng)基分離羧酸?？梢杂缅F形瓶、生物反應(yīng)器、補(bǔ)料分批(fed batch)生物反應(yīng)器或恒化式(chemostat)生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)菌菌株來獲得羧酸。通過在無氧條件下生產(chǎn)琥珀酸之前在有氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞能進(jìn)一步增加羧酸的產(chǎn)量。
此外，還顯示了改變細(xì)菌中糖酵解通量來分配經(jīng)由OAA-檸檬酸和OAA-蘋果酸途徑的羧酸。糖酵解通量的比率可以是10-40％的檸檬酸和90-60％蘋果酸，更優(yōu)選約30％檸檬酸和約70％蘋果酸。上述細(xì)菌菌株以此種方式分配糖酵解通量。
附圖簡要說明并入本說明書并構(gòu)成本說明書一部分的附圖舉例說明了本發(fā)明，并和所說明的內(nèi)容一起用來解釋了本發(fā)明的原理。
圖1.基因工程無氧代謝途徑。NADH競爭途徑乳酸(LDH)、乙醇(ADH)，以及乙酸途徑(ACK-PTA)。乙醛酸旁路開放(ICLR敲除)并且來源于乳酸乳球菌(L.lactis)的異源丙酮酸羧化酶(PYC)過表達(dá)。此處所描述的基因工程菌株表示為SBS550MG。
圖2.葡萄糖消耗和產(chǎn)物濃度。
圖3.產(chǎn)物產(chǎn)量。
圖4.累計(jì)琥珀酸產(chǎn)量。
圖5.用菌株SBS550MG(pHL413)補(bǔ)料分批生產(chǎn)。實(shí)心標(biāo)記對(duì)應(yīng)于第一期測(cè)得的代謝物，空心標(biāo)記對(duì)應(yīng)于復(fù)制期測(cè)得的代謝物。當(dāng)指針指示葡萄糖降到20mM時(shí)，葡萄糖以脈沖式加入。
發(fā)明的詳細(xì)描述所述的羧酸可以是鹽、酸、堿或衍生物，取決于結(jié)構(gòu)、pH和存在的離子。例如，詞語“琥珀酸(succinate)”和“琥珀酸(succinic acid)”在這里可交替使用。琥珀酸也叫丁二酸(C4H6O4)。這里所使用的化學(xué)品包括甲酸、乙醛、乳酸、蘋果酸、草酰乙酸(OAA)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和丙酮酸。包括Krebs循環(huán)(也叫檸檬酸、三羧酸或TCA循環(huán))的細(xì)菌代謝途徑能夠在Lehninger的“生物化學(xué)原理(Principles of Biochemistry)”及其他生物化學(xué)教科書中找到。
術(shù)語“控制性聯(lián)系(operably associated)”或“控制性相關(guān)(operably linked)”指功能上配對(duì)的核苷酸序列。
在此所定義的“降低的活性”或“失活”指與適當(dāng)?shù)膶?duì)照組菌株相比，蛋白質(zhì)的活性至少降低75％。優(yōu)選地，達(dá)到活性降低至少80、85、90、95％，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，活性被消除(100％)?？梢酝ㄟ^抑制劑、突變、抑制表達(dá)或翻譯等方法使蛋白失活。
在此所定義的“過表達(dá)”或“過表達(dá)的”是指與適當(dāng)?shù)膶?duì)照組菌株相比，至少150％的蛋白質(zhì)活性?？梢酝ㄟ^突變所述的蛋白生成更具活性的形式，或通過清除抑制劑、加入激活劑等方式使蛋白能抵抗抑制的形式。還可以通過清除阻抑物、向細(xì)胞中加入基因的多個(gè)拷貝或正向調(diào)節(jié)內(nèi)源基因等等也能夠?qū)崿F(xiàn)過表達(dá)。
所使用的術(shù)語“破壞(disruption)”和“破壞菌株”是指細(xì)胞株中天然的基因或啟動(dòng)子被突變、刪除、阻斷或負(fù)向調(diào)節(jié)，以這樣的方式來降低基因的活性。通過基因敲除或除去整個(gè)基因組DNA序列，能使基因完全(100％)被破壞(reduced)。利用移碼突變、終止密碼提前、重要?dú)埢c(diǎn)突變、缺失或插入等方式，通過完全阻止活性蛋白的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，能夠使基因產(chǎn)物完全失活(100％)。
在此所用的“重組體”是指來源于或包含基因工程物質(zhì)。
