專利名稱：具有改良生長特性的植物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及分子生物學領域，并且涉及改良植物生長特性的方法。更具體的，本發(fā)明涉及通過增加LRR受體激酶(RLK827)或其同源物在植物中的表達和/或活性來增加植物產量和/或生物量的方法。本發(fā)明還涉及具有LRR受體激酶或其同源物的編碼核酸表達增加的植物，該植物相對于對應的野生型植物具有改良的生長特性。本發(fā)明還提供了可用于本發(fā)明方法的構建體。
鑒于不斷增長的世界人口和農業(yè)用地面積的縮小，增加農業(yè)效率和增加園藝植物的多樣性一直是農業(yè)研究的主要目標。作物和園藝改良的常規(guī)手段利用選育技術來鑒定具有期望特性的植物。然而，這種選育技術具有若干缺點，即這些技術一般是勞動密集型的，而且產生通常含有異質遺傳成分的植物，這并非總是產生自親本植物傳遞過來的期望性狀。分子生物學的發(fā)展已經允許人類操作動物和植物的種質。植物的遺傳工程需要分離和操作遺傳物質(一般是DNA或RNA的形式)，隨后把該遺傳物質引入到植物中。此種技術導致具有多種改良的經濟學、農藝學或園藝性狀的植物的開發(fā)。具有特殊經濟利益的性狀是生長性狀，例如高產量。產量通常定義為作物產生的可衡量經濟價值。這可以從數量和/或質量方面定義。產量直接取決于一些因素，例如，器官的數量和尺寸，植物結構(例如，枝條的數量)，種子產量等等。根的發(fā)育、營養(yǎng)吸收和脅迫耐受性也是確定產量的重要因素?？梢酝ㄟ^優(yōu)化上述因素之一來提高作物產量。
植物的生長和發(fā)育取決于環(huán)境信號以及內部信號，例如激素介導的信號傳導、脅迫和養(yǎng)料信號傳導、細胞周期控制或發(fā)育信號傳導。細胞通過細胞表面受體將信號轉導到細胞內部，從而感知這些信號。這些受體中的一些是蛋白激酶。蛋白激酶包含一個酶的大家族，其通過羥基氨基酸的磷酸化介導真核細胞對刺激的響應。根據其底物的特異性，這些酶分為兩大類絲氨酸/蘇氨酸特異性酶或酪氨酸特異性酶?？梢詫⑴c信號轉導的激酶歸為主要由酪氨酸激酶組成的不同家族。動物中的受體酪氨酸激酶(RTK)具有統(tǒng)一的結構，由胞外配體結合結構域、跨膜結構域和胞質酪氨酸激酶結構域組成。在植物酪氨酸激酶中，類受體激酶(RLK)蛋白質也有突出的作用。已知植物中有600多種不同的RLK。它們具有和動物RTK類似的結構，在圖1中給出了分類(Shiu和Bleecker，Proc.Natl.Acad.Sci USA98，10763-10768，2001)。已經鑒定了一些植物RLK蛋白質，例如BRI1(brassinoid信號傳導)，CLV1(分生組織分化)，HAESA(花器官的脫落)，XA21(真菌檢測)CR4(葉和胚乳的發(fā)育)，FLS2(鞭毛蛋白/病原體檢測)，SRK(自交不親和性)等(Becraft，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.18，163-192，2002；Diévart和Clark，Curr. Opin.Plant Biol.6，507-516)。大約200種植物RLK具有富亮氨酸重復序列(LRR)。LRR是23到25個殘基的序列基序，其包含共有序列LxxLxLxxN/CxL，其中x可以是任何氨基酸。這些LRR存在于蛋白質中，具有多種功能，例如激素受體相互作用、酶抑制、細胞黏著和細胞運輸，并且LRR結構域常以串連排列組織。已顯示LRR對于細胞骨架的形態(tài)和動態(tài)是重要的。這些基序的主要功能似乎是提供用于形成蛋白質-蛋白質相互作用的多樣化結構構架(Kobe和Kajava，Curr.Opin.Struct.Biol.11，725-732，2001)。
富亮氨酸重復序列和激酶結構域的組合是將外部信號介導到細胞中的受體蛋白質的特征。認為它們通過這種機制運作，即其中一個或多個LRR結構域(主要是胞外的)用為胞外信號傳感器，而激酶結構域通常在內部，通過磷酸化胞內靶標并由此起始信號轉導來參與信號的轉導。RLK在植物中參與多個過程，如植物發(fā)育、抗病性或自交不親和性。本發(fā)明顯示植物生長特性，尤其是產量可以通過調節(jié)RLK編碼核酸植物中的表達來改良。
國際專利中請WO03/072763公開了在植物中過量表達時，使植物生長和種子產量增加的類受體激酶。但是，該RLK蛋白質在其非胞質結構域中不含有任何LRR結構域，而代替此結構域的是富含脯氨酸的結構域。另一份公開(WO00/04761)報道了當RKN受體激酶過量表達時，根的生長增強。類似的，BRI1受體激酶的過量表達會產生調節(jié)的產量在WO98/59039中提示但是沒有說明。但是在后兩種情形中所使用的RLK在非胞質結構域中包含22個LRR結構域，典型的是類受體激酶LRR-X亞家族。至今為止沒有報道說明甚至提示LRR-I亞家族的類受體激酶可用于改良植物生長特性，尤其是增加產量。
令人驚訝的發(fā)現相對于對應的野生型植物，在植物中增加RLK827蛋白質的表達和/或活性使得植物具有改良的生長特性，尤其是增加的產量。
RLK827是類受體激酶，其與作為類受體激酶LRR-I亞家族成員的LRRPK結構相關(Shiu和Bleecker，2001)。從N端開始，成熟RLK827蛋白質具有長的推定非胞質結構域、單一的跨膜結構域以及在C端胞質部分中的激酶結構域。類受體激酶根據其非胞質結構域的組成分類，所述的組成可以包括富含脯氨酸序列、凝集素結構域、LRR結構域、EGF重復、TNFR重復、奇異果甜蛋白或凝集素結構域等。類受體激酶的大基團在非胞質結構域具有富亮氨酸重復序列(LRR)。各種LRR亞家族在這些富亮氨酸重復序列的數量和位置上彼此不同(綜述，參見Shiu和Bleecker，2001)。RLK827的推定非胞質結構域特征在于在其C端部分存在1到3個串連的富亮氨酸重復序列；因此RLK827屬于LRR-I受體激酶亞家族。受體激酶的各種LRR亞家族還在它們的染色體分布上彼此不同。通常它們以串連重復排列。染色體的串連重復、大規(guī)模重復和重排至少部分是植物中LRR類受體激酶進化和擴增的原因。因此，除了一些例外，LRR-I受體激酶分布在擬南芥(Arabidopsis)染色體I、II和III上。
本發(fā)明的一個實施方案提供了改良植物生長特性的方法，其包括增加RLK827多肽或其同源物的表達和/或活性，以及任選選擇具有改良生長特性的植物。
有利的，實施本發(fā)明的方法得到了具有多種改良生長特性的植物，如改良的生長、改良的產量、改良的生物量、改變的構造或改良的細胞分裂，每種都是相對于對應的野生型植物。優(yōu)選的，改良的生長特性至少包括比對應的野生型植物增加的產量。優(yōu)選的，增加的產量是增加的種子產量，包括增加的(飽滿)種子數，增加的種子總重量和增加的收獲指數。
本文所定義的術語“增加的產量”意指分別相對于對應的野生型植物，如下任何一個或多個方面的增加(i)植物的一個或多個部分增加的生物量(重量)，特別是地上(可收獲)部分、增加的根生物量或任何其他可收獲部分的增加的生物量；(ii)增加的總種子產量，其包括種子生物量(種子重量)的增加并且其可以是每株植物種子重量(總種子重量)的增加或單個種子基礎上的增加；(iii)增加的(飽滿)種子數；(iv)增加的種子尺寸；(v)增加的種子體積；(vi)增加的單個種子面積；(vii)增加的單個種子長度；(viii)增加的收獲指數，它表示為可收獲部分如種子的產量對總生物量的比例；(ix)每個圓錐花序小花增加的數量，其從所計數的種子總數以及初級圓錐花序的數量推論出來；以及(x)增加的千粒重(TKW)，其從所計的飽滿種子數和它們的總重量推論出來。增加的TKW可源于增加的種子尺寸(長度、寬度或其二者)和/或種子重量。增加的TKW可源于胚胎尺寸和/或胚乳尺寸的增加。
以谷類為例，產量增加可以表現為下列一種或多種每公頃或英畝植物數量增加、每株植物穗數量的增加、畦數、每畦種子數、粒重、TKW、穗的長度/直徑的增加等。以稻為例，產量增加可以表現為下列一種或多種的增加每公頃或英畝植物數量、每株植物的圓錐花序數量、每個圓錐花序的小穗數量、每個圓錐花序花的數量，種子飽滿率的增加、TKW的增加等。產量的增加還可產生改變的構造或可以作為改變的構造的結果發(fā)生。
優(yōu)選的，實施本發(fā)明的方法使得植物具有增加的產量和/或增加的生物量。更具體的，實施根據本發(fā)明的方法使得植物具有增加的種子產量。優(yōu)選的，增加的種子產量包含分別相對于對照植物，在下列一種或多種的增加飽滿種子數、總種子重量和收獲指數。因此，本發(fā)明提供了增加植物產量的方法，該方法包括在植物中增加RLK827多肽或其同源物的表達和/或活性。
由于根據本發(fā)明的修飾植物具有增加的產量，因此，相對于在其生活周期對應階段的相應野生型植物的生長速度，這些植物很可能表現出增加的生長速度(至少是在其生活周期的一部分)。生長速度增加可以是對植物的一個或多個部分或細胞類型(包括種子)特異性的，或者可以基本遍布整株植物。具有增加的生長速度的植物可以具有更短的生活周期。植物的生活周期意指從干的成熟種子生長到植物產生干的成熟種子(類似于起始物質)的階段所需的時間。此生活周期可以受到如早期活力、生長速度、開花時間和種子成熟速度等因素的影響。生長速度的增加可以發(fā)生在植物生活周期的一個或多個階段或者基本遍布整個植物生活周期期間。在植物生活周期的早期階段增加的生長速度反映了增強的活力。生長速度的增加可以改變植物的收獲周期，這使得植物可以比可能的情形更晚播種和/或更早收獲。如果生長速度充分增加，可以允許播種相同植物物種的更多種子(例如在播種和收獲稻植物后，接著播種和收獲更多的稻植物，所有這些都在一個常規(guī)生長期內)。類似的，如果生長速度充分增加，可以允許播種不同植物物種的更多種子(例如在播種和收獲稻植物后，例如接著播種和任選收獲大豆、馬鈴薯或任何其他適當的植物)。在一些植物的情形下，從同一根狀莖收獲多次也是可能的。改變植物的收獲周期可以使得每英畝每年生物量的產出增加(由于任何特定植物可以生長和收獲次數(指在一年中)的增加)。生長速度的增加還使得轉基因植物可以比它們的野生型對應物在更廣的地域栽培，這是因為生長作物的區(qū)域性限制通常決定于種植時(初期)或收獲時(晚期)的不利環(huán)境條件。如果收獲周期縮短，那么可以避免此類不利條件?？梢酝ㄟ^生長實驗測繪生長曲線，得到多個參數來確定生長速度，此類參數可以是T-Mid(植物達到其最大尺寸的50％時所用的時間)以及T-90(植物達到其最大尺寸的90％時所用的時間)等。
本發(fā)明方法的實施提供了具有增加的生長速度的植物。因此，本發(fā)明提供了增加植物生長速度的方法，該方法包括在植物中增加RLK827多肽或其同源物的表達和/或活性。
與對照植物相比，無論植物是否在無脅迫條件下或植物是否接觸多種脅迫，產生產量和/或生長速度的增加。植物一般通過生長更加緩慢來應答所接觸的脅迫。在嚴重的脅迫條件下，植物甚至完全停止生長。另一方面，本文將中等脅迫定義為植物所接觸的不引起植物完全停止生長且沒有能力恢復生長的任何脅迫。根據農業(yè)實踐(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)的發(fā)展，在栽培的作物植物中通常不會遇到嚴重脅迫。因而，中等脅迫誘導的受損生長通常是農業(yè)所不希望的特征。中等脅迫是植物所接觸的典型脅迫。這些脅迫可以是植物所接觸的日常生物和/或非生物(環(huán)境)脅迫。典型的非生物或環(huán)境脅迫包括由反常的熱或寒冷/凍結溫度引起的溫度脅迫；鹽脅迫；水脅迫(干旱或過量的水)。非生物脅迫還可以由化學制劑引起。生物脅迫通常是那些由病原體，如細菌、病毒、真菌和昆蟲引起的脅迫。
在任何植物中可以有利地修飾上述生長特性。
本文所用的術語“植物”包括整株植物、植物的祖代和后代以及部分植物，包括種子、枝條、莖、葉、根(包括塊莖)、花，以及組織和器官，其中前述每種包括目的基因/核酸，或在目的基因/核酸中的特異性修飾。術語“植物”還包括植物細胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚胎、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣的，其中前述每種包含目的基因/核酸。