基因縮寫如下異檸檬酸裂解酶(aceA a.k.a.icl)；蘋果酸合酶(aceB)；thy乙醛酸支路操縱子(aceBAK)；異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸化酶(aceK)；乙酸激酶-磷酸轉(zhuǎn)乙?；?ackA-pta)；醇脫氫酶(adhE)；對(duì)有氧呼吸調(diào)控的調(diào)節(jié)子A和B(arcAB)；過氧化物敏感性(arg-lac)；醇乙?；D(zhuǎn)移酶1和2(atf1和atf2)；推定的尸胺/賴氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體(cadR)；檸檬酸合酶(citZ)；脂肪酸降解調(diào)節(jié)子(fadR)；延胡索酸還原酶(frd)；果糖調(diào)節(jié)子(fruR)；延胡索酸酶A，B，或C(fumABC)；異檸檬酸脫氫酶(icd)；異檸檬酸裂合酶(icl)；aceBAK操縱子阻抑物(iclR)；乳酸脫氫酶(ldhA)；蘋果酸脫氫酶(mdh)；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepC)；丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)；丙酮酸氧化酶(poxB)；磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)基因F和G(ptsF和ptsG)；丙酮酸羧化酶(pyc)；鳥苷3’，5’-二焦磷酸合成酶I(relA1)；核糖體蛋白S12(rpsL)；以及琥珀酸脫氫酶(sdh)。Δlac(arg-lac)205(U169)是染色體arg-lac區(qū)缺失，該區(qū)攜帶一個(gè)或幾個(gè)使細(xì)胞對(duì)H2O2敏感的基因(51)。PYC能從不同的物種獲得，乳酸乳球菌pyc是被表達(dá)為一個(gè)實(shí)施例(AF068759)。
縮寫氨芐西林(Ap)；苯唑西林(Ox)；羧芐青霉素(Cn)；氯霉素(Cm)；卡那霉素(Km)；鏈霉素(Sm)；四環(huán)素(Tc)；萘啶酮酸(Nal)；紅霉素(Em)；氨芐西林耐藥性(ApR)；甲砜氯霉素/氯霉素耐藥性(ThiR/CmR)；大環(huán)內(nèi)酯，林可酰胺和鏈陽性菌素A耐藥性(MLSR)；鏈霉素耐藥性(SmR)；卡那霉素耐藥性(KmR)；革蘭氏陰性復(fù)制起點(diǎn)(ColE1)；革蘭氏陽性復(fù)制起點(diǎn)(OriII)。常見的限制酶和限制位點(diǎn)可以在NEB(NEW ENGLAND BIOLABS，www.neb.com)和INVITROGEN(www.invitrogen.com).ATCC，AMERICAN TYPE CULTURECOLLECTIONTM(www.atcc.org)找到。
本發(fā)明某些實(shí)施方案中所用質(zhì)粒和菌株在表1和表2中列出。MG1655是在F接合中F-λ-的自發(fā)突變?nèi)毕?，如Guyer等人所報(bào)道(18)。用P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)和基于λred重組酶的一步失活法來消除途徑(10)。使用本文所引用的以及Sambrook(38)與Ausebel(5)描述的標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)技術(shù)來構(gòu)建質(zhì)粒和突變大腸桿菌菌株。
表1質(zhì)粒
表2菌株
如果合適，每次實(shí)驗(yàn)菌株是剛剛用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的。單一菌落在含有適當(dāng)?shù)目股氐呐囵B(yǎng)皿上被重新劃線。一個(gè)單個(gè)的菌落被轉(zhuǎn)入250ml搖瓶中，搖瓶中包含具有適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)基50ml，并且在37℃、以250rpm搖動(dòng)有氧生長所述的單個(gè)菌落12個(gè)小時(shí)。用LB培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩次，以1％的體積比接種所述的細(xì)胞于2L搖瓶內(nèi)，每個(gè)搖瓶內(nèi)包含400ml具有適當(dāng)抗生素濃度的LB培養(yǎng)基，并且在37℃、以250rpm搖動(dòng)有氧生長所述的細(xì)胞12個(gè)小時(shí)。通過離心收獲適當(dāng)量的細(xì)胞生物質(zhì)(～1.4gCDW)，棄上清。細(xì)胞被重新懸浮于60ml厭氧LB培養(yǎng)基中(LB肉湯培養(yǎng)基補(bǔ)充有20g/L的葡萄糖，1g/L的NaHCO3)，并且立即接種于反應(yīng)器中達(dá)到約10OD600的濃度。
發(fā)酵在完全無氧條件下進(jìn)行。1L的生物反應(yīng)器中有0.66L包含適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)基的初始體積。在0時(shí)間點(diǎn)，如前所述，反應(yīng)器被接種到約10OD600。當(dāng)接種物足以改變培養(yǎng)物濃度時(shí)，之前所述的反應(yīng)器內(nèi)葡萄糖和抗生素起始濃度及細(xì)胞密度是在計(jì)算了接種體的稀釋作用后的濃度。在發(fā)酵期間內(nèi)，用1.0M Na2CO3將pH保持在7.0，CO2以0.2L/min的恒定流速噴射經(jīng)過培養(yǎng)物。溫度和振蕩分別維持在37℃和250rpm。從反應(yīng)器中取出用于確定葡萄糖和產(chǎn)物濃度樣本，用0.2μm濾器過濾，然后立即用HPLC進(jìn)行分析。