尤其可用于本發(fā)明方法中的植物包括藻類、蕨類植物以及屬于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，包括選自如下物種的飼料或飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、喬木或灌木秋葵屬物種(Abelmoschus spp.)、槭樹屬物種(Acer spp.)、獼猴桃屬物種(Actinidia spp.)、冰草屬物種(Agropyron spp.)、蔥芹屬物種(Allium spp.)、莧屬物種(Amaranthus spp.)、鳳梨(Ananas comosus)、番荔枝屬物種(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、落花生屬物種(Arachis spp.)、木波羅屬物種(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麥(Avenasativa)、陽桃(Averrhoa carambola)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Betavulgaris)、蕓苔屬物種(Brassicaspp.)、Cadaba farinosa、大葉茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒屬物種(Capsicum spp.)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、紅花(Carthamus tinctorius)、山核桃屬物種(Carya spp.)、栗屬物種(Castanea spp.)、苦苣(Cichoriumendivia)、樟屬物種(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘屬物種(Citrus spp.)、椰子屬物種(Cocos spp.)、咖啡屬物種(Coffeaspp.)、Cola spp.、芋(Colocasia esculenta)、榛屬物種(Corylus spp.)、山楂屬物種(Crataegus spp.)、香瓜屬物種(Cucumis spp.)、南瓜屬物種(Cucurbita spp.)、菜薊屬物種(Cynara spp.)、胡蘿卜(Daucuscarota)、山馬蟥屬物種(Desmodium spp.)、龍眼(Dimocarpus longan)、薯蕷屬物種(Dioscorea spp.)、柿樹屬物種(Diospyros spp.)、稗屬物種(Echinochloa spp.)、穇子(Eleusine coracana)、枇杷(Eriobotryajaponica)、紅仔果(Eugenia uniflora)、蕎麥屬物種(Fagopyrum spp.)、山毛櫸屬物種(Fagus spp.)、無花果(Ficus carica)、金桔屬物種(Fortunella spp.)、草莓屬物種(Fragaria spp.)、銀杏(Ginkgo biloba)、大豆屬物種(Glycine spp.)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵屬物種(Helianthus spp.)、木槿屬物種(Hibiscus spp.)、大麥屬物種(Hordeum spp.)、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃屬物種(Juglans spp.)、萵苣(Lactuca sativa)、山黧豆屬物種(Lathyrus spp.)、浮萍屬物種(Lemna spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亞麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脈根屬物種(Lotus spp.)、棱角絲瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆屬物種(Lupinus spp.)、硬皮豆屬物種(Macrotylomaspp.)、西印度櫻桃(Malpighia emarginata)、蘋果屬物種(Malus spp.)、曼密蘋果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯屬物種(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿、草木樨屬物種(Melilotus spp.)、薄荷屬物種(Mentha spp.)、苦瓜屬物種(Momordicaspp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉屬物種(Musa spp.)、煙草屬物種(Nicotianum spp.)、木犀欖屬物種(Olea spp.)、仙人掌屬物種(Opuntiaspp.)、Ornithopus spp.、稻屬物種(Oryza spp.)、稷(Panicummiliaceum)、雞蛋果(Passiflora edulis)、歐防風(Pastinaca sativa)、鱷梨屬物種(Persea spp.)、香芹(Petroselinum crispum)、菜豆屬物種(Phaseolus spp.)、刺葵屬物種(Phoenix spp.)、酸漿屬物種(Physalisspp.)、松屬物種(Pinus spp.)、阿月渾子(Pistacia vera)、豌豆屬物種(Pisum spp.)、早熟禾屬物種(Poa spp.)、楊屬物種(Populus spp.)、牧豆樹屬物種(Prosopis spp.)、李屬物種(Prunus spp.)、番石榴屬物種(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬物種(Quercus spp.)、蘿卜(Raphanus sativus)、波葉大黃(Rheumrhabarbarum)、茶藨子屬物種(Ribes spp.)、懸鉤子屬物種(Rubus spp.)、甘蔗屬物種(Saccharum spp.)、接骨木屬物種(Sambucus spp.)、黑麥(Secale cereale)、Sesamum spp.、茄屬物種(Solanum spp.)、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜屬物種(Spinacia spp.)、蒲桃屬物種(Syzygium spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可樹(Theobromacacao)、車軸草屬物種(Trifolium spp.)、Triticosecale rimpaui、小麥屬物種(Triticum spp.)、越桔屬物種(Vaccinium spp.)、野豌豆屬物種(Viciaspp.)、豇豆屬物種(Vigna spp.)、葡萄屬物種(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zeamays)、北美洲野生稻(Zizania palustris)、棗屬物種(Ziziphus spp.)等。
根據本發(fā)明優(yōu)選的特征，植物是包含大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽或棉花的作物植物。更優(yōu)選的，本發(fā)明的植物是單子葉植物，如甘蔗。最優(yōu)選的是谷類，如稻、玉米、小麥、粟、大麥、燕麥或高粱。
可以通過增加RLK827多肽的水平來增加RLK827蛋白質的活性?？蛇x的，當RLK827的水平沒有變化或者甚至是當RLK827的水平減少時，活性也可以增加。當該多肽的內部性質改變時，例如通過產生突變體或選擇比野生型更有活性的變體，可以發(fā)生這種情況。
本文所定義的術語“RLK827或其同源物”指具有激酶活性并且在其成熟形式中包含非胞質結構域(胞外結構域)、單一的跨膜結構域和推定胞質激酶結構域的類受體激酶(RLK)。非胞質結構域或RLK827包含至少一個但不多于3個富亮氨酸重復序列(LRR)結構域，優(yōu)選存在2個LRR結構域，更優(yōu)選是3個LRR結構域。更優(yōu)選的，非胞質結構域的長度范圍在250和550個氨基酸之間。非胞質結構域優(yōu)選包含氨基酸序列基序LRxFP(E/D)GxRNC(Y/F)(SEQ ID NO33)，其中x可以是任何氨基酸并且至多2個其他氨基酸可以用在表2中列出的保守性替換來置換。優(yōu)選的，在此基序中的第一個x是Y或A，并且第二個x優(yōu)選是V、F、E和A中的一個。
術語“RLK827或其同源物”還指的是具有與SEQ ID NO2所代表的氨基酸具有一定的全序列同一性的多肽，所述全序列同一性按照增加的優(yōu)選順序為至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
術語“RLK827或其同源物”包含RLK827(SEQ ID NO2)、其旁系同源物和直系同源物。使用總體對比算法，如程序GAP(GCG WisconsinPackage，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，用默認參數設置確定全序列同一性。
使用特型數據庫例如SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244；http://smart.embl-heidelberg.de/)或Pfam(Bateman等人，Nucleic AcidsResearch 30(1)276-280(2002)，http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)來鑒定RLK827蛋白質中的多種結構域。
激酶結構域是SEYKc類型(SMART登錄號SM00221，Interpro登錄號IPR004040)，并且可能具有雙特異性Ser/Thr/Tyr激酶活性。在催化結構域的N端，在賴氨酸殘基附近存在富含甘氨酸的一段殘基，其已經被證明參與ATP的結合。在催化結構域的中心部分，存在對于酶的催化活性重要的保守天冬氨酸殘基。
此外，LRR結構域本領域熟知并且在Pfam(登陸PF00560)中被定義為在一些具有多種功能的蛋白質中串連排列的20到29個殘基序列基序，所述的功能如激素受體相互作用、酶抑制、細胞黏著和細胞運輸。近期的研究顯示LRR蛋白質參與早期哺乳動物發(fā)育、神經發(fā)育、細胞極化、基因表達的調節(jié)和程序性細胞死亡信號傳導。這些基序的首要功能似乎是提供用于蛋白質-蛋白質相互作用形成的多樣化結構構架。LRR蛋白質的序列分析表明存在一些不同的LRR亞家族。很明顯來自不同亞家族的重復從不同時存在并且極可能獨立進化。但是，所有主要類的LRR似乎在凹面具有帶有平行β-折疊的彎曲馬蹄型結構，并且在凸面大部分具有螺旋元件。通過重復的不同長度以及共有序列的特征，已經鑒定了至少6個LRR蛋白質家族。對應著β鏈和臨近的環(huán)區(qū)域的LRR的11個殘基節(jié)段(LxxLxLxxN/CxL)通常在LRR蛋白質中是保守的，而重復的剩余部分是很不相同的。除此不同外，每種這些可變部分在兩端均包含2個半轉角并且在中間包含通常由螺旋形成的“線性”區(qū)段(如鏈從頭到尾沿著線性路徑)。凹面和臨近的環(huán)是LRR蛋白質上最常規(guī)的蛋白質相互作用表面。一些LRR蛋白質-配體復合物的3D結構顯示LRR結構域的凹面對于與α-螺旋相互作用而言是理想的，因此支持了更早期的結論，即伸長和彎曲的LRR結構提供了用于實現不同的蛋白質-蛋白質相互作用的卓越構架。分子模型表明通常保守的并且比前面提出的LxxLxLxxN/CxL更短的模式LxxLxL足夠使具有20-到30-殘基重復的蛋白質具有特征性馬蹄型彎曲。LRR827蛋白質的LRR結構域不同于本領域已知的常規(guī)LRR結構域，但是可以通過適當的計算機算法(優(yōu)選是在Pfam數據庫中使用的那些)鑒別出來。
跨膜結構域長約15到30個氨基酸并且通常由形成α-螺旋的疏水殘基組成。它們通常是在疏水性的基礎上預測出來(例如Klein等人，Biochim.Biophys.Acta 815，468，1985；或Sonnhammer等人.，In J.Glasgow，T.Littlejohn，F.Maj or，R.Lathrop，D.Sankoff，和C.Sensen編著，Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systemsfor Molecular Biology，175-182頁，Menlo Park，CA，1998.AAAI出版)。
搜索和鑒定RLK827同源物的方法是本領域技術人員熟悉了解的。此類方法包括使用本領域熟知的用于比對或比較序列的算法，如GAP(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48；443-453(1970))、BESTFIT(使用Smith和Waterman(Advances in Applied Mathematics 2；482-489(1981))的局部同源性算法)、BLAST(Altschul，S.F.，Gish，W，Miller，W.，Myers，E.W.&Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215403-410(1990))、FASTA和TFASTA(W.R.Pearson和D.J.Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444-2448(1988))，比較計算機可讀形式的SEQ ID NO1或2代表的序列和在公共數據庫如MIPS(http://mips.gsf.de/)、GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)或EMBL Nucleotide Sequence Database(http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html)中獲得的序列。進行BLAST分析的軟件通過National Centre for Biotechnology Information(NCBI)公開可用。下面提到的同源物是使用BLAST默認參數(BLOSUM62矩陣，空位開放罰分為11且空位延伸罰分為1)鑒定出的，優(yōu)選使用全長序列用于分析。
落入“RLK827多肽或其同源物”定義中的實例包括擬南芥蛋白質At1g51850、At1g51805、At1g51810、At2g04300、At3g21340、At1g49100。應當注意的是相關的推定類受體激酶的群以串連方式位于擬南芥染色體1上，其包括At1g51800、At1g51805、At1g51810、At1g51820、At1g51830、At1g51840、At1g51850、At1g51860、At1g51870、At1g51880和At1g51890，它們中的至少4個與RLK827高度相關。