實(shí)施例1NADH競爭性途徑的去除SBS110MG中醇脫氫酶(adhE)和乳酸脫氫酶(ldhA)的活性被降低，來關(guān)注損耗NADH產(chǎn)出醇和乳酸而以琥珀酸為代價(jià)(39)。SBS110MG(pTrc99A)消耗了11％的起始葡萄糖，帶來低的琥珀酸產(chǎn)量和高的乙酸產(chǎn)量。
實(shí)施例2丙酮酸羧化酶的表達(dá)來自乳酸乳球菌的異源PYC表達(dá)(質(zhì)粒pHL413)，通過將丙酮酸直接轉(zhuǎn)化成OAA，有助于增加OAA庫，OAA起著乙醛酸和發(fā)酵途徑的前體的作用，如圖1中所示，兩者均能導(dǎo)致琥珀酸的產(chǎn)生。正如所預(yù)料，歸因于活性的iclR，菌株SBS990MG比SBS330MG(pHL413)和SBS550MG(pHL413)具有更低的ICL和MS活性，然而，基礎(chǔ)酶水平似乎足以啟動(dòng)乙醛酸途徑。
產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌中PYC的表達(dá)異源增加了從丙酮酸到OAA的通量。PYC將丙酮酸轉(zhuǎn)向OAA有助于生成琥珀酸。容納(harboring)編碼來自乳酸乳球菌的異源丙酮酸羧化酶的質(zhì)粒pHL413的SBS110MG，在CO2氣體中培養(yǎng)24小時(shí)，從18.7g/L(104mM)葡萄糖生成15.6g/L(132mM)琥珀酸，每摩爾葡萄糖產(chǎn)出1.3摩爾琥珀酸。證明了增加OAA來增加琥珀酸產(chǎn)出量的有效性。
實(shí)施例3激活乙醛酸支路ICLR的失活通過aceBAK的操縱子的激活使乙酰輔酶A轉(zhuǎn)向琥珀酸的生成，從而降低碳通量通過乙酸并繼續(xù)乙酰輔酶A的循環(huán)。菌株SBS330MG(pHL413)中ACK-PTA被活化，因此，即使該途徑已經(jīng)被基因活化，也只有極少的碳流量被轉(zhuǎn)向乙醛酸。相對(duì)于野生型對(duì)照組(數(shù)據(jù)未示出)，這種菌株所顯示的較高酶活性證明了乙醛酸途徑的活性。具有較高的ICL和MS活性的菌株是SBS330MG(pHL413)和SBS550MG(pHL413)。這些菌株顯示兩倍以上的野生型菌株的活性。菌株SBS330MG是通過使adh，ldh突變體SBS110MG中的iclR基因失活而創(chuàng)建的中間菌株(intermediate strain)。在ldhA adhE突變體中，乙酰輔酶A轉(zhuǎn)向乙醛酸途徑，由此而減少了乙酸排泄。即使當(dāng)該菌株中的乙醛酸途徑在結(jié)構(gòu)上已經(jīng)被活化，乙酰輔酶A仍然被引導(dǎo)通過乙酸途徑。
如圖3所示，SBS330MG菌株中每摩爾葡萄糖產(chǎn)出1.1mol琥珀酸，每摩爾葡萄糖0.66mol甲酸，以及每摩爾葡萄糖0.89mol醋酸。雖然SBS330MG(pHL413)產(chǎn)出相當(dāng)數(shù)量的琥珀酸，該菌株也產(chǎn)出了最高水平的甲酸和乙酸。
實(shí)施例4有氧呼吸調(diào)節(jié)的去除
ARCA蛋白屬于雙成分(ARCB-ARCA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)家族，與其同源的感覺激酶ARCB相呼應(yīng)，代表整體的調(diào)節(jié)體系，負(fù)向或正向調(diào)節(jié)許多操縱子的表達(dá)，如黃素蛋白族的幾個(gè)脫氫酶、末端氧化酶、三羧酸循環(huán)、乙醛酸支路的酶和用于脂肪酸降解的途徑的酶。突變株SBS440MGC包含arcA的突變型，一種編碼參與有氧呼吸調(diào)節(jié)的蛋白的基因。
SBS440MGC菌株中arcA的缺失產(chǎn)出每摩爾葡萄糖1.02mol/mol琥珀酸，每摩爾葡萄糖0.45mol/mol甲酸，以及每摩爾葡萄糖0.75mol/mol醋酸，如圖3所示。ARCA的去除沒有顯著影響葡萄糖的消耗(圖2)，但少量降低了總的琥珀酸的產(chǎn)量(圖3)。
實(shí)施例5減少乙酸產(chǎn)出量在菌株SBS990MGC中，在醇脫氫酶(adhE)和乳酸脫氫酶(ldhA)的背景下，乙酸激酶-磷酸轉(zhuǎn)乙?；?ackA-pta)減少，增加了琥珀酸的產(chǎn)出量，減少了經(jīng)由乙醇和乳酸的產(chǎn)出對(duì)NADH的消耗。ack和pta基因缺失消除了形成乙酸的主要途徑。雖然突變株SBS990MG中包含adhE、ldhA和ack-pta基因缺失，SBS990MG仍有完整的iclR。有活性的ICLR能減少ACEBAK的表達(dá)，但剩余的ACEA和ACEB酶活性可能仍然允許具有殘留的乙醛酸支路活性。
SBS990MG中增加的NADH可利用率的實(shí)現(xiàn)，在完全無氧條件下，將琥珀酸的產(chǎn)量提高到每摩爾葡萄糖1.6mol/mol(圖2和圖3)。SBS990MG能達(dá)到高產(chǎn)量的琥珀酸。