應當理解的是術語RLK827多肽或其同源物不限于SEQ ID NO2、SEQ ID NO7、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15或SEQID NO17和SEQ ID NO19所代表的序列，而是任何符合下列標準的多肽都可適用于本發(fā)明的方法(i)具有胞質激酶結構域并且(ii)在用跨膜區(qū)域從激酶結構域分離的蛋白質的推定非胞質部分中具有至少一個，但不多于3個LRR結構域，并且優(yōu)選具有SEQ ID NO33的共有序列，該激酶結構域包含STYKc共有序列和/或(iii)是RLK827的旁系同源物或直系同源物，并且與SEQ ID NO2的序列具有至少25％的序列同一性。優(yōu)選的，激酶結構域是功能性的，意味著RLK827多肽或其同源物具有激酶活性。
為了確定RLK827的激酶活性，一些測定是可用的并且在本領域中是公知的(例如Current Protocols in Molecular Biology，1和2卷，Ausubel等人(1994)，Current Protocols；或者是在線的，例如http://www.protocol-online.org)。簡要的，激酶測定通常包括(1)使激酶蛋白質接觸含有待磷酸化的靶位點的底物多肽；(2)適當的條件下，在適當激酶緩沖液中進行靶位點的磷酸化；(3)在恰當的反應期后將磷酸化的產物從未磷酸化的底物中分離出來。激酶活性的存在或缺乏是通過磷酸化靶標的存在或缺乏來確定的。另外，可以進行定量測量。純化的RLK827蛋白質，或者含有或富含RLK827蛋白質的細胞提取物可以用作激酶蛋白質的來源。備選的，可以使用Zhao等人(Plant Mol.Biol.26，791-803，1994)的方法，其中稻類受體激酶的胞質結構域在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達并測定激酶活性。作為底物，小肽是尤其適合的。肽在磷酸化位點基序中必須含有一個或多個絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基?？梢栽贐iochimicaet Biophysica Acta 1314，191-225，(1996)中找到磷酸化位點的匯編。此外，肽底物可以優(yōu)選具有凈正電荷，以利于結合到磷酸纖維素濾器上(可用于將磷酸化的肽從未磷酸化的肽中分離出來并且檢測磷酸化的肽)。如果不知道磷酸化位點基序，可以使用常規(guī)酪氨酸激酶底物。例如，“Src相關肽”(RRLIEDAEYAARG)是許多受體和非受體酪氨酸激酶的底物。為了確定合成肽磷酸化的動力參數，需要肽濃度的范圍。對于起始反應，可使用0.7-1.5mM的肽濃度。對于每種激酶，重要的是要確定活性的最佳緩沖液、離子強度和pH。標準5×激酶緩沖液通常含有5mg/ml BSA(防止激酶與測定管吸附的牛血清蛋白)、150mM Tris-Cl(pH7.5)、100mM MgCl2。絕大部分酪氨酸激酶需要二價陽離子，盡管一些酪氨酸激酶(例如胰島素-、IGF-1-和PDGF受體激酶)需要MnCl2替代MgCl2(或除了MgCl2外還需要MnCl2)。根據經驗為每種蛋白激酶確定二價陽離子的最佳濃度。常用的磷?；?phophoryl)基團供體是放射性標記的[γ-32P]ATP(通常是0.2mM終濃度)。在肽中摻入的32P可以通過在閃爍計數器中的硝化纖維素干墊上測量活性來確定。
可選的，RLK827多肽或其同源物的活性可以通過在稻植物(尤其是在稻的變種Nipponbare)中，在稻GOS2啟動子調控下表達RLK827多肽或其同源物來測定，這使得植物比對應的野生型植物具有增加的產量。例如，此產量的增加可以作為飽滿種子數、種子總重量和/或收獲指數的增加中的一種或多種來測量。
RLK827多肽或其同源物的編碼核酸可以是任何天然或合成核酸。如本文所定義的RLK827多肽或其同源物是由RLK827核酸分子編碼的。因此本文所定義的術語“RLK827核酸分子”或“RLK827基因”是如上所定義的RLK827多肽或其同源物的任何編碼核酸分子。RLK827核酸分子的實例包括由SEQ ID NO1、SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQ ID NO18、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 31所代表的那些核酸中的任一項。RLK827核酸及其功能性變體可適用于進行本發(fā)明的方法。RLK827核酸的功能性變體包括部分RLK827核酸分子和/或能夠與RLK827核酸分子或與RLK827同源物的編碼核酸分子雜交的核酸。在功能性變體的范圍中，術語“功能性”指的是編碼具有激酶活性，并包含非胞質(胞外)結構域以及通過跨膜結構域將其從非胞質結構域中分開的C端激酶結構域的多肽的變體RLK827核酸分子(即一部分或雜交序列)，該非胞質結構域包含至少1個但不多于3個LRR基序，且優(yōu)選還包含如上所定義的SEQ ID NO33的氨基酸序列基序。
植物中類受體激酶的LRR-I類型具有模塊結構，并且已經表明一個LRR蛋白質能夠結合不同的配體，例如番茄SR160受體及其番茄同源物tBRI1能結合油菜素內酯激素和長距離的信號傳導肽——系統(tǒng)素。油菜素內酯和系統(tǒng)素不競爭結合，這表明它們結合到不同的位點。因此，假設以保留或改變LRR活性的方式改造LRR結構域(例如通過改變LRR結構域的數量，或通過進行結構域堆積(結合相同或不同的配體)，或結構域改組)，這可用于產生進行本發(fā)明方法的變體RLK827核酸分子。以類似的方式，可以改造激酶結構域以增強激酶活性。變體優(yōu)選的類型包括結構域缺失、堆積或改組產生的那些(參見例如He等人.，Science 288，2360-2363，2000，或美國專利5,811,238和6,395,547)。
本文定義的術語部分指的是一段包含至少150個核苷酸的DNA?？梢酝ㄟ^對RLK827核酸制造一個或多個缺失來制備部分。該部分可以以分離的形式使用或者例如，它們可以與其他編碼(或非編碼)序列融合，以產生組合了一些活性(它們中的一種是蛋白激酶活性)的蛋白質。當融合到其他編碼序列時，由翻譯產生的所得多肽要比RLK827部分預測的多肽大。可用于本發(fā)明方法的部分至少包含激酶結構域，優(yōu)選的進一步包含非胞質LRR結構域和位于激酶結構域N端的跨膜結構域，更優(yōu)選的是該部分在非胞質結構域中包含至少1個但不多于3個LRR結構域，最優(yōu)選的，該部分在非胞質結構域包含至少1個但不多于3個LRR結構域，以及如上所定義的SEQ ID NO33的氨基酸序列基序。優(yōu)選的，功能性部分是SEQID NO1、SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQ ID NO18中任一項所代表的核酸的一部分。
本文所定義的術語“雜交”是基本同源的互補核苷酸序列相互退火的過程。雜交過程可以完全發(fā)生在溶液中，即互補核酸都在溶液中。雜交過程還可以如此進行，即其中互補核酸之一固定于基質如磁珠、瓊脂糖珠子或任何其他樹脂上。此外雜交過程可還可以如此進行，即其中互補核酸之一固定于固相支持物如硝化纖維素膜或尼龍膜上，或通過例如照相平版印刷術固定到例如硅酸玻璃支持物上(后者稱之為核酸陣列或微陣列，或稱之為核酸芯片)。為了使得雜交發(fā)生，通常使核酸分子熱變性或化學變性，以使雙鏈解鏈成兩條單鏈和/或從單鏈核酸中除去發(fā)夾或其他二級結構。雜交的嚴格性受諸如溫度、鹽濃度和雜交緩沖液組成等條件的影響。
在諸如Southern雜交和Northern雜交的核酸雜交實驗中，“嚴格雜交條件”和“嚴格雜交洗滌條件”是序列依賴性的，并且隨環(huán)境參數而不同。本領域技術人員認識到在雜交和洗滌中可以改變多種參數，并且所述變化將保持或改變嚴格條件。
Tm是在確定的離子強度和pH下，50％的靶標序列與完全匹配的探針雜交時的溫度。Tm依賴于溶液條件、堿基組成以及探針的長度。例如，較長的序列在較高溫度下特異雜交。雜交的最大速率是在Tm低于大約16℃到32℃下得到的。雜交溶液中一價陽離子的存在降低了兩條核酸鏈之間的靜電排斥，從而促進雜交體的形成；對于高達0.4M的鈉濃度，這個作用是明顯的。甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度，每百分數甲酰胺降低0.6至0.7℃，加入50％的甲酰胺雖然使雜交速率降低，但使雜交在30至45℃進行。堿基對錯配降低了雜交速率和雙鏈體的熱穩(wěn)定性。一般對于大探針，每％堿基錯配使Tm降低大約1℃。取決于雜交體的類型，Tm可以使用下列公式計算·DNA-DNA雜交體(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138267-284，1984)Tm＝81.5℃+16.6×log[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×[Lc]-1-0.61×％甲酰胺·DNA-RNA或RNA-RNA雜交體Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc·寡-DNA或寡-RNAd雜交體對于＜20個核苷酸Tm＝2(ln)對于20-35個核苷酸Tm＝22+1.46(ln)a或對于其他一價陽離子，但是僅僅在0.01-0.4M的范圍精確。
b僅僅對30％至75％范圍的％GC精確。
cL＝雙鏈體中堿基對的長度。
d寡，寡核苷酸；ln，引物的有效長度＝2×(G/C數目)+(A/T數目)。
注解對于每1％甲酰胺，Tm降低大約0.6至0.7℃，而6M尿素的存在降低Tm大約30℃。
雜交的特異性通常是雜交后洗滌的函數。為了除去非特異性雜交產生的背景，用稀釋的鹽溶液洗滌樣品。此類洗滌的關鍵因素包括最終洗滌溶液的離子強度和溫度鹽濃度越低以及洗滌溫度越高，洗滌的嚴格性越高。洗滌條件一般在雜交嚴格性或低于雜交嚴格性下進行。一般而言，用于核酸雜交試驗或基因擴增檢測方法的合適的嚴格條件如上所述。也可以選擇更高或更低的嚴格條件。一般而言，低嚴格條件選擇為比在確定的離子強度和pH下特異性序列的熱解鏈溫度(Tm)低大約50℃。中等嚴格條件是當溫度比Tm低20℃時，而高嚴格條件時當溫度比Tm低10℃時。例如，嚴格條件是那些至少，例如條件A-L的嚴格性；并且簡化的嚴格條件是至少，例如條件M-R的嚴格性。非特異性的結合可以使用一些已知技術中的任一種(例如用含有蛋白質的溶液將膜封閉，添加異源RNA、DNA和SDS到雜交緩沖液中，以及用RNA酶處理)來調控。
雜交和洗滌條件的實例在表1中列出表1
“雜交體長度”是雜交核酸的預期長度。當已知序列的核酸雜交時，可以通過比對序列和鑒別本文所述的保守區(qū)來確定雜交體長度。
在雜交和洗脫緩沖液中可以用SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1×SSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉)；在雜交完成后洗脫15分鐘。雜交和洗脫可以另外地包括5×Denhardt試劑、0.5-1.0％SDS、100μg/ml變性的片段化的鮭精DNA、0.5％焦磷酸鈉和高達50％甲酰胺。
*Tb-Tr對于預期長度少于50個堿基對的雜交體，雜交溫度應該比雜交體的熔解溫度Tm低5-10℃，根據上述公式確定Tm。
±本發(fā)明還包括用PNA或修飾的核酸取代任意一個或多個DNA或RNA雜交體配偶體。
為了定義嚴格性水平的目的，通常參考Sambrook等人(2001)Molecular Cloninga laboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York或Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)。
例如，SEQ ID NO2或其同源物的編碼核酸可以用在雜交實驗中。可選的，其片段可以用作探針。根據鑒別RLK的序列原料庫，可以選擇不同的片段來雜交。例如，當需要有限數量的與RLK827具有高序列同一性的同源物時，可以使用保守性較低的片段用于雜交，如GGTAGACTCGCCAAAGAATTTGAACCACTCGTTGAT(SEQ ID NO1的核苷酸第184至219位)。通過比對SEQ ID NO 2及其同源物，可以設計與雜交探針作用相當的核酸片段。雜交序列優(yōu)選至少包含激酶結構域，優(yōu)選還包含非胞質LRR結構域和位于激酶結構域N端的跨膜結構域，更優(yōu)選此部分在非胞質結構域中包含至少1個但不多于3個LRR結構域，最優(yōu)選此部分在非胞質結構域中包含至少1個但不多于3個LRR結構域以及如上所定義的SEQ ID NO33的氨基酸序列基序。
在雜交和洗滌后，依賴于探針標記的類型，可以通過放射自顯影(當使用放射性探針時)或者通過化學發(fā)光、免疫檢測、通過熒光或顯色檢測來檢測雙鏈體。可選的，可以進行核糖核酸酶保護試驗來檢測RNA:RNA雜交體。
RLK827核酸分子或其變體可以來自任何天然來源或人工來源?？梢詮奈⑸飦碓慈缂毦?、酵母或真菌，或者從植物、藻類或動物(包括人)來源中分離核酸/基因或其變體?？梢酝ㄟ^嚴謹的人工操作，在組成和/或基因組環(huán)境方面從核酸的天然形式對其進行修飾。核酸優(yōu)選是植物來源的，既可以是來自相同的植物物種(例如來自其待引入的植物物種)或來自不同的植物物種。核酸可以分離自雙子葉物種，優(yōu)選分離自十字花科(Brassicaceae)，更優(yōu)選的分離自擬南芥。更優(yōu)選的，分離自擬南芥的RLK827是SEQ ID NO1所代表的，并且RLK827氨基酸序列是SEQ IDNO2所代表的。
可用于本發(fā)明方法中的功能性變體還包括可選的RLK827核酸分子或基因的剪接變體。本文所用的術語“可選擇的剪接變體”涵蓋這樣的核酸序列變體，即其中選定的內含子和/或外顯子已經切除、置換或添加。這樣的變體是其中蛋白質的生物學活性保持未受影響的那些變體，其可以通過選擇性的保留蛋白質的功能片段來獲得。此類剪接變體可以是天然發(fā)現的或可以是人造的。用于產生這種剪接變體的方法是本領域熟知的。優(yōu)選的剪接變體是SEQ ID NO1所代表的核酸的剪接變體。更優(yōu)選的剪接變體是這樣的多肽剪接變體，其編碼保留激酶活性并且在蛋白質的推定非胞質部分中具有至少1個但不多于3個LRR結構域，所述推定非胞質部分被跨膜區(qū)域從激酶結構域分開。更優(yōu)選的剪接變體另外在推定非胞質結構域中還包含SEQ ID NO33的氨基酸序列基序。最優(yōu)選的RLK827核酸分子的剪接變體是編碼如上所定義的RLK827多肽的那些。
可用于本發(fā)明方法中的功能性變體另外包括編碼RLK827多肽或其同源物的核酸的等位變體，優(yōu)選的是SEQ ID NO 1所代表核酸的等位變體。更優(yōu)選的，等位變體所編碼的多肽具有激酶活性，并且在被跨膜區(qū)域從激酶結構域分開的推定非胞質部分中具有至少1個但不多于3個LRR結構域。更優(yōu)選的，等位變體另外在推定非胞質結構域中還包含SEQ ID NO33的氨基酸序列基序。最優(yōu)選的RLK827核酸分子的等位變體是編碼如上所定義的RLK827多肽的那些。等位變體天然存在，并且包括在本發(fā)明方法中的是這些天然等位基因的用途。等位變體包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)以及小的插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多數生物天然存在的多態(tài)性品系中SNP和INDEL形成了最大的一類序列變體。
還可以通過以引入遺傳修飾(優(yōu)選在RLK827基因的基因座中)來增加RLK827多肽或其同源物的表達和/或活性。本文中所定義的基因的基因座意指包括目的基因和編碼區(qū)上游或下游10kb的基因組區(qū)域。
例如，遺傳修飾可以通過以下的任何一種(或多種)方法引入TDNA激活、TILLING、定點誘變、同源重組、定向進化或者通過在植物中引入和表達編碼RLK827多肽或其同源物的核酸。在引入遺傳修飾后，接下來的步驟是選擇RLK827多肽增加的表達和/或活性，這種表達和/或活性的增加使得植物具有改良的生長特性。
T-DNA激活標簽(Hayashi等人.Science 258，1350-1353，1992)涉及在目標基因的基因組區(qū)域或基因編碼區(qū)域上游或下游10KB中插入通常包含啟動子(也可以是翻譯增強子或內含子)的T-DNA，如此構型以便啟動子指引靶基因表達。通常，破壞靶基因天然啟動子對其的表達調控，而使該基因處于新引入的啟動子的控制之下。該啟動子一般嵌入到T-DNA中。例如，T-DNA通過農桿菌屬感染隨機插入到植物基因組中，并導致靠近該插入T-DNA的基因過量表達。由于接近引入的啟動子的基因過量表達，所得的轉基因植物顯示出顯性表型。待引入的啟動子可以是能指導基因在所需的生物體(在本案中為植物)中表達的任何啟動子。例如，組成型、組織偏好的、細胞類型偏好的以及誘導型啟動子都適合用于T-DNA激活。
也可以使用TILLING技術(靶向誘導基因組局部突變技術)，把遺傳修飾引入到RLK827基因的基因座中。這是一種誘變技術，可用于產生和/或鑒定，并最終分離能顯示RLK827活性的RLK827核酸分子的誘變變體。TILLING還能夠選擇攜帶這類突變變體的植物。這些突變變體甚至可表現出比該基因的天然形式所表現出的更高的RLK827活性。TILLNG將高密度誘變與高通量篩選方法結合起來。TILLING一般遵循的步驟是(a)EMS誘變(Redei和Koncz(1992)，InC Koncz，N-H Chua，J Schell編著，Methods in Arabidopsis Research.World Scientific，Singapore，16-82頁；Feldmann等人，(1994)InEM Meyerowitz，CR Somerville編著，Arabidopsis.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，137-172頁；Lightner和Caspar(1998)，InJ Martinez-Zapater，JSalinas編著，Methods on Molecular Biology，82卷，Humana Press，Totowa，NJ，91-104頁)；(b)DNA制備和個體合并；(c)目標區(qū)域的PCR擴增；(d)變性和退火以允許形成異源雙鏈體；(e)DHPLC，其中庫中異源雙鏈體的存在檢測為色譜圖中額外的峰值；(f)鑒定突變個體；和(g)突變PCR產物的測序。TILLING的方法是本領域熟知的(McCallum NatureBiotechnol.18，455-457，2000，Stemple Nature Rev.Genet.5，145-150，2004)。
定點誘變可用于產生保留了活性(即蛋白激酶活性)的RLK827核酸或其部分的變體。一些方法可用來實現定點誘變，最常用方法是基于PCR的方法(見例如Ausubel等人.，Current Protocols in Molecular Biology.Wiley編著，http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.htmD。
定向進化也可以用來產生具有增加的生物學活性的RKS11或RKS4多肽或其直系同源物或其部分的編碼RLK827核酸分子或其部分的變體。定向進化由下列組成DNA改組的重復，隨后適當的篩選和/或選擇(Castle等人，(2004)Science 304(5674)1151-4；美國專利5,811,238和6,395,547)。
T-DNA激活、TILLING、定點誘變和定向進化是能夠產生保留了RLK827功能并因此可用于本發(fā)明方法中的新的RLK827等位基因和變體的技術的實例。
同源重組能夠在基因組的指定選擇位置引入選定的核酸。同源重組是生物學中通常使用的標準技術，用于較低等的生物體如酵母或苔蘚physcomitrella。用于在植物中進行同源重組的方法不僅已在模式植物中描述(Offringa等人(1990)EMBO J.9，3077-3084)，而且在作物植物例如稻中描述(Terada等人，(2002) Nature Biotechnol.20，1030-1034；或Iida和Terada(2004)Curr.Opin.Biotechnol.15，132-138)。例如，待靶向的核酸(其可以是如上文所定義的RLK827核酸分子或其變體)不需要靶向到RLK827基因的基因座中，但是可以被引入到高表達的區(qū)域。待靶向的核酸可以是改良的等位基因，用于替換內源基因，或另外引入到內源基因中。
根據本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，可以通過在植物中引入和表達編碼RLK827多肽或其同源物的核酸來改良植物的生長特性。
引入遺傳修飾(在本案中不需要在RLK827基因的基因座中)的優(yōu)選方法是在植物中引入和表達RLK827多肽或其同源物的編碼核酸。上述RLK827多肽或其同源物具有激酶活性并且包含非胞質(胞外)結構域和通過跨膜結構域將其從非胞質結構域中分離出的C端激酶結構域，所述的非胞質結構域包含至少1個但不多于3個LRR基序，并且優(yōu)選還包含如上所定義的SEQ ID NO33的氨基酸序列基序。優(yōu)選的，RLK827多肽或其同源物與SEQ ID NO2所代表的氨基酸序列具有一定的全序列同一性的多肽，所述全序列同一性按照增加的優(yōu)選順序為至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％96％、97％、98％或99％。
蛋白質的“同源物”涵蓋相對于所討論的未修飾蛋白質具有氨基酸取代、缺失和/或插入，且與其所衍生自的未修飾蛋白質具有相似的生物學活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶。
術語“同源物”涵蓋兩種特殊形式的同源性，即直系同源序列和旁系同源序列，它們涉及用于描述基因遺傳關系的進化概念。
術語“旁系同源”涉及某物種基因組內的基因復制，產生旁系同源基因。RLK827的旁系同源物可以容易地通過對一組序列進行BLAST分析來鑒定，所述序列來自與查詢序列相同的物種。
術語“直系同源”涉及不同生物體中因物種形成所致的同源基因。例如，單子葉植物物種中的直向同源物可以通過實施所謂的交互blast搜索很容易地找到。這可以通過第一次blast完成，其包括在任何序列數據庫如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov中找到的公眾可用的NCBI數據庫中，對所討論的序列(例如，SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)進行blast。如果尋找的是稻的直系同源物，所討論的序列將再次與例如來自NCBI上可用的稻Nipponbare的28,469的全長cDNA克隆進行blast。當起始于核苷酸時可以使用BLASTn或tBLASTX，或者當起始于蛋白質時可以使用BLASTP或TBLASTN，并使用標準缺省值?？梢赃^濾blast結果。之后將過濾結果或未過濾結果的全長序列與所討論的序列所來源生物的序列進行反向blast(第二次blast)。然后對第一次和第二次blast的結果進行比較。當第二次blast的結果與RLK827核酸或RLK827多肽具有最高相似性時，就找到了直系同源物，例如，如果生物之一是擬南芥，那么就找到了旁系同源物。在大家族的情況下，使用ClustalW，接著使用相鄰連接樹以幫助觀察聚類(clustering)。使用交互BLAST方法，鑒別出由EST CB631540，CB628137.1和CB31541.1所代表的稻的直系同源物(單一基因登錄號Os.26918)。優(yōu)選的直系同源物是在交互BLAST搜索中與RLK827或其旁系同源物具有最高相似性的那些。稻的同源物的其他實例在SEQ ID NO24、26、28、30和32中給出。
同源物可以是蛋白質“取代變體”的形式，即其中氨基酸序列中的至少一個殘基已經被除去，并且不同的殘基插入到它的位置上。氨基酸取代一般是單殘基的，但是取決于對多肽構成的功能限制可以是成串的；插入片段通常是大約1到10個氨基酸殘基。優(yōu)選的，氨基酸取代包括保守性氨基酸取代(表2)。為了產生此類同源物，蛋白質的氨基酸可以被其他具有相似性質(如類似的疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞α-螺旋結構或β-折疊結構的傾向)的氨基酸所置換。保守性取代表是本領域所熟知的(見例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。
表2保守性氨基酸取代的實例
在上述氨基酸性質不是很關鍵的情況下，可以產生保守性較低的取代。
同源物還可以是蛋白質的“插入變體”的形式，即將其中一個或多個氨基酸殘基引入到蛋白質中的預定位點。插入可包括氨基端和/或羧基端的融合，以及單個或多個氨基酸的序列內插入。通常，氨基酸序列內的插入將小于氨基端或羧基端的融合，約為1到10個殘基的數量。氨基端或羧基端融合蛋白質或肽的實例包括如用于酵母雙雜交系統(tǒng)的轉錄激活因子的結合結構域或激活結構域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)6-標簽、谷胱甘肽S-轉移酶-標簽、A蛋白、麥芽糖結合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG表位、lacZ、CMP(鈣調蛋白結合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。
蛋白質“缺失變體”形式的同源物的特征在于從該蛋白質除去一個或多個氨基酸。
使用本領域熟知的肽合成技術，如固相肽合成等等，或通過重組DNA操作，可以很容易的制備蛋白質的氨基酸變體。對DNA序列進行操作以產生蛋白質的取代、插入或缺失變體的方法是本領域熟知的。例如，在DNA的預定位點產生突變的技術是本領域技術人員熟知的，包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH)、快速變換的定點誘變(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介導的定點誘變或其他定點誘變方案。
RLK827多肽或其同源物可以是衍生物。“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶，與蛋白質天然存在形式的氨基酸序列相比，例如，如SEQID NO2所示的，其可以包括天然和非天然存在氨基酸殘基的取代、缺失或添加。蛋白質的“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶，與多肽天然存在形式的氨基酸序列相比，其可以包括天然存在的改變的、糖基化的、?；陌被釟埢蚍翘烊淮嬖诘陌被釟埢?。與其所衍生自的氨基酸序列相比，衍生物還可包括一個或多個非氨基酸取代基，例如與氨基酸序列共價或非共價結合的報道分子或其他配體，如結合以便于其檢測的報道分子，以及相對于天然存在蛋白質的氨基酸序列而言非天然存在的氨基酸殘基。