實(shí)施例6雙重琥珀酸合成路線已經(jīng)利用生物信息學(xué)(in silico)研發(fā)和檢驗(yàn)了一種具有活化乙醛酸途徑的途經(jīng)設(shè)計(jì)(9)，并通過基因工程的大腸桿菌在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)(41)以增加琥珀酸產(chǎn)量，并且緩解了對(duì)NADH可利用率的限制。構(gòu)建菌株SBS550MG(pHL413)具有雙重琥珀酸合成路線，該路線將所需量的NADH轉(zhuǎn)向通過傳統(tǒng)發(fā)酵途徑，并且通過平衡經(jīng)由該發(fā)酵途徑和乙醛酸途徑(它需要更少的NADH)的碳通量，使碳向琥珀酸的轉(zhuǎn)化最大化(41)。和野生型大腸桿菌菌株每摩爾琥珀酸2摩爾NADH的理論需要量相對(duì)照，重新設(shè)計(jì)的途徑顯示來自葡萄糖的NADH實(shí)驗(yàn)需要量是每摩爾琥珀酸～1.25摩爾NADH。
已經(jīng)證明ldhA adhE iclR突變體中ack-pta失活是造成乙酰輔酶A引導(dǎo)通過乙醛酸途徑的關(guān)鍵。乙酸途徑的缺失利于以乙酰輔酶A的形式保存碳分子，而乙酰輔酶A轉(zhuǎn)向生成乙醛酸和琥珀酸。乙醛酸到蘋果酸，到延胡索酸，最終到琥珀酸的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，也有利于減少NADH需要量。該途徑從2摩爾乙酰輔酶A和1摩爾OAA，生成2摩爾琥珀酸，只需要1摩爾NADH(41)。
對(duì)過表達(dá)PYC的菌株SBS550MG的性能進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。雖然具有PYC的菌株SBS550MG在無氧條件下能相當(dāng)好地生長，但在該研究中細(xì)胞經(jīng)受無氧琥珀酸生產(chǎn)期之前，采用有氧條件以迅速積聚生物量。具有和不具有pHL531的菌株SBS550MG消耗了100％的葡萄糖，兩個(gè)菌株從100mM的葡萄糖產(chǎn)出相似水平的琥珀酸(160mM)。在攜帶質(zhì)粒pHL531的菌株中，觀察到殘余甲酸增加，乙酸水平降低，該菌株中過表達(dá)了對(duì)NADH不敏感的檸檬酸合酶。在以SBS550MG為基礎(chǔ)的菌株的培養(yǎng)物中見到的乙酸水平大大低于SBS110MG(pHL413)的培養(yǎng)物中見到的乙酸水平。SBS550MG(pHL413，pHL531)和SBS550MG(pHL413，pDHK29)的琥珀酸產(chǎn)量非常相似(約每摩爾葡萄糖1.6mol/mol琥珀酸)。
盡管過表達(dá)了NADH非敏感型檸檬酸合酶，但1.6mol/mol的高琥珀酸產(chǎn)量保持不變，這一事實(shí)也表明天然的檸檬酸合酶體系已足以啟動(dòng)乙醛酸途徑。此外，這些結(jié)果進(jìn)一步顯示雙路線琥珀酸生產(chǎn)體系非常強(qiáng)?。辉擉w系能在OAA節(jié)點(diǎn)處理相當(dāng)多的微擾情況而不會(huì)顯著改變產(chǎn)量。顯然，在可利用的減少等價(jià)物和碳原子方面，這些細(xì)胞能夠在發(fā)酵和乙醛酸途徑間達(dá)到一個(gè)平衡分配，達(dá)到有效地最大化的琥珀酸產(chǎn)出。
以SBS660MG為基礎(chǔ)的菌株的培養(yǎng)物經(jīng)過24小時(shí)僅消耗25-35％的葡萄糖。SBS660MG(pHL413，pHL531)和SBS660MG(pHL413，pDHK29)菌株產(chǎn)出約1.7mol/mol的相似的琥珀酸產(chǎn)量。在所有被研究菌株中，這些產(chǎn)值在最高值之列(表3)。經(jīng)轉(zhuǎn)化的突變株SBS660MG(pHL413，pHL531)與對(duì)照組相比，沒有觀察到在琥珀酸、乙酸或甲酸產(chǎn)量方面有顯著的差別(圖3)。arcA缺失增加了每摩爾葡萄糖的琥珀酸產(chǎn)出量，但降低了葡萄糖的消耗量。
實(shí)施例7檸檬酸合酶的表達(dá)圖1描述了大腸桿菌突變株，用丙酮酸羧化酶編碼質(zhì)粒pHL413和檸檬酸合酶表達(dá)質(zhì)粒pHL531轉(zhuǎn)染SBS550MG，SBS660MGC和SBS990MGC產(chǎn)生的不同代謝產(chǎn)物。與對(duì)照組和SBS110MG(pHL413)相比，SBS330MG(pHL413)的乙酸產(chǎn)量增加。這些結(jié)果表明對(duì)檸檬酸合酶可能有某些抑制作用，這種抑制作用是由較高的NADH水平造成的并且受益于較低的NAD+水平。眾所周知，NADH以別構(gòu)的方式抑制檸檬酸合酶(33，43)，NAD+是NADH結(jié)合的微弱競爭性抑制劑(13)。在SBS330MG(pHL413)中觀察到的檸檬酸合酶絕對(duì)體外活性在所有被研究菌株中是最低的。
菌株SBS550MG(pHL413+pDHK29)作為對(duì)照組，SBS550MG(pHL413+pHL531)共表達(dá)異源的PYC和檸檬酸合酶。具有和沒有pHL531的菌株SBS550MG消耗了100％的葡萄糖，兩種菌株從100mM葡萄糖產(chǎn)出相似水平的琥珀酸(160mM)。盡管事實(shí)是乙酸途徑已被敲除，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)培養(yǎng)物中仍能檢測(cè)到低濃度乙酸。用過表達(dá)NADH非敏感型檸檬酸合酶的攜帶質(zhì)粒pHL531的菌株觀察到剩余甲酸增多和乙酸水平降低。
表3羧酸產(chǎn)量A
A在24小時(shí)無氧生產(chǎn)期期間，產(chǎn)物摩爾數(shù)/葡萄糖摩爾數(shù)與SBS660MG(pHL413，pDH29)對(duì)照菌株相比，SBS660MG(pHL413，pHL531)菌株中NADH檸檬酸合酶的表達(dá)增加了葡萄糖消耗并且增加了約40％的所產(chǎn)生的代謝物。SBS660MG(pHL413，pHL531)和SBS660MG(pHL413，pDHK29)菌株都產(chǎn)出了相似的約1.7mol/mol的琥珀酸產(chǎn)量。這些產(chǎn)值在所有被研究的菌株中位于最高值之列(表3)。SBS990MG(pHL413，pDHK29)菌株產(chǎn)出的琥珀酸水平與SBS550MG(pHL413，pDHK29)菌株產(chǎn)出的琥珀酸水平非常相似。
結(jié)果顯示雙路線琥珀酸生產(chǎn)體系非常強(qiáng)健的；該體系能在OAA節(jié)點(diǎn)處理重大的微擾而不顯著地改變產(chǎn)量。在可利用的減少等價(jià)物和碳原子方面，工程細(xì)胞能在發(fā)酵和乙醛酸鹽途徑間達(dá)到一個(gè)平衡的分配，達(dá)到有效地最大化的琥珀酸產(chǎn)出。這些結(jié)果進(jìn)一步支持當(dāng)adhE，ldhA和ack-pta失活時(shí)，乙醛酸途徑可能有某種程度激活的假說。
實(shí)施例8NADH通量分析用在成批培養(yǎng)條件下獲得的測(cè)得的通量，來估計(jì)細(xì)胞內(nèi)的通量和鑒別關(guān)鍵分支點(diǎn)通量的分流比。由不同突變所造成的在OAA節(jié)點(diǎn)進(jìn)入乙醛酸途徑和發(fā)酵途徑的分支點(diǎn)通量的分流比變化的比較，揭示了琥珀酸產(chǎn)量對(duì)這些操作的敏感性。
依據(jù)質(zhì)量守恒定律和細(xì)胞內(nèi)中間代謝物準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)假設(shè)(pseudo-steady state hypothesis，PSSH)，構(gòu)建了一個(gè)代謝矩陣。從依據(jù)圖1所示代謝網(wǎng)絡(luò)公式化的一組線性方程所得到的化學(xué)計(jì)量矩陣給出了一個(gè)維數(shù)為15×15的方矩陣，該方矩陣僅依據(jù)測(cè)得的代謝物、細(xì)胞內(nèi)代謝物的PSSH平衡和NADH平衡。對(duì)NADH平衡，假定NADH的產(chǎn)出量和消耗應(yīng)當(dāng)是相等的。氧化還原平衡的推導(dǎo)不考慮任何被生物質(zhì)同化的碳原子。除野生型外所有突變體的生物量(υ2)都被假定為零，是在生成能找到最小二乘擬合值的多種因素決定系統(tǒng)時(shí)的度量方法。數(shù)學(xué)表達(dá)式、化學(xué)計(jì)量矩陣和與所述網(wǎng)絡(luò)中各種物質(zhì)有關(guān)的凈轉(zhuǎn)化方程在表4(酶的反應(yīng))中給出。
表4酶的反應(yīng)
向量r(t)(m×1)，其中m＝15，16或17)表示對(duì)不同代謝物的凈轉(zhuǎn)化率rT＝[r1......r80 0 0 0 0 0 0 0 0]對(duì)MG1655(pHL413)，不考慮H2和生物量的平衡，因此矩陣A減少為15×15的方矩陣，通過方程1得到精確解υ(t)＝A-1r(t) (1)對(duì)突變株SBS110MG(pHL413)、SBS330MG(pHL413)、SBS550MG(pHLA13)和SBS990MGC(pHL413)，不考慮H2平衡，考慮生物量，其結(jié)果給出一個(gè)由多種因素決定的系統(tǒng)(m＝16并且n＝15)，該系統(tǒng)利用最小二乘擬合法由下面的方程2來估算υ(t)＝(ATA)-1Aτr(t)(2)對(duì)分泌的代謝物濃度變化的時(shí)間擬合值被確定在t＝0h和t＝6h或7h之間，并且如下式(4)基于平均細(xì)胞密度ri=Ci(t+δt)-Ci(t)δtxX‾---(3)]]>其中，X‾=X(t+δt)-X(t)ln{X(t+δt)X(t)}---(4)]]>研究發(fā)現(xiàn)，琥珀酸產(chǎn)量對(duì)在OAA節(jié)點(diǎn)的分流比比在PEP/PYR節(jié)點(diǎn)的分流比相對(duì)更為敏感。為得到最高的琥珀酸產(chǎn)量，最有利的分流比是在OAA的分?jǐn)?shù)分配為0.32到乙醛酸，0.68到菌株SBS550MG(pHL413)和SBS990MG(pHL413)中得到的發(fā)酵途徑。這兩種菌株達(dá)到的琥珀酸產(chǎn)量分別是1.6mol/mol和1.7mol/mol。前面已顯示ldhA，adhE，ack-pta突變菌株中活化的乙醛酸途徑是造成在無氧下達(dá)到高琥珀酸產(chǎn)量的原因。與野生型相比，在無氧發(fā)酵的起點(diǎn)發(fā)現(xiàn)SBS550MG(pHL413)和SBS990MG(pHL413)中NADH和乙酰輔酶A的高細(xì)胞內(nèi)水平，但這些水平很快降低，表明盡管PEP/PYR分支點(diǎn)下游的酶失活，這些菌株仍能處理高糖酵解通量。