根據本發(fā)明優(yōu)選的方面，希望增強或增加RLK827核酸分子或其變體的表達。得到基因或基因產物表達增強或增加的方法在本領域中詳細記載并且包括例如用適當的啟動子驅動的過量表達、轉錄增強子或翻譯增強子的使用。可以將作用為啟動子或增強子元件的分離的核酸引入至多核苷酸非異源形式的適當位置上(一般為上游)，從而上調RLK827核酸或其變體的表達。例如，可以通過突變、缺失和/或取代來體內改變內源啟動子(參見Kmiec，美國專利5,565,350號；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或者可以將分離的啟動子以適當的方向和與本發(fā)明基因的距離引入植物細胞中，從而調控基因的表達。
如果希望多肽表達，通常需要在多核苷酸編碼區(qū)的3’-端包含聚腺苷酸化作用區(qū)域。聚腺苷酸化作用區(qū)域可以來自天然基因、來自多種其他植物基因或來自T-DNA。待添加的3’端序列可以來自例如胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因，或可選的來自其他植物基因，或較小優(yōu)選的來自其他真核基因。
還可以將內含子序列添加到5’非翻譯區(qū)或部分編碼序列的編碼序列以增加在細胞溶膠中聚集的成熟信息的量。已經表明在植物和動物表達構建體中的轉錄單位中包含可剪接的內含子能在mRNA和蛋白質水平上使基因表達增加達1000倍(Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8，4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1，1183-1200(1987))。當將內含子置于轉錄單位的5’端附近時，基因表達的此類內含子增強通常是最大的。本領域已知玉米內含子Adh1-S內含子1、2和6，Bronze-1內含子的用途?？傮w上參見The Maize Handbook，116章，Freeling和Walbot編著，Springer，N.Y.(1994)。
本發(fā)明還提供了遺傳構建體和載體，以便于引入和/或表達可用于本發(fā)明方法中的核苷酸序列。
因此，本發(fā)明提供了基因構建體，其包含(i)RLK827核酸分子或其功能性變體(ii)能驅動(i)中核酸序列表達的一個或多個調控序列；及可選的(iii)轉錄終止序列。
可用于本發(fā)明方法的構建體可以使用本領域技術人員熟知的重組DNA技術構建?；驑嫿w可插入到載體中，該載體可以是商購的，適于轉化到植物中并適于在轉化的細胞中表達目的基因。
植物使用包含目的序列(即RLK827核酸或其功能性變體)的載體轉化。目的序列與一個或多個調控序列(至少與啟動子)有效連接。術語“調節(jié)元件”、“調控序列”和“啟動子”在文中都可以互換使用，且應當取其廣義，是指能影響與它們連接的序列表達的調節(jié)核酸序列。上述術語包括來源于經典真核生物基因組基因的轉錄調節(jié)序列(包括精確轉錄起始所需的TATA框，帶或不帶CCAAT框序列)以及根據發(fā)育和/或外界刺激，或以組織特異性方式改變基因表達的另外的調節(jié)元件(即上游激活序列、增強子和沉默子)。該術語還包括經典原核基因的轉錄調節(jié)序列，在這種情況下它可以包括-35框序列和/或-10框轉錄調節(jié)序列。術語“調節(jié)元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其使得核酸分子能夠在細胞、組織或器官中表達，激活或增強這種表達。本文所用的術語“有效連接”指啟動子序列與目的基因之間的功能性連接，使得啟動子序列能起始目的基因的轉錄。
有利地，可以使用任何類型的啟動子來驅動核酸序列的表達。啟動子可以是誘導型啟動子，即對發(fā)育、化學、環(huán)境或物理刺激應答而具有誘導的或增加的轉錄起始。作為脅迫誘導型啟動子(即當植物接觸多種脅迫條件時激活的啟動子)的誘導型啟動子的實例是水脅迫誘導型啟動子WS118。另外的或可選的，啟動子可以是組織特異性啟動子，即能夠在特定組織如葉、根、種子組織等中優(yōu)選起始轉錄的這種。種子特異性啟動子的實例是稻油質蛋白18kDa啟動子(Wu等人(1998)J Biochem 123(3)386-91)。
優(yōu)選的，RLK827核酸或其功能性變體與組成型啟動子有效連接。組成型啟動子在其生長和發(fā)育的絕大部分(但不必是所有)階段有轉錄活性并且基本上在各處都表達。優(yōu)選的，組成型啟動子是GOS2啟動子(來自稻)(在SEQ ID NO3中第1到2193位核苷酸)。要明確的是本發(fā)明的適用性不限于SEQ ID NO1所代表的RLK827核酸，本發(fā)明的適用性也不限于由GOS2啟動子所驅動的RLK827核酸的表達。其他也可用來驅動RLK827核酸表達的組成型啟動子在下表3中顯示。
表3組成型啟動子的實例
任選的，一個或多個終止子序列也可引入植物的構建體中。術語“終止子”包括調控序列，其位于轉錄單位末端的DNA序列，標志初級轉錄本的3′加工和聚腺苷酸化以及轉錄的終止。其他調節(jié)元件可以包括轉錄增強子以及翻譯增強子。本領域技術人員知曉適合用于實施本發(fā)明的終止子和增強子序列。此類序列是已知的，或本領域技術人員可以很容易的獲得。
在SEQ ID NO3中給出了包括有效連接至GOS2啟動子的RLK827核酸并且進一步包含終止子序列的表達盒實例。
本發(fā)明的遺傳構建體還可以包括在特定細胞類型中維持和/或復制所需要的復制起點序列。一個實例是需要遺傳構建體在細菌細胞中作為附加型基因元件(如質?；蝠ち?維持的情況。優(yōu)選的復制起點包括但不局限于fl-ori和colE1。
遺傳構建體任選地可包含選擇標記基因。如本文所用，術語“選擇性標記基因”包括賦予表達該基因細胞表型，以便于鑒定和/或選擇用本發(fā)明的核酸構建體轉染或轉化的細胞的任何基因。合適的標記可選自賦予抗生素或除草劑抗性的標記，其引入新的新陳代謝性狀或允許可視選擇。選擇標記基因的實例包括能賦予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt)、賦予除草劑抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox)的基因，或提供陳代謝性狀的基因(如允許植物利用甘露糖作為唯一碳源的manA)?？梢晿擞浕驅е骂伾男纬?例如β-葡糖苷酸酶，GUS)、發(fā)光(如熒光素酶)或熒光(綠色熒光蛋白GFP及其衍生物)。
本發(fā)明還包括通過本發(fā)明方法獲得的植物。本發(fā)明因此提供了可通過本發(fā)明方法獲得的植物，該植物在其中引入了RLK827核酸或其功能性變體，或者該植物在其中引入了遺傳修飾，優(yōu)選在RLK827的基因座中。
本發(fā)明還提供了產生具有改良生長特性的轉基因植物的方法，其包括在植物中引入和表達RLK827核酸或其功能性變體。
更具體的，本發(fā)明提供了產生具有改良的生長特性的轉基因植物的方法，該方法包括(i)向植物或植物細胞中引入RLK827核酸或其功能性變體；并且(ii)在促進植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細胞。
核酸可以直接引入到植物細胞或植物本身中(包括引入到植物的組織、器官或任何其他部分)。根據本發(fā)明優(yōu)選的特征，核酸優(yōu)選通過轉化引入植物中。
本文所涉及的術語“轉化”包括把外源多核苷酸向宿主細胞中的轉移，而不管轉移所用的方法如何。無論是通過器官發(fā)生還是胚胎發(fā)生能夠隨后克隆繁殖的植物組織，可以用本發(fā)明的遺傳構建體轉化，并從其再生出整株植物。選擇的特定組織將根據可用且最適于轉化的特定物種的克隆繁殖系統(tǒng)而不同。例示性的靶標組織包括葉圓盤、花粉、胚胎、子葉、下胚軸、雌配子體、胼胝體組織、已存在的分生組織(例如，頂端分生組織，腋芽和根分生組織)以及誘導的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可以瞬時或穩(wěn)定的被引入到宿主細胞中，并可保持非整合狀態(tài)，例如，作為質粒?？蛇x擇的，它可以整合到宿主基因組中。以本領域技術人員所知的方法，所得的轉化植物細胞然后可用來再生轉化植物。
植物物種的轉化目前是一種相當常規(guī)的技術。有利的，任何轉化方法都可用于將目的基因引入到合適的祖代細胞中。轉化方法包括使用脂質體、電穿孔、能增加游離DNA攝入的化學品、直接注射DNA到植物中、基因槍顆粒轟擊、使用病毒或花粉進行轉化以及顯微注射。方法可選自用于原生質體的鈣/聚乙二醇方法(Krens等人，(1982)Nature 296，72-74；Negrutiu等人(1987)Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生質體的電穿孔(Shillito等人，(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；顯微注射到植物材料中(Crossway等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202，179-185)；DNA或RNA包被顆粒轟擊(Klein等人，(1987)Nature 327，70)；用(非整合型)病毒感染等等。優(yōu)選使用任何用于稻轉化的已知方法，其通過農桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化產生表達RLK827基因的轉基因稻植物，所述的方法例如在任何以下文獻中描述的方法公開的歐洲專利申請EP1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人(Plant J.6，271-282，1994)，其公開的內容以其全文在此引用作為參考。在谷類轉化情形下，優(yōu)選的方法如Ishida等人(NatureBiotechnol.14，745-50，1996)或Frame等人(Plant Physiol.129，13-22，2002)所述，其公開的內容以其全文在此引用作為參考。
通常在轉化以后，選擇存在有與目的基因共轉移的植物可表達基因所編碼的一個或多個標記的植物細胞或細胞群，接著將轉化的材料再生成整株植物。
DNA轉移和再生之后，可評價推定轉化植物中目的基因的存在、拷貝數和/或基因組結構，例如使用Southern分析。可選的或另外的，新引入DNA的表達水平可使用Northern和/或Western分析進行監(jiān)控，兩種技術都是本領域普通技術人員所熟知的。因此將轉化的植物細胞培養(yǎng)為成熟植物包括步驟選擇和/或再生和/或生長至成熟。
產生的轉化植物可通過多種方法進行繁殖，如通過無性繁殖或經典育種技術。例如，第一代(或T1)轉化植物可以自花授精以產生純合的第二代(或T2)轉化體，并且T2植物可進一步通過經典的育種技術進行繁殖。
產生的轉化生物可以是多種形式的。例如，它們可以是轉化細胞與非轉化細胞的嵌合體；克隆轉化體(例如，所有的細胞都被轉化以含有表達盒)；轉化與未轉化組織的嫁接體(例如，在植物中，轉化的根莖被嫁接到未轉化的接穗中)。
本發(fā)明顯然延及由文中描述的任何方法產生的任何植物細胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖體。本發(fā)明還延及囊括由任何上述方法產生的原代轉化或轉染細胞、組織、器官或整株植物的后代，唯一的要求是該后代表現出與由本發(fā)明方法在親代中產生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。本發(fā)明還包括含有分離的RLK827核酸或其功能性變體的宿主細胞。根據本發(fā)明優(yōu)選的宿主細胞是植物細胞。本發(fā)明還延及本發(fā)明植物的可收獲部分，例如但不限于種子、葉、果實、花、莖、根莖、塊莖和鱗莖。本發(fā)明另外涉及直接來自此類植物的可收獲部分的產物，如干的顆?；蚍?、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白質。
本發(fā)明還包括RLK827核酸或其功能性變體的用途，以及RLK827多肽或其同源物的用途。
一種此類用途涉及改良植物的生長特性。優(yōu)選的用途涉及改良植物的產量，更優(yōu)選的用途涉及增加種子產量。種子產量可以包括下列一種或多種增加的(飽滿)種子數、增加的種子重量、增加的收獲指數等。
RLK827核酸或其功能性變體，或RLK827多肽或其同源物可以用在育種方案中，其中鑒定了與RLK827基因或其變體遺傳連鎖的DNA標記。RLK827或其變體，或RLK827或其同源物可以用來定義分子標記。之后可以將此DNA或蛋白質標記用在育種方案中以選擇具有改變的生長特性的植物。RLK827基因或其變體可以是例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29和SEQ ID NO31中任一項所代表的核酸。
還發(fā)現RLK827的等位變體在標記輔助的育種方案中的用途。此類育種方案有時需要通過植物的誘變處理引入等位變異，例如使用EMS誘變；可選的，該方案可以開始于收集無意引起的“天然”來源的等位變體。之后通過例如PCR進行等位變體的鑒定。接著是選擇步驟，用于選擇所討論序列的優(yōu)良等位變體，其在植物中產生改良的生長特性。通常通過監(jiān)控含有所討論序列的不同等位變體的植物的生長特性來進行選擇，所述的所討論序列的等位變體如SEQ ID NO1、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQID NO18、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29和SEQ ID NO31中任一項的不同等位變體。監(jiān)控生長特性可以在溫室或野外進行。此外可選的步驟包括使已鑒定優(yōu)良等位變體的植物與另一種植物雜交。例如，這可用于產生目標表型特征的組合。
RLK827核酸或其變體還可用作探針，以對基因進行遺傳和物理作圖，這些基因是與之連鎖的性狀的一部分和標志。此類信息可用于植物育種，以開發(fā)具有所需表型的品系。RLK827核酸或其變體的此類用途僅需要長度至少為15個核苷酸的核酸序列。RLK827核酸或其變體可用作限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標記。限制性消化的植物基因組DNA的Southern印跡可使用RLK827核酸或其變體進行探測。然后可以使用計算機程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1174-181)對所得的帶型進行遺傳分析，以構建遺傳圖譜。此外，該核酸可用于探測Southern印跡，該Southern印跡含有代表親本和確定的遺傳雜交后代的一組個體的限制酶處理的基因組DNA。記錄DNA多態(tài)性的分離，并用來計算RLK827核酸或其變體在之前使用該群體獲得的遺傳圖譜中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32314-331)。
在遺傳作圖中植物基因來源的探針的制備和用途在Bematzky和Tanksley(Plant Mol.Biol.Reporter 4，37-41，1986)中描述。眾多出版物描述了使用上述方法或其變通形式對特定的cDNA克隆進行遺傳作圖。例如，F2雜交群體、回交群體、隨機交配群體、近親同基因系及其他的個體組可用于作圖。這類方法是本領域技術人員熟知的。
核酸探針也可用于物理作圖(即，將序列置于物理圖上；參見Hoheisel等人，在Non-mammalian Genomic AnalysisA Practical Guide，Academicpress 1996，第319-346頁，以及其中引用的參考文獻)。
在另一個實施方案中，核酸探針可用于直接熒光原位雜交(FISH)作圖(Trask(1991)Trends Genet.7149-154)。雖然現在的FISH作圖方法偏向于使用大的克隆(幾個到幾百KB；參見Laan等人(1995)Genome Res.513-20)，但是靈敏度的提高允許使用較短的探針進行FISH作圖。
基于核酸擴增的多種遺傳和物理作圖方法可以使用所述核酸進行。實例包括等位基因特異性擴增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 1195-96)、PCR擴增片段的多態(tài)性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16，325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等人(1988)Science 2411077-1080)、核苷酸延伸反應(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.183671)、放射雜交作圖(Walter等人(1997)Nat.Genet.722-28)和Happy作圖(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.176795-6807)。為實施這些方法，使用核酸序列設計和制備引物對，以用于擴增反應或引物延伸反應。此類引物的設計是本領域技術人員所熟知的。在采用基于PCR的遺傳作圖方法中，有必要鑒定跨越了對應于此核酸序列區(qū)域作圖的親代之間的DNA序列差異。但是，這對作圖方法通常不是必要的。
以此方式可以實施產生、鑒定和/或分離具有改變的RLK827表達和/或活性，表現出改良的生長特性的修飾植物。
RLK827核酸或其功能性變體，或RLK827多肽或其同源物還可以用作生長調節(jié)劑。由于已經表明這些分子可用于改良植物的生長特性，它們也是有用的生長調節(jié)劑，如除草劑或生長刺激物。本發(fā)明因此提供了一種用作生長調節(jié)劑的組合物，其包含RLK827核酸或其功能性變體，或RLK827多肽或其同源物以及合適的載體、稀釋劑或賦形劑。
根據本發(fā)明的方法產生如上所述的具有改良生長特性的植物。這些改良的生長特性也可與其他經濟學上有利的性狀組合，如進一步增產性狀、對各種脅迫的耐受性、修飾各種結構特征和/或生化和/或生理學特征的性狀。


本發(fā)明現在將參考以下附圖進行描述，其中圖1給出了植物類受體激酶結構的全圖(改編自Shiu & Bleecker，2001)。箭頭指示了RLK827的結構以及RLK827所屬的亞家族。
圖2顯示了SEQ ID NO2結構的示意圖。三角形指示了具有ATP-結合位點標記的序列。
圖3顯示了二元載體p031，其用于在稻中轉化和表達受到稻GOS2啟動子(內參PRO0129)調控的擬南芥RLK827(內參CDS0827)。
圖4詳細說明了用于實施本發(fā)明方法的序列的實例?！癆t”號指的是MIP登錄號(http://mips.gsf.de/)；其他標識符指的是基因文庫登錄號。
實施例本發(fā)明現在將參考以下實施例進行描述，其僅僅是為了例證說明。
DNA操作除非另外說明，否則重組DNA技術按照(Sambrook(2001)Molecular Cloninga laboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等人(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols的卷1和2(http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)中描述的標準方案進行。用于植物分子工作的標準材料和方法描述于R.D.D Croy的Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
實施例1基因克隆使用擬南芥幼苗cDNA文庫(Invitrogen，Paisley，UK)作為模板，PCR擴增擬南芥AtRLK827(內部編碼CDS0827)。對從幼苗提取的RNA進行反轉錄以后，把cDNA克隆到pCMV Sport 6.0中。文庫的平均插入大小為1.5kb，并且克隆的原始數為1.59×107cfu。原始滴度確定為9.6×105cfu/ml，并且在第一輪擴增以后變成6×1011cfu/ml。質粒提取以后，將200ng的模板用于50μl PCR混合物。用于PCR擴增的引物prm00405(SEQ IDNO4，正義)和prm00406(SEQ ID NO5，反向互補)包含用于Gateway重組的AttB位點。使用Hifi Tag DNA聚合酶，在標準條件下進行PCR。同樣使用標準方法擴增和純化2750bp的PCR片段。然后進行Gateway方法的第一步，即BP反應，在此期間，PCR片段與pDONR201質粒體內重組以產生“進入克隆”(entry clone)”p3080(根據Gateway術語)。質粒pDONR201作為Gatewaytechnology的一部分購自Invitrogen。
實施例2載體構建和稻的轉化繼之在LR反應中使用進入克隆p3080和用于稻轉化的指定載體。該載體包含位于T-DNA邊界內的以下部分作為功能性元件植物選擇性標記；可視標記表達盒；旨在與已克隆到進入克隆中的目的序列進行LR體內重組的Gateway盒。用于組成型表達的稻GOS2啟動子位于該Gateway盒的上游。
LR重組步驟之后，將得到的表達載體p031(圖3)轉化到農桿菌屬菌株LBA4404中，并且隨后轉化到稻植物中。使轉化的稻植物生長，并且然后檢驗實施例3中所述的參數。
實施例3轉化體的評估生長測量產生了大約15到20個獨立的T0轉化體。將初級轉化體從組織培養(yǎng)箱轉移到溫室中生長，并收獲T1種子。5個事件得以保留，其中T1后代發(fā)生3∶1的轉基因存在/缺乏分離。對于這些事件中的每一個，通過可視標記選擇，選擇了10個包含轉基因的T1幼苗(雜合子和純合子)，以及10個缺乏轉基因的T1幼苗(失效合子)。將選擇的T1植物轉移到溫室中。每個植物具有一個唯一的條形標簽以將表型數據與對應植物明確聯(lián)系起來。所選擇的T1植物在10cm直徑花盆的土壤中并在下列環(huán)境狀態(tài)下生長光周期＝11.5小時、目光強度＝30,000勒克斯或更多、日間溫度＝28℃或更高、夜間溫度＝22℃、相對濕度＝60-70％。轉基因植物和相應的失效合子在隨機位置上并排生長。從播種期到成熟期，植物幾次通過數字成像箱。在每個時間點上對每株植物從至少6個不同的角度取得數字圖像(2048×1536像素，1千6百萬色)。
收獲成熟的初級圓錐花序、裝袋并貼上條碼標簽，然后在37℃烤箱中干燥三天。隨后將圓錐花序脫粒并且收集所有的種子。使用鼓風裝置將飽滿外殼和空外殼分開。在分離后，使用可商購的計數儀器對兩批種子進行計數。棄去空外殼。在分析天平上稱重飽滿的外殼并且使用數字成像測量種子的截面積。此方法得到一組下面描述的種子相關參數。
這些參數是使用圖像分析軟件，以自動方式從數字圖像中得到并且進行統(tǒng)計分析的。將對不平衡設計進行修正的雙因素ANOVA(方差分析)用作統(tǒng)計模型，用于植物表型特征的全面評估。對用本發(fā)明基因轉化的所有植株的所有事件的所有測量參數進行F測驗。進行F檢驗以檢查基因對所有轉化事件的效應，并檢驗基因的總效應，亦稱之為整體基因效應。如果F檢驗的值顯示數據具有顯著性，那么結論是有“基因”效應，這意味著基因的存在或定位引起了效應。真實整體基因效應的顯著性閾值設置為F測驗的5％概率水平。
為了檢查基因在事件中的效應，即品系特異性效應，在每一事件中使用來自轉基因植物和相應無效植物的數據集進行t檢驗?！盁o效植物”或“無效分離子”或“無效合子”是以與轉基因植物相同的方式處理的，但是轉基因已經從中分離的植物。也可以將無效植物描述為純合的陰性轉化植物。將t檢驗顯著性的閾值設定為10％概率水平。一些事件的結果可以高于此閾值或低于此閾值。這是基于這種假設，即基因可以僅在基因組中的某些位置中具有效應，并且此位置依賴性效應的發(fā)生不是罕見的。本文中此類基因效應也稱為“基因的線性效應(line effect of the gene)”。通過比較t值和t分布得到p值，或者通過比較F值和F分布得到p值。p值給出了零假設(即沒有轉基因的作用)為正確的概率。
將在第一個實驗中得到的數據在使用T2植物的第二個實驗中來證實。選擇了具有正確表達模式的3個品系用于進一步分析。通過監(jiān)控標記基因表達來篩選T1中的來自陽性植物(雜合子和純合子)的一批種子。對于每一個所選事件，隨后保存幾批雜合種子用于T2評估。在每批種子中，在溫室中種植等量的陽性和陰性植物用于評估。
在T2代中評估了總數為120的RLK827轉化植物，即每個事件有40個植物，其中有20個轉基因陽性以及20個陰性。
由于進行了具有重疊事件的兩個實驗，進行組合分析。這可用于檢查兩個實驗中效應的一致性，并且如果在這種情形下，其可用于從兩個實驗中收集證據從而增加結論的可信性。使用的方法是考慮到數據的多級結構(即實驗-事件-分離子)的混合模型方法。通過對比卡方分布的似然比測定得到p值。
實施例4轉化體的評估種子相關參數的測量當對上述種子進行分析時，發(fā)明人發(fā)現用RLK827基因構建體轉化的植物比缺乏RLK827轉基因的植物具有更高的飽滿種子數、更高的種子總重量和增加的收獲指數。在T1代中得到的植物陽性結果在T2代中再次得到。作為實例，給出了品系OS2的數據(表4)。
表4

飽滿種子數通過計數分離步驟之后保留的飽滿外殼的數目確定飽滿的種子數。品系OS2的T1代在飽滿種子數上顯示出41％的顯著性增加。此增加在T2代中也觀察到(+54％)。T1和T2數據的組合分析證明對飽滿種子數的效應是高顯著性的(p值為0.0079)。
種子總產量通過對從植物中收獲的全部飽滿外殼進行稱重，來測量每株植物的種子總產量(種子總重量)。不僅飽滿種子的數量增加了，而且種子總重量也增加了。在第一代中，增加為43％，該增加是統(tǒng)計學顯著的。此增加在T2代中得到了證實，并且組合分析顯示種子產量的增加是顯著性的(p值為0.0065)。
收獲指數品系OS2還具有增加的收獲指數。在本發(fā)明中將收獲指數定義為種子總產量和地上面積(mm2)之間的比值，再乘以因子106。在T1和T2中，都觀察到了收獲指數的正效應(分別增加了48％和57％，p值分別為0.0007和0.0527)。在此相同，T1和T2數據的組合分析表明了顯著性效應(p值為0.0003)。