菌株SBS550MG(pHL413)的糖酵解通量(υ1到υ4)相對(duì)于SBS330MG(pHL413)是增加的，但相對(duì)于野生型對(duì)照菌株是降低的。PFL通量(υ7)相對(duì)于野生型對(duì)照菌株也是降低的，造成乙酸和甲酸通量顯著減少。這些糖酵解通量證明高的琥珀酸產(chǎn)量取決于在OAA-檸檬酸和OAA-蘋果酸之間羧酸產(chǎn)出量的分配。通量分配平衡了NADH消耗量并且導(dǎo)致增加的琥珀酸產(chǎn)出量。在高琥珀酸產(chǎn)出菌株中的分配在10-40％檸檬酸來源的琥珀酸和90-60％蘋果酸來源的琥珀酸產(chǎn)出量之間變化(見圖1)。
實(shí)施例9補(bǔ)料分批無氧發(fā)酵由于更可控的環(huán)境，生物反應(yīng)器形成更高的生產(chǎn)率。重復(fù)進(jìn)行了一個(gè)批次的實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)在受控的條件下SBS550(pHL314)產(chǎn)出琥珀酸的效率(圖5)。在該實(shí)驗(yàn)中，生物反應(yīng)器起始裝載LB，并補(bǔ)加了86mM葡萄糖。在0時(shí)間點(diǎn)，反應(yīng)器被接種至OD值為17。當(dāng)指針指示葡萄糖降到約20mM時(shí)，以脈沖形式加入葡萄糖。起始葡萄糖濃度差別和在各輪中葡萄糖添加的時(shí)間的差別，不影響菌株的性能。
如圖5所示，菌株在產(chǎn)出琥珀酸方面非常有效。琥珀酸的產(chǎn)出量在每小時(shí)12mM到9mM琥珀酸之間，具有1.6mole/mole的極高效產(chǎn)量。該體系僅產(chǎn)生極少量的其他代謝物，如作為副產(chǎn)品的甲酸和乙酸。該體系將有望被進(jìn)一步優(yōu)化，把琥珀酸產(chǎn)量提高到1.8、1.9或2.0mole/mole，甚至更高。
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權(quán)利要求
1.一種基因工程細(xì)菌菌株，所述的菌株在多于兩條途徑的蛋白具有降低的活性，以提高在無氧條件下羧酸的產(chǎn)出量，其中所述的菌株包括a)降低的乳酸脫氫酶(LDH)和醇脫氫酶(ADH)活性；b)針對(duì)選自由ARC、乙酸激酶-磷酸轉(zhuǎn)乙?；?ACKA-PTA)、醇脫氫酶(ADHE)、有氧呼吸調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)子A和B(ARCAB)、過氧化物敏感性(ARG-LAC)、推定的尸胺/賴氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體(CADR)、脂肪酸降解調(diào)節(jié)子(FADR)、延胡索酸還原酶(FRD)、果糖調(diào)節(jié)子(FRUR)、延胡索酸酶(FUM)、異檸檬酸脫氫酶(ICD)、異檸檬酸裂合酶(ICL)、aceBAK操縱子阻抑物(ICLR)、乳酸脫氫酶(LDHA)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、丙酮酸氧化酶(POXB)、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)基因F和G(PTSF和PTSG)和琥珀酸脫氫酶(SDH)所構(gòu)成的組的一種或更多種蛋白的降低的活性；以及c)一個(gè)選自由異檸檬酸裂合酶(ACEA)、蘋果酸合酶(ACEB)、異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸化酶(ACEK)、檸檬酸合酶(CITZ)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸甲酸裂合酶(PFL)和丙酮酸羧化酶(PYC)所組成的組的蛋白的過表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株，其中所述的細(xì)菌在無氧條件下從每摩爾葡萄糖產(chǎn)出至少1.5摩爾琥珀酸。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株，其中所述的細(xì)菌在無氧條件下從每摩爾葡萄糖產(chǎn)出至少1.6摩爾琥珀酸。
4.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株，其中所述的細(xì)菌在無氧條件下從每摩爾葡萄糖產(chǎn)出至少1.7摩爾琥珀酸。
5.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株，其中所述的細(xì)菌包括一個(gè)或更多個(gè)選自ldhA、adhE、ackA-pta、arcA、ptsG和iclR的基因的破壞。