序 列 表<110>克羅普迪塞恩股份有限公司<120>具有改良生長特性的植物及其制備方法<130>CD-117-prio<150>EP04103393.7<151>2004-07-15<150>US60/589，235<151>2004-07-20<160>33<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>2655<212>DNA<213>擬南芥(Arabidospis thaliana)<400>1atggagagac attttgtgtt tattgccacc tatttgctga tatttcatct tgttcaagct 60caaaatcaaa caggattcat tagtgtggat tgtggtttat cccttcttga gtctccttac120gatgcaccac aaacgagttt aacatataca tcagatgccg atttagtagc tagtggcaaa180accggtagac tcgccaaaga atttgaacca ctcgttgata agccgacttt gacactgaga240tactttccag agggagtacg aaactgctac aatctaaatg tcaccagcga caccaactat300ttaatcaagg ccacatttgt atatgggaat tacgatggtc ttaatgttgg gccaaacttc360aacctttatc tcggtccgaa tttgtggaca acggtgagta gcaatgacac tatagaggaa420ataatccttg tgaccagatc caactcttta caggtgtgtc ttgttaagac gggaataagt480atacctttta taaatatgtt ggagctacga ccgatgaaga aaaatatgta cgttactcaa540agcggttcac tgaagtattt attcagaggg tatattagca attcaagtac tcgtataagg600ttcccggatg atgtctatga ccgtaaatgg tacccgctct tcgacgactc atggacacaa660gtaactacaa atctcaaagt gaacacaagt attacttatg aactaccaca aagtgtaatg720gcaaaagccg caacgccaat taaggctaac gacaccttga acattacatg gacggtagag780ccccctacta cacagtttta ctcttacgta cacattgcag agattcaggc tctaagggca840aacgagacaa gggagttcaa tgtgacactg aatggagaat atacttttgg accttttagt900cctataccgc taaaaaccgc atccatagtc gacttaagcc cagggcaatg cgatggaggg960agatgcattt tgcaggttgt gaagacgctg aaatctacgc ttcctccttt acttaatgct 1020atcgaagctt tcaccgtgat tgatttcccg caaatggaga caaatgaaaa tgatgttgct 1080gggatcaaga atgttcaagg tacttatgga ttgagtagaa ttagttggca aggagatcca 1140tgtgtcccca aacagttatt gtgggatggt ctaaactgca aaaactcgga tatttctacg 1200ccaccgataa tcacttcctt agacttatct tcaagtggat taactgggat catcacgcaa 1260gccattaaga atcttactca cctgcaaata ttggacttgt cagataataa tttgactgga 1320gaagtacctg agtttttagc tgacataaaa tcactcttgg tcataaactt aagtggtaat 1380aatctaagtg gctcagttcc tccctcactt cttcagaaga aaggaatgaa gttaaatgtc 1440gaaggcaatc ctcatattct ttgcacaacg ggttcttgtg tcaagaaaaa agaggatgga 1500cataagaaaa agagtgtcat agtgccagtt gttgcatcaa ttgcttcaat agctgttctt 1560ataggtgcat tggttctgtt tctaattctt agaaagaaaa ggtcaccaaa agttgaaggg 1620ccaccaccat cttatatgca agcatcagat ggtagattgc ctagatcatc tgaaccggca 1680atcgtaacga aaaatagaag gttttcttat tcacaagttg tgataatgac aaataacttc 1740caaagaatcc ttgggaaagg agggtttgga atggtttatc atggtttcgt gaacggtaca 1800gagcaagtag ctgttaagat actctcccat tcatcgtctc aaggatataa acaattcaaa 1860gctgaggtag aacttcttct tagagttcat cacaagaact tggttggtct tgttgggtac 1920
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Lys Trp Tyr Pro Leu Phe Asp Asp Ser Trp Thr Gln Val Thr Thr Asn210 215 220Leu Lys Val Asn Thr Ser Ile Thr Tyr Glu Leu Pro Gln Ser Val Met225 230 235 240Ala Lys Ala Ala Thr Pro Ile Lys Ala Asn Asp Thr Leu Asn Ile Thr245 250 255Trp Thr Val Glu Pro Pro Thr Thr Gln Phe Tyr Ser Tyr Val His Ile260 265 270Ala Glu Ile Gln Ala Leu Arg Ala Asn Glu Thr Arg Glu Phe Asn Val275 280 285Thr Leu Asn Gly Glu Tyr Thr phe Gly Pro Phe Ser Pro Ile Pro Leu290 295 300Lys Thr Ala Ser Ile Val Asp Leu Ser Pro Gly Gln Cys Asp Gly Gly305 310 315 320Arg Cys Ile Leu Gln Val Val Lys Thr Leu Lys Ser Thr Leu Pro Pro325 330 335Leu Leu Asn Ala Ile Glu Ala Phe Thr Val Ile Asp Phe Pro Gln Met340 345 350Glu Thr Asn Glu Asn Asp Val Ala Gly Ile Lys Asn Val Gln Gly Thr355 360 365Tyr Gly Leu Ser Arg Ile Ser Trp Gln Gly Asp Pro Cys Val Pro Lys370 375 380Gln Leu Leu Trp Asp Gly Leu Asn Cys Lys Asn Ser Asp Ile Ser Thr385 390 395 400Pro Pro Ile Ile Thr Ser Leu Asp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Thr Gly405 410 415Ile Ile Thr Gln Ala Ile Lys Asn Leu Thr His Leu Gln Ile Leu Asp420 425 430Leu Ser Asp Asn Asn Leu Thr Gly Glu Val Pro Glu Phe Leu Ala Asp435 440 445Ile Lys Ser Leu Leu Val Ile Asn Leu Ser Gly Asn Asn Leu Ser Gly450 455 460Ser Val Pro Pro Ser Leu Leu Gln Lys Lys Gly Met Lys Leu Asn Val465 470 475 480Glu Gly Asn Pro His Ile Leu Cys Thr Thr Gly Ser Cys Val Lys Lys485 490 495Lys Glu Asp Gly His Lys Lys Lys Ser Val Ile Val Pro Val Val Ala500 505 510Ser Ile Ala Ser Ile Ala Val Leu Ile Gly Ala Leu Val Leu Phe Leu
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<223>表達盒<400>3aatccgaaaa gtttctgcac cgttttcacc ccctaactaa caatataggg aacgtgtgct 60aaatataaaa tgagacctta tatatgtagc gctgataact agaactatgc aagaaaaact120catccaccta ctttagtggc aatcgggcta aataaaaaag agtcgctaca ctagtttcgt180tttccttagt aattaagtgg gaaaatgaaa tcattattgc ttagaatata cgttcacatc240tctgtcatga agttaaatta ttcgaggtag ccataattgt catcaaactc ttcttgaata300aaaaaatctt tctagctgaa ctcaatgggt aaagagagag atttttttta aaaaaataga360atgaagatat tctgaacgta ttggcaaaga tttaaacata taattatata attttatagt420ttgtgcattc gtcatatcgc acatcattaa ggacatgtct tactccatcc caatttttat480ttagtaatta aagacaattg acttattttt attatttatc ttttttcgat tagatgcaag540gtacttacgc acacactttg tgctcatgtg catgtgtgag tgcacctcct caatacacgt600tcaactagca acacatctct aatatcactc gcctatttaa tacatttagg tagcaatatc660tgaattcaag cactccacca tcaccagacc acttttaata atatctaaaa tacaaaaaat720aattttacag aatagcatga aaagtatgaa acgaactatt taggtttttc acatacaaaa780aaaaaaagaa ttttgctcgt gcgcgagcgc caatctccca tattgggcac acaggcaaca840acagagtggc tgcccacaga acaacccaca aaaaacgatg atctaacgga ggacagcaag900tccgcaacaa ccttttaaca gcaggctttg cggccaggag agaggaggag aggcaaagaa960aaccaagcat cctcctcctc ccatctataa attcctcccc ccttttcccc tctctatata 1020ggaggcatcc aagccaagaa gagggagagc accaaggaca cgcgactagc agaagccgag 1080cgaccgcctt cttcgatcca tatcttccgg tcgagttctt ggtcgatctc ttccctcctc 1140cacctcctcc tcacagggta tgtgcccttc ggttgttctt ggatttattg ttctaggttg 1200tgtagtacgg gcgttgatgt taggaaaggg gatctgtatc tgtgatgatt cctgttcttg 1260gatttgggat agaggggttc ttgatgttgc atgttatcgg ttcggtttga ttagtagtat 1320ggttttcaat cgtctggaga gctctatgga aatgaaatgg tttagggtac ggaatcttgc 1380gattttgtga gtaccttttg tttgaggtaa aatcagagca ccggtgattt tgcttggtgt 1440aataaaagta cggttgtttg gtcctcgatt ctggtagtga tgcttctcga tttgacgaag 1500ctatcctttg tttattccct attgaacaaa aataatccaa ctttgaagac ggtcccgttg 1560atgagattga atgattgatt cttaagcctg tccaaaattt cgcagctggc ttgtttagat 1620acagtagtcc ccatcacgaa attcatggaa acagttataa tcctcaggaa caggggattc 1680cctgttcttc cgatttgctt tagtcccaga attttttttc ccaaatatct taaaaagtca 1740ctttctggtt cagttcaatg aattgattgc tacaaataat gcttttatag cgttatccta 1800gctgtagttc agttaatagg taatacccct atagtttagt caggagaaga acttatccga 1860tttctgatct ccatttttaa ttatatgaaa tgaactgtag cataagcagt attcatttgg 1920attatttttt ttattagctc tcaccccttc attattctga gctgaaagtc tggcatgaac 1980tgtcctcaat tttgttttca aattcacatc gattatctat gcattatcct cttgtatcta 2040cctgtagaag tttctttttg gttattcctt gactgcttga ttacagaaag aaatttatga 2100agctgtaatc gggatagtta tactgcttgt tcttatgatt catttccttt gtgcagttct 2160tggtgtagct tgccactttc accagcaaag ttcatttaaa tcaactaggg atatcacaag 2220
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Leu Ser Val Ser Ile Ser His Leu Ala Arg Gln Arg Tyr Gly Ser Val210 215 220Asp Asp Tyr Ile Thr Arg Tyr Pro Thr Asp Pro Phe Asp Arg Phe Trp225 230 235 240Glu Ala Ala Leu Arg Tyr Lys Phe Pro Phe Leu Asn Met Thr Thr Asn245 250 255Gln Asp Val Thr Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asp Phe Gln Val Pro Met260 265 270Pro Ile Leu Gln Lys Ala Ser Thr Ile Ser Ser Asn Phe Ser Glu Phe275 280 285Asn Val Ser Val Ile Phe Pro Asp Asn Met Lys Asn Ile Asp Asn Ile290 295 300Asn Asn Ile Asp Tyr Arg Ser Leu Glu Leu Leu Pro Ile Phe His Phe305 310 315 320Ala Asp Ile Gly Gly Asn Asn Gln Asn Arg Thr Phe Asp Ile Tyr Asn325 330 335Asp Gly Asn Leu Met Phe Pro Asn Tyr Ile Pro Pro Leu Phe Arg Ala340 345 350Glu Ser Thr Tyr Gln Ser Gly Lys Phe Leu Arg Lys Arg Gly Leu Asn355 360 365Phe Thr Leu Arg Lys Thr Pro Ser Ser Glu Leu Gln Pro Leu Ile Asn370 375 380Ala Phe Glu Val Tyr Ser Leu Val His Thr Asp Asn Leu Thr Thr Ser385 390 395 400Pro Asp Asp Val Asp Tyr Met Lys Glu Val Lys Lys Tyr Tyr Ser Tyr405 410415Thr Arg Asn Trp Asn Gly Asp Pro Cys Ser Pro Arg Glu Tyr Ser Trp420 425 430Gln Gly Leu Ala Cys Asp Tyr Ala Asn Gly Asn Lys Asn Pro Arg Ile435 440 445Thr Arg Met Asp Leu Ser His Asn Asn Leu Thr Gly Ala Ile Pro Asp450 455 460Tyr Gln Leu Asn Ser Leu Arg Val Leu Asp Ser Ser Cys Gly Ile Pro465 470 475 480Pro Thr Pro Cys Thr Gly Leu Tyr Pro Leu Glu Ala Val Leu Glu Arg485 490 495Leu Glu Phe Ala Gly Lys Ser Ala Glu Gln Glu Asp Tyr Ser Ile Tyr500 505 510Glu Glu Glu Ala Pro Leu His Ile Asp Ile Lys Arg Phe Thr Tyr Ala
515 520 525Glu Leu Lys Leu Ile Thr Asn Asn Phe Gln Ser Ile Ile Gly Lys Gly530 535 540Gly Phe Gly Thr Val Tyr His Gly Ile Leu Glu Asn Asn Asp Glu Val545 550 555 560Ala Val Lys Val Leu Val Glu Thr Ser Ile Ala Glu Ser Lys Asp Phe565 570 575Leu Pro Glu Arg Lys Ser Ser Ala Val Met Val Gly Ile Thr Tyr Gln580 585 590Arg Arg Ser Arg Thr Gly Leu Gln Asp Thr Ala Ser Gly Asp Ala Ala595 600 605Gln Arg Thr Thr Asn Phe Ala His Phe Asp Ala Gly Tyr Asp Ser Ser610 615 620Leu Asn Trp Glu Glu Arg Leu His Ile Ala Leu Asp Ala Ala Gln Gly625 630 635 640Leu Glu Tyr Leu His Glu Ser Cys Ser Pro Ser Ile Val His Arg Asp645 650 655Val Lys Thr Pro Asn Ile Leu Leu Asp Lys Asn Leu Val Ala Lys Ile660 665 670Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Ala Phe Asn Ala Ala His Thr His Ile675 680 685Ser Thr Val Val Ala Gly Thr Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Glu Tyr His690 695 700Ala Thr Phe Gln Leu Thr Val Lys Thr Asp Val Tyr Ser Phe Gly Ile705 710 715 720Val Leu Leu Glu Ile Val Thr Gly Gln Pro Pro Val Phe Met Asp Pro725 730 735Gln Thr Val His Leu Pro Asn Trp Val Arg Gln Lys Ile Asp Lys Gly740 745 750Ser Ile His Asp Val Val Asp Lys Lys Leu Leu Asp Gln Tyr Asp Ala755 760 765Thr His Leu Gln Thr Val Ile Asp Leu Ala Met Asn Cys Leu Glu Asn770 775 780Thr Ser Ile Asp Arg Pro Ser Met Thr Glu Val Val Ser Val Leu Lys785 790795 800Val Leu Phe Thr Val Ala Ile Ser Ser Glu Lys Arg Ser Val Thr Ser805 810 815Thr Pro Gln Glu Lys Asn Val Met Asp Ala Asp Ile Pro Arg Gln Phe820 825 830His Leu Met Ile Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ser Tyr Asp Asn Glu Gly
835 840 845Ser Ser Ser Gln Ser Gly Pro Thr Gly Gly Met Ser Glu Ile Ser Tyr850 855 860Ile Ser Gly Arg865<210>33<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>共有序列<220>
<221>混合特征<222>(3)..(3)<223>Xaa可以是任何氨基酸<220>
<221>混合特征<222>(6)..(6)<223>Xaa可以是Asp或Glu<220>
<221>混合特征<222>(8)..(8)<223>Xaa可以是任何氨基酸<220>
<221>混合特征<222>(12)..(12)<223>Xaa可以是Tyr或Phe<400>33Leu Arg Xaa Phe Pro Xaa Gly Xaa Arg Asn Cys Xaa1 5 10
權利要求
1.相對于對應的野生型植物，改良植物生長特性的方法，其包括增加RLK827多肽或其同源物的活性，和/或通過增加RLK827編碼核酸分子的表達，以及任選選擇具有改良生長特性的植物。
2.權利要求1的方法，其中所述增加活性和/或增加表達通過優(yōu)選在RLK827多肽或其同源物的編碼基因的基因座中引入遺傳修飾來實現。
3.權利要求2的方法，其中所述遺傳修飾通過定點誘變、同源重組、TILLING、定向進化和T-DNA激活中的一種來實現。
4.相對于對應的野生型植物，改良植物生長特性的方法，其包括在植物中引入和表達RLK827核酸分子或其功能性變體。
5.權利要求4的方法，其中所述功能性變體是部分RLK827核酸分子或能夠與RLK827核酸分子雜交的序列，其中所述功能性變體包含非胞質結構域、跨膜結構域和激酶結構域，其中所述非胞質結構域具有至少1個但不多于3個LRR結構域以及SEQ ID NO33的氨基酸序列基序。
6.權利要求4或5的方法，其中所述RLK827核酸分子或其功能性變體在植物中過量表達。
7.根據權利要求4到6中任一項的方法，其中所述RLK827核酸分子或其功能性變體是植物來源的，優(yōu)選來自雙子葉植物，進一步優(yōu)選來自十字花科，所述核酸更優(yōu)選來自擬南芥。
8.根據權利要求4到7中任一項的方法，其中所述功能性變體編碼RLK827的直系同源物或旁系同源物。
9.根據權利要求4到8中任一項的方法，其中所述RLK827核酸分子或其功能性變體與組成型啟動子有效連接。
10.根據權利要求9的方法，其中所述組成型啟動子是GOS2啟動子。
11.根據權利要求1到10中任一項的方法，其中所述改良的植物生長特性是增加的產量。
12.根據權利要求11的方法，其中所述增加的產量是增加的種子產量。
13.根據權利要求12的方法，其中所述增加的種子產量選自(i)增加的種子生物量；(ii)增加的(飽滿)種子數；(iii)增加的種子尺寸；(iv)增加的種子體積；(v)增加的收獲指數(HI)；以及(vi)增加的千粒重(TKW)中的任一項或多項。
14.根據權利要求1到13中任一項的方法獲得的植物或植物細胞。
15.構建體，其包括(i)RLK827核酸分子或其功能性變體；(ii)能夠驅動(i)中核酸序列表達的一個或多個調控序列；及任選的(iii)轉錄終止序列。
16.根據權利要求15的構建體，其中所述調控序列是組成型啟動子。
17.根據權利要求16的構建體，其中所述組成型啟動子是GOS2啟動子。
18.根據權利要求15或17的構建體轉化的植物或植物細胞。
19.制備具有改良生長特性的轉基因植物的方法，所述方法包括(i)向植物中引入RLK827核酸分子或其功能性變體；(ii)在促進植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細胞。
20.相對于對應的野生型植物，具有改良生長特性的轉基因植物或植物細胞，所述改良生長特性由引入所述植物或植物細胞中的RLK827核酸分子或其功能性變體產生，或由優(yōu)選在RLK827多肽或其同源物的編碼基因的基因座中的遺傳修飾產生。
21.根據權利要求14、18或20的轉基因植物或植物細胞，其中所述植物是單子葉植物，如甘蔗，或其中植物是谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥或高粱；或其中所述植物細胞來自單子葉植物，如甘蔗，或其中所述植物細胞來自谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥或高粱。
22.根據權利要求14、18、20或21中任一項的植物的可收獲部分，和/或直接來自其的產物。
23.根據權利要求22的可收獲部分，其中所述可收獲部分是種子。
24.RLK827核酸分子或其功能性變體的用途，或者RLK827多肽或其同源物的用途，其用于改良植物的生長特性，特別是改良產量，尤其是改良種子產量。
25.根據權利要求24的用途，其中所述的種子產量包括下列一種或多種增加的(飽滿)種子數、增加的種子重量、增加的收獲指數和增加的千粒重。
26.RLK827核酸分子或其功能性變體作為分子標記的用途。
27.用于改良植物的生長特性，優(yōu)選用作生長調節(jié)劑的組合物，其包含RLK827核酸分子或其功能性變體。
28.用于改良植物的生長特性，優(yōu)選用作生長調節(jié)劑的組合物，其包含RLK827蛋白質或其同源物。
全文摘要
本發(fā)明涉及改良植物生長特性的方法，其通過增加植物中LRR受體激酶或其同源物的表達和/或活性來實現。此類方法之一包括將RLK827核酸分子或其功能性變體引入植物。本發(fā)明還涉及具有改良生長特性的轉基因植物，該植物具有調節(jié)的LRR受體激酶編碼核酸的表達。本發(fā)明還涉及可用于本發(fā)明方法中的構建體。
文檔編號C12N15/82GK101023176SQ200580030856
公開日2007年8月22日 申請日期2005年7月14日 優(yōu)先權日2004年7月15日
發(fā)明者V·弗蘭卡德, A·I·桑茲莫林納羅, V·米隆諾弗 申請人:克羅普迪塞恩股份有限公司