6.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株，其中所述的細(xì)菌包括一個(gè)重組DNA，所述的重組DNA包括一個(gè)與一個(gè)基因控制性相關(guān)的表達(dá)構(gòu)建體，所述的基因選自由aceA、aceB、aceBAK、aceK、citZ、pepC、pfl和pyc所組成的組。
7.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株，其中所述的細(xì)菌菌株選自由SBS330MG、SBS440MG、SBS990MGC、SBS550MG和SBS660MGC所組成的組。
8.一種在厭氧細(xì)菌培養(yǎng)物中生產(chǎn)羧酸的方法，包括a)在培養(yǎng)物中提供細(xì)菌，其中所述細(xì)菌包括降低活性的LDH和ADH；其中所述的細(xì)菌選自由以下各項(xiàng)組成的組i)包括針對(duì)一個(gè)或更多個(gè)蛋白降低活性的細(xì)菌，所述的蛋白選自由ARC、FADR、FRD、FRUR、FUM、ICD、ICLR、MDH、POXB、PTSF、PTSG和SDH所組成的組；ii)過表達(dá)包括選自由PYC、PEPC、CITZ、ACEA、ACEB和ACEK所組成的組的蛋白的細(xì)菌；以及iii)包括i)和ii)兩者的細(xì)菌；b)向所述細(xì)菌提供糖底物，c)使所述細(xì)菌利代謝所述的蔗糖，以及d)從所述的培養(yǎng)物回收所述的羧酸。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)菌包括adh、ldh和iclR的破壞。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)菌包括adh、ldh、iclR和arcA的破壞。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)菌包括adh、ldh和ack-pta的破壞。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)菌包括adh、ldh、ack-pta和arcA的破壞。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)菌包括adh、ldh、ack-pta和iclR的破壞。
14.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)菌包括adh、ldh、ack-pta、iclR和arcA的破壞。
15.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)菌包括表達(dá)PYC、PEPC、CITZ、ACEA、ACEB或ACEK的表達(dá)載體。
16.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的羧酸是琥珀酸，并且所述的細(xì)菌包括被破壞的sdh基因。
17.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的羧酸是延胡索酸，并且所述的細(xì)菌包括被破壞的fum、延胡索酸酶A(fumA)、延胡索酸酶B(fumB)或延胡索酸酶C(fumC)基因。
18.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的羧酸是蘋果酸，并且所述的細(xì)菌包括被破壞的mdh基因。
19.如權(quán)利要求8所述的細(xì)菌菌株，其中所述的細(xì)菌菌株選自由SBS330MG、SBS440MG、SBS990MGC、SBS550MG和SBS660MGC所組成的組。
20.如權(quán)利要求8所述的細(xì)菌菌株，其中所述的細(xì)菌菌株選自由SBS330MG(pHL413)、SBS440MG(pHL413)、SBS990MGC(pHL413)、SBS550MG(pHL413)和SBS660MGC(pHL413)所組成的組。
21.如權(quán)利要求8所述的細(xì)菌菌株，其中所述的細(xì)菌菌株選自由SBS330MG(pHL413+pHL531)、SBS440MG(pHL413+pHL531)、SBS990MGC(pHL413+pHL531)、SBS550MG(pHL413+pHL531)和SBS660MGC(pHL413+pHL531)所組成的組。
22.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的方法包括在錐形瓶、生物反應(yīng)器、補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器或恒化式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述細(xì)胞。
23.一種基因工程細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)菌包括a)ldhA的破壞；b)adhE的破壞；以及c)ack-pta的破壞。
24.如權(quán)利要求23所述的細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)菌包括iclR的破壞。
25.如權(quán)利要求23所述的細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)菌包括可操作地連接于表達(dá)構(gòu)建體的pyc基因。
26.如權(quán)利要求25所述的細(xì)菌菌株，其中所述的pyc來源于乳酸乳球菌。
27.如權(quán)利要求23所述的細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)菌包括可操作地連接于表達(dá)構(gòu)建體的citZ基因。
28.如權(quán)利要求27所述的細(xì)菌菌株，其中所述的citZ來源于枯草芽孢桿菌。
29.如權(quán)利要求23所述的細(xì)菌菌株，其中所述的細(xì)菌菌株選自由SBS330MG、SBS440MG、SBS990MGC、SBS550MG和SBS660MGC所組成的組。
30.如權(quán)利要求23所述的細(xì)菌菌株，其中所述的細(xì)菌菌株選自由SBS330MG(pHL413)、SBS440MG(pHL413)、SBS990MGC(pHL413)、SBS550MG(pHL413)和SBS660MGC(pHL413)所組成的組。
31.如權(quán)利要求23所述的細(xì)菌菌株，其中所述的細(xì)菌菌株選自由SBS330MG(pHL413+pHL531)、SBS440MG(pHL413+pHL531)、SBS990MGC(pHL413+pHL531)、SBS550MG(pHL413+pHL531)和SBS660MGC(pHL413+pHL531)所組成的組。
32.一種生產(chǎn)琥珀酸的方法，所述的方法包括a)在無氧條件下培養(yǎng)權(quán)利要求20的細(xì)菌菌株；b)提供糖底物，c)使所述細(xì)菌代謝所述的底物；以及d)分離琥珀酸。
33.一個(gè)改造用來生產(chǎn)羧酸的細(xì)菌菌株，其中所述的細(xì)菌菌株在OAA和蘋果酸之間分配糖酵解通量，以在無氧培養(yǎng)條件下增加羧酸產(chǎn)出量；其中所述糖酵解通量的比率是10至40％的檸檬酸和90至60％的蘋果酸。
34.如權(quán)利要求33所述的細(xì)菌菌株，其中所述糖酵解通量的比率是約30％檸檬酸和約60％蘋果酸。
35.如權(quán)利要求33所述的細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)菌從每摩爾葡萄糖產(chǎn)出大于1.5摩爾琥珀酸。
36.如權(quán)利要求33所述的細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)菌從每摩爾葡萄糖產(chǎn)出大于1.6摩爾琥珀酸。
37.如權(quán)利要求33所述的細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)菌從每摩爾葡萄糖產(chǎn)出大于1.7摩爾琥珀酸。
38.如權(quán)利要求33所述的細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)菌菌株選自由SBS330MG、SBS440MG、SBS990MGC、SBS550MG和SBS660MGC所組成的組。
39.如權(quán)利要求33所述的細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)菌菌株選自由SBS330MG(pHL413)、SBS440MG(pHL413)、SBS990MGC(pHL413)、SBS550MG(pHL413)和SBS660MGC(pHL413)所組成的組。
40.如權(quán)利要求33所述的細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)菌菌株選自由SBS330MG(pHL413+pHL531)、SBS440MG(pHL413+pHL531)、SBS990MGC(pHL413+pHL531)、SBS550MG(pHL413+pHL531)和SBS660MGC(pHL413+pHL531)所組成的組。
41.一種生產(chǎn)琥珀酸的方法，所述的方法包括a)在無氧條件下培養(yǎng)權(quán)利要求33的細(xì)菌菌株；b)提供糖底物；c)使所述細(xì)菌代謝所述的底物；以及d)分離琥珀酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)菌的突變株，該突變株缺少或包含對(duì)應(yīng)幾個(gè)關(guān)鍵代謝酶的突變基因，并且，該突變株在無氧條件下產(chǎn)出高產(chǎn)量的琥珀酸。
文檔編號(hào)C12P1/00GK101044245SQ200580028883
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2005年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月27日
發(fā)明者K-Y·單, 喬治·N·貝內(nèi)特, 艾倫·桑切斯 申請(qǐng)人:萊斯大學(xué